JPS6018765A - Novel antigen decision group regarding adenocarcinoma, antibody special to said group, manufacture of these group and antibody and reaction agent system related to said method - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、腺癌に関する新規な抗原決定基、それに特異
的な抗体、並びに生物学的体液１組織抽出物もしくは切
片及び腫瘍細胞もしくは腫瘍塊のｉｎ　ｖｉｖｏに於【
プる前記抗原決定基の検知に基づいてヒト腺癌を診断す
る方法に係る。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention provides novel antigenic determinants for adenocarcinoma, antibodies specific therefor, and the use of novel antigenic determinants for adenocarcinoma, as well as antibodies specific for the same, as well as biological fluids, tissue extracts or sections, and tumor cells or tumor masses in vivo.
The present invention relates to a method for diagnosing human adenocarcinoma based on the detection of said antigenic determinant.

−Ｉ　Ｃ）− 本発明は又、抗１１・Ｉ’ＪΩ桑又は他の細胞用１１１
剤を腫瘍細胞もしくは腫瘍１鬼に運ぶ！、：めの、腺癌
の治療に於りる特巽的抗体の使用に−１）係る。腫瘍病
理学にあっては、師瘍塊イのもの又は生物学的体液から
そのような病理に１１１４随一（Ｊる物質の単離が可能
であることはよく知られている３、これらの物質の多く
は人間Ｊ、リーｂ動物に於いてＪ、り多くの抗原↑１１
を有している。一般に″腫瘍標識（ｔｕｍｏｒ　ｍａｒ
ｋｅｒｓ）”と称されているそれらのうＪ５いくつかの
ものは、腫瘍胎児Ｐ１抗原（０１１ＣＯｆＯｔａｌ　ａ
ｎｔｉｇｅｎ　）である。-IC)- The present invention also provides anti-11.I'JΩ mulberry or 111 for other cells.
Deliver the drug to tumor cells or tumor 1 demon! .: Concerning the use of a specific antibody in the treatment of adenocarcinoma of the eye -1). In tumor pathology, it is well known that it is possible to isolate substances that are unique to such pathologies from tumor masses or biological body fluids. Many of the substances are antigens in humans and animals, and many antigens ↑11
have. In general, "tumor mark"
Some of these, called oncofetal P1 antigen (011COfOtal a
ntigen).

主として腺癌特にその転位部に阻隔するといわれている
抗１訂（の存在は、Ｑｏｌｄ　ｅｔ　ａｌ、によって明
らかにさティる（Ｊ、　ＦｘＤｔ、、Ｍｅｄ、１２１：
　４３９〜１１６２（１９６５）　）。The existence of anti-1st cancer, which is said to mainly block adenocarcinoma, especially its metastatic sites, was revealed by Qold et al. (J, FxDt, Med, 121:
439-1162 (1965)).

癌関連肝抗原（ｃａｒｃｉｎｏａｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａ
ｎｔｉｇｅｎ、　ＣＩＥΔ）として知られているこの抗
原は、いくつかの公知の０１究方法によって、生物学的
体液においてちまた組織抽出物もしくは切片においても
分析され得るものである。この公知の研究方法として、
例えば、Ｕ、Ｓ、特許Ｎ　Ｏ１３，６６３，６８４及び
Ｎｏ。Cancer-associated liver antigen (carcinoambryonic a)
This antigen, known as CIEΔ), can be analyzed in biological fluids and also in tissue extracts or sections by several known laboratory methods. As this known research method,
For example, U.S. Patent No. 13,663,684 and no.

３．６９７．６３８；　Ａｎｎ、　ｏｆ　Ｃｌ１ｎ、　
ａｎｄ　ｌ　ａｂ。3.697.638; Ann, of Cl1n,
and l ab.

５ｃｉＯｎｃｅ　４．５．３５７．１９７４：　ＣＩｉ
ｎ、ｃｌｌｏｍ、す、１０゜１９７３：　Ｃａｎｃｅｒ
　３４：　１５０４−１５０９．１９７４：　Ｃｆｉｎ
。5ciOnce 4.5.357.1974: CIi
n, clom, su, 10゜1973: Cancer
34: 1504-1509.1974: Cfin
.

Ｒｅｓ、　１９：　１４３．１９７１；　ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、３ｃｉ。Res, 19: 143.1971; proc, N
atl, Acad, 3ci.

しノ　Ｓ　△　６４　：　１６１−１６７、　１９６９
：　Ｃａｎｃｅｒ　３７：　６２−８１、１９７６：　
５ｃａｎｄ、　Ｊ　、Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、、Ｖｏｌ、　
７Ｓｕｐｐ１．６．１９７８：　Ｃａｎｃｅｒ　４５：
　１２４３−１２４７．１９８０：及びＪ　、　Ｎａｔ
ｌ、Ｃａｎｃｅｒ　ｌ　ｎｓｔ、５７．１．１９７６、
を挙げることができる。Shino S △ 64: 161-167, 1969
: Cancer 37: 62-81, 1976:
5cand, J. Immunol,, Vol.
7Supp1.6.1978: Cancer 45:
1243-1247.1980: and J, Nat.
l, Cancer lnst, 57.1.1976,
can be mentioned.

これに関して例えば上記した文献に示されるように数多
くの研究がなされてきたが、しかしながらこれらの研究
にＪこるとＣＥＡの特異性が極めて小さいものであった
。というのは、これらの研究に於いはＣＥＡが、腫瘍病
理のみならず変性炎症性プロｔ？ス（＋ｌｅｇｃｎｃｒ
ａ＋ｉｖｅ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｐｒｏｃ−ｅ
ｓｓｅｓ　）のような別の即ち非腫瘍病理史には健康な
ドナーに於いてさえも検知されたからであった。A large number of studies have been conducted in this regard, as shown in the above-mentioned documents, however, the specificity of CEA in these studies is extremely small. In these studies, CEA was shown to be associated not only with tumor pathology but also with degenerative inflammatory proteases. (+legcncr
a+ive-inflammatory proc-e
Other or non-neoplastic pathologies such as sses) were detected even in healthy donors.

加えて、生化学的研究［Ｕ　ｒｂａ　Ｒ、、Ａ　１ｐｅ
ｒｔ　Ｅ　、。In addition, biochemical studies [U rba R,, A 1pe
rtE,.

ｌ５ｓｅｌｂａｃｈｅｒ　Ｋ、　Ｊ、、Ｐｒ０Ｃ，Ｎａ
ｊｌ、Ａ（ｉａｄ、ＳＣ！。l5selbacher K, J,, Pr0C, Na
jl, A(iad, SC!.

Ｕ　、　Ｓ　、　Ａ　、　７２．　／１６０２−６　（
１９７５）　］から、異なった研究所から（ｑられるＣ
ＥＡそれぞれに相異が認められること、結局、異なった
オリジンの材お１を用いて同じ技術を使用したとしても
異なった臨床結果が得られることが判った。U, S, A, 72. /1602-6 (
1975)] and from different laboratories (q.C.
It was found that there are differences between each EA, and that even if the same technique is used with materials of different origins, different clinical results can be obtained.

胃腺癌、***腺癌及び甲状腺腺癌の如きあらゆるヒト腺
癌に加えてに１〜腺癌転移部から、腺癌に特異的な抗原
決定基（１り）及び腺癌上のに決定基に阻隔する抗原決
定ＪＫ　（Ｐ’）が１ｑられることが判明した。ｐｋ抗
原決定基は正常ドナーのプラズマもしくは血清中に存在
１−る抗原決定基（Ｐ”）と大変強い交叉反応を示すが
、抗原決定ＭＫは一抗原決１３一 定材と何らの交叉反応を示ずものではない。該抗原決定
基Ｋ及び−の混合物、あるいはおそらくそれらといくつ
かの他の未知抗原との混合物が従来ＣＥΔとして知られ
ていたものである。In addition to all human adenocarcinomas such as gastric adenocarcinoma, breast adenocarcinoma, and thyroid adenocarcinoma, from 1 to adenocarcinoma metastases, antigenic determinants specific to adenocarcinoma (1) and determinants on adenocarcinoma The blocking antigen determination JK (P') was found to be 1q. The pk antigenic determinant shows a very strong cross-reactivity with the antigenic determinant (P'') present in the plasma or serum of normal donors, whereas the antigenic determinant MK shows no cross-reactivity with the antigenic determinant (P'') present in the plasma or serum of normal donors. It is no surprise that the mixture of the antigenic determinants K and -, or perhaps their mixture with some other unknown antigen, is what was conventionally known as CEΔ.

本発明によれば、上記した抗原決定基Ｋ及び抗原決定ｍ
　ｐｋ、！：ｐ″′を利用することにより、特異的抗体
抗−に、抗−１〕１及び抗−Ｐ″′が得られる。According to the present invention, the above-mentioned antigenic determinant K and antigenic determinant m
pk,! By using p'', specific antibodies anti-1]1 and anti-P'' can be obtained.

公知の免疫学的方法例えばラジオイムノアッセイ、エン
１７”イムイムノアッセイ、イムノフルオレセンス、イ
ムノルミネセンス及びその他の多くの方法に於いて抗原
決定ＭＫ及びＰ並びにそれらに特賃的な抗体抗−Ｋ及び
抗−ｐｌ−を使用すれば、正常プラズマもしくは正常血
清の抗原決定ＭＰに由来する妨害なしに、腺癌に特有の
抗原決定基Ｋを専ら検知及び定量し得、又は所望ならば
、腺癌に関連するに決定基に阻隔する抗原決定基ｐｋを
専ら検知及び定量することができる。この決定は定性１
４− 的に、定量的に又は半定用的に行うことができる。In known immunological methods such as radioimmunoassay, immunoassay, immunofluorescence, immunoluminescence and many other methods, antigen determination MK and P and their specialized antibodies anti-K and Using anti-pl-, adenocarcinoma-specific antigenic determinant K can be exclusively detected and quantified without interference from antigen-determined MPs of normal plasma or normal serum, or if desired, adenocarcinoma-specific antigenic determinant K. It is possible to exclusively detect and quantify the antigenic determinant pk that is associated with the determinant.
4- Can be carried out quantitatively, quantitatively or semi-quantitatively.

」；って、本発明は、じトの患者から採取されたザンプ
ル例えば生物学的体液、組織抽出物もしくは組織切片の
ｉｎ　ＶｉｔｒＯ又ｔｉｔ腫瘍細胞もしくは腫瘍塊のｉ
ｎ　ｖｉｖｏでの腺癌関連抗原性物質を決定すイ）こと
を介して、ヒ１−腺癌診断のための改良された方法を提
供するものであり、該改良は、特異内払−にもしくは抗
−Ｐ″抗（、＋を利用して、正常細胞の一抗原決定大１
を明らかにすることなしに、腺癌に特異的な抗原決定基
Ｋ又は別個に腺癌上のに決定基に阻隔する抗原決定基［
）１を専ら決定することにある。これにより明らかに誤
った結果が少なくなる１゜ “′抗原決定基Ｋ　Ｊｌという表現は、既に述べたよう
に腺癌に特異的であり目つ正常細胞のＰ″′″抗原決定
基ど交叉反応を示さないので、それらに特異的な抗体す
なわち抗−に抗体によってのみ認識される抗原決定基を
相称Ｊるものである：この定義は、Ｋ抗原決定基以外の
抗原決定基が完全にまたは実質的に除去されたあらゆる
ＣＦＡ抗原混合物を含む。Thus, the present invention provides for the in vitro analysis of samples, such as biological fluids, tissue extracts or tissue sections, taken from a patient, or of tumor cells or tumor masses.
The present invention provides an improved method for diagnosing adenocarcinoma in humans through (a) determining adenocarcinoma-associated antigenic substances in vivo, which improvement can be performed in a specific intra- or Determination of one antigen of normal cells using anti-P'' anti(,+)
without revealing the adenocarcinoma-specific antigenic determinant K or the antigenic determinant that separately blocks the determinant on adenocarcinoma [
) 1. This clearly reduces the number of erroneous results.1゜The expression ``''antigenic determinant KJl'' is specific to adenocarcinoma, as mentioned above, and also represents the cross-reactivity of the P'''' antigenic determinant in normal cells. This definition means that antigenic determinants other than the K antigenic determinant are completely or substantially Contains any CFA antigen mixture that has been depleted.

パ抗原決定基ｐｋ＋＋という表現は、腺癌に特異的な抗
原決定基Ｋに阻隔して即ち抗原決定基にと共に腺癌細胞
上に存在する抗原決定基を相称するものであり、該Ｐ−
原決定基は、既に述べたように、正常細胞のビ抗原決定
基と交叉反応を示す：この定義は、ｐｌ（ｌ□原決定基
以外の抗原決定基が完全に又は実質的に除去されたあら
ゆるＣＦＡ抗原混合物を含む。The expression P- antigenic determinant pk++ is synonymous with an antigenic determinant present on adenocarcinoma cells in opposition to the adenocarcinoma-specific antigenic determinant K, that is, together with the antigenic determinant, and the P-
The proto-determinant, as already mentioned, cross-reacts with the bi-antigenic determinant of normal cells: this definition is defined as a pl Contains any CFA antigen mixture.

Ｐ″′抗原決定基は、既に述べたように、正常プラズマ
もしくは正常血清中に存在し１つＰ１抗原決定基と交叉
反応する抗原決定基である。The P″′ antigenic determinant, as already mentioned, is an antigenic determinant that is present in normal plasma or normal serum and cross-reacts with one P1 antigenic determinant.

抗−に抗体は、前記に抗原決定基で動物を免疫化して得
られる抗体であるか、又は、抗−にサイト以外の抗体サ
イトがそれらに特異的な抗原決定基によって完全に又は
実質的に飽和されるように変性された抗−ＣトＡ抗体（
’ｌ−’Ｊわち、該ＣＥＡで動物を免疫化して生産され
る抗体）のいずれかである。Anti-antibodies are antibodies obtained by immunizing an animal with the antigenic determinants described above, or antibody sites other than the anti-antigenic sites are completely or substantially mediated by antigenic determinants specific for them. Anti-CtoA antibody denatured to saturate (
'l-'J, ie, an antibody produced by immunizing an animal with the CEA).

同様に、抗−ｐｋ抗体は、晟Ｐｋ抗原決定基で動物を免
疫化して１９られる抗体であるか、又は、抗−Ｐ′サイ
ト以外の抗体ナイｌ〜がそれらに特安的な抗原決定基に
にって完全に又は実質的に飽和されるように変性された
抗−ＣＥＡ抗体のいずれかである。Similarly, anti-pk antibodies are antibodies that can be obtained by immunizing an animal with a specific Pk antigenic determinant, or antibodies other than the anti-P' site may be antibodies with specific antigenic determinants that are specific to them. Any anti-CEA antibody that has been modified to be completely or substantially saturated with.

本明細書中の抗体どいつ用語は、イムノグロブリン及び
イムノグＩＩ＋プリン画分の両方を相称するものであり
、また対応する抗血清を意味し得る。The term antibody herein is synonymous with both immunoglobulin and immunogII+purine fractions, and may also refer to the corresponding antiserum.

更に、特記しない限り、抗体という用語はポリクローン
抗体を意味Ｊ−る；モノクローン抗体を意図する場合は
このことを明記する。Furthermore, unless otherwise specified, the term antibody refers to polyclonal antibodies; if monoclonal antibodies are intended, this will be specified.

］く抗原決定基に特異的な抗−１〈抗体を生産するため
に、本発明は２つの二者択一的な方法を提供する。The present invention provides two alternative methods for producing anti-1 antibodies specific for antigenic determinants.

そのうらの１つの方法によれば、Ｋ及びｐｋ抗原決定基
の混合物に対して生産された抗体にＰ又はｐｋ抗原決定
基を吸着させて、該抗体上のｐｋ免疫学的結合１ノイド
を飽和させることにより、抗−に抗体が得られる。According to one such method, the P or pk antigenic determinant is adsorbed onto an antibody produced against a mixture of K and pk antigenic determinants to saturate the pk immunological binding 1 nod on the antibody. By this, an anti-antibody can be obtained.

他の方法によれば、抗−に抗体は、 １）動物をＰ″′又はｐｋ抗原決定基で免疫化して抗−
ビ又は抗−ｐｋ抗体を生産し： ２）抗原決定基Ｋ及びｐｋの混合物を１）で得られ！ご
抗−Ｐ″又は抗−Ｐ１抗体で精製してに抗原決定基を１
ｑ；そして ３）動物を２）で得られたに抗原決定基で免疫化するこ
とにより１りられる。According to another method, antibodies against anti-
2) A mixture of antigenic determinants K and pk is obtained in 1). Purify with anti-P'' or anti-P1 antibody to isolate antigenic determinants.
and 3) by immunizing the animal with the antigenic determinant obtained in 2).

本発明の範囲は、上記２つの二者択一的方法によって得
られる抗−１＜特異的抗体に加えて、前記二者択一的方
法の第２番］］の方法のステップ２）によって生産され
る１く抗原決定７ｄ　、並びに更に、前記方法に含：１
：れるｐｋ、！：Ｐ″′抗原決定基及びそれらに特異的
な抗−Ｐｋ、！：抗−醪抗体を包含Ｊ−る。The scope of the invention covers the anti-1 antibody produced by step 2) of the method of [in addition to the specific antibody obtained by the above two alternative methods] 1 antigen determination 7d, and further included in the method: 1
:Reru pk,! :P'' antigenic determinants and anti-Pk specific for them;

また、前記に、！”及びＰ″′抗原決定基並びに対応リ
−る抗−に、抗−ｐｋ及び抗−Ｐ′抗体のラベルした形
態、例えばラジオアイソ１〜−ブでラベル１ノだ形態、
酵素でラベルした形態又はフルオレヒンスでラベルした
形態は本発明の範囲内に包含されるものである。Also, as mentioned above! labeled forms of anti-PK and anti-P' antibodies, such as labeled forms labeled with radioisotopes 1--,
Enzyme-labeled or fluorehin-labeled forms are included within the scope of the invention.

抗−１く抗体を生産Ｊるための上記した第１の方法によ
れば、抗原決定基１＜及びＰｌの混合物を通常の及び公
知の免疫化１法に従って、例えばフロインドアジコバノ
ド中エマルジョンの形態で、ヤギ。According to the first method described above for producing anti-1 antibodies, a mixture of antigenic determinants 1 and PI is prepared according to conventional and known immunization methods, e.g. Goat in form.

ヒツジ、ウサギのＪ、う（７動物にと１射し、抗−に／
Ｐｋ抗而抗血生じさせる。通常の手法に従って該動物か
ら裸面してこの抗血清を採取し、次いで、インキュベー
ションによりＰ’又はＰ１抗原決定基を吸着さゼる１、
インキコベーションは、一般に室温乃至約５０　’Ｃ好
ましくは約３７℃で１乃至５日間好ましくは約３［１間
これを行なう。正常なヒトプラズマをＰ″′抗原決定基
の代わりに使用し得る。というのは、前述したＪ：うに
、正常なヒ１へプラズマは一抗原決定基を含むからであ
る。Sheep, rabbit J, horse (1 shot to 7 animals, anti-/
Produces Pk anti-blood. The antiserum is collected naked from the animal according to conventional techniques, and then the P' or P1 antigenic determinant is adsorbed by incubation.
Inkovation is generally carried out at room temperature to about 50'C, preferably about 37'C, for 1 to 5 days, preferably for about 3[1 minutes]. Normal human plasma may be used in place of the P'' antigenic determinant, since normal human plasma contains the P'' antigenic determinant, as described above.

具体的には、例えばＰｌ又はｐｌ−抗原決定基を約５０
７　／　ｍ（！の’Ｉｊｉ度で含有するＰＢＳ溶液３２
４　ｔｎｅと共に、又は正常なヒトプラスマ約５０ｄと
共にヤギ血清０．１ｍｊを３７℃で３日間インキュベー
ションし得る。Specifically, for example, about 50 Pl or pl- antigenic determinants
A PBS solution containing 32 degrees of
0.1 mj of goat serum can be incubated with 4 tne or with about 50 d of normal human plasma at 37°C for 3 days.

インキコベーションの終わりに遠心分離にか【プ、上澄
液を可能ならば更に希釈化／精製化／安定化処理に付し
た後、抗−１〈特異的抗体として用いる。At the end of incubation, the supernatant is centrifuged and, if possible, subjected to further dilution/purification/stabilization treatment before use as anti-1 specific antibody.

抗−に抗体又は抗血清を生産するために上記した第２の
方法によれば、通常の免疫化手法に従ってＰ″′又はＰ
ｋ抗原決定！Ｊを例えばフロインドアジュバント中Ｊ−
マルジ三１ンの形態でＡ７ギ、ヒツジ、ウサギのＪζう
イ（動物に注０□Ｉ　Ｉハ抗−−又は抗−Ｐ１′抗血清
を生じざ１ｉる。この抗血清を常法に従って動物の裸面
により回収覆る。According to the second method described above for producing antibodies or antisera against anti-P'' or P
K antigen determination! For example, J- in Freund's adjuvant.
Anti- or anti-P1' antiserum is generated in the form of A7, sheep, and rabbit anti-P1' antiserum. Collect and cover the bare surface.

所望ならば、該抗血清からイムノグロブリンを公知の手
法を用いて抽出してもよい。If desired, immunoglobulins may be extracted from the antiserum using known techniques.

Ｋ抗原決定基をＩＦるための、抗−一又は抗−Ｐ２抗体
を用いるＫ及び１〕１抗原決定１Ｊ混合物の精製は、公
知の方法に従って行な−）てＪ：い。通常利用し得る技
術としては、抗原と不活性支持体に結合している抗体と
の免疫学的反応に基づくようなものであって、例えばイ
ムノアフィニティ、バイＡアブソープション、り［１マ
ドグラフイー等を例示し得る。Purification of the K and 1]1 antigen determination 1J mixture using anti-1 or anti-P2 antibodies for IF of the K antigen determinant is carried out according to known methods. Commonly available techniques include those based on immunological reactions between an antigen and an antibody bound to an inert support, such as immunoaffinity, bioabsorption, lipography, etc. can be exemplified.

具体的には、例えば１く及びｐｋ抗原混合物の溶液例え
ばＰＢＳ溶液を抗−一又は抗−ｐｋ抗体が結合２１− した樹脂例えば３　ｅｐｈａｒｏｓｅ　４〜を通して溶
出さ）古る。このＪ：うにして、Ｋ抗原決定基を非結合
画分で回収する。Specifically, a solution of a mixture of pk and pk antigens, e.g., a PBS solution, is eluted through a resin to which anti-pk or anti-pk antibodies are bound, e.g., epharose. In this way, the K antigenic determinant is recovered in the unbound fraction.

次いで、常法に従って例えば前記した方法に従って、（
ｑられたに抗原決定基を動物に例えば上に示した種に注
射１′ることによって抗−に抗血清を生産する。Next, according to a conventional method, for example, according to the method described above, (
Antisera are produced by injecting antigenic determinants into animals, eg, the species listed above.

上記した方法に従って抗−に抗体を生産するために用い
た抗原決定基Ｋ及びＰの混合物は、−次又は転移腺癌組
織例えば肝転移、又は腺癌を患っている患者の生物学的
流体からの抽出により得られる。The mixture of antigenic determinants K and P used to produce antibodies against according to the method described above can be obtained from next or metastatic adenocarcinoma tissue, e.g. liver metastases, or from biological fluids of patients suffering from adenocarcinoma. Obtained by extraction of

この抽出は公知の方法に従って行なってよいが、腺癌組
織を用いる場合には予め均質化することが必要である。This extraction may be performed according to known methods, but when using adenocarcinoma tissue, it is necessary to homogenize it in advance.

一般に、均質化はＸ　Ｐ　ｒｅｓｓ　（Ｌ　ＫＢ）を用
いて達成し得る。Generally, homogenization can be achieved using X Press (L KB).

次いで該抽出はいずれかの適当な溶媒好ましく−２９− はグリコブ［１テイン溶媒に、１、って実施され得る。The extraction is then carried out using any suitable solvent, preferably -29- can be carried out with 1 glycob [1 tein in solvent].

この溶媒は、例えば、過塩素酸；トリクロル酢酸：ホス
ボタングス−ｊン酸；塩化カリウムの如ぎハ１］ゲン化
アルカリ金属；フ］ノール−エタノール混合物：　５ｔ
）Ｓ、　ＤＯＣ，ＣＰＣ，Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　１００゜
Ｎ　ｏｎｉｄｅｔ　ｐ　４０１々の如ぎ中ｆ１１又は陽
イオン性又は陰イオンｆ１デタージ丁ントであってもＪ
：い。This solvent is, for example, perchloric acid; trichloroacetic acid; fosbutanic acid; potassium chloride, alkali metal chloride; phenol-ethanol mixture: 5 t
) S, DOC, CPC, Triton
:stomach.

抽出溶媒は好ましくは均質体の容量又は生物学的流体の
容重ど等しい容量で用いられ、好ましくは濃縮酸例えば
約０．５Ｎ乃至約２Ｎの濃度である。The extraction solvent is preferably used in a volume equal to the volume of the homogenate or the volume of the biological fluid, preferably at a concentration of concentrated acid, such as from about 0.5N to about 2N.

２Ｎ過ＪＭ索酸が特に好ましい抽出溶媒である。室温以
下の温１（［が抽出工程に適するが、例えば約４℃の温
１ａが一般に好ましい１．抽出時間は通常約１０分から
約１時間に口って変化する。2N perjM acid is a particularly preferred extraction solvent. Temperatures below room temperature are suitable for the extraction process, but temperatures of about 4° C., for example, are generally preferred. Extraction times usually vary from about 10 minutes to about 1 hour.

抽出後、沈降物を濾過除去又は遠心分１ｌｌ１１除去し
、上澄を透析しそして精製してもよい。多くの公知の精
製システムを異なった原理に基づいて適用し１ｑる。After extraction, the precipitate may be removed by filtration or centrifugation, and the supernatant dialyzed and purified. Many known purification systems are applied based on different principles.

具体的には、例えば電荷量の相違に基づけば、Ｄ　Ｆ　
Ａ　Ｅ　Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ”、　３　ｅｐｈａｃｅｌ
■すなわちＣＭレルロース又はＱΔＥ　Ｓ　ｅｐｈａｄ
ｅＰ）すなわち５ＰＳｅ面ａｄｅｘ■の如きイオン交換
樹脂を精製に用いてよい。Specifically, for example, based on the difference in charge amount, D F
A E S ephadex”, 3 ephacel
■That is, CM lelulose or QΔE S ephad
Ion exchange resins such as 5PSe surface adex (eP) or 5PSe may be used for purification.

分子量の相違及び動水力学的容量の相違に基づけば、ゲ
ル口過及び高性能液体クロマトグラフィーのようなりロ
マトグラフィー技術を利用してもよい。Based on the differences in molecular weight and hydrodynamic capacity, chromatographic techniques such as gel filtration and high performance liquid chromatography may be utilized.

電気泳動移動の相違及び等電点の相違に基づ【ノば、精
製度が高いものを得ることができる。すなわち、Ｓ　ｅ
ｐｈａｄｅｘ０．ポリアクリルアミドゲル等々のような
不活性支持体上での調製用電気泳動法又はプレー１〜も
しくはカラム電気泳動的等電点分画法の如き電気泳動技
術を使用し得る。Based on the difference in electrophoretic migration and the difference in isoelectric point, highly purified products can be obtained. That is, S e
phadex0. Preparative electrophoresis on inert supports such as polyacrylamide gels and the like or electrophoretic techniques such as plate 1 or column electrophoretic isoelectric focusing may be used.

グリシシン含ωに基づ（プば、所望により■ Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｃ　４Ｂの、にうな樹脂に結合した
異なったレクチンの使用を介して、更に精製度の高い１
）のが（ｑられ得る。A more highly purified lectin based on glycicin-containing (if desired) S epharosc 4B can be produced through the use of different lectins conjugated to resins.
) can be (q).

抗−１く抗体を！１産するための上記した方法に於いて
使用されるＦ抗原決定基は、通常の抽出及び精製手法に
従って正常なヒ（−プラズマから得ることができる。Anti-1 antibody! The F antigenic determinant used in the above-described method for producing H. 1 can be obtained from normal human plasma following conventional extraction and purification procedures.

具体的には、例えば、正常なヒトプラズマは、等容量の
過塩素酸又は他の適当な溶媒例えば腺癌１′Ｉ＃Ａから
の１＜／Ｐ抗原況合物の抽出に於ける上記したような溶
媒を用いて抽出され得る。同様に抽出温度１時間もまた
利用１〕得る。　□抽出物を次いで常法に従って透析し
、公知の技術例えば１〕決定基に特異的な抗体を用いる
イムノアフィニディ更に具体的には抗−Ｋ　／　Ｐｋ抗
体、抗−Ｐ噺体・６しくは抗−一抗体に対するイムノア
フイニティク［１７１〜グラフイーににって精製しても
よい。抗原決定基Ｐは該抗体に結合するが、公知の方法
例えば通常の方法に従ってヂオシアネ−１・もしく　ｔ
Ｊ尿素もしくはプロピオン酸を使用して引き―ｔずこと
ができる［Ｊ、　Ｗ、　Ｅｖｅｌｅｉｏｈ、Ｄ、　Ｅ。Specifically, for example, normal human plasma can be prepared using an equal volume of perchloric acid or other suitable solvent such as those described above in the extraction of the 1</P antigen condition from adenocarcinoma 1'I#A. can be extracted using solvents such as Similarly, an extraction temperature of 1 hour is also used. □The extract is then dialyzed in accordance with conventional methods and tested using known techniques such as 1) immunoaffinity using antibodies specific for the determinant, more specifically anti-K/Pk antibodies, anti-P antibody, and may be purified using immunoaffinity [171-Graphei] against anti-monoantibodies. The antigenic determinant P is bound to the antibody by a method known in the art, such as a conventional method.
It can be removed using J urea or propionic acid [J, W, Eveleioh, D, E.

ＬＯＶＶ、、）　、ｏｆ　３ｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　１
３ｉｏｃｈｃｍｉｓｔｒｙ。LOVV,,),of 3olid phase 1
3iochcmistry.

２、４５．１９７７］。2, 45.1977].

所望ならば抗−に抗体を生産するために上記方法に利用
されてもよいＰ抗原決定基は、例えば抗原決定ＩＪＫ及
びＰ′の混合物から得られ得る。例えば前記したように
腺癌組織から抽出したこの混合物は、抗−一抗体が結合
している３　ｅｐｈａｒｏｓＰ４３の如き樹脂を介して
、該混合物の溶液例えばＰＢＳ溶液を溶出さゼることに
よりバイオアブソープションクロマトグラフィーにかけ
られ得る。The P antigenic determinant, which may be utilized in the above method to produce antibodies against, if desired, may be obtained, for example, from a mixture of the antigenic determinants IJK and P'. For example, this mixture extracted from adenocarcinoma tissue as described above can be made into a bioabsorbent by eluating a solution of the mixture, such as a PBS solution, through a resin such as 3 epharos P43 to which an anti-1 antibody is bound. chromatography.

１（ Ｐ抗原決定基は、Ｐ６抗原決定基との交叉反応の結果、
抗−Ｐ抗体を担持する樹脂に結合するようになり、常法
例えば上記したように通常の方法に従ってヂＡシアネー
１〜又は尿素によってそこから引き離される。1 (The P antigenic determinant is a result of cross-reaction with the P6 antigenic determinant,
It becomes bound to the resin carrying the anti-P antibody and is detached therefrom by dioxycyanate or urea according to conventional methods, such as those described above.

抗原ｉ１物質刀な４つら＋＜　、　ｐｋ、　Ｐ″′抗原
決定基及びに／Ｐｋｆ’ｊ原１（１混合物の含ｈｉ叉は
精製度は、常法に従って、それらの］く及び］〕１又は
（〕１免疫学的活性に基づいてラジオ免疫学的に又は免
疫化学的に監視される。具体的には、例えば抗原性物質
のに決定基含宿のラジオ免疫学的調整は、ＲＩ　Ａ　Ｉ
−に←抗−にシステムの結合能に対する該物質によって
引き起こされるＭ害を測定することを介してなされ得る
。Ｒ１へ＋２５ｔ　ｐ−抗−Ｐ’＞ステム又は別個にＲ
ＩＡ　Ｉ−Ｐ＋＝抗−Ｐシステムに対する同様の調整に
より、ＩＡ原性物質のＰ含量又は別個にｐｋ含量を評価
しｊ°７る６ 抗−ビ抗体及び抗−Ｐ抗体は、公知の免疫化技術例えば
抗−Ｋ　／　Ｐｋ抗血清及び抗体を得るために前記した
のと同様の方法で（ｑられる。Antigen i1 substance + <, pk, P''' antigenic determinant and /Pkf'j original 1 (the content or degree of purification of the mixture can be determined according to the conventional method) 1 or (1) monitored radioimmunologically or immunochemically on the basis of immunological activity. Specifically, for example, radioimmunological modulation of determinant inclusion in an antigenic substance is I
This can be done through measuring the M harm caused by the substance to the binding capacity of the system. +25t p-anti-P'>stem or separately R to R1
Similar adjustments to the IA I-P+ = anti-P system assess the P content or separately the pk content of the IA-genic material. Techniques are similar to those described above to obtain anti-K/Pk antisera and antibodies (q.

本発明ににれば、モノク［１−ンな抗−に、抗−ｐｋ及
び抗−一抗体は、モノクローン抗体を調整するために一
般に用いられている公知の手法例えばＫｏｈ＋ｅｒ　ｃ
、及びＭｉｌｓｔｅｉｎＣ，、Ｎａｔｕｒｅ２５６゜４
９５−４９７．１９７５に報告されているような公知の
ハイブリドーマ技術を利用することにより、単一のに、
ＰもしくはＰ″′抗原決定基に対して生産され得る。According to the present invention, monoclonal anti-, anti-pk and anti-1 antibodies can be prepared using known techniques commonly used to prepare monoclonal antibodies, such as Koh+erc
, and Milstein C, , Nature256°4
By utilizing known hybridoma technology as reported in 95-497.1975, a single
It can be produced against the P or P'' antigenic determinant.

本発明によれば、腺癌に特異的な抗原決定基Ｋ又は所望
ならば腺癌上のに決定基に阻隔する抗原決定基ｐｋを明
らかにするため又は定量するために、抗原の決定に対す
る公知の方法例えばラジオイムノアッセイ（ＲＴＡ＞、
エン１ｆイムイムノアツセイ（ＥＴＡ）、イムノフルオ
レセンス、イムノルミネヒンス、イムノディヒコージョ
ン又はイムノエレク１〜ロフＡレシス法を利用し得る。According to the invention, in order to reveal or quantify the antigenic determinant K specific for adenocarcinoma or, if desired, the antigenic determinant pk that inhibits the determinant on adenocarcinoma, the known methods such as radioimmunoassay (RTA),
An immunoassay (ETA), immunofluorescence, immunoluminescence, immunodeficiency, or immunoelectrolysis method may be utilized.

上記した公知方法のいずれかに於いて、ラベルしていな
い形態か又はラベルしでいる形態の抗原決定ＭＫ、Ｐｋ
及びＫ　／　Ｐｋ抗原性混合物並びにラベルされている
か又はラベルされていない抗体の１つ又はそれ以上を利
用すれば、腺癌どして知られているに１・腫瘍病理の早
］！ＩＩ診断が可能になる。In any of the above-mentioned known methods, antigen determination MK, Pk in unlabeled or labeled form
and K/Pk antigenic mixtures and one or more of labeled or unlabeled antibodies can be used to rapidly develop tumor pathology known as adenocarcinoma! II diagnosis becomes possible.

ラベルされＩこ抗原、抗原決定基、抗原性混合物又は抗
体とはそれぞれ、何がしかのタッグシステムによってタ
ッグされた抗原、抗原決定基、抗原性混合物又は抗体の
ことである。このタッグは例えばラジオアイソ１−一ブ
、酵素、螢光物質又は発光物質である。タッグ覆るため
には例えば抗体をラベルするためのいずれかの公知の及
び通常の方法を用いればＪ、い。Labeled antigen, antigenic determinant, antigenic mixture or antibody respectively refers to an antigen, antigenic determinant, antigenic mixture or antibody tagged by some tag system. This tag is, for example, a radioisomer, an enzyme, a fluorescent substance or a luminescent substance. To coat the tag, for example, any known and conventional method for labeling antibodies can be used.

例えば　■又は　Ｉラジオアイソト−プを用いてラベル
するためには、り［ｉラミンＴもしくはラクトバーオキ
シダー１’（＋−ＰＯ）技術［Ｎ　ａｔｕｒｅ１９４、
４９５．１９６２あるいはＩ３１ｏｃｈ、Ｂ　１ｏｐｈ
、　Ａ　ｃｔａ２５１、３６３．１９７１］又はその変
形法を使用すればよい。あるいはまた、ポルトン（Ｂｏ
ｌｔｏｎ　）及びハンター（１−口＋ｎｔｃｒ　）試薬
［Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、Ｊ　、　１３３゜５２９、１９７
３］を使ってもＪζい。For example, in order to label using the or I radioisotope, the R[i lamin T or lactover oxidizer 1' (+-PO) technique [Nature 194,
495.1962 or I31och, B 1oph
, Acta 251, 363.1971] or a modified method thereof. Alternatively, Polton (Bo
lton) and Hunter (1-port + ntcr) reagent [Biochem, J, 133°529, 197
3] is also used.

例えば酵素を用いてラベルするためには、「ＥＢＳ　Ｌ
ｅｔｔｅｒ　９５．３１１．１９７８又はＪ　、　ｌ−
１ｉｓｔｏ−ｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｃｍ、　２２．
１０８４．１９７４に報告されている技術を用いること
ができる。For example, in order to label using an enzyme, "EBS L
etter 95.311.1978 or J, l-
1isto-chem, Cytochcm, 22.
1084.1974 can be used.

腺癌の診断にラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いる
場合、任意のＲＩＡ技術［例えばＣｌ１ｎ。When using radioimmunoassay (RIA) for the diagnosis of adenocarcinoma, any RIA technique [e.g. Cl1n.

Ｃｈｅｍ、　１９　：　１４６．１９７３］を用いるこ
とができる。Chem, 19: 146.1973] can be used.

具体的には、例えば、腺癌に特異的な抗原決定基Ｋ又は
腺癌上にある該Ｋに阻隔する抗原決定基Ｐのそれぞれは
、一定量の抗−Ｋ又は別個に抗−ビ抗体との反応に於い
て、既知量のラジオアイソトープでラベルされた例えば
　Ｉ又は　Ｉでフンオヨード化されたＫもしくは別個に
ｐｋ抗原決定基又はに／Ｐ″抗ｔｒ；ｒ　ｉＩｌ混合物
と競合さけることにより、例えば生物学的体液Ｉ；１、
組織抽出物に於いて定損され得る。該競合１５（応を常
法通り、例えば約４℃から約４０℃の稿磨好ましくは室
温で約６〜９０時間好ましくは約１！１〜１６時間イン
キコベーションすることによつ（行ない１ｇる。Specifically, for example, each of the adenocarcinoma-specific antigenic determinant K or the K-blocking antigenic determinant P on the adenocarcinoma is treated with a certain amount of anti-K or separately with an anti-bi antibody. In the reaction, for example, by avoiding competition with known amounts of radioisotope-labeled, e.g. Biological body fluids I; 1,
Can be determined in tissue extracts. The Competitor 15 (competitor 15) is prepared in a conventional manner, such as by inkovating at about 4° C. to about 40° C., preferably at room temperature, for about 6 to 90 hours, preferably for about 1.1 to 16 hours. Ru.

抗体に結合しでいる抗原フラクションを次いで非結合フ
ラクションから分＃ｌｌハ結合フラクション及び７／又
は非結合フラクション中の放射能を測定り−る。The antigen fraction bound to the antibody is then separated from the unbound fraction and the radioactivity in the bound and/or unbound fractions is determined.

結合抗１１：【フラクションの非結合フラクションから
の分離は、公知方法例えば第１抗体なすわち抗−Ｋ又は
抗−ｐｋ抗体を生じ」去しめられた種族のイムノグロブ
リンに特異的な抗体を利用することによって行なうこと
ができる。Bound anti-11: [Separation of the fraction from the unbound fraction is carried out using known methods, e.g., using antibodies specific for the immunoglobulin of the depleted species to generate the first antibody, i.e., anti-K or anti-pk antibody. This can be done by doing.

結合及び非結合フラクションの放射能は例えば標準１く
又は標準１〕２を用いてトレースされた標準曲線によっ
て評価し得る。あるいは、ラジオラベルされたＫまたは
Ｐｋ又はＫ　／　Ｐｋの抗−Ｋ又は抗−１抗体との結合
能に於ける牛じ１ｑるであろうと思われる低下を直接的
に測定することによっても前記放射能を評価覆ることが
できる。この場合、例えば結合フラクションで測定され
た放射能の低下は、ザンプルのｌく又はＰ’１度に比例
する。The radioactivity of the bound and unbound fractions can be assessed, for example, by means of a standard curve traced using Standard 1 or Standard 1]2. Alternatively, radiolabeled K or Pk or K/Pk can be detected by directly measuring the likely decrease in the binding ability of radiolabeled K or Pk or K/Pk to anti-K or anti-1 antibodies. ability can be over-evaluated. In this case, the decrease in radioactivity measured, for example, in the bound fraction is proportional to the sample length or P'1 degree.

腺癌の診断にエンザイムイムノアッセイ法を利用する場
合、例えばＪ　、ｌ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１０９．１
２９゜１９７２に記載されているように、酵素ラベルを
用いるいずれかの公知の免疫学的方法を応用しくｑる。When enzyme immunoassay method is used for diagnosis of adenocarcinoma, for example, J, Immunology 109.1
29, 1972, any known immunological method using enzyme labels may be applied.

多くの酵素がラベルとして成功裡に使用され得るが、特
に好ましい酵素は例えばパーオキシダーゼ、β−ガラク
トシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びグルコースオ
キシダーゼである。Although many enzymes can be successfully used as labels, particularly preferred enzymes are, for example, peroxidase, β-galactosidase, alkaline phosphatase and glucose oxidase.

具体的には、例えば、利用できるエンザイムイムノアッ
セイ手法に従えば、生物学的体液又は組織抽出物からの
一リンプルの抗原決定基１〈又はＰはＥＩＡ→Ｊンドイ
ップタイプの手法にＪ：つて定量化され得る。［Ｅ　Ｉ
　Ａ−’Ｊンドイッチ法に於いては、ポリエチレンビー
ズのＪ：うな固形支持体上に化学的に結合されでいるか
又は受動的に吸着されている抗−］く又【、Ｊ、別個に
抗−Ｐｋ抗体と該勺ンプルとを例えばインキュベーショ
ンにより反応させる。洗浄により過剰量の反応剤を除去
した後、酵素ラベルした抗−Ｋ又は別個に抗−ｐｋ抗体
、例えばＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　９５．３１１−３
１３．１９７８に記載されている方法に従って得られる
β−ガラクトシダーゼラベルした抗体を加える。更に洗
浄した後、適当な酵素基質例えばβ−ガラクトシダーゼ
を酵素ラベルとして用いる場合には０−ニトロフェニル
−ガラクトピラノシドを加え、発色した色を測定する。Specifically, for example, according to available enzyme immunoassay techniques, one sample of antigenic determinant 1 from a biological fluid or tissue extract can be quantified using EIA→J dip-type techniques. can be converted into [E I
In the A-'J switch method, polyethylene beads are chemically bonded or passively adsorbed onto a solid support, and the anti- The Pk antibody and the sample are reacted, for example, by incubation. After removing excess reagents by washing, enzyme-labeled anti-K or separately anti-pk antibodies, e.g. FEBS Letters 95.311-3
13.1978 is added. After further washing, a suitable enzyme substrate such as 0-nitrophenyl-galactopyranoside is added when β-galactosidase is used as an enzyme label, and the color developed is measured.

該色の強度が、１ノンプル中のＫ又は別個に一抗原決定
基の潤度に比例する。The intensity of the color is proportional to the abundance of K in a sample or separately to an antigenic determinant.

、ｊＭ：ｌ　一 本発明にお（プる組織化学的応用にあっては、抗−Ｋ又
は抗−一特異的抗体によって組織的学的標本上に抗原決
定１ｉ　Ｋ又はｐｋを局在化させるために、任意の公知
のイムノヒストケミカル法［ＨｕｍａｎＰａｔｌＴＯｌ
ｏｏＶ　１２．５９０−５９６．１９８１］を利用し得
る。. For this purpose, any known immunohistochemical method [HumanPatlTOl
ooV 12.590-596.1981].

組織学的決定は、常法に従−）で凍結した又は通常固定
した及び包埋されたｌｆｌ　ｔｔＡ切片上で行なわれ得
る。Histological determinations can be performed on frozen or conventionally fixed and embedded lfl ttA sections according to conventional methods.

具体的には、例えば水性バッファー中室温で該切片を抗
−Ｋ又は別個に抗−Ｐ惰体と共にインキコベートし、Ｋ
又は別個にｐｋ抗原決定基が存在する勺−イトに抗−Ｋ
又は別個に抗−一抗体が固定されるようにする。次いで
咳払−Ｋ又は該抗−Ｐ１第１抗体が生じた種族のイムノ
グロブリンに特異的なラベルした抗体との続く反応例え
ばインキュベーションにより、前記固定された抗体の存
在を確認する。Specifically, the sections are inked with anti-K or separately with anti-P inerts, e.g. in an aqueous buffer at room temperature, and K
Alternatively, anti-K antigens can be added to antibodies in which the pk antigenic determinant is present.
Alternatively, the anti-one antibody may be immobilized separately. The presence of the immobilized antibody is then confirmed by subsequent reaction, eg, incubation, with a labeled antibody specific for cough-K or the immunoglobulin of the species against which the anti-P1 first antibody was raised.

３４− ＋ｆｆｆ記ラベシラベル抗体は既知のラベルを用いる公
知方法により調整され１ｒ、する。既知のラベルとして
、例えば、パーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、
アルカリホスファターげ、グルコースオキシダーゼ、Ｐ
Ａｆ−）パーオキシダーゼ−抗バーオキシダーＵ複合体
の、Ｊ：うな酵素−抗酵素複合体の如き酵素；フルＡし
１２イン又はロダミンの如き螢光分子；又はここに記載
したような酵素又は螢光物質にアヴイジンがそれ自体結
合しているビＡヂンーアヴイジン（１１ｉｏｔｉｎ−Δ
ｖｉｄｌｎ　）システム等々を挙げることがｐ　（Ｘる
。34-+fff Labeled antibodies are prepared by known methods using known labels. Known labels include, for example, peroxidase, β-galactosidase,
Alkaline phosphatase, glucose oxidase, P
Af-) enzymes such as peroxidase-anti-peroxidase U complex, J:enzyme-antienzyme complex; fluorescent molecules such as flu-A-12-12in or rhodamine; or enzymes or fluorescers as described herein. Vividin-Avidin (11iotin-Δ) in which Avidin itself is bound to a substance
vidln) system and so on.

組織学的標本の最後に行なう顕微鏡分析により、探査し
ているＫ又はｐｋ抗原決定基が存在しているサイ１へが
明らかになる。決定に於いて螢光性ラベルを用いたなら
ば螢光リイトが観察され、使方決定に於いて酵素ラベル
及びそれに特異的な発色性基質を用いたならば発色した
゛リイトが観察される。Final microscopic analysis of the histological specimen reveals the presence of the K or pk antigenic determinant being probed. If a fluorescent label is used in the determination, fluorescent lights will be observed, and if an enzyme label and its specific chromogenic substrate are used in the usage determination, colored lights will be observed.

ｌ　織切片上のＫ又はｐｋ抗原決定基を組織化学的に検
出するための特に有用なシステムは、ラベルどしてのβ
−ガラクトシダーゼ酊素と酵素の発色性基質としての５
−ブロモ−４−クロロ−インドリル−ガラクトシドのよ
うなインドリル−ガラクトシドを含む。例えばＨｉｓｔ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　７６、１５３−１５８、１９８
２に記載されているようなイムノーガラク］・シダーゼ
技術をこのような決定のために用いてよい。A particularly useful system for histochemically detecting K or pk antigenic determinants on tissue sections is
- 5 as a chromogenic substrate for galactosidase and enzymes
-Indolyl-galactosides such as -bromo-4-chloro-indolyl-galactoside. For example, Hist
chemistry 76, 153-158, 198
Immunogalac] sidase technology, such as that described in 2, may be used for such determinations.

しかしながら、既に述べたＪ：うに、上記したイムノア
ッセイ手法に加えて、本発明に於いては生物学的体液又
は組織抽出物もしくは切片中の腺癌特異的に抗原決定基
又は阻隔するｐｋ抗原決定基を検出するために、任意の
その他の免疫学的方法を使用してもよい。However, in addition to the above-mentioned immunoassay method, the present invention uses adenocarcinoma-specific antigenic determinants or blocking pk antigenic determinants in biological body fluids or tissue extracts or sections. Any other immunological method may be used to detect.

また既に述べたように、ヒ１〜腺癌の診断のための方法
に加えて、本発明は該方法を実施するための反応剤シス
テムを提供するものである。Also, as already mentioned, in addition to a method for the diagnosis of human adenocarcinoma, the present invention provides a reactive agent system for carrying out the method.

分析方法が巽なればそれに応じて異なった反応剤システ
ムが用意されイＨ“ノればならないが、Ｋ抗原決定基の
検出用反応剤システムは常に必須成分として抗−１〈特
）■内払体を含み、Ｐｌｃ抗原決定基の検出用反応剤シ
ステムは必須成分どして抗−ｐｋ抗体を含む。各反応剤
システムは、各反応剤システムが意図する分析方法に応
じて各反応剤システム間で相互に胃なり得る他の成分を
更に含む。これらの追加的成分は、例えばラベルされた
Ｋ又はＰ′抗原決定阜、ラベルされたＫ　／　Ｐ’抗原
性混合物。As analytical methods evolve, different reagent systems must be prepared accordingly, but the reagent system for detecting K antigen determinants always contains anti-1 (special) ■ internally administered body as an essential component. The reagent system for the detection of Plc antigenic determinants contains an anti-PK antibody as an essential component. It further includes other components that may be compatible with each other. These additional components include, for example, labeled K or P' antigenic determinants, labeled K/P' antigenic mixtures.

ラベルされた抗−Ｋ又は抗−ｐｋ抗体又は前記抗−Ｋ又
は抗−ＰＩ（抗体が生じた種族のイムノグロブリンに特
異的なラベルされた抗体のなかから選択され得る。The antibody may be selected from a labeled anti-K or anti-pk antibody or a labeled antibody specific for the immunoglobulin of the species in which the antibody was raised.

更に、ぞの他の成分例えばＢ−Ｆ分−ｔシステム。Additionally, other components such as the B-F min-t system.

コン１〜ロール、標準、バッファー、安定化剤、抗菌剤
、張力作用１／ｌ物質、酵素基質及び活性化剤を任意に
又は任意ではなしに本発明反応剤システムに存在させる
ことは可能である。Controls, standards, buffers, stabilizers, antimicrobial agents, tension-acting 1/1 substances, enzyme substrates and activators can optionally or not be present in the reactant system of the invention. .

具体的には、例えば、本明細書に於いて上記したＲＩＡ
の手法に従って生物学的流体又は組織抽出物中に１〈又
はＰ−原決定材を検知するためのラジオイムノアッセイ
法にあっては、有効な反応剤システムは、 １）抗−Ｋ又は別個に抗−ｐｋ抗体； ２）ラジオラベルされたＫもしくは別個にＰ’ｆｆｉ原
決定基又はラジオラベルされたＫ　／　Ｐｋ抗原性混合
物； ３）コントロール：及び ４）バッファー から本質的になるキットであり得る。Specifically, for example, the RIA described above in this specification
In a radioimmunoassay method for detecting 1 or P-initiating agents in biological fluids or tissue extracts according to the method of 1) anti-K or separately anti- - a pk antibody; 2) a radiolabeled K or separately P'ffi prototypical determinant or a radiolabeled K/Pk antigenic mixture; 3) a control; and 4) a buffer.

このキットは、成分１）の抗−Ｋ又は別個に抗−Ｐ５休
が生じた種のイムノグロブリンに特異的な第２抗体を追
加的に、及び張り作用性物質及び／又は安定化１〕シ＜
は抗菌剤を任意に含むことができる。This kit additionally contains component 1) a second antibody specific for the immunoglobulin of the anti-K or separately anti-P5 species, and a tonicity agent and/or stabilizing agent 1] <
may optionally contain an antimicrobial agent.

キット成分２）のラジオラベルしたＫ又はｐｌｃ又はＫ
　／　Ｐｋは例えばラジＡアイソｉ〜−プ１２９Ｉまた
は１３１１でラベル化した１〈又１．Ｊ　ｌ）’、に１
ごはに／Ｐｋである。Kit component 2) radiolabeled K or plc or K
/Pk is, for example, 1<or 1. labeled with Radius A iso i~-p129I or 1311. J l)', 1
It's rice/Pk.

コン１〜ロール３）は少なくとも１つのネガティブコン
１〜ロールと１つのポジティブコントロールを含み、バ
ッファー４）は例えばｐｌ−１約６．５〜８好ましくは
約７６２を持ついかなるバッファーを含んでもよい。Controls 1 to 3) include at least one negative control and one positive control, and buffer 4) may include, for example, any buffer with a pl-1 of about 6.5 to 8, preferably about 762.

張力作用性物質は、例えばＴｗｅｅｎ　２０又は８０゜
Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ２Ｏ，Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　１００の
如ぎものである。Tension-acting substances are, for example, Tween 20 or 80° Nonldet P2O, Triton X 100.

安定化剤は例えばウシ内情アルブミン、ゼラチンのよう
なものである。抗菌剤は例えばナトリウムアジ化物であ
る。Stabilizing agents include, for example, bovine albumin and gelatin. Antibacterial agents are, for example, sodium azide.

バッファーは例えば燐酸バッファーで、塩化ナトリウム
のにうな無機塩類と混合されていてもにい。The buffer may be, for example, a phosphate buffer, mixed with an inorganic salt such as sodium chloride.

特に好ましい態様においては、Ｋ又はＰ１抗原決定基の
ＲＩＡ検出用キットは以下のものを含んでいる。In a particularly preferred embodiment, a kit for RIA detection of K or P1 antigenic determinants comprises:

１）−１１１１−１が約６．５〜約８好ましくは約　７
．２であり且つモル濃度が約２０ｍＭから約１５０ｍＭ
好ましくは約７０ｍＭである燐酸バッファー　モル濃度
が約２０ｍＭから約１５０ｍＭ好ましくは約７０ｍＭで
ある塩化ナトリウム−モル濃度が約２５ｍＭから約５０
ｍＭ好ましくは約３３ｍＭであるＥＤＴＡ二ナトリウム 一　モル濃度が約１５ｍＭから約５０ｍＭ好ましくは約
３１＋＋＋Ｍであるナトリウムアジ化物−容吊対容吊淵
疫が約０．０５％から約０．５好ましくは約０．１％の
ヤギの正常自消の混合物中に適切に希釈された、ヤギに
おいて生じさせられた抗−Ｋまたは抗−ｐｋｋ体２）−
−１１１−１約６．５から約８の間、好ましくは約７．
２をもつ、モル濃度が約２０ｍＭから約１５０ｍＭりＹ
ましくは約７０Ｊｙｌの燐酸バッファー　モル濃度が約
２０１１１Ｍから約１５Ｏｎ＋Ｍ好ましくは約７０ＩＩ
ＩＭの塩化ナトリウム−モル濃度が約１５１１１Ｍから
約５０１ｎＭ好ましくは約３１１１１Ｍのす］−リウム
アジ化物−重量対審用濃度が約０．１％から約１％好ま
しくは約０．４％のウシ面清アルブミンを含む参照バッ
ファー（抗体←ンラジオラベルした抗原システムの最大
結合能を測定するのに用いる） −４１−、、、、。1) -1111-1 is about 6.5 to about 8, preferably about 7
．． 2 and the molar concentration is about 20mM to about 150mM
Phosphate buffer, preferably about 70mM; Sodium chloride, preferably about 70mM; molarity about 25mM to about 50mM;
disodium EDTA, which is preferably about 33 mM; sodium azide, whose molar concentration is about 15 mM to about 50 mM, and preferably about 31 +++ M; Anti-K or anti-pkk antibodies raised in goats, appropriately diluted in a mixture of 0.1% goat normal autoimmune 2)-
-111-1 between about 6.5 and about 8, preferably about 7.
2, with a molar concentration of about 20 mM to about 150 mM Y
preferably about 70 Jyl of phosphate buffer, with a molar concentration of about 20111M to about 15On+M, preferably about 70II
IM Sodium Chloride - molar concentration from about 15111 M to about 501 nM, preferably about 31111 M] - Lium azide - bovine serum albumin at a weight relative concentration of about 0.1% to about 1%, preferably about 0.4% Reference buffer containing (used to measure the maximum binding capacity of the antibody radiolabeled antigen system) -41-, .

３））茄度１．５ｍｇ／ｍＱテ比活性が約６０ｍＣ１／
ｍｇになるように参照バッファー２）に希釈された１″
Ｉラジオヨード化した１〈又はｐｋ抗抗原決定文はＫ　
／　Ｐｋｋ原性混合物を含むラベルしたｉ〜レーナー。3)) Potency: 1.5 mg/mQ Tei specific activity is approximately 60 mC1/
1″ diluted in reference buffer 2) to mg
I radioiodinated 1 or pk anti-antigen determinant is K
/ Labeled i~Lehner containing Pkkogenic mixture.

４）　参照バッファー２）中に適切に希釈された沈澱性
抗血清拭−ヤギー免疫グロブリン。4) Precipitated antiserum wipe-goat immunoglobulin appropriately diluted in reference buffer 2).

５）　ネガティブコントロール：本テストに対してネガ
ティブなヒトのプラスマ即ち正常ヒトプラズマ。5) Negative control: human plasma negative for this test, ie normal human plasma.

６）　ポジティブコントロール二本テストに対してポジ
ティブなヒトのプラスマ即ちＫ又は虻抗原決定基又はＫ
　／　Ｐｋｋ原性混合物の既知量が加えられている正常
ヒトプラズマあるいは腺癌患者からのヒトのプラズマ。6) positive control double test positive human plasma or K or horsetail antigenic determinant or K
/ Normal human plasma or human plasma from an adenocarcinoma patient to which a known amount of a Pkkagenic mixture has been added.

この明細書に於いて前述したｕＡサンドイッチ法による
生物学的流体または組織抽出物中のに４２− 又はｐｋ抗原決定基の検出用１−ン１Ｆイムイムノアッ
セイにあっては、例えば以下のｂのを本質的に含む反応
剤システムが用いられる。In the 1-1F immunoassay for detection of 42- or pk antigenic determinants in biological fluids or tissue extracts by the uA sandwich method described above in this specification, for example, the following b. An essentially containing reactant system is used.

１）　固体相に結合した抗−］く又は別個に抗−ｐｋ抗
体 ２）　抗−１〈又は別個に抗−１〕５抗体に結合された
酵素 ３）酵素基ｖ′Ｊ ４）コントロール ５）バラノア− 該反応剤システムは追加的に例えば酵素反応のブロッキ
ング剤のにうなぞの他の成分用には既述のように張力作
用ｆノ１物質、安定化剤、抗菌剤、酵素活性化剤のよう
イｒものを含んでもよい。1) Anti-pk antibody bound to solid phase or separately 2) Enzyme bound to anti-1 [or separately anti-1]5 antibody 3) Enzyme group v'J 4) Control 5) Balanoa - The reactant system may additionally contain other components such as blocking agents for enzymatic reactions, such as tension-acting substances, stabilizers, antibacterial agents, enzyme activators, as already mentioned. It may also include things like.

成分１）の抗−Ｋ又は抗−ｐｋ抗体は例えばポリスチレ
ンビーズに吸指される。The anti-K or anti-pk antibody of component 1) is, for example, absorbed onto polystyrene beads.

酵素結合成分２）は例えば本明細書に記ｊボされた既知
の操作法ににすβ−ガラクトシダーゼ酵素と結合された
抗−Ｋ又は抗−ｐｋ抗体である。Enzyme-binding component 2) is, for example, an anti-K or anti-pk antibody conjugated to the β-galactosidase enzyme using known procedures as described herein.

酵素基質成分３）は例えば成分２〉の酵素に特異的な任
意の発色性基質であり得る。酵素としてβ−ガラク１〜
シダーゼを用いるならば、適当な発色性基質は例えばＯ
−二１〜ロフェニルガラクトピラノシドである。Enzyme substrate component 3) can be, for example, any chromogenic substrate specific for the enzyme of component 2>. β-galac 1 as an enzyme
If a sidase is used, a suitable chromogenic substrate is e.g.
-21~ lophenylgalactopyranoside.

］ン１〜ロール４）とバッファー５）はＲ■Δキットに
おいて既に指摘したＪ：うなものである。] N1 to Roll 4) and Buffer 5) are the same as those already pointed out in the R■Δ kit.

酵素反応の可能なブロッキング剤は、例えばβ−ガラク
トシダーゼが酵素として用いられる場合には、炭酸す１
〜リウムのようなアルカリ金属の炭酸塩である。For example, when β-galactosidase is used as the enzyme, a blocking agent capable of enzymatic reaction is carbonic acid 1
~It is a carbonate of an alkali metal such as lium.

特に好ましい態様においては、上述のＫ又はｐｋ抗原決
定基のＥＩＡサンドインチ法検法用出用キット下のもの
を含／υである。In a particularly preferred embodiment, the above-mentioned K or pk antigenic determinant EIA sandwich assay kit includes:

１）　ポリスチレンビーズ上に吸着された抗−Ｋ又は別
個に抗−ｐｋ抗体； ２）　以下を含む希釈バッファー −１）　１１が約６．５から約８好ましくは約７．２を
もち、モル製電が約５０１１１Ｍから約１５０ｍＭ好ま
しくは約７０ｍＭの燐酸バッファー　モル淵１良が約５
０１１１Ｍから約１５０ＩＩＩＭ好ましくは約７０１１
１Ｍの塩化ナトリウム−モルｉ！Ｊ度が約１５ｍＭから
約５０ｍＭ好ましくは約３１１Ｍのナトリウムアジ化物
−重吊対審吊１１ｉ１度が約０．５％から約３％好まし
くは約１％のウシアルブミン ３）　バッファー２）に適切に希釈されたβ−ガラク１
〜シダー１結合抗−Ｋ又は別個に抗−耐抗体； ４）−［ル淵１αが約２ｍＭから約４１１Ｍ好ましくは
約２．３１１１Ｍの０−二トローフェニルガラクトピラ
ノシドニ ー１１１−１が約６．５から約８好ましくは約　７．２
をもち、モル温度約１０ｍＭから約３０ｍＭ好ましくは
約１５ｎ＋Ｍの燐酸バッファー；を含む酵素基質。1) Anti-K or separately anti-PK antibody adsorbed onto polystyrene beads; 2) Dilution buffer containing - 1) 11 having about 6.5 to about 8 preferably about 7.2, made by Mol. Phosphate buffer with a voltage of about 50111M to about 150mM, preferably about 70mM.
0111M to about 150IIIM preferably about 7011
1M sodium chloride - mole i! Sodium azide with a J degree of about 15mM to about 50mM, preferably about 311M - bovine albumin with a J degree of about 0.5% to about 3%, preferably about 1%, diluted appropriately in buffer 2) β-galak 1
~Cedar 1 conjugated anti-K or separately anti-antibodies; 4) -[LeFuchi 1α is about 2mM to about 411M, preferably about 2.3111M O-ditrophenylgalactopyranosydney 111-1 is about 6 .5 to about 8 preferably about 7.2
a phosphate buffer having a molar temperature of about 10mM to about 30mM, preferably about 15n+M;

５）−モル温度約０．２５Ｍから約２Ｍ好ましくは約１
Ｍの炭酸ナトリウムを含む酵素反応のブロッキング剤 ６〉　ネガティブコントロール：本テストに対してネガ
ティブなヒトのプラズマ即ち正常ヒトプラズマ フ）　ポジティブコントロール：本テストに対してポジ
ティブなヒトのプラズマ即ち腺癌患者からのヒトのプラ
ズマ又は既知量のＫ又はｐｋ抗原決定基又はＫ　／　Ｐ
’抗原性混合物が加えられである正常ヒトプラズマ。5) - Molar temperature from about 0.25M to about 2M preferably about 1
Enzyme reaction blocking agent containing sodium carbonate of M6〉 Negative control: Human plasma negative for this test, i.e. normal human plasma) Positive control: Human plasma positive for this test, i.e. from an adenocarcinoma patient of human plasma or known amounts of K or pk antigenic determinants or K/P
'An antigenic mixture is added to normal human plasma.

本明細書中に於いて既述した方法による組織切バエの１
く又はｐｋ抗１１１決定基の組織化学的分析にあっては
有用イ【反応剤システムは例えば本質的に以下のものを
含む−１，ツトである。1 of tissue-cut flies according to the method already described in this specification.
The reactant system may be useful in the histochemical analysis of anti-pk or anti-111 determinants.

１）　抗−１〈又は別個に抗−ｐｋ抗体；２）　成分　
１）の抗−１く又は別個に抗［す抗体が生じた種の免疫
グ（］プリンに対して特異的な酵素でラベルされた抗体
： ３）　酵素基質；及び ４）　バッファー 例えば可能な妨害的非特異的相互作用を除去するための
ブ［１ツキング剤、対比発色剤（核に対する）のような
その他の成分も上記の４ニツトに含有することができ、
更には既に述べられたように張力作用性物質、安定化剤
、抗菌剤、酵素活性化剤のようなものも加えることがで
きる。1) Anti-1 or separately anti-PK antibody; 2) Components
1) an enzyme-labeled antibody specific for the immunogupine of the species against which the anti-1 antibody was raised; 3) the enzyme substrate; and 4) a buffer such as a possible interference. Other ingredients such as a blocking agent, a contrasting coloring agent (for the nucleus) to eliminate non-specific interactions can also be included in the above 4 nitrogens,
Furthermore, as already mentioned, tension-affecting substances, stabilizers, antibacterial agents, enzyme activators, and the like can be added.

上記の反応剤システムにおいて、抗−Ｋ又は抗−聞抗体
は例えばトギに由来Ｊるものであり、成分２）の抗体は
抗−Ｖギー免疫グロブリン抗体であってもＪ：り、また
例えばロバにおいて生じせしめられてもＪ：い。成分２
）の酵素ラベルした抗体は例えば既述の公知技術により
得られたβ−ガラク］〜シダーゼ標識化抗体である。In the above reactant system, the anti-K or anti-human antibody is, for example, one derived from Togi, and the antibody of component 2) may be an anti-V Gi immunoglobulin antibody. Even if it occurs in J: Yes. Ingredient 2
) The enzyme-labeled antibody is, for example, a β-galac-sidase-labeled antibody obtained by the known technique described above.

酵素基質成分３）は成分２）の酵素に特異的な基質のい
ずれでもよく、酵素の作用にＪ、り着色し、不溶の生成
物を生ずることのできるいかなる基質でもにい。もしも
β−ガラクトシダ＝１が酵素として用いられるならば、
有用な発色性基質は例えばインドリルーガラク１ヘシド
特に５−ブロモ−４＝クロロ−インドリル−ガラクトシ
ドである。Enzyme substrate component 3) can be any substrate specific for the enzyme of component 2), and can be any substrate that is capable of producing a colored and insoluble product upon the action of the enzyme. If β-galactocida=1 is used as an enzyme,
Useful chromogenic substrates are, for example, indolyl-galac-1-heside, especially 5-bromo-4-chloro-indolyl-galactoside.

バッファーは例えばｐｌ−１約６．５から約８好ましく
は約７．３をもつ燐酸バッフ１−またはトリスバッファ
ーである。The buffer is, for example, a phosphate buffer 1- or a Tris buffer with a pl-1 of about 6.5 to about 8, preferably about 7.3.

おそらく非特異的相互作用からの妨害を除去するために
必要とされるであろうブロッキング剤は、例えば成分２
）の抗体がロバから由来する場合には正常の［−１バの
血清である。Blocking agents that would probably be needed to remove interference from non-specific interactions are e.g. component 2.
) is derived from donkeys, it is normal [-1 Ba serum.

対比発色剤は例えばカルミニン酸を含む。Contrasting color formers include, for example, carminic acid.

特に好ましい態様に上れば、組織切片上〇に或いはｐｋ
抗原決定基の組織化学的検知用４ニツトは以下のものを
含む：　［ｉＩＩら、 １）−ｐｌ−１約６．５から約８好ましくは約　７．３
をもち、モル濃度が約５１１１Ｍから約１００ｍＭ好ま
しくは約１０　Ｉｎ　Ｍであるトリスまたは燐酸バッフ
ァーおよび −モル温度約５０１１１Ｍから約２００１１１Ｍ好まし
くは約１５０ｍＭの塩化ナトリウム を含む洗浄バッファー ２）　上記１）による洗浄バッフ１−と同じ成分を含み
、更に容品対審吊濶度で約１％から約５％好ましくは約
３％のの正常ロバ血清を含むブロツ゛１ニングバッファ
− ３）　上記１）のバッファー中に適切に希釈したヤギに
生じさせた抗−Ｋ又は別個の抗−Ｐ１抗体 ４）」−配置）のバッファー中に適切に希釈したロバに
おいて生じさじた抗（７ギ免疫グロブリン抗体どβ−ガ
ラクトシダーゼとの結合体 ５）　以下を含む酵素基質 −ｐｌ−１約　７から約８好ましくは約　７．４で、モ
ル瀧疫が約５ｍＭから約５０１１１Ｍ好ましくは約１０
ｍＭの燐酸バッファー −モル濃度が約５１１１Ｍから約５（ＩＩＩＩＭ好まし
くは約１０ｍＭの塩化ナトリウム −モル濃度が約０．１１１１Ｍから約２ｍＭ好ましくは
約１ｍＭの塩化マグネシウム −モル濃度が約０．５１１１Ｍから約５ｍＭ好ましくは
約１ｍＭの５−ブロモ−４−クロローインドリルガラク
１ヘシド ー　［ルｉＩｉ！ＩＣ［が約３ｍＭから約１０ｍＭ好ま
しくは約（ｉｍＭのカリウムフＪロシ）７ナイドーＴ−
ル濶１！：［約：＋　ｍ　Ｍから約ｉｏｍＭｇ７ましく
は約６ｍＭのカリウムフ、［リシアナイド６）　以下を
含む対比発色剤 −約１ｇ／ｌから約１０ｆｌ／　Ｉｌ好ましくは約２．
５（１／　ｐの小量／容吊濃度のカルミニン酸−モルｉ
ｎが約２４ｉ　ＩＩＩ　Ｍから約１５０ｍＭ好ましくは
約５０ｍＭ（ｒ）ｔ＋Ｘｔ酸アルミニウムカリウム。In a particularly preferred embodiment, on the tissue section or pk
4 nits for histochemical detection of antigenic determinants include: [III et al., 1)-pl-1 about 6.5 to about 8 preferably about 7.3
2) a washing buffer comprising a Tris or phosphate buffer having a molar concentration of about 5111M to about 100mM, preferably about 10InM, and a molar temperature of about 50111M to about 200111M, preferably about 150mM; 2) washing according to 1) above; A blotting buffer containing the same components as Buffer 1 and further containing normal donkey serum in an amount of about 1% to about 5%, preferably about 3% in terms of product tolerance. 3) In the buffer of 1) above. Anti-K or separate anti-P1 antibodies raised in goats appropriately diluted or anti-P1 antibodies raised in donkeys appropriately diluted in a buffer of Conjugate 5) Enzyme substrate comprising - pl-1 of about 7 to about 8, preferably about 7.4, with a molar density of about 5mM to about 5011M, preferably about 10
Phosphate buffer in mM - molar concentration from about 5111M to about 5 (IIIM) preferably about 10mM Sodium chloride - molar concentration from about 0.1111M to about 2mM Magnesium chloride - molar concentration preferably from about 0.5111M to about 5mM Preferably about 1mM 5-bromo-4-chloroindolylgalac 1hesido [ruii!
Le 1! : [approximately: + mM to about iomMg7 or about 6mM potassium chloride, [lysyanide 6] Contrasting color former comprising - about 1 g/l to about 10 fl/Il preferably about 2.
5 (1/p small/volume concentration of carminic acid - mol i
Potassium aluminum acid, where n is about 24i III M to about 150 mM, preferably about 50 mM (r)t+Xt acid.

本発明の反応剤システムに対する」−記の望ましい態様
に４３いて記載された潤度は、本テストの実施に用いら
れる溶液または混合物中に各成分が存在する　１β当り
のＷｌｌｌｔを指す。The wettability described in preferred embodiments for the reactant systems of the invention refers to Wlllt per 1β of each component present in the solution or mixture used to perform the test.

液相イムノアラレイ法、固相イムノアラレイ法及び組織
化学的定量を含む抗原の測定用既知分析法において本発
明の反応剤システムを使用することにより、ヒ１〜の腺
癌の診断を可能にする関連する方法が改良される。The use of the reactive agent system of the present invention in known analytical methods for the determination of antigens, including liquid-phase immunoarray methods, solid-phase immunoarray methods, and histochemical quantification, enables the diagnosis of adenocarcinoma in humans. The method is improved.

本発明により、抗原決定基Ｐ″′から由来する妨害なし
に、腺癌に特異的な抗原決定基（Ｋ）のみ、又は腺癌上
のに決定基と関連している抗原決定基（Ｐ’）のみを検
出し得るということは、既知の市販のＣＦ八へ析用キッ
トにより得られるよりも優れた診断成績が１ｑられると
いうことである。事実、本発明の方法と反応剤とを用い
ると、誤ったポジティブの数は著しく減少される。According to the invention, only the adenocarcinoma-specific antigenic determinant (K) or the antigenic determinant associated with the determinant on the adenocarcinoma (P' ), this means that the diagnostic results are better than those obtained with the known commercially available kits for analysis of CF8.In fact, using the method and reagent of the present invention, , the number of false positives is significantly reduced.

多くの炎症性変性病理を含む多数の非腫瘍病理的症例並
びに腫瘍病理症例における本発明の方法と反応剤とを用
いる実験成績は、にせのポジティブのパーセント又はに
「のネガティブのパーセントが抗−ＣＥＡ抗体を用いる
ＣＥＡ用の既知キット（例えばＣＥＡロッシュテストと
りシーフェイズＣＥＡキッ１〜）を用いた時よりも低い
ことが特徴である。Experimental results using the methods and reagents of the present invention in numerous non-tumor pathological cases as well as oncological pathological cases, including many inflammatory degenerative pathologies, have shown that the percentage of false positives or the percentage of negatives in anti-CEA It is characterized by being lower than when using known kits for CEA using antibodies (for example, CEA Roche Test, Sea Phase CEA Kit 1~).

特に本発明の反応剤を用いる組織学的標本分析の実験と
例えばＤ　Ａ　Ｋ　ＯＰ　Ａ　ＰキットやＩＭＭＩＪ　
Ｌ　ＯＫ　＋−１１Ｓ　Ｔ　ＯレットのＪ：うな市販の
キットを用いた実験とを比較するど、公知のキットはい
くつかの正常細胞に−１）ポジティブの反応を与え且つ
特に高いエラーを例えば骨髄組織の分析例において示す
のに対し、本発明の反応剤はもっばら腺癌転移細胞のみ
を検出してにせのポジティブ成績は全く与えない。即ら
、例えば顆粒球のような正常細胞をポジディプに染色す
ることはない。このことは市販の４ニットと化べて明確
な対比をな寸。In particular, histological sample analysis experiments using the reactive agent of the present invention, such as the DAK OP AP kit and IMMIJ
Comparison of experiments using commercially available kits shows that known kits give -1) positive responses in some normal cells and have particularly high errors, e.g. in bone marrow. In contrast to the tissue analysis example shown, the reactive agent of the present invention exclusively detects adenocarcinoma metastases and does not give any false positive results. That is, normal cells such as granulocytes are not positively stained. This is a clear contrast to commercially available 4 knits.

この新規な本発明のポリクローナルまたはモノクローナ
ルのいずれかの抗−に抗体又は抗−Ｐ１ゝ抗体並びに抗
−１く又は抗−ｐｋ抗体断片例えばＦａｂ’あるいはＦ
　（ａｂ’）、断片は例えば核医学及び放射線免疫化学
においてＩ−レーサーとしてもちいられる。This novel polyclonal or monoclonal anti- or anti-P1 antibody as well as anti-1 or anti-pk antibody fragments such as Fab' or F
(ab'), fragments are used as I-racers, for example in nuclear medicine and radioimmunochemistry.

すなわち例えば該抗体又は抗体断片を、■のような放射
性同位元素で標識化し、かくして得られた放射線標識化
トレーサーを人体に注射して腺癌細胞又は腫瘍塊を可視
化させ目つその局在場所をつぎとめることができる。ト
レーサーの可視化は既知の方法ににり例えばγ−カメラ
ースキャンニングによる特殊装置の使用により実施でき
る。That is, for example, the antibody or antibody fragment is labeled with a radioactive isotope such as (2), and the thus obtained radiolabeled tracer is injected into the human body to visualize adenocarcinoma cells or tumor masses and to determine the localized location of the tumor. You can continue. Visualization of the tracer can be carried out in known manner, for example by using special equipment by gamma camera scanning.

本発明によるこの新規なポリクローナルあるいはモノク
ローナルのいずれかの抗−に抗体又は抗ｐｋ抗体あるい
はそれらの断片は更にヒトの腺癌の治療に適用される。The novel polyclonal or monoclonal anti- or anti-pk antibodies or fragments thereof according to the invention are further applied in the treatment of adenocarcinoma in humans.

正常な細胞を検出することなく、腺癌のみを排他的に認
知することのできる特異内払−に抗体または抗−Ｐ５抗
体の使用の可能性は、腫瘍塊のみに特異的かつ排他的に
向【ノられた腫瘍化学療法を実現せしめる。The possibility of using anti-P5 antibodies or anti-P5 antibodies to specifically and exclusively recognize adenocarcinoma without detecting normal cells is a possibility, since it is possible to specifically and exclusively target only tumor masses. [Realize advanced tumor chemotherapy.]

この適用のために上記の新規な抗体または抗体断片は抗
腫瘍剤又は゛〔の仙のｍ　＋＋：ｑ毒ｆ１薬剤ど結合さ
れ、患者に注射さｌ’して該腫瘍剤又は細胞毒性薬剤が
特異的に抗体−Ｉ＋・す１ノーにＪ、すｎΦ瘍細胞また
は腫瘍塊のみに運ばれるようになる。For this application, the novel antibodies or antibody fragments described above are conjugated to an anti-tumor agent or a toxic f1 drug and injected into the patient to induce the tumor or cytotoxic drug. Specifically, the antibody-I+ is transported only to tumor cells or tumor masses.

抗腫瘍剤どしでは例えばダウノルビシン、ドキソルごシ
ン、］［−ピルピシン、メ１ヘト１ツキセードがある。Examples of antitumor drugs include daunorubicin, doxorgocin, pirpicin, and methoxade.

細胞青竹薬剤どしては例えばリシンが挙げられる。Examples of cellular green bamboo drugs include ricin.

上）ｄｉのＪ、うイ「抗ｎΦ瘍剤又は細胞バ）佐剤の本
発明によるボリク［１−プル又はモノクローナル抗−１
く又は抗−ｐｋ抗体との結合Ｉ３Ｌ以下の既知の操作法
例えばＪ　、Ｉ　ｍｍｔ＋ｎ、　Ｍ　ｅｌ、ｈｏｄｓ　
５９．１２９−１４３　（１９８３）に記載のよう２’
Ｌ方法に従い実施できる。1) Di J, U ``Anti-nΦ tumor agent or cell b) Adjuvant of the present invention Volik [1-pur or monoclonal anti-1
or binding with anti-pk antibodies.
59.129-143 (1983) 2'
It can be carried out according to method L.

前記したような抗腫瘍剤あるいは細胞毒性薬剤とポリク
ローナル８したはモノクローナル抗−Ｋ又は抗菌抗体ど
の間の結合は本発明の更に別の目的でもある。The conjugation between anti-tumor or cytotoxic agents as described above and polyclonal 8 or monoclonal anti-K or antibacterial antibodies is yet another object of the present invention.

従って、本発明はまた薬剤効果が排他的に腫瘍細胞上に
発現され、正常細胞はその薬剤効果により全く影響を受
けないにうなヒト腺癌に焦点をしぼった特異的な化学療
法に対する改善された方法にも関わる。Therefore, the present invention also provides an improvement over specific chemotherapy focused on human adenocarcinoma, where the drug effect is exclusively expressed on tumor cells and normal cells are completely unaffected by the drug effect. It also concerns the method.

本明細書にお（プる略語ＥＤＴＡ、７ｒ’ｉｓ、ｐ３Ｓ
、　ＰＥＧ、ＨＰＬＣ，ＩｇＧ、ｍＣｉ、ＩＩＩＭ、Ｗ
／Ｖ、Ｖ／Ｖ、ＤＥＡＥ、ＳＤＳ、ＤＯＣ，ＣＰＣは、
それぞれエチレンジアミン−テ１〜ラー酢酸。(Puru abbreviations EDTA, 7r'is, p3S
, PEG, HPLC, IgG, mCi, IIIM, W
/V, V/V, DEAE, SDS, DOC, CPC,
Ethylenediamine-tetraacetic acid, respectively.

トリスーヒドロキシメヂルーアミノメタン、燐酸バツフ
ァーサリーン、ポリエチレングリコール。Tris-hydroxymedyl-aminomethane, phosphate buffer saline, polyethylene glycol.

高性能液体クロマ１〜グラフィー、免疫グロブリン類、
ミリキコーリー、ミリモル、重量対容量、容量対審吊、
ジエヂルアミノエヂルセルローズ、硫酸ドデシルナ１−
リウム、デオキシコール酸ナトリウム及び塩化セヂルビ
リジニウムである。High performance liquid chroma 1~graphy, immunoglobulins,
Miriki Corey, mmol, weight vs. volume, capacity vs. trial suspension,
Dietylaminoedyl cellulose, dodecylna sulfate 1-
sodium deoxycholate and cedylviridinium chloride.

次の実施例は本発明を例証するが、決してそれを限定ザ
るものではない。The following examples illustrate the invention but do not limit it in any way.

（ｊｘ下全余白 実施例１ ］ロン腺癌肝性転移部（ｈｃｐａｔｉｃ　ｍｅｔａｓｔ
ａｓｅｓ＞（１００！１）を−８０℃に２４時間凍結さ
せ、高圧下でＸ−ブ１ノスＬ　Ｋ　Ｂ　’ＪＡ　置を用
いて均質化した３、ホモシネ−１へを３容量の０．０２
５Ｍショ糖水溶液に移し、これに等容量の２Ｎｌ−ＩＣ
ｊＯ□を添加した。遠心分１ｉｆｔ　（１０，Ｏ’ＯＯ
ｘ　ａ　ｘ　２０分、４℃）にか（）上清を蒸溜水で透
析後、撹拌し乍ら４℃、２４時間３ＭＫＣ４）を用いて
沈澱処理を行なった。混合物を再び遠心万頭（１００，
０ＯＯＸ（ｌ　ｘ　１時間、４℃）にがけ、上清を１Ｉ
Ｈ６，７５の０．００５Ｍリン酸塩緩衝液で透析した。(Jx lower full margin Example 1) Ron adenocarcinoma hepatic metastasis (hcpatic metastasis)
ases > (100!1) was frozen at -80°C for 24 hours and homogenized under high pressure using an
Transfer to a 5M sucrose aqueous solution and add an equal volume of 2Nl-IC to this.
jO□ was added. Centrifugation minute 1ift (10,O'OO
After dialyzing the supernatant against distilled water (x a x 20 minutes at 4°C), precipitation was performed using 3MKC4) at 4°C for 24 hours while stirring. Centrifuge the mixture again (100,000,
000X (l x 1 hour, 4°C) and the supernatant was diluted with 1I
Dialyzed against H6,75 in 0.005M phosphate buffer.

抽出物を）２！：（Ｋ　＋＋抗−Ｋ又は　Ｈｒｉ　Ｋ　
／ｐ％抗−ＫＲＩＡシステムの結合能の抑制度を基準に
してＲＩＡでコントロールし、ｐｌ−１６，７５の０．
００５Ｍリン酸塩緩衝液で予め平衡にされたＤＥＡＥ−
セルロースカラム（１，６ｘ５ｃｍ　）のクロマトゲラ
フにか（）た。ＩＩ　Ｈ６、７５の０．０２５Ｍリン酸
塩緩衝液（４０ｍｉり、ｌ１ｔ−１６，７５の０．０５
Ｍリン酸塩緩Ｖｌｊ液（４０ｍｅ）及びｐｌ−１６，７
５の０．１Ｍリン酸塩緩衝液（４０ｍｊ）を用いて、順
次溶用させた。各溶出画分を上記した如＜　ＲＩ　Ａで
コントロールし、次いで５ｍｅに濃縮させた。０．０２
５Ｍ及び０．０５Ｍ画分を更に、０．０５Ｍ　Ｎ　ａ　
１１２１）ｏ、及び０，９％Ｎａ　Ｃｊ＋を含む水溶液
でｌ１ｌ−１４，６５に緩衝させたＳ　ｅｐｈａｄｅｘ
”　Ｇ２００カラム（φ−１，（ｉｃｍ　：　ＩＩ　＝
　１００ｃｍ　）でゲルｅ過（Ａｍ（ｔ／　ＩＩ　）に
か（）精製した。２ＵＸＵのピークが溶出され、その各
ピークについて上記した如きＲＩＡど　゛”ｔ、−ｐ−
ン抗−Ｐｋシステムを用いてＫとｐｋの抗原活性量を測
定した。両方のピークは、第１のピークの１り濃度が第
２ののピークのそれにりも高いＫ及び［）抗原決定１．
ｔの混合物であることが確認された。Extract) 2! :(K ++ anti-K or Hri K
/p% Anti-KRIA system was controlled with RIA based on the degree of inhibition of binding ability.
DEAE- pre-equilibrated with 005M phosphate buffer
It was mounted on a chromatograph on a cellulose column (1.6 x 5 cm). II H6,75 of 0.025M phosphate buffer (40ml, 1t-16,75 of 0.05
M phosphate mild Vlj solution (40me) and pl-16,7
5 and 0.1M phosphate buffer (40mj) were used to dissolve the mixture in sequence. Each eluted fraction was controlled with RIA as described above and then concentrated to 5me. 0.02
The 5M and 0.05M fractions were further treated with 0.05M Na
1121) o, and Sephadex buffered to l1l-14,65 with an aqueous solution containing 0,9% Na Cj+
” G200 column (φ-1, (icm: II =
It was purified by gel filtration (Am(t/II) at 100 cm). A peak of 2 UXU was eluted and each peak was analyzed by RIA as described above.
The antigenic activities of K and pk were measured using the anti-Pk system. Both peaks show that the concentration of the first peak is also higher than that of the second peak and [) antigen determination 1.
It was confirmed that it was a mixture of t.

実施例２ 正常なヒ１へ面漿（５ｊりを遠心分１ｉｉＩ＋　（５，
０ＯＯＸｑ×１５分、４°Ｃ）にか【プ、上清を等容ω
の１．２Ｎ１−ＩＣｐＯりで抽出した。Example 2 Centrifuged plasma (5j) to normal human 1iiiI+ (5,
0OOXq x 15 min, 4°C), then add an equal volume of supernatant to
Extracted with 1.2N1-ICpO.

抽出物を２４時間流水で透析し、更に２４時間２回蒸溜
した水で透析した。Ａｍ１ｃｏｎ　Ｌルで１（１−２０
（Ｑに濃縮し、ＤＨ７，２ＰＢＳで透析後、０．５％Ｔ
　ｗｅｅｎｇｏを抽出物に添加しく非特異的相互反応を
避りるために）、これを樹脂に結合した抗−Ｐ”抗体を
担持したＳ　ｅｐｈａｒｏｓＩ４　Ｂ生物吸収（ｂｉｏ
ａｂ−ｓｏｒｐｔｉｏｎ）カラムのクロマトグラフにか
けた。The extract was dialyzed against running water for 24 hours and then against double-distilled water for an additional 24 hours. Am1con L le 1 (1-20
(Concentrated to Q, after dialysis with DH7,2PBS, 0.5%T
Weengo was added to the extract (in order to avoid non-specific interactions), and this was combined with a Sepharos I4B biosorbent (biosorbent) carrying a resin-bound anti-P” antibody.
chromatographed on an ab-sorption) column.

両分は溶出工程で樹脂に結合されており（Ｐ”抗原決定
１）　、Ｊ、　ｏｆ　３ｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２．４５．１９７７に記載された
方法に従ってチオシアン酸アンモニウムの３Ｍ　Ｐ　Ｂ
　Ｓ溶液によって樹脂から脱着させた。Both fractions are bound to the resin during the elution step (P” Antigen Determination 1), J. of 3olid-Phase Bio
3M P B of ammonium thiocyanate according to the method described in chemistry 2.45.1977.
It was desorbed from the resin by S solution.

得られた生成物を蒸溜水、ｐ）−１７，２のＰＢＳ溶液
で透析し、１２ｒｌ−］）’←）抗−１−’Ｒ１Δシス
テムの結合能の抑制度を調べ２ｉがらＲＩＡで］ント［
］−ルした。The obtained product was dialyzed against distilled water and a PBS solution of p)-17,2, and the degree of inhibition of the binding ability of the anti-1-1-'R1Δ system was examined by RIA during 2i. [
] - I did it.

ｌ−ｏｗｒｙ法により測定ｌノたところ、Ｐ抗原決定基
の濃度は５０γ／　ｍ（ｌであることが確認された。The concentration of the P antigen determinant was determined to be 50 γ/m (l) by the l-owry method.

実施例３ Ｔ　Ｗｅｅｎ８０　（０，５％）及び実施例１で１ｇら
れだ（最初の溶出ピーク）Ｋ／Ｐ抗原混合物（１ｍｇ／
ｍｆｌ　）を含むＩｌｌ　７．２のＰｌ３　Ｓ溶液を、
抗−Ｐ抗体を結合さＵた３　ｅｐｈａｒｏｓＰ４Ｂ生物
吸収カラムのクロマ１〜グラフにか【ノた１゜ Ｋ抗原決定基を含む非結合画分を少容帛にまで濃縮し、
′２′１−ＫＯ抗−ＫＲＩΔシステムの結合能の抑制度
を調べ乍らＲＩＡでコントロールした。Example 3 T Ween80 (0.5%) and 1 g of Example 1 (first elution peak) K/P antigen mixture (1 mg/
Pl3S solution of Ill 7.2 containing mfl),
The unbound fraction containing the anti-P antibody was concentrated to a small volume, and the unbound fraction containing the antigenic determinant was concentrated to a small volume.
The degree of inhibition of the binding ability of the '2'1-KO anti-KRIΔ system was investigated and controlled with RIA.

非結合画分には、１く抗原決定基がＰＢＳ−Ｔ　ｗｅｅ
ｎ混合物中に０，１ｍ！Ｊ／ｍｆ！の濃度で含まれてい
ることが確認された。The unbound fraction contains one antigenic determinant as PBS-T wee.
0,1 m in the n mixture! J/mf! It was confirmed that it was present at a concentration of

結合画分、即らカラムの抗−一抗体に結合されている両
分を、実施例２に記載の方法に従ってチオシアン酸アン
モニウムの３Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓ溶液で溶出させて樹脂から
脱着させた。The bound fractions, ie, both those bound to the anti-1 antibody on the column, were desorbed from the resin by elution with ammonium thiocyanate in 3M PBS according to the method described in Example 2.

次いで溶出物を２回蒸溜した水、ＰＢＳで透析し、その
量を”’ｌ　−ｐｋＨ抗−Ｐｌ＜　ＲＩＡシステムの結
合能の抑制度を基にしてＲＩＡでコントロールした。溶
出画分には、ｐｋ抗原決定基が０．１５１１１！＋／ｄ
の濃度で含まれていることが確認された。The eluate was then dialyzed against twice-distilled water and PBS, and the amount was controlled by RIA based on the inhibition of the binding ability of the RIA system. pk antigenic determinant is 0.15111!+/d
It was confirmed that it was present at a concentration of

上記した手順を、抗−Ｐ抗体を結合させた３　ｅｐｈａ
ｒｏｓＩ）４Ｂ生物吸収カラムを用いて繰返した。The above procedure was repeated using 3 epha conjugated with anti-P antibody.
rosI) was repeated using a 4B bioabsorption column.

Ｋ　／　Ｐ’！原混原物合物出させている間、Ｐ−原状
定材はカラムの抗−一抗体に交差反応で結合しており、
このことは０．１５ｍｇ／ｍの濃度のｐｌ＜抗原決定基
が結合画分から回収されたことから裏付【プられた。ｐ
ｋ含量のコントロールは＋　ｔ’Ｉ　Ｐ−〉抗−ｐｋＲ
ＩＡシステムに対して上記した如＜ＲＩＡを用いて実施
した１゜ 実施例４ 実施例１−（”　ｉｉ）られた、１ｍｏ／　ｍＱ　ｉｌ
’Ｊ度のＫ　／　ｌ）’抗原混合物のｌ”　Ｂ　Ｓ溶液
を、等容量の完全フロインドアジコバン１〜懸濁液で乳
化さ「だ。得られた混合物をＴｉ　１１　ｅ　ｔ　ａ　
ｎ　Ａ７ギの背中の４か所に皮下注射した。注Ｑ４を１
５日間隔で３回繰返した。３回目の注射後、免疫応答を
調べた。動物を放血させ、血清タイ１ヘル（ＳＯｒｌｌ
ｍ　Ｎ＋１１（！　）を次のにうにしてコンｌ−ロール
した。−］す２の血清希釈物を１．５ｎＯ／ｍｆ！０１
″勺−１く抗ＩＩＩ決定１．（又（１１当−、Ｋ　／　
Ｐｋ抗原混合物を含むＰ　１３　Ｓ溶液１００／Ｉｆ！
　、！：　ｊｌ′ニ３７℃チー晩インキュベ−１へざけ
た１、イン１−コベー１へ侵、家兎で作られた抗−１７
ギイムノグｌ”ｌ　７７リンの１／　１０Ｐ　Ｂ　Ｓ溶
液０．１ｍＱ及びＩ’　。ｌ’　ｉｌＥ常血７ｉ’ｔ　
（７）　１／　１０００Ｐ　Ｂ　Ｓ　溶ＭＯ，１ｍＱを
添加シタ。ｆｌ’ｉｉ合物ヲｉＷｔ心分＃ｌｌｉ　（５
，０００ｘｇ×１５分、　４°０）にか（）、上清を除
去し、沈澱物についてその放射活性をガンマ−カウンタ
ーで測定した。抗血清のタイ１〜ルを全部ラベルした抗
原の５０％を結合し得る抗体希釈物として計算した。K/P'! While the original contaminant compound is being released, the P-in situ sizing material binds to the anti-1 antibody on the column through cross-reactivity.
This was supported by the fact that pl< antigenic determinants at a concentration of 0.15 mg/m were recovered from the bound fraction. p
The control for k content is +t'I P->anti-pkR
EXAMPLE 4 EXAMPLE 1-("ii) 1 mo/mQ il performed using RIA as described above for IA system
The BS solution is emulsified with an equal volume of Freund's complete Freund's dicoban suspension.
n A7gi was injected subcutaneously at four locations on his back. Note Q4 1
Repeated three times at 5-day intervals. After the third injection, the immune response was examined. Animals were exsanguinated and serum Tie 1 Hel (SOrll)
I controlled m N+11 (!) as follows. -] 2 serum dilutions at 1.5 nO/mf! 01
``T-1 anti-III decision 1. (Also (11-, K /
P 13 S solution containing Pk antigen mixture 100/If!
,! : Incubation 1 at 37°C overnight, Incubation in 1-Covey 1, Anti-17 made from domestic rabbits.
1/10P B S solution of 77 phosphorus 0.1 mQ and I' ilE ordinary blood 7i't
(7) Add 1 mQ of 1/1000PBS dissolved MO. fl'ii mixture wt heart #lli (5
The supernatant was removed, and the radioactivity of the precipitate was measured using a gamma counter. All antiserum categories were calculated as the antibody dilution capable of binding 50% of the labeled antigen.

１ワられた抗−Ｋ　／　Ｐ’抗血清の平均タイ１〜ルは
１／！ｉ０，００（ｌであることが知見された。The average number of anti-K/P' antisera tested was 1/! It was found that i0,00(l).

Ｋ　／　Ｐｋ抗原混合物の代りに、実施例３で得られた
１〈抗原決定基又はＰｌｃ抗原決定基、若しくは実施例
２で得られたＰ″抗原決定基を用いて上記手順を繰返し
たどころ、抗−に抗血清、抗−Ｐゞ抗血清、抗−戸抗血
清が夫々得られた。The above procedure was repeated using the 1< or Plc antigenic determinant obtained in Example 3 or the P'' antigenic determinant obtained in Example 2 instead of the K/Pk antigen mixture. Anti-antiserum, anti-P2 antiserum, and anti-Do antiserum were obtained, respectively.

実施例５ 実施例４で得られた抗−１〈／Ｐ抗抗血（１ｍｆｆ）を
、ｒｌｌ−１８，６の０．ＩＭ　Ｖ　ｅｒｏｎａｌ緩衝
液の１４％ＰＥＧ６，０００溶液（ｈ＋ｆ２）で処理し
た。Example 5 The anti-1〈/P anti-blood (1 mff) obtained in Example 4 was added to 0.0. Treated with 14% PEG 6,000 solution (h+f2) in IM V eronal buffer.

ｊｑられた沈澱物を最小量のＤＩ−１８を有する０、０
２ＭリンＭ塩緩衝液に導入し、Ｄ［ΔＦセルロースで精
製した。0,0 with a minimum amount of DI-18
2M Phosphorus M salt buffer and purified with D[ΔF cellulose.

最初の緩！ｉ液（５ｍｆり中に溶出さＵた蛋白質を、１
’１ｌ−１８，６の０．ＩＭ　Ｖｅｒｏｎａｌ緩衝液の
２０％Ｐ［Ｇ６．０００溶液（４５ｍｆｆ）を用いて沈
澱さ【！た。沈澱物をＰＢＳ及びＯ１！）％−ｌ”　ｗ
ｅａｎｌｌＯ（１ｍＱ　）に導入し、更に、Ｋ　／　Ｐ
ｋ抗を１を結合状態で損持さＵた５ａ−ｐｈａｄｅＰ４
Ｂ生物吸収カラｌ、で精製ざぜた。First loose! The protein eluted in the i solution (5 mf) was
'1l-18,6's 0. Precipitated using a 20% P[G6.000 solution (45 mff) in IM Veronal buffer. Ta. The precipitate was dissolved in PBS and O1! )%-l"w
eanllO (1 mQ) and further K/P
5a-phadeP4 with k anti-1 in the bound state
Purified with B bioabsorbent color.

カラムに結合された状態にある抗−Ｋ　／　Ｐ’−１’
　ｌ＼ノグロブリンを、実施例２に記載１ノだ方法に従
ってチオシアン酸アンモニウムで溶出させて除去させる
と、抗−Ｋ　／　Ｐ抗体が得られた。Anti-K/P'-1' bound to column
The anti-K/P antibody was obtained when the l\noglobulin was removed by elution with ammonium thiocyanate according to the method described in Example 2.

同様にして、実施例４で１ｑられた抗−に、抗−ｐｋ及
び抗−一抗血清を用いると、抗−に、抗−Ｐ５及び抗−
Ｐ”ｌＡ体が夫々得られた。Similarly, when anti-pk and anti-1 antiserum were used for the anti-1q antibody in Example 4, anti-P5 and anti-1 antiserum were used.
P''lA bodies were obtained respectively.

実施例６ 実施例１の方法に従って得られた抗−Ｋ　／　ＰｋＪ７
’Ｃ血清（０，１〜ルりを正常に１〜面漿（８ｍｆｆ）
ど共に３７℃で２４時間インキ：１ベートし、混合物を
遠心分離（５，０ＯＯＸ（ｌ　Ｘ１５分、　４℃）にか
（プた。Example 6 Anti-K/PkJ7 obtained according to the method of Example 1
'C serum (0,1 to 1 to normal serum (8 mff)
Both were incubated at 37°C for 24 hours and the mixture was centrifuged at 5,000 ml (15 min, 4°C).

上清各０．１ｍｌ！を再び、正常ヒ］へ血漿４ｒｎＱと
共に３７℃で２４時間インキュベートし、上記と同じ条
件で遠心分離にかけた。0.1ml each of supernatant! were again incubated with normal human plasma 4rnQ for 24 hours at 37°C and centrifuged under the same conditions as above.

上清を分前し、その免疫活性を正常ヒト血漿の存在又は
非存在下で同程度に”’Ｉ　−Ｋ　／　Ｐｋ抗原混合物
を結合させ得る能力に基づいてコントロールした。The supernatant was aliquoted and its immunoactivity was controlled based on its ability to bind the I-K/Pk antigen mixture to the same extent in the presence or absence of normal human plasma.

正常ヒト血漿即ちＰ抗原決定基との交差反応が無いこと
から、得られた抗血清は抗−に抗血清であることが認め
られた。Since there was no cross-reactivity with normal human plasma, ie, the P antigen determinant, the obtained antiserum was confirmed to be an antiserum.

得られた血清を適当に希釈して、ヒト血漿又は他の生物
学的流体若しくは組織抽出物に対するに抗原決定基の免
疫学的測定に使用した。The resulting serum was appropriately diluted and used for immunoassays of antigenic determinants against human plasma or other biological fluids or tissue extracts.

実施例７ 実施例４の方法に従って得られた抗−Ｋ　／　Ｐ’抗抗
血（０，１ｍｆｌ）を、実施例２で得られた獅抗原決足
間の５０γ／　ｍｉ！Ｐ　１３　Ｓ溶液（１，８ｍ＋り
と共に３７℃で２４時間インキュベー１へさけた。イン
キュベー１〜後、混合物を遠心分ｍｌ　（５，０００ｘ
ｇ　Ｘ　１！ｉ分、４℃）にか（）た。Example 7 The anti-K/P' antihematin (0.1 mfl) obtained according to the method of Example 4 was mixed with the lion antigen obtained in Example 2 at 50 γ/mi! The mixture was incubated for 24 hours at 37° C. with 1.8 ml of P 13 S solution (1.8 ml). After incubation 1, the mixture was centrifuged (5,000×
gX1! i minutes at 4°C).

上清各０．１ｎ＆を、１〕４抗原決定基の５０γ／　ｍ
ｆ！　Ｐ　ＢＳ溶液（１，ｌｌｍｊ）と共に３７℃で２
４時間再インキュベートした。Ｌ記したと同じ条イ′１
で遠心分前後、上清を適当に希釈して、イムノヒストケ
ミカル測定法用抗−用く抗血清として使用した。Supernatants each 0.1 n & 1] 50 γ/m of 4 antigenic determinants
f! 2 at 37°C with PBS solution (1,llmj)
Re-incubated for 4 hours. Same strip A'1 as marked L
Before and after centrifugation, the supernatant was diluted appropriately and used as an antiserum for immunohistochemical assay.

抗血清の抗−に免疫活１！１をぞの能力を基にしてコン
Ｉ・ロールしたどころ、正常細胞ではなく腺癌細胞が組
織切片にみられた。ｌ　ｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍ−
ｉｓｔｒｙ　（第　２版）−Ｊ　ｏｌ＋＋１Ｗ　１ｌｃ
ｙ　ａｎｄ　Ｓ　ｏｎｓ　−Ｎ　ｅｗ　Ｙ　ｏｒｋ、　
１９７９に３ｔｃｒｎｂｅｒｇｅｒ　ｌ　、　Ａ、が記
載したベルオキシダー１！染色法を用いて、テストを行
なった。When I performed a control test based on the ability of the antiserum to have an immunological activity of 1:1, adenocarcinoma cells, not normal cells, were observed in the tissue sections. lmmunocytochem-
istry (2nd edition) - Jol++1W 1lc
y and Sons-New York,
Veroxider 1! described by 3tCrnberger I, A. in 1979! Tests were conducted using a staining method.

実施例８ 実施例３の方法に従って製造された１く抗原決定基（１
００埒）と同容量の完全フロインドアジュバントとを混
合して得られたエマルジョンを、ＢΔＬＢ／Ｃマウス（
８週令）の腹腔内に注入して、免疫化させた。Example 8 1 antigenic determinant (1 antigenic determinant) produced according to the method of Example 3
An emulsion obtained by mixing the same volume of complete Freund's adjuvant with BΔLB/C mice (
(8 weeks old) was immunized by intraperitoneal injection.

３０日後、低用量のに抗原決定基を再び腹腔内に注入し
た。実施例４と同様にして、動物に対する免疫応答をコ
ントロールした。Thirty days later, a lower dose of the antigenic determinant was again injected intraperitoneally. Immune responses to the animals were controlled in the same manner as in Example 4.

コントロールに対して正の動物を用いて、ＮａｔＵｒＯ
２５６，４９５−４９７，１９７５に記載された方法に
準じてネズミの骨髄肝細胞で体ハイブリダイゼーション
を行なった。NatUrO
256, 495-497, 1975, somatic hybridization was performed with murine bone marrow hepatocytes.

得られた生成物の特異性を１当−に抗原の結合能を測定
し乍らＲＴＡテストで評価した。The specificity of the obtained product was evaluated by the RTA test while measuring the antigen binding ability.

テストに対して正の結果を示すハイブリッドを単離し、
クローンさせた。isolate hybrids that show positive results for the test;
I cloned it.

人聞の拍−に−Ｅニック［１−ンな抗体が、七ツク［１
−ンな抗−９に抗体を分泌り−る細胞を右するＢ　Ａ　
ｌ−Ｂ／Ｃマウスに腹腔内注入覆ることにより得られた
。E-nick [1-one antibody is seven-trick [1] in human beat.
B A that identifies cells that secrete antibodies to the active anti-9.
Obtained by intraperitoneal injection into l-B/C mice.

注入した細胞により」−Ｆ瘍の増殖が、モノクローンな
抗−に抗体を２０１１１０／　ｍＱ　３：で含む腹水の
発生から認められた。Due to the injected cells, growth of F tumors was observed from the development of ascites containing monoclonal anti-201110/mQ3: antibodies.

Ｋ抗原決定基の代りに１〕又は１）抗原決定基を用いて
免疫化さゼる以外は同様にして、抗−Ｐｌ（モノクロー
ンな抗体又は抗−１）“［ツクローンな抗体を夫々前た
。。Anti-Pl (monoclonal antibody or anti-1) or monoclonal antibody (monoclonal antibody or monoclonal antibody) was prepared in the same manner, except that instead of the K antigenic determinant, immunization was carried out using the antigenic determinant 1] or 1). Ta..

哀濃例９ 実施例３で製造した１く抗原決定基（１ＯＮ）の吐　７
．２のＰＢｓ溶液（２０７１ｅ　）を水中でＮａ１２５
Ｉ（１ｍｃｉ）のｌ）　Ｂ　Ｓ溶液（１０Ｉｌｅ）ど０
−５１ｎ（１／　ｍ（ｌ　テＣｈｌｏｒａｍｉｎｅ−１
−を含むＰ　ｒ３　Ｓ溶液（１０／Ｊ）とで５分間処即
した。Aino Example 9 Preparation of 1ON antigenic determinant (1ON) produced in Example 3 7
．． 2 PBs solution (2071e) in water with Na125
I (1mci) of B S solution (10Ile) 0
-51n(1/m(l) Chloramine-1
- containing Pr3S solution (10/J) for 5 minutes.

次いで、２ｍａ／　ｒｔｄｌのメタ亜硫酸水素ナトリウ
ムを含むＰＢＳ溶液（２０ｐＩりと２０ｍ（１／ｍｅの
ヨウ化〕Ｊ０ リウ１１を含むＰＢＳ溶液（ｍｐｅ　＞を混合物に添加
した。反応生成物をＨＰ　Ｌ　Ｃで処即して遊離の１町
を除去し、′１−に抗原決定基（＋２Ｑ　Ｋ　）を定量
的に得た。A PBS solution containing 2 ma/rtdl of sodium metabisulfite (20 pI and 20 m (1/me iodide)) was then added to the mixture. The reaction product was purified by HPLC. The free 1 group was removed by treatment, and an antigenic determinant (+2Q K ) was quantitatively obtained at '1-.

同様にして、＋２！；ＩｐＩ（抗原決定基（”’Ｉ　−
Ｐｋ）及ヒ”Ｔ　Ｋ／　Ｐｋ抗Ｄｉｊ３Ｐ合物（”５′
Ｉ　Ｋ／　Ｐｋ）　ヲ製造した。Similarly, +2! ; IpI (antigenic determinant ("'I -
Pk) and H"TK/Pk anti-Dij3P compound ("5'
IK/Pk) was manufactured.

実施例１０ 腫瘍疾患を早していない３３５人の入院患者から得たヒ
ト血清検体を下記に示す試薬及び分析方法を用い、実施
例６で得られた抗−に抗血清を使用して調べた。Example 10 Human serum samples obtained from 335 hospitalized patients without early tumor disease were examined using the antiserum obtained in Example 6 using the reagents and analysis method shown below. .

試　薬 アジ化ナトリウム３１ｍ１ｙｊ　；及びウシアルブミン
０．４％Ｗ／Ｖを含む対照緩衝液。Reagents Sodium azide 31ml; and control buffer containing bovine albumin 0.4% W/V.

（■　ｐｌ−１７，２のリン酸塩緩衝液７０ｍＭ　：塩
化ナトリウム７（１ｍＭ　：　Ｅ　Ｄ　ＴΔ二ナトリウ
ム塩３３ｍＭ　；アジ化す１〜ツリウム１ｍＭ　＋及び
５０．０００に希釈した実施例６で１９られた抗−に抗
血清。(■ Phosphate buffer of pl-17,2 70mM: Sodium chloride 7 (1mM: EDTΔ disodium salt 33mM; Anti-antiserum.

Ｔｌ夛 （３）濃度１，５ｎｌ／ｍｆ！で比活性６０ｍＣ１／−
１１となるように緩衝液（１）中に希釈した”′５１−
　Ｋ　／　Ｐ’抗原混合物。Tl concentration (3) concentration 1.5nl/mf! specific activity 60mC1/-
11 diluted in buffer (1)
K/P' antigen mixture.

（４）第２の抗血清； Ｇ）　負の］ントロール：正常ヒＩ〜血漿。(4) second antiserum; G) Negative control: normal human I to plasma.

（６）　正の＝１ン１ヘロール：既知量のＫ　／　Ｐｋ
抗原混合物を添加した正常ヒ１〜血漿。(6) Positive = 1 n 1 Herol: Known amount of K / Pk
Normal human plasma supplemented with antigen mixture.

分析方法 ゼロ　負の　正の　検体 角のコン１〜ロール（５）　−０，５ｍ　−混合し、室
温で５時間インキュベートする室温で１晩インキュベ−
１〜する 計算方法 Ｐ、１．　（Ｄｏｓｉｔｉｖｉｔｙ　１ｎｄｅｘ）を次
式に従ッテゼロの放射活性に対するサンプルとコントロ
ールの放射活性の比から計算した。Analytical Method Zero Negative Positive Specimen Corner Con1 to Roll (5) -0,5m - Mix and incubate for 5 hours at room temperature Incubate overnight at room temperature
1. Calculation method P, 1. (Dositivity 1ndex) was calculated from the ratio of the radioactivity of the sample and the control to the radioactivity of the zero according to the following formula.

Ｐ　Ｌ　（フン１〜［−１−ル） Ｐ、１．値が１５以上の場合、腺癌が存在するど考えら
れ、一方１〕、１値が１５以下の場合、腺癌は存在しな
いと考えられた。P L (Hun 1 ~ [-1-L) P, 1. If the value was 15 or more, it was considered that adenocarcinoma was present, whereas if the value was 1] or 15 or less, it was considered that adenocarcinoma was not present.

同時に上記した３３５検休を従来市販のヒ１−ＣＥＡの
決定用キラ１〜２種、即ちＣＥＡロツシュＴｅ５ｔ及び
１−ｅｐｃｔｉｔのリソ−フコ二−スＣＥΔキットを用
いて試験した。At the same time, the above-mentioned 335 test results were tested using 1 or 2 types of commercially available H1-CEA determination kits, namely CEA Lotus Te5t and 1-epctit Lyso-Fucconise CEΔ kits.

得られた結果を下記表に示Ｊ０ 実施例１１ 腺癌にかかつていると確実な診断が下された８４名の患
者からのヒト血漿検体を、実施例１０に示した試薬及び
分析方法を用い、同時に実施例１０に示した種類の市販
キットを用いて分析した。The results obtained are shown in the table below.J0 Example 11 Human plasma samples from 84 patients who were definitively diagnosed as having adenocarcinoma were analyzed using the reagents and analytical method shown in Example 10. , and simultaneously analyzed using a commercially available kit of the type shown in Example 10.

その結果を下記表に示す。The results are shown in the table below.

実施例１２ 実施例１０及び１１のヒト血漿検体を、下記の試薬およ
び分析方法を用いて調べた。Example 12 The human plasma samples of Examples 10 and 11 were examined using the reagents and analytical methods described below.

試　薬 （１）　ポリスチレンビーズに吸収させた、実施例５及
び６に記載された方法に従って１りられた抗−７４− に抗体。Reagents (1) Anti-74 antibody prepared according to the method described in Examples 5 and 6, absorbed onto polystyrene beads.

■　ｌｌ　７．２のリン酸塩ｔｌｊ　画液７０ｍＭ　；
塩化す１−リウム７０ｍＭ　： アジ化す−１〜リウム３１ｍＭ　：及びウシアルブミン
１％（Ｍ／Ｖ）を含む希釈緩挿ｉ液。■ Phosphate tlj drawing solution of ll 7.2 70mM;
A diluted slow infusion solution containing 70mM of 1-lium chloride: 31mM of 1-1-lium azide: and 1% (M/V) of bovine albumin.

（３）　（Ｆ　Ｅ　１３　Ｓ　ｌ−０１ｔＯｒＳ　９５
．３１１．１９７８に記載された方法にｉｌ！ｉじて）
β　ガラク１゛・シダーゼに結合させ緩衝液（２）に正
確に希釈した、上記した試薬（１）の抗体として抗−１
く抗体を含有する酵素結合体。(3) (F E 13 S l-01tOrS 95
．． il! to the method described in 311.1978. i)
Anti-1 as an antibody for the reagent (1) described above, conjugated to β-galac-1-sidase and diluted accurately in buffer (2).
Enzyme conjugate containing antibodies.

（４）　ρＦ１７．０のリン？Ｉｌｔ塩緩衝液１５１１
１Ｍ　；及び〇−二トロフ■ニルガラクトシド２．３ｍ
Ｍを含む酵素基質。(4) Phosphorus with ρF17.0? Ilt salt buffer 1511
1M; and 2.3M of 〇-nitrof■nylgalactoside
An enzyme substrate containing M.

■　ブロツニ１ニング７１ＮＩ：ＩＭＩタノ酸す１〜リ
ウム。■ Brodzni 1ning 71NI: IMI tanoic acid 1~lium.

（６）　負の］ン１〜［］−ル：正常ヒ１〜血漿。(6) Negative ]n1~[]-ru: Normal human plasma.

（７）　正の］ン１〜ローノｌバ既知…の１〈／Ｐ抗原
混合物を添加した正常ヒ１〜血漿。(7) Normal human plasma supplemented with positive]n1-low nolva known...1/P antigen mixture.

分析方法 ゼロ　１１の　正の　検体 負のコン１〜ロール（６）　−０，１ｍＱ　−−正のコ
ン１〜ロール（７）　−０，１ｍｌ！、　−検　体　０
．１ｍｅ 抗−Ｋ　抗体（１）　１ｂｅａｄ　Ｉｂｅａｄ　１ｂｅ
ａｄ　Ｉｂｅａｄ振とうし乍ら室温で５時間インキコベ
ートする液相を捨てる。Analysis Method Zero 11 Positive Specimen Negative Control 1~Roll (6) -0,1mQ --Positive Control 1~Roll (7) -0,1ml! , -specimen 0
．． 1me anti-K antibody (1) 1bead Ibead 1be
Incubate for 5 hours at room temperature while shaking the ad Ibead. Discard the liquid phase.

食塩水２ｄで２回洗浄する。Wash twice with 2 d of saline solution.

振とうし乍ら室温で２時間インキュベートする液相を捨
てる。Discard the liquid phase and incubate for 2 hours at room temperature with shaking.

食塩水２ｄで２回洗浄する。Wash twice with 2 d of saline solution.

３７°Ｃで１時間インキュベートする。Incubate for 1 hour at 37°C.

分光光度泪で４２０ｎｍの吸光度を測定する。Measure the absorbance at 420 nm with a spectrophotometer.

１豆ブＵ［ Ｐ、Ｉ　、（ｐｏｓｉｔｉｖＮｙ　１ｎｄｅｘ）を、次
式に従ってゼ［］の光学密度（０，１）、）に対する比
でめた。The ratio of U[P, I, (positivNy 1ndex) to the optical density (0,1), ) of Ze[] was determined according to the following formula.

Ｐ、１．値が３Ｊ：ｌ十の場合には腺癌が存在するもの
と考えられ、一方Ｐ、１．値が３以下の場合には腺癌が
存在し２．−いものと考えられる。P.1. If the value is 3J:10, adenocarcinoma is considered to be present, while P, 1. If the value is 3 or less, adenocarcinoma exists; 2. -It can be considered as something.

実施例１０おにび１１で得られたと同様の結果が知見さ
れた。Results similar to those obtained in Example 10 Onibi 11 were observed.

実施例１３ ヒ１−］ロン腺癌、ヒ１−哺乳動物腺癌及び胸部腺癌か
らの組織切片をホルマリン固定し、パラフィン包埋し、
下記の試薬及び分析方法に従って試験した。Example 13 Tissue sections from human adenocarcinoma, human mammalian adenocarcinoma, and thoracic adenocarcinoma were formalin-fixed, paraffin-embedded,
Tested according to the reagents and analytical methods described below.

試　薬 （１）　１）Ｉ−１７，３のリンＦＢＩ　Ｊ２．を緩衝
液１０ｍＭ：及び塩化す１〜リウム１５０ｍＭ を含有するウオツシング緩衝液。Reagent (1) 1) I-17,3 Phosphorus FBI J2. A washing buffer containing 10mM of chloride and 150mM of chloride.

■　ｐｌ−１７，３のリンｉｌ　ｊｉｉ緩衝液１１０ｎ
１：塩化ナトリウム１５０ｍＭ：及び正常のロバ血清３
％（Ｖ／Ｖ） を含有するブロッキング緩衝液。■ PL-17,3 phosphorus il jii buffer 110n
1: Sodium chloride 150mM: and normal donkey serum 3
Blocking buffer containing % (V/V).

（３）　（Ｆ　Ｅ　Ｂ　Ｓ　Ｌ　ｅｔｔｅｒｓ　９５．
３１１．１９７８ニ記載された方法に従って）β−ガラ
クトシダーゼでラベルし緩衝液で正確に希釈した、ロバ
で作った抗−１７ギイムノグロブリン抗体を含む酵素結
合体。(3) (F E B S L etters 95.
Enzyme conjugate containing donkey-produced anti-17 immunoglobulin antibody labeled with β-galactosidase (according to the method described in 311.1978) and accurately diluted in buffer.

（４）　ｐＨ７，４のリン酸塩緩衝液１０１１１Ｍ　；
塩化ナトリウム１０ＩＩＩＭ： 塩化マグネシウム１１１１Ｍ　； ５−ブロモ−４−クロロ−インドリル　ガラクトシド１
ｍＭ； フェロシアン化カリウム６ｍＭ；及び ノ〕リシアン化カリウム６ｍＭ を含有する酵素に４質。(4) Phosphate buffer 10111M at pH 7.4;
Sodium chloride 10IIIM: Magnesium chloride 1111M; 5-bromo-4-chloro-indolyl galactoside 1
Potassium ferrocyanide 6mM; and potassium lysyanide 6mM.

０）　明ぽん及びカルミニン酸を含有するコントラスト
若色剤。0) Contrast young agent containing alum and carminic acid.

（６）上記した緩愉液（１）に１確に希釈した、実施例
７の方法に従って１１？られたＡ７ギで作った抗−に抗
体。(6) 11% diluted with the above-mentioned diluted liquid (1) according to the method of Example 7. Antibody made with A7gi.

分析力Ｖ（ 二トシｎ−）し、１００％−５０％の各濃度のエヂルア
ルコール、ウオツシング緩衝液を順次用いて、切片を脱
脂した。各試薬を切片全体にいき届くようモイストヂ１
７ンバ内テ３７℃で２０分間インキュベー１〜する。浸
透１召Ｊユり過剰の試薬を除去する。The sections were delipidated with an analytical power of V (Nitoshi n-) using 100% to 50% of each concentration of alcohol and washing buffer sequentially. Apply moisturizer 1 to distribute each reagent to the entire section.
7. Incubate for 20 minutes at 37°C in a chamber. 1. Remove excess reagent by osmosis.

抗−に抗体（６）を添加づる。モイストチャンバ内で３
７℃で２時間−インキュベートする。Add antibody (6) to the anti-antibody. 3 in the moist chamber
Incubate for 2 hours at 7°C.

酵素結合体（３）を添加する。Add enzyme conjugate (3).

モイストチャンバ内で３７℃で３０分間インキュベ３７
℃で３０分間インキュベートする。過剰の試薬１分後切
片を流水で洗浄し光学顕微鏡で観察する。Incubate for 30 min at 37°C in a moist chamber.
Incubate for 30 minutes at °C. After 1 minute of excess reagent, the sections are washed with running water and observed under an optical microscope.

また、同じ分析方法を、酵素基質とのインキュベーショ
ンの場合以外はモイストチャンバ内で室温で一晩インキ
ユベートし、酵素基質とはモイストチャンバ内で室温で
１時間インキュベー１〜することにより実施した。上記
した方法に於【プる別法では常に、流水での最終洗浄と
顕微鏡観察との間に、切片をウオツシング緩衝液（１）
、５０％−１００％の各種濃度のエチルアルコール、キ
ジロールを順次流した。The same analytical method was also performed by incubating in a moist chamber overnight at room temperature except for incubation with the enzyme substrate, which was incubated for 1 hour at room temperature in the moist chamber with the enzyme substrate. In the method described above, sections are always washed with washing buffer (1) between the final wash in running water and microscopic observation.
, ethyl alcohol at various concentrations from 50% to 100%, and Kijirol were sequentially flowed.

切片の顕微銃検杏では、腫瘍細胞の細胞質及び細胞膜の
みが強くゾル−に染色されており、隣接する止常細■１
す例λ、ば顆粒球は染色されていなかった。Microscopic gun examination of the section revealed that only the cytoplasm and cell membrane of the tumor cells were strongly stained with sol, and the adjacent permanent cells 1
In example λ, granulocytes were not stained.

これらの結果は、同じ標本を抗−ＣＥΔ抗体とのＣＦＡ
コンプレックスを組織化学的に検出するための市販の：
ｔツト、Ｄ　Ａ　Ｋ　ＯＰΔＰＫＩＩ−及びＩ　Ｍ　Ｍ
　Ｕ　Ｎ　Ｏｌ、、　Ｑ　Ｋ　ＩＮ　Ｉ　Ｓ　Ｔ−ＯＳ
　Ｆ王　ＫＩＴを用いて分析１ノだ結束とは好対照であ
った。These results demonstrate that the same specimen was subjected to CFA with anti-CEΔ antibody.
Commercially available for histochemical detection of the complex:
ttt, DAKOPΔPKII- and IMM
U N Ol,, Q K IN I S T-OS
King F: It was a good contrast to the 1st analysis using KIT.

前記した市販の試薬の場合、実際腫瘍細胞以外の正常（
−７絹械１ｒ＋　ｌ１ｉｑもかなり染色され、特に骨髄
組織の分析では誤認室が高く、特賃性が極めて低いこと
が認められた。In the case of the commercially available reagents mentioned above, in fact, normal cells other than tumor cells (
-7 Silk machine 1r+l1iq was also stained considerably, and especially in bone marrow tissue analysis, there was a high rate of misidentification, and it was observed that the special performance was extremely low.

上記した方法を７ｆｌｆ結組械切片の分析に利用したと
ころ、同１］１イを結果が１テノられた。When the above-mentioned method was applied to the analysis of a 7flf tissue section, the same results were obtained.

実施例１４ ドキソルビシンを共有結合方法に」、り抗−に抗体を結
合させた。Example 14 Doxorubicin was conjugated to an antibody by a covalent method.

ドキソルビシン（４０ｍ（１／　ｍｅ　）のＩ）１１　
７．２の０．０１５Ｍリン酸緩衝食塩水溶液に、わずか
に過剰のｏ、ＩＭ　Ｎ　ａ　Ｉ　Ｓ　Ｏ，ｔ−混合し、
室’ｆａ−ｃ暗所で　１時間インキュベー１〜させた。Doxorubicin (40 m (1/me) I) 11
7.2 into a 0.015 M phosphate buffered saline solution with a slight excess of o, IM Na ISO, t- mixed;
Incubate for 1 hour in the dark in a room fa-c.

インキコベー１〜終了後、１Ｍグリセロールを最終濃度
０．０５Ｍになるまで添加した。After completion of Ink Covey 1, 1M glycerol was added to a final concentration of 0.05M.

酸化されたドキソルビシンの溶液を、抗−に抗体（２０
ｍ（１／　ｍＱ　）のｐｌ−１９，５の０．１５Ｍ炭酸
カルシウム緩衝液の溶液１ｄど混合し、１時間室温でイ
ンキュベートした。A solution of oxidized doxorubicin was mixed with an anti-antibody (20
m(1/mQ) of pl-19.5 in 0.15M calcium carbonate buffer solution was mixed for 1 d and incubated at room temperature for 1 hour.

インキュベート終了後、Ｎ　ａ　Ｂ　＋−１，を最終′
Ｃ痕０．３１１＋（１／ｄになるまで添加し、反応を３
７℃で２時間続けた。反応終了後、混合物を、Ｐ８８で
平衡化すｔｔりＢｉｏ−ｇｅＰｐ　１００（７）ケ／Ｌ
ｚｆ濾過カフ　ム（１５Ｘ１．５ｃｍ）のり１］７１−
グラフにか【ノた。After the incubation, N a B +−1, is the final
Add until the C trace becomes 0.311+(1/d, and reduce the reaction to 3
Continued at 7°C for 2 hours. After the reaction is complete, the mixture is equilibrated with P88 Bio-gePp 100(7) pieces/L.
zf filtration cuff (15x1.5cm) glue 1] 71-
The graph was [nota].

除外された部分の両分には、抗体結合−薬物（非共役薬
物を含まイｒい）が含まれていた。Both portions of the excluded portion contained antibody binding-drug (including unconjugated drug).

出に６人　７−？１ＬＳＺリア　かむ０　プ／し八”工
ｒｔ　ピー　ｉンー代１１１（人弁理十用　「１　義　
雄 代理人弁理士今　イ寸　元 ８３−6 people out 7-? 0
Yoshio Patent Attorney Kon Isun Gen 83-

Claims (39)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）　ヒ１〜の患者から採取したサンプル中にある腺
癌に関する抗原物質を決定することによってヒ１〜腺癌
を診断するのに適当な方法であって、（ａ）抗−１く抗
体又Ｇ；Ｕ　（ｂ）抗−一抗体を用いて、該サンプル中
の物質が、それぞれ、（ａ’）腺癌に特異的な抗原決定
基１くを専ら有しているか又は（ｂｏ）腺癌のに決定基
に附随する抗原決定基Ｐｋを右しているかどうかを決定
することを特徴とする前記方法。(1) A method suitable for diagnosing H1-1 adenocarcinoma by determining antigenic substances related to adenocarcinoma in a sample collected from a H1-1 patient, the method comprising: (a) anti-1-1 antibody; G; The method described above, characterized in that it is determined whether an antigenic determinant Pk associated with a cancerous determinant is present. （２）　ヒ１への患者から採取したサンプルが生物学的
体液又は組織抽出物又は組織切片からのリーン　１− プルＣあることを特徴とする特許′［請求の範囲第１項
に記載の方法。(2) The method according to claim 1, characterized in that the sample taken from the patient is a lean sample from a biological body fluid or a tissue extract or a tissue section. . （３）　Ｋ又は別個にＰ嘴原決定基の決定を定性的に、
定量的に又は半定量的に行なうことを特徴とする特許請
求の範囲第１項または第２項に記載の方法。(3) Determination of K or separately P beak origin determinants qualitatively;
The method according to claim 1 or 2, characterized in that the method is carried out quantitatively or semi-quantitatively. （４）　モノクローン抗−に抗体又はｔツクローン抗−
ｐｋ抗体を用いることを特徴とする特許請求の範囲第１
項〜第３項のいずれかに記載の方法。(4) Antibody to monoclonal anti- or t-clonal anti-
Claim 1, characterized in that a pk antibody is used.
The method according to any one of Items 1 to 3. （５）　Ｋ抗原決定基に特賃的な抗−に抗体。(5) Antibodies specific to the K antigenic determinant. （６）　Ｋ及びｐ％原決定基の混合物に対して生産され
る抗体にｐｎ又はＰ弘原決定基を吸着させて、該抗体上
のＰ〉疫学的結合サイトを飽和させることを特徴とする
特許請求の範囲第５項に記載の抗−に抗体の製造方法。(6) A patent characterized in that the pn or P Hirogen determinant is adsorbed onto an antibody produced against a mixture of K and p% original determinants to saturate the P> epidemiological binding site on the antibody. A method for producing an anti-antibody according to claim 5. （７）　１）動物をＰｏ又はＰ騒原決定基で免疫化して
抗−Ｐｏ又は抗−ｐｋ抗体を生産し、＝２− ２）抗原決定基１〈及びＰ窃’ｔ！ｎ合物を１）で４ｒ
／られた抗−Ｐへは抗−１）ゞ抗体を用いて精製してに
抗原決定基を１ｉノ、ぞして ３）動物を２）で１！１られた１く抗原決定基で免疫化
する ことを特徴とする４Ｊ１訂請求の範囲第５項に記載の抗
−に抗体の製造７Ｊ法。(7) 1) Immunize animals with Po or P antigenic determinants to produce anti-Po or anti-pk antibodies, =2- 2) Antigenic determinant 1 and P steal't! n compound with 1) 4r
The anti-P that has been purified is purified using an anti-1) antibody and the antigenic determinants are purified, and then 3) animals are immunized with the antigenic determinants that have been purified in 2). 7J method for producing an anti-antibody according to claim 5 of the 4J1 revision, characterized in that （８）Ｐｋ抗原決定１ルに特異的な抗−一抗体。(8) Anti-one antibody specific for Pk antigen determination. （９）　動物をＰｋ抗原決定星で免疫化することを特徴
とする特許請求の範囲第８項に記載の抗−ｐｋ抗体の製
造方法。(9) The method for producing an anti-pk antibody according to claim 8, which comprises immunizing an animal with a Pk antigen determinant. （１０）　ｐｎ抗原決定基に特異的な抗−Ｐ０抗体。(10) Anti-P0 antibody specific for pn antigenic determinant. （１１）　動物をＰ抗原決定基で免疫化づ゛ることを特
徴どするＦ１♂１請求の範囲第１０項に記載の抗−一抗
体の製造方法。(11) A method for producing an anti-1 antibody according to claim 10, which comprises immunizing an animal with a P antigenic determinant. （１２）　ヒ１〜腺昂に特５１シ的な抗原決定基Ｋ。(12) Antigenic determinant K, which is particularly found in human glands. （１３）　抗原決定基１〈及び−の混合物を抗−一又は
抗−ｍ−抗体で精製Ｊ−ることを特徴とする特許請求の
範囲第１２項に記載のに抗原決定基の製造方法。(13) The method for producing antigenic determinants according to claim 12, characterized in that a mixture of antigenic determinants 1 and 1 is purified with an anti-1 or anti-m antibody. （１４）　抗原決定基Ｐｋ／Ｊ’ｉ　ｅ　１へ腺癌−に
のに抗原決定基にトド１随する抗原決定基であるＪ：う
な前記抗原決定基ｐｋ。(14) Adenocarcinoma to antigenic determinant Pk/J'ie 1 - J which is an antigenic determinant associated with sea lion 1 to crab antigenic determinant: Eel antigenic determinant pk. （１５）　抗原決定ＭＫ及び−の混合物を抗−一抗体で
精製することを特徴とする特許請求の範囲第１４項に記
載のＰ町ん原決定基の製造方法。(15) The method for producing a P-mochogen determinant according to claim 14, which comprises purifying a mixture of antigen-determining MK and - with an anti-one antibody. （１６）　抗原決定２３　ｐが、ｉＥ常ブラスマ又は正
常血清中に存在しＨつｐｋｉＡ原決定基と交叉反応する
ようなものである前記抗原決定基−６(16) Antigenic determinant 23 p is present in iE normal plasma or normal serum and cross-reacts with the H pkiA primary determinant-6. （１７）　正常ブラスマ又は正常面清から抽出し、次い
でｐｎ抗原決定基に特異的な抗体とのイムノアフイニテ
ィにより精製することを特徴とする特許請求の範囲第１
６項に記載のｐｎ抗原決定基の製造方法。(17) Claim 1, which is characterized in that it is extracted from normal plasma or normal surface supernatant, and then purified by immunoaffinity with an antibody specific for the pn antigenic determinant.
A method for producing a pn antigenic determinant according to item 6. （１８）　単一のに抗原決定基に特異的なモノクローン
抗−１＜抗体。(18) Monoclonal anti-1 antibody specific for a single antigenic determinant. （１９）　甲　の１−９°抗１ｊｌ決定基に特異的なモ
ノクローン抗−［〕抗体。(19) Monoclonal anti-[] antibody specific for the 1-9° anti-1jl determinant of A. （２０）　甲−の１−ｆ″抗１Ｇ（決定基に特異的なモ
ノクローン抗−Ｐ抗体。(20) A-1-f'' anti-1G (monoclonal anti-P antibody specific for the determinant; （２１）　４’：ｉｉｉ’ｌ晶Ｊ２（７）ｆ１ｉ１１１
１ｍ１８］Ｔｌ、ｍｌＯ項又４；を第２０項に記載のｔ
ツクローン抗体の製造方法であって、該七ツク「１−ン
抗体をハイブリドーマ技術ににつて１ｑることを特徴と
り−る前記方法。(21) 4':iii'l crystal J2 (7) f1i111
1m18] Tl, mlO term or 4;
1. A method for producing a monoclonal antibody, characterized in that the 7-clonal antibody is produced by hybridoma technology. （２２）　主成分とし゛Ｃ１抗原決定ＩＫに特異的な抗
−１く抗体を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１
項〜第４項のいり”れかに記載のヒ１へ腺癌を診断する
方法に用いる反応剤システム。(22) Claim 1 characterized in that it contains an anti-1 antibody specific to C1 antigen-determining IK as a main component.
1. A reactive agent system for use in the method for diagnosing adenocarcinoma described in any of Items 1 to 4. （２３）　士ツク［］−ン抗−に抗体を含むことを特徴
とする特許請求の範囲第２２項に記載の反応剤システム
。(23) The reactant system according to claim 22, characterized in that the reaction agent system contains an antibody to the reaction agent. （２４）　主成分として、抗原決定基１）に特異的な抗
−Ｐ警体を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項
〜第４項のいずれかに記載のヒ１〜腺癌を診断する方法
に用いる反応剤システム。(24) Human adenocarcinoma according to any one of claims 1 to 4, characterized in that it contains an anti-P antibody specific to antigenic determinant 1) as a main component. A reactive agent system used in a method for diagnosing. （２５）　モノクローン抗−Ｐ石体を含むことを特徴と
する特許請求の範囲第２４項に記載の反応剤システム。(25) The reactant system according to claim 24, which comprises a monoclonal anti-P stone body. （２６）　１）抗−に抗体もしくは別個に抗−一抗体； ２）ラジオラベルしたに抗原決定基もしくは別個にＰ５
原決定基又はラジオラベルしたに／Ｐｋ抗原性混合物； ３）コントロール；及び ４）バッファー を主として含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項
〜第４項のいずれかに記載のヒト腺癌を診断するための
ラジオイムノアッセイ法に使用するための反応剤システ
ム。(26) 1) Anti-antibody or separately anti-monoantibody; 2) Radiolabeled antigenic determinant or separately P5
Human adenocarcinoma according to any one of claims 1 to 4, characterized in that it mainly comprises a primary determinant or a radiolabeled Pk antigenic mixture; 3) a control; and 4) a buffer. A reactive agent system for use in radioimmunoassay methods for diagnosing. （２７）　成分１）の抗−に抗体又は別個に抗−ｐｋ抗
体が生じた種族のイムノグロブリンに特異的な第二の抗
体を更に成分として含むことを特徴とする特許請求の範
囲第２６項に記載の反応剤システム。(27) Claim 26, characterized in that it further comprises as a component a second antibody specific for the immunoglobulin of the species in which the anti-pk antibody or the anti-pk antibody was separately generated in component 1). The reactant system described in. （２８）　ラジオラベルされた成分２）が　ｌ−Ｋ又は
１２５Ｉ−姥又は１２５．−に／Ｐｋであることを特徴
とする特許請求の範囲第２６項又は第２７項に記載の反
応剤システム。(28) Radiolabeled component 2) is l-K or 125I-U or 125. The reactant system according to claim 26 or 27, characterized in that - /Pk. （２９）　１）固体相に結合した抗−に抗体又は別個に
抗−Ｐ騒体； ２）酵素結合抗−に抗体又は別個に酵素結合抗ｐｋ抗体
； ３）酵素基質； ４）コン１〜ロール；及び ５）バラフッｌ− を主成分どしで含むことを特徴とする特許請求の範囲第
１項〜第４項のいずれかに記載のヒト腺癌を診断するた
めのエンザイムイムノアッセイ法に使用するだめの反応
剤システム。(29) 1) Anti-P antibody bound to a solid phase or separately anti-P antibody; 2) Enzyme-conjugated anti-antibody or separately enzyme-conjugated anti-PK antibody; 3) Enzyme substrate; 4) Con1~ and 5) baraflu- as the main components. Used in the enzyme immunoassay method for diagnosing human adenocarcinoma according to any one of claims 1 to 4. Sudame's reactant system. （３０）　成分２）の酵素がβ−ガラクトシダーゼであ
り、酵素Ｍ質成分３）がＯ−ニトローフェニルガラク１
−ピラノシドを含むことを特徴とする特許請求の範囲第
２９項に記載の反応剤システム。(30) The enzyme component 2) is β-galactosidase, and the enzyme M component 3) is O-nitrophenyl galac 1.
- Reactant system according to claim 29, characterized in that it comprises a pyranoside. （３１）　１）抗−に抗体又は別個に抗−Ｐ５体；に ２）成分１）の抗−に抗体又は別個に抗−Ｐ抗体が生起
した種族のイムノグロブリンに特異的な酵素でラベルし
た抗体； ３）酵素基質；及び ４）バッファー を主成分どして含むことを特徴とする特許請求の範囲第
１項乃至第４項のいずれかに記載のヒト腺癌を診断する
ためのイムノヒストケミカル法に使用するための反応剤
システム。(31) 1) anti-antibody or separately anti-P5 antibody; and 2) component 1) anti-antibody or separately labeled with an enzyme specific to the immunoglobulin of the species in which the anti-P antibody was raised. The immunohist for diagnosing human adenocarcinoma according to any one of claims 1 to 4, which comprises an antibody; 3) an enzyme substrate; and 4) a buffer as main components. Reactant systems for use in chemical methods. （３２）　成分２）の酵素がβ−ガラク１へシダー１！
であり、酵素基質成分３）が５−ブロモ−４−クロロ−
インドリル−ガラクトシドを含むことを特徴とする特許
請求の範囲第３１項に記載の反応剤システム。(32) Enzyme of component 2) to β-galac 1 to cedar 1!
and the enzyme substrate component 3) is 5-bromo-4-chloro-
32. A reactant system according to claim 31, characterized in that it comprises indolyl-galactoside. （３３）　ラベルされた＋＜、ｐ’ａび一抗原決定基又
はラベルされた抗−に、抗−Ｐｋ７Ａび抗−醪ポリクロ
ーン又はモノクローン抗体。(33) Labeled +<, p'a and one antigenic determinant or labeled anti-, anti-Pk7A and anti-Momi polyclonal or monoclonal antibodies. （３４）　抗原決定基及び抗体がラジオラベルされてい
ることを特徴とする特許請求の範囲第３３項に記載のラ
ベルされた抗原決定基又はラベルされた抗体。(34) The labeled antigenic determinant or labeled antibody according to claim 33, wherein the antigenic determinant and the antibody are radiolabeled. （３５）　抗原決定基及び抗体が酵素ラベルされている
ことを特徴とする特ｒ［請求の範囲第３３項に記載のラ
ベルされた抗原決定基又はラベルされた抗体。(35) The labeled antigenic determinant or labeled antibody according to claim 33, wherein the antigenic determinant and the antibody are enzyme-labeled. （３６）　ヒト腺癌の治療に於いて抗−腫瘍薬又は９− 細胞毒性剤のキャリアとして使用するためのポリクロー
ン又はモノクローン抗−Ｋ又は抗−Ｐ騒体。(36) Polyclonal or monoclonal anti-K or anti-P antibodies for use as carriers of anti-tumor or cytotoxic agents in the treatment of human adenocarcinoma. （３７）　ポリクローン又はモノクローン抗−Ｋ又は抗
−ｐｋ抗体と抗−肝瘍薬又は細胞毒性剤との複合体。(37) Complexes of polyclonal or monoclonal anti-K or anti-pk antibodies and anti-liver tumor drugs or cytotoxic agents. （３８）　抗−腫瘍薬がダウノルビシン、ドキソルごシ
ン、エビルビシン及びメトトレキセートから選択される
ことを特徴とする特許請求の範囲第３１項に記載の複合
体。(38) Complex according to claim 31, characterized in that the anti-tumor drug is selected from daunorubicin, doxorgocin, evirubicin and methotrexate. （３９）細胞毒性剤がリジンであることを特徴とする特
許請求の範囲第３７項に記載の複合体。(39) The complex according to claim 37, wherein the cytotoxic agent is lysine.