JPS60188099A - Ｇｏｔの検出方法 - Google Patents
Ｇｏｔの検出方法Info
- Publication number
- JPS60188099A JPS60188099A JP4522784A JP4522784A JPS60188099A JP S60188099 A JPS60188099 A JP S60188099A JP 4522784 A JP4522784 A JP 4522784A JP 4522784 A JP4522784 A JP 4522784A JP S60188099 A JPS60188099 A JP S60188099A
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- Japan
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- acid
- glutamic
- oxalacetic
- detecting
- transminase
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- Pending
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はＧＯＴの検出方法に関し、特には、血清中のｃ
ｏＴａ検出、定量する方法に関する。
ｏＴａ検出、定量する方法に関する。
血清中のＧＯＴ （グルタミン酸−オキサロ酢酸トラン
スアミナーゼ（ＧｌｕＦ−ａｍａｔｅ−Ｏｘａｌｏａｃ
ｅＬａＬｅｔ、ｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ） ］はアスパ
ラギン酸・２−オキソグルタル酸・アミノトランスフェ
ラーゼ（Ｌ −Ａｓｐａｒｔ：ａｔｅ ２ −ｏｘｏｇ
ｌｕｌ：ａｒａしｅ ａ＋＋＋１ｎｏｔｒａｎｓｆｅｒ
ａｓｅ）ともよばれ、正常時には低レベルであるが、肝
炎、心筋梗塞時などには顕著に活性レベルが増加するこ
とから、日常臨床上欠くことのできない検査項１」の一
つとなっている。
スアミナーゼ（ＧｌｕＦ−ａｍａｔｅ−Ｏｘａｌｏａｃ
ｅＬａＬｅｔ、ｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ） ］はアスパ
ラギン酸・２−オキソグルタル酸・アミノトランスフェ
ラーゼ（Ｌ −Ａｓｐａｒｔ：ａｔｅ ２ −ｏｘｏｇ
ｌｕｌ：ａｒａしｅ ａ＋＋＋１ｎｏｔｒａｎｓｆｅｒ
ａｓｅ）ともよばれ、正常時には低レベルであるが、肝
炎、心筋梗塞時などには顕著に活性レベルが増加するこ
とから、日常臨床上欠くことのできない検査項１」の一
つとなっている。
従来、Ｇ Ｏｉ’の測定方法としてはＷｒ６ｂｌｅシ５
ｋｉ−Ｋｉｌｌ ｒ Ｉｎ ｅ ｎ法（Ｌａ Ｄｕｅ、
、Ｊ 、 Ｓら： Ｓ ｃｉｃｒ＋ｃＣ。
ｋｉ−Ｋｉｌｌ ｒ Ｉｎ ｅ ｎ法（Ｌａ Ｄｕｅ、
、Ｊ 、 Ｓら： Ｓ ｃｉｃｒ＋ｃＣ。
第１２０巻４９７〜４９９頁、 １０５４年）が標準的
な方法として広く用いられている。その測定原理は２−
オキソグルタル酸およびＬ−アスパラギン酸にＧ ＯＴ
を作用させて生しるオギサロ酢酸をリンゴ酸脱水素酵素
で還元し、その際に等モルて起こるＮΔＤ Ｉ−１−＋
Ｎ Ａ Ｄ’の変化を紫外線吸収の変化として測定す
るものである。しかしながら、この方法では高価なリン
ゴ酸脱水素酵素やＮΔＤにコチン酸アミドアデニンジヌ
クレオチ１〜）のような試薬を用いる必要があり、また
、酵素を使うために試薬の保存性が悪く、低温に保存す
る必要があった。
な方法として広く用いられている。その測定原理は２−
オキソグルタル酸およびＬ−アスパラギン酸にＧ ＯＴ
を作用させて生しるオギサロ酢酸をリンゴ酸脱水素酵素
で還元し、その際に等モルて起こるＮΔＤ Ｉ−１−＋
Ｎ Ａ Ｄ’の変化を紫外線吸収の変化として測定す
るものである。しかしながら、この方法では高価なリン
ゴ酸脱水素酵素やＮΔＤにコチン酸アミドアデニンジヌ
クレオチ１〜）のような試薬を用いる必要があり、また
、酵素を使うために試薬の保存性が悪く、低温に保存す
る必要があった。
本発明は、このような欠点’ｘＭ−消するためになさＪ
したものであり、より簡便に、しかも高感度にＧＯＴｆ
検出、定量することのできる方法を提供することを目的
とする。
したものであり、より簡便に、しかも高感度にＧＯＴｆ
検出、定量することのできる方法を提供することを目的
とする。
すなわち１本発明のＧＯＴの検出方法は、試料中のＧ○
′Ｆと、基質としてシスティンスルフィン酸および２−
オキソグルタル酸とを作用させて亜硫酸を生成させ、こ
の亜硫酸をＮ−（０−アクリジニル）マレイミドで検出
することを特徴とする。
′Ｆと、基質としてシスティンスルフィン酸および２−
オキソグルタル酸とを作用させて亜硫酸を生成させ、こ
の亜硫酸をＮ−（０−アクリジニル）マレイミドで検出
することを特徴とする。
システィンスルフィン酸（Ｃ８Δ）と２−オキソグルタ
ル酸とを基質として、Ｇ Ｏ’Ｉ”を補酵素とともに作
用させると、β−スルフィニルピルビン酸を経て、ピル
ビン酸と亜硫酸とが生じる。
ル酸とを基質として、Ｇ Ｏ’Ｉ”を補酵素とともに作
用させると、β−スルフィニルピルビン酸を経て、ピル
ビン酸と亜硫酸とが生じる。
↓
ピルビン酸＋Ｓ０２
このようなＧＯＴとの反応は、たとえばｌ−リス−塩酸
緩衝液などの緩衝液中で、ρ１（７ｍ９程度で行ない、
２０〜４０°Ｃで、３分間〜６０聞方程度インキュベー
１−することにより完了する。もちろん、Ｃ８Δと２−
オキソグルタル酸は塩の形で添イ４することもできる。
緩衝液などの緩衝液中で、ρ１（７ｍ９程度で行ない、
２０〜４０°Ｃで、３分間〜６０聞方程度インキュベー
１−することにより完了する。もちろん、Ｃ８Δと２−
オキソグルタル酸は塩の形で添イ４することもできる。
後記の実施例１および２からも明らかなように、試料の
Ｇ ＯＴ Ｌｍ度により、適宜に基質濃度を変化させ、
広範囲のＧ ＯＴ’濃度に亘り、Ｇ○゛１′を定置する
ことかてきる。
Ｇ ＯＴ Ｌｍ度により、適宜に基質濃度を変化させ、
広範囲のＧ ＯＴ’濃度に亘り、Ｇ○゛１′を定置する
ことかてきる。
ついて、この反応液中にＮ−（９−アクリジニル）マレ
イミド（ＮＡＭ） を加える。
イミド（ＮＡＭ） を加える。
本発明者らか特願昭５８−１４７５８１号明細書で報告
したように、ＮＡＭはＳＯ３と反応してＳ○、−ＮＡＭ
を形成して蛍光を発する。このＳＯ２−ＮＡＭの蛍光強
度は非常に強く、高感度で血清Ｇ○゛１゛を微量定量す
ることができる。
したように、ＮＡＭはＳＯ３と反応してＳ○、−ＮＡＭ
を形成して蛍光を発する。このＳＯ２−ＮＡＭの蛍光強
度は非常に強く、高感度で血清Ｇ○゛１゛を微量定量す
ることができる。
ＮＡＭは適当な溶媒、たとえばアセトンに溶解し、この
溶液と試料液とを、）（３ＢＯ，−ＫＣＬ−Ｎａ２ＣＯ
３緩衝液などの緩衝液中でｐＨ７〜１０程度で混合する
とＳＯ７−ＮＡＭが形成されて濃青色の蛍光を呈する。
溶液と試料液とを、）（３ＢＯ，−ＫＣＬ−Ｎａ２ＣＯ
３緩衝液などの緩衝液中でｐＨ７〜１０程度で混合する
とＳＯ７−ＮＡＭが形成されて濃青色の蛍光を呈する。
この蛍光強度を測定することにより、ＧＯＴレベルを定
量することかでき、高速液体クロマ１−グラフィー（＋
−ＩＰＬｃ）などで分離、定量することにより、血清中
の（’Ｊ ＯＴ’をさらに高感度に微量定量することが
できる。
量することかでき、高速液体クロマ１−グラフィー（＋
−ＩＰＬｃ）などで分離、定量することにより、血清中
の（’Ｊ ＯＴ’をさらに高感度に微量定量することが
できる。
以上説明した通り、本発明によれば、従来法に比へ高感
度てＧＯＴを定量することがてき、よって検査に必要な
血液量を著しく減少することができる。また、高価なＮ
ＡＤや酵素を用いる必要がなく、簡便にＧＯＴを定量す
ることができる。
度てＧＯＴを定量することがてき、よって検査に必要な
血液量を著しく減少することができる。また、高価なＮ
ＡＤや酵素を用いる必要がなく、簡便にＧＯＴを定量す
ることができる。
実施例１
２０ ｍ ＭのＣ，Ｓ Ａ 、 ｌｏｍＭの２−オキソ
グルタル酸および４０７ｉ１のピリドキサル燐酸を７５
ｍ Ｍの１ヘリス−塩酸緩衝液（ｐ＋４８．６）に溶
解した液２０μＱに、ＧＯＴ（ブタ心臓から精製したＧ
ｐ’ｒ、２Ｂ／＋ｎ（１）２ｆ）μ０． ’ｉ？ｆ１
．ぜ、３７℃で２０分間インキュベートしたのち、ＮＡ
Ｍのアセトン７容液（］ ｍｇ／ ５ｍ Ｑ ）を１０
０μ（ｌ加え、次いでＨ，ＢＯ，−ＫＣ１−Ｎａ２ＣＯ
，緩衝液（ｐＨｌＯ） ３ ｍ （ｌを加えテ２０分間
反応させた。
グルタル酸および４０７ｉ１のピリドキサル燐酸を７５
ｍ Ｍの１ヘリス−塩酸緩衝液（ｐ＋４８．６）に溶
解した液２０μＱに、ＧＯＴ（ブタ心臓から精製したＧ
ｐ’ｒ、２Ｂ／＋ｎ（１）２ｆ）μ０． ’ｉ？ｆ１
．ぜ、３７℃で２０分間インキュベートしたのち、ＮＡ
Ｍのアセトン７容液（］ ｍｇ／ ５ｍ Ｑ ）を１０
０μ（ｌ加え、次いでＨ，ＢＯ，−ＫＣ１−Ｎａ２ＣＯ
，緩衝液（ｐＨｌＯ） ３ ｍ （ｌを加えテ２０分間
反応させた。
この反応液をｌ ｃｍセルを用いて、励起波長（１・Ｘ
）３６０ ｎ ｍ、蛍光波長（Ｅｍ）４４０μｍの蛍光
強度を測定した。その結果第１図に示すごと＜、ｒＩｙ
ｆ素量０．２９−２．］ｎｇ （ｌＩｌｒ２＋ｂｌｅｈ
ツｓｋｉ−Ｋａｒｍｅｎ法の０．１１−０．８０１１Ｕ
に相当）で直線性か得ら］した（相関係数ｒ ＝ＯｙＤ
Ｏ８）。
）３６０ ｎ ｍ、蛍光波長（Ｅｍ）４４０μｍの蛍光
強度を測定した。その結果第１図に示すごと＜、ｒＩｙ
ｆ素量０．２９−２．］ｎｇ （ｌＩｌｒ２＋ｂｌｅｈ
ツｓｋｉ−Ｋａｒｍｅｎ法の０．１１−０．８０１１Ｕ
に相当）で直線性か得ら］した（相関係数ｒ ＝ＯｙＤ
Ｏ８）。
実施例２
３０ｍＭの（１：ｓＡ、１５ｍ門の２−オキソグルタル
酸および４０μト１のピリトキサルＩｓ ｍ ｔｘ ７
５ｍＭの１〜リス−塩酸緩衝液（ｐ１４８．６）に溶解
した混液２ｏμＱに、ＧＯ１’（実施例］と同シ）２０
１１Ｑを混ぜ、３７℃で５分間反応させたのち、実施例
１と同様にして蛍光強度を測定したどころ第２図に示す
ごとく、酸素ｆｔ２．ｏ〜２０．０ｎｇ （Ｗｒδｂ１
．ｅｗｓｋｉ −Ｋａｒｍｅｎ法で０．１１〜０．８０
＋ｎＵに相当）で直線性が得られた（ ｒ ＝ｆ）、９
９７）。
酸および４０μト１のピリトキサルＩｓ ｍ ｔｘ ７
５ｍＭの１〜リス−塩酸緩衝液（ｐ１４８．６）に溶解
した混液２ｏμＱに、ＧＯ１’（実施例］と同シ）２０
１１Ｑを混ぜ、３７℃で５分間反応させたのち、実施例
１と同様にして蛍光強度を測定したどころ第２図に示す
ごとく、酸素ｆｔ２．ｏ〜２０．０ｎｇ （Ｗｒδｂ１
．ｅｗｓｋｉ −Ｋａｒｍｅｎ法で０．１１〜０．８０
＋ｎＵに相当）で直線性が得られた（ ｒ ＝ｆ）、９
９７）。
実施例３
３０ ｍ ＭのＣ８Ａ、１５ｍＭの２−オキソグルタル
酸および４０μＨのビリドキサル燐酸を７５ ＋ｎ Ｍ
の１−リス−塩酸緩衝？ｃｊ、（ｐＨ８，６）に溶解し
た液３５μＱとヒト血清希釈液５ ｌｔ Ｑとを混合し
、３７℃で１５分間インキュベートしたのち、氷冷下に
ＮＡＭのアセ１−ン溶液（１１１１ｇ１５Ｉ＋１２）を
１００μＱ加え、次いでＨ３ＢＯ３−ＫＣ１−Ｎａ、Ｃ
ｏ３緩衝液（ｐ）（１０，０） ３ ｍΩを加え、室温
で１時間放置したのち、ｌＯμＱを取りＨＰＬＣでＳＯ
２−ＮＡＭ移動相：２０％ＣＨ３ＣＮ−０，２Ｍリン酸
カリウム緩衝液 （ｐ＋−１７，０） 流 速： １．ｏｍ Ｏ，／ ｍｉｎ 検出器：蛍光検出器（Ｅｘ−３６０ｎｍ 、 ［Ｅｍ
＝＝ ４５５ｎｍで測定） その結果第３図に示すごと（ＷｒＬ）ｂｌｅｗｓｋｉ
−にａ ｒ Ｉｌｌ ｅ ｎ法に換算して４．７５−８
１．５Ｕ／ Ｑで直線性が得られた（ ｒ ＝０．９９
９）。
酸および４０μＨのビリドキサル燐酸を７５ ＋ｎ Ｍ
の１−リス−塩酸緩衝？ｃｊ、（ｐＨ８，６）に溶解し
た液３５μＱとヒト血清希釈液５ ｌｔ Ｑとを混合し
、３７℃で１５分間インキュベートしたのち、氷冷下に
ＮＡＭのアセ１−ン溶液（１１１１ｇ１５Ｉ＋１２）を
１００μＱ加え、次いでＨ３ＢＯ３−ＫＣ１−Ｎａ、Ｃ
ｏ３緩衝液（ｐ）（１０，０） ３ ｍΩを加え、室温
で１時間放置したのち、ｌＯμＱを取りＨＰＬＣでＳＯ
２−ＮＡＭ移動相：２０％ＣＨ３ＣＮ−０，２Ｍリン酸
カリウム緩衝液 （ｐ＋−１７，０） 流 速： １．ｏｍ Ｏ，／ ｍｉｎ 検出器：蛍光検出器（Ｅｘ−３６０ｎｍ 、 ［Ｅｍ
＝＝ ４５５ｎｍで測定） その結果第３図に示すごと（ＷｒＬ）ｂｌｅｗｓｋｉ
−にａ ｒ Ｉｌｌ ｅ ｎ法に換算して４．７５−８
１．５Ｕ／ Ｑで直線性が得られた（ ｒ ＝０．９９
９）。
ＧＯＴ量は市販の紫外部吸光度測定によるＧＯＴ測゛定
用試薬（ベーリンガー、マンハイム山之内株式会社から
発売）を用いて測定した。
用試薬（ベーリンガー、マンハイム山之内株式会社から
発売）を用いて測定した。
第１図および第２図はブタ心臓から精製したＧＯＴ量と
蛍光強度との関係を示すグラフである。 第３回はヒ１〜血清中のＧＯＴ量とｌ（Ｐ Ｉ−Ｃによ
るＳＯ２−ＮＡＭビークの高さとの関係を示すグラフで
ある。 特許出願人朝日麦酒株式会比 筋１凹 吊３霞 ／ 弔２図 醇ｉ−ｉ （ｎｇ） 〆
蛍光強度との関係を示すグラフである。 第３回はヒ１〜血清中のＧＯＴ量とｌ（Ｐ Ｉ−Ｃによ
るＳＯ２−ＮＡＭビークの高さとの関係を示すグラフで
ある。 特許出願人朝日麦酒株式会比 筋１凹 吊３霞 ／ 弔２図 醇ｉ−ｉ （ｎｇ） 〆
Claims (1)
- ■、 試料中のグルタミン酸−オキサロ酢酸１〜ランス
アミナーゼと、基質としてのシスティンスルフィン酸お
よび２−オキソグルタル酸とを作用させて亜硫酸を生成
させ、この亜硫酸をＮ−（９−アクリジニル）マレイミ
ドで検出することを特徴とするグルタミン酸−オキサロ
酢酸トランスアミナーゼの検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4522784A JPS60188099A (ja) | 1984-03-09 | 1984-03-09 | Ｇｏｔの検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4522784A JPS60188099A (ja) | 1984-03-09 | 1984-03-09 | Ｇｏｔの検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60188099A true JPS60188099A (ja) | 1985-09-25 |
Family
ID=12713375
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4522784A Pending JPS60188099A (ja) | 1984-03-09 | 1984-03-09 | Ｇｏｔの検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60188099A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4702676A (en) * | 1984-10-15 | 1987-10-27 | Canadian Patents And Development Limited | Liquid driven pump or propulsive apparatus |
| EP0523227A1 (en) * | 1991-01-31 | 1993-01-20 | Xytronyx, Inc. | One-step test for aspartate aminotransferase |
-
1984
- 1984-03-09 JP JP4522784A patent/JPS60188099A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4702676A (en) * | 1984-10-15 | 1987-10-27 | Canadian Patents And Development Limited | Liquid driven pump or propulsive apparatus |
| EP0523227A1 (en) * | 1991-01-31 | 1993-01-20 | Xytronyx, Inc. | One-step test for aspartate aminotransferase |
| US5834226A (en) * | 1991-01-31 | 1998-11-10 | Xytronyx, Inc. | One-step test for aspartate aminotransferase |
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