FR2548901A1 - Diagnosis of human adenocarcinoma by detecting specific determinants - Google Patents
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Abstract
Description
Nouveaux déterminants antigéniques apparentés à
l'adénocarcinome et anticorps qui leur sont spécifiques,
procédés pour les préparer et combinaisons de réactifs
s'y rapportant
La présente invention concerne de nouveaux déterminants antigéniques apparentés à l'adénocarcinome, des anticorps gui leur sont spécifiques, et es procédés de diagnostic des adénocarcinomes humains bases sur la mise en évidence desdit. déterminants antigéniques dans des fluides biologiques, dans des extraits ou des coupes de tissus et in vivo sur les cellules ou les masses tumorales.New antigenic determinants related to
adenocarcinoma and antibodies specific to them,
processes for preparing them and combinations of reagents
relating thereto
The present invention relates to novel adenocarcinoma-related antigenic determinants, to antibodies specific thereto, and to methods of diagnosing human adenocarcinoma based on the detection of adenocarcinoma. antigenic determinants in biological fluids, in extracts or sections of tissues and in vivo on cells or tumor masses.
L'invention concerne également l'emploi d'anticorps spécifiques dans la thérapie des adénocarcinomes pour faire atteindre les cellules ou les masses tumorales par des médicaments antitumoraux ou d'autres agents cytotoxiques. On saint que dans le cas des pathologies tumorales il est possible d'isoler, des masses tumorales elles-mm.es ou bien des fluides biologiques, des substances associées auxdites pathologies.Nombre de ces substances ont des propriétés antigéniques plus marquées chez l'animal que chez l'homme certaines d'entre elles, généralement appelées "marqueurs tumoraux", sont des antigènes oncofoetaux. La présence d'un antigène qui est dit etre principalement associe aux adénocarcinomes, et surtout avec leurs métastases, a été démontrée par Gold et al, J. Expt. Med. 121 : 439-462 (1965). The invention also relates to the use of specific antibodies in the therapy of adenocarcinomas to reach cells or tumor masses by antitumor drugs or other cytotoxic agents. It is safe to say that, in the case of tumoral pathologies, it is possible to isolate, from the same tumoral masses or biological fluids, substances associated with these pathologies. Many of these substances have more marked antigenic properties in animals. that in humans some of them, generally called "tumor markers", are oncofoetal antigens. The presence of an antigen which is said to be mainly associated with adenocarcinomas, and especially with their metastases, has been demonstrated by Gold et al, J. Expt. Med. 121: 439-462 (1965).
Cet antigène, connu sous le nom d'antigène carcinoembryonnaire (CEA) peut être dosé aussi bien dans des fluides biologiques que dans des extraits ou des coupes de tissus par diverses méthodologies connues, par exemple celles qui sont rapportées dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique
Nos 3.663.684 et 3.697.638 ; Ann. of Clin. and Lab. Science 4, 5, 357, 1974 ; Clin. Chem. 19, 10, 1973 ; Cancer 34:15041509, 1974 ; Clin. Res. 19:143, 1971 ; Proc. Natl. Acad. Sci. This antigen, known as carcinoembryonic antigen (CEA) can be assayed both in biological fluids and in extracts or tissue sections by various known methodologies, for example those reported in US patents. of America
Nos. 3,663,684 and 3,697,638; Ann. of Clin. and Lab. Science 4, 5, 357, 1974; Clin. Chem. 19, 10, 1973; Cancer 34: 15041509, 1974; Clin. Res. 19: 143, 1971; Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 64:161-167, 1969 ; Cancer 37:62-81, 1976 ; Scand. J.USA 64: 161-167, 1969; Cancer 37: 62-81, 1976; Scand. J.
Immunol., Vol. 7 Snppl. 6, 1978 ; Cancer 45:1243-1247, 1980 et J. Natl. Cancer Inst. 57, 1, 1976. Immunol., Vol. 7 Snppl. 6, 1978; Cancer 45: 1243-1247, 1980 and J. Natl. Cancer Inst. 57, 1, 1976.
Les nombreuses études qui ont été faites en la matière, y compris par exemple les références ci-dessus, ont cependant révélé la très faible spécificité du CEA, car celle-ci a été mise en évidence non seulement dans le cas des pathologies tumorales mais aussi en présence de pathologies différentes, c'est-à-dire non tumorales, telles que par exemple de nombreux processus de dégénérescence inflammatoire, et même chez des donneurs sains. Par ailleurs, des études biochimiques [Urba R.; Alpert E., Isselbacher K.J., Proc. The many studies that have been done in this area, including for example the above references, however, revealed the very low specificity of the CEA, because it has been demonstrated not only in the case of tumor pathologies but also in the presence of different pathologies, that is to say non-tumorous, such as for example many inflammatory degeneration processes, and even in healthy donors. In addition, biochemical studies [Urba R .; Alpert E., Isselbacher K.J., Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 4602-6 (1975)] ont révélé des différences entre les CEA obtenus de laboratoires différents, avec pour conséquence l'obtention de resultats cliniques différents quand les mêmes techniques sont utilisées avec des substances d'origine différente. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 4602-6 (1975)] have revealed differences between CEAs obtained from different laboratories, with the result that different clinical results are obtained when the same techniques are used with substances of different origin.
Il a maintenant été découvert qu'il était possible 1btenir à partir des métastases d'adénocarcinome humain, ainsi que de tous les adénocarcinomes humains, par exemple des adénocarcinomes gastriques, mammaires et thyroidaux, des déterminants antigéniques (K) qui sont "spécifiques" aux adénocarcinomes, et des déterminants antigéniques (pk) qui sont "associés" aux déterminants K sur- les adénocarcinomes. It has now been discovered that it is possible to obtain from human adenocarcinoma metastases, as well as from all human adenocarcinomas, for example gastric, mammary and thyroidal adenocarcinomas, antigenic determinants (K) which are "specific" to adenocarcinomas, and antigenic determinants (pk) which are "associated" with the K determinants on adenocarcinomas.
Alors que les déterminants antigéniques pk font apparaître une réaction croisée très forte avec les déterminants antigènes (Pn) qui se trouvent dans le plasma ou le sérum des donneurs normaux, les déterminants antigéniques K ne font apparaître aucune réaction croisée avec les déterminants antigéniques Pn. C'est le mélange desdits déterminants antigéniques K et R et peut-être, de certains autres antigènes inconnus, qui étaient auparavant connus sous le nom de CEA.While the antigenic determinants pk show a very strong cross-reaction with the antigenic determinants (Pn) found in the plasma or serum of normal donors, the antigenic determinants K show no cross-reactivity with the antigenic determinants Pn. This is the mixture of said antigenic determinants K and R and perhaps some other unknown antigens that were previously known as CEA.
En utilisant les déterminants antigéniques K et les déterminants antigéniques Pk et Pn susmentionnés, on obtient des anticorps spécifiques anti-K, anti- Pk et anti-Pn, selon 1' invention. Using antigenic determinants K and the aforementioned antigenic determinants Pk and Pn, anti-K, anti-Pk and anti-Pn specific antibodies are obtained according to the invention.
L'emploi des déterminants antigéniques K et Pk et des anticorps anti-K et anti-Pk Pk qui leur sont spécifiques dans les procédés immunologiques connus, tels que, par exemple, le dosage radio-immunologique le dosage enzymoimmunologique, l'immunofluorescence, l'immunoluminescence, et bien d'autres, permet de détecter et de quantifier exclusivement les déterminants antigéniques K qui sont spécifiques aux adénocarcinomes, sans interférence dérivant des déterminants antigéniques pn du plasma ou du sérum normal, ou, le cas échéant, les déterminants antigéniques pk qui sont associés aux déterminants K sur les adénocarcinomes. La détermination ci-dessus peut se faire soit qualitativement soit quantitativement, soit encore semi-quantitativement. The use of the antigenic determinants K and Pk and anti-K and anti-Pk Pk antibodies which are specific to them in known immunological methods, such as, for example, the radioimmunoassay, the enzymoimmunoassay, the immunofluorescence, the Immunoluminescence, and many others, can detect and quantify exclusively the antigenic determinants K which are specific to adenocarcinomas, without interference deriving from pn antigenic determinants of plasma or normal serum, or, where appropriate, the antigenic determinants pk which are associated with the determinants K on adenocarcinomas. The above determination can be done either qualitatively or quantitatively or semi-quantitatively.
La présente invention a donc pour objet un procédé amélioré de diagnostic des adénocarcinomes humains par détermination de la substance antigène apparentée à l'adénocarcinome, soit dans un échantillon prélevé d'un patient humain, par exemple in vitro sur des fluides biologiques ou des extraits ou des coupes de tissus, ou in vivo sur les cellules ou les masses tumorales, l'amélioration consistant à déterminer, au moyen d'anticorps anti-K ou anti-pk spécifiques, exclusivement les déterminants antigènes K qui sont spécifiques aux adénocarcinomes sans révéler les déterminants antigènes Pn des cellules normales, ou, respectivement, les déterminants antigènes Pk qui sont associés aux déterminants
K sur les adénocarcinomes. Le pourcentage de résultats positifs erronés est ainsi réduit.The subject of the present invention is therefore an improved method for diagnosing human adenocarcinomas by determining the antigen substance related to adenocarcinoma, either in a sample taken from a human patient, for example in vitro on biological fluids or extracts or tissue sections, or in vivo on the cells or tumor masses, the improvement consisting in determining, by means of specific anti-K or anti-pk antibodies, exclusively K antigen determinants which are specific to adenocarcinomas without revealing the Pn antigen determinants of normal cells, or, respectively, the Pk antigen determinants that are associated with the determinants
K on adenocarcinoma. The percentage of false positive results is thus reduced.
L'expression "déterminants antigènes K désigne des déterminants antigènes qui, comme on l'a déjà dit, sont spécifiques aux adénocarcinomes et qui, ne faisant pas apparaître de réaction croisée avec les déterminants antigènes pn des cellules normales, ne sont reconnus que par les anticorps qui leur sont spécifiques, c'est-à-dire les anticorps anti-K : cette définition inclut tout mélange antigène CEA dans lequel les déterminants antigènes autres que les déterminants K ont été éliminés totalement ou quasitotalement. The expression "antigenic determinants K" denotes antigenic determinants which, as already stated, are specific to adenocarcinomas and which, not showing cross-reactivity with the pn antigen determinants of normal cells, are recognized only by the antibodies specific thereto, i.e. anti-K antibodies: this definition includes any CEA antigen mixture in which antigen determinants other than K determinants have been eliminated totally or substantially.
L'expression "déterminants antigènes k" désigne des déterminants antigènes qui sont présents sur les cellules d'adénocarcinome en "association" avec, c'est-à-dire en compagnie des déterminants antigènes K qui sont spécifiques aux adénocarcinomes, lesdits déterminants antigènes pk faisant apparaître, comme on l'a déjà dit, une réaction croisée avec les déterminants antigènes pn des cellules normales : cette définition inclut tout mélange antigène CEA dans lequel les déterminants antigènes autres que les déterminants pk ont été éliminés en totalité ou en quasitotalité. The expression "k antigen determinants" refers to antigenic determinants that are present on adenocarcinoma cells in "association" with, ie, with the K antigen determinants that are specific for adenocarcinomas, said antigen determinants pk. showing, as already mentioned, a cross-reaction with the pn antigen determinants of normal cells: this definition includes any CEA antigen mixture in which the antigen determinants other than the determinants pk have been eliminated in whole or in quasi-all.
Les déterminants antigènes pn sont, comme on l'a déjà dit, des déterminants antigènes présents dans le plasma ou le sérum normal et donnant une réaction croisée avec les déterminants antigènes pk
Un anticorps anti- est soit un anticorps obtenu en immunisant des animaux avec les déterminants antigènes K précités, soit tout anticorps anti-CEA (c'est-à-dire l'anticorps produit en immunisant es animaux avec le CEA" modifié, de telle sorte que les sites d'anticorps autres que les sites anti-K y ont été saturés en totalité ou en quasitotalité par des déterminants antigènes qui leur sont spécifiques.The pn antigen determinants are, as already mentioned, antigen determinants present in plasma or normal serum and cross-reactive with the antigen determinants pk
An anti-antibody is either an antibody obtained by immunizing animals with the above-mentioned K antigen determinants or any anti-CEA antibody (i.e., the antibody produced by immunizing animals with the modified CEA, such as so that the antibody sites other than the anti-K sites have been saturated in whole or in almost all of them with antigenic determinants specific to them.
De même, un anticorps anti-Pk est soit un anticorps obtenu en immunisant des animaux assc les déterminants antigènes pk précités, soit tout anticorps ani-CEA modifié de telle sorte que les su sites d'anticorps autres que les sites anti pk y ont été saturés en totalité OU en quasi-totalité par des déterminants antigènes quI eur sont spécifiques
Dans l'ensemble du présent mémoire descriptif, le terme "anticorps" désigne aussi bien des immunoglobulines que des fragments d'immunoglobulines et peut également signifier l'antisérum correspondant.Similarly, an anti-Pk antibody is either an antibody obtained by immunizing animals with the aforementioned pk antigen determinants or any modified ani-CEA antibody so that antibody sites other than anti pk sites have been saturated in total OR almost completely by antigen determinants which are specific
Throughout this specification, the term "antibodies" refers to both immunoglobulins and immunoglobulin fragments and may also mean the corresponding antiserum.
Par ailleurs, sauf indication contraire, le terme "anticorps" signifie un anticorps polyclonal ; lorsqu'il s'agit d'un anticorps monoclonal, cela est précisé. Moreover, unless otherwise indicated, the term "antibody" means a polyclonal antibody; when it is a monoclonal antibody, this is specified.
Deux procédés différents sont fournis par la présente invention pour la préparation d'anticorps anti-17 spécifiques aux déterminants antigènes K. Two different methods are provided by the present invention for the preparation of anti-17 antibodies specific for K antigen determinants.
Selon le premier de ces procédés, on obtient des anticorps anti-K en absorbant des anticorps produits contre un mélange de déterminants antigènes K et avec des déterminants antigènes pn ou pk de manière à saturer les sites de fixation immunologiques pk sur lesdits anticorps. According to the first of these methods, anti-K antibodies are obtained by absorbing antibodies produced against a mixture of antigenic determinants K and with pn or pk antigen determinants so as to saturate the immunological binding sites pk on said antibodies.
Selon le second procédé, on cbtient des anticorps anti-K en 1) immunisant des animaux avec des déterminants antigènes
Pn ou Pk pour produire des anticorps anti-Pn ou anti-Pk 2) purifiant un mélange de déterminants antigènes K et Pk
au moyen des anticorps anti-Pn ou anti-Pk produits selon
1), de manière à obtenir des déterminants antigènes R ; et 3) immunisant des animaux avec des déterminants antigènes K
obtenus selon 2).According to the second method, anti-K antibodies are 1) immunizing animals with antigenic determinants.
Pn or Pk to produce anti-Pn or anti-Pk 2 antibodies purifying a mixture of K and Pk antigen determinants
using anti-Pn or anti-Pk antibodies produced according to
1), so as to obtain R antigen determinants; and 3) immunizing animals with K antigen determinants
obtained according to 2).
Le champ d'application de l'invention inclut, en plus des anticorps spécifiques anti-K obtenus par les deux procédés différents ci-dessus, également les déterminants antigènesKproduits selon l'étape 2) du second procédé décrit ci-dessus, et, en outre, les déterminants antigènes pk et et les anticorps anti-Dk et anti-pn qui leur sont spécifiques, qui sont mis en jeu dans les deux procédés ci-dessus. The scope of the invention includes, in addition to specific anti-K antibodies obtained by the two different methods above, also the antigenic determinants produced according to step 2) of the second method described above, and in addition, the antigenic determinants pk and and anti-Dk and anti-pn antibodies specific thereto, which are involved in the two methods above.
Les formes marquées, par exemple les formes radiomarquées, les formes marquées par enzymes, ou les formes marquées par fluorescence, des déterminants antigènes.K, pk et pn précités et des anticorps anti-K, anti-pk et anti-Pn correspondants, sont également incluses dans le champ d'application de la présente invention. The labeled forms, for example the radiolabelled forms, the enzyme-labeled forms, or the fluorescently labeled forms, of the aforementioned antigenic determinants K, pk and pn and the corresponding anti-K, anti-pk and anti-Pn antibodies are also included in the scope of the present invention.
Conformément au premier procédé décrit ci-dessus pour la préparation des anticorps anti-K, on injecte le mélange de déterminants antigènesKet à à un animal, à une chèvre, un mouton ou un lapin par exemple, en suivant les modes opératoires habituels et connus d'immunisation, par exemple sous la forme d'une émulsion dans l'adjuvant de
Freund, pour donner naissance à un antisérum anti-K/Pk. On récupère ce dernier en prélevant du sang de l'animal selon des techniques habituelles puis on l'absorbe par incubation par exemple, avec des déterminants antigènes pn ou
L'incubation se fait généralement entre la température ambiante et 500C environ, de préférence à 370C environ, pendant un temps variant de 1 à 5 jours, de préférence pendant trois jours environ.On peut utiliser du plasma humain normal au lieu des déterminants antigènes Pn puisque, comme on l'a déjà dit, le plasma humain normal contient des déterminants antigènes pn. A titre indicatif, par exemple, on peut faire incuber 0,1 ml de sérum de chèvre à 37 C pendant trois jours avec 324 ml d'une solution de PBS contenant des déterminants antigènes p n ou R à une concentration d'environ 50 y/ml, ou bien avec environ 50 ml de plasma humain normal. A la fin de 17 incubation, on centrifuge la substance et on utilise le surnageant tel quel, ou, éventuellement, après des traitements complémentaires de dilution, de purification et/ou de stabilisation, en tant qu'anticorps spécifique anti-K.Conformément au second procédé décrit ci-dessus pour la préparation des anticorps ou des antisérums anti-K, on injecte des déterminants antigènes Pn ou Pk, par exemple sous la forme d'une émulsion dans l'adjuvant de reund, à un animal, à une chèvre, un mouton ou un lapin par exemple, en suivant un mode opératoire classique d'immunisation, pour donne naissance à un antisérum anti-Pn ou anti-Pk, que l'on récupère Ici encore on prélevant le sang de l'animal dlune manière habituelle. According to the first method described above for the preparation of anti-K antibodies, the mixture of Ket antigen determinants is injected into an animal, a goat, a sheep or a rabbit, for example, following the usual and known procedures of the invention. immunization, for example in the form of an emulsion in the adjuvant of
Freund, to give birth to anti-K / Pk antiserum. The latter is recovered by taking blood from the animal according to standard techniques and then absorbed by incubation, for example, with pn or antigen determinants.
The incubation is generally between room temperature and approximately 500 ° C., preferably at about 370 ° C., for a time varying from 1 to 5 days, preferably for about three days. Normal human plasma can be used instead of the antigenic determinants Pn since, as already mentioned, normal human plasma contains pn antigen determinants. As an example, for example, 0.1 ml of goat serum can be incubated at 37 ° C. for three days with 324 ml of a solution of PBS containing pn or R antigen determinants at a concentration of approximately 50%. ml, or with about 50 ml of normal human plasma. At the end of the incubation, the substance is centrifuged and the supernatant is used as it is, or, optionally, after further dilution, purification and / or stabilization treatments, as an anti-K. specific antibody. second method described above for the preparation of antibodies or anti-K antisera, Pn or Pk antigen determinants are injected, for example in the form of an emulsion in reund's adjuvant, to an animal, to a goat a sheep or a rabbit, for example, following a standard immunization procedure, to give rise to an anti-Pn or anti-Pk antiserum, which is recovered Here again, the blood is removed from the animal in a certain manner. usual.
On extrait les immunoglobulines de l'antisérum, le cas échéant, par des modes opératoires connus,
La purification du mélange de déterminants antigènes K et Pk au moyen d'anticorps anti-Pn ou anti-Pk pour obtenir les déterminants antigènes K, peut se faire selon des procédés connus. Une technique utilisable peut être, à titre d'exemple, la chromatographie d'immuno-affinité ou de bio-absorption, qui est basée sur la réaction immunologique entre un antigène et un anticorps lié à un support inerte. C'est ainsi, par exemple, que l'on élue une solution, par exemple une solution dans le PBS, du mélange d'antigènes K et pk, à travers une résine, par exemple la "Sepharose 4B, portant des anticorps anti-Pn ou anti-Pk qui lui sont liés. On récupère ainsi les déterminants antigenes K dans la fraction non liée.The immunoglobulins are extracted from the antiserum, if appropriate, by known procedures,
The purification of the mixture of antigenic determinants K and Pk by means of anti-Pn or anti-Pk antibodies to obtain the antigenic determinants K can be carried out according to known methods. One useful technique may be, by way of example, immunoaffinity or bioabsorption chromatography, which is based on the immunological reaction between an antigen and an antibody bound to an inert carrier. For example, a solution, for example a solution in PBS, of the mixture of antigens K and pk is eluted through a resin, for example Sepharose 4B, carrying anti-human antibodies. Pn or anti-Pk bound to it, thus recovering the antigenic determinants K in the unbound fraction.
On produit ensuite l'antisérum anti-K en injectant les déterminants antigènes K ainsi obtenus à un animal, par exemple de l'espèce indiquée ci-dessus, selon des modes opératoires classiques, par exemple ceux qui ont déjà été décrits dans le présent mémoire descriptif. The anti-K antiserum is then produced by injecting the antigenic determinants K thus obtained into an animal, for example of the species indicated above, according to standard procedures, for example those which have already been described herein. description.
Le mélange des déterminants antigènes K et pk utilisé selon les procédés décrits ci-dessus pour la préparation des anticorps anti-K est obtenu par extraction de tissus d'adénocarcinome primaire ou métastatique, par exemple de métastases hépatiques, ou bien de fluides biologiques de patients atteints d'adénocarcinome. The mixture of the K and pk antigen determinants used according to the methods described above for the preparation of anti-K antibodies is obtained by extraction of primary or metastatic adenocarcinoma tissues, for example from liver metastases, or from patients' biological fluids. with adenocarcinoma.
On peut procéder à l'extraction en suivant des modes opératoires connus et, si des tissus d'adénocarcinome sont utilisés, ceux-ci demandent à être homogénéisés au préalable : l'homogénéisation se fait généralement avec une "X Press" (LKB). The extraction can be carried out according to known procedures and, if adenocarcinoma tissues are used, they require homogenization beforehand: the homogenization is generally done with an "X Press" (LKB).
On peut ensuite procéder à l'extraction à l'aide d'un solvant approprié quelconque, de préférence un solvant de glycoprotéines, qui peut être, à titre d'exemple, l;acide perchlorique, l'acide trichloracétique, l'acIde phosphotungstique, un halogénure de métal alcalin, le chlorure de potassium par exemple, un mélange de phénol et d'éthanol, un détergent neutre, cationique ou anionique tel que, par exemple, le SDS, le DOC, le CPC, le "Triton X 100", le "Nonidet P40", etc. The extraction can then be carried out using any suitable solvent, preferably a glycoprotein solvent, which may be, for example, perchloric acid, trichloroacetic acid, phosphotungstic acid and the like. , an alkali metal halide, potassium chloride for example, a mixture of phenol and ethanol, a neutral detergent, cationic or anionic such as, for example, SDS, DOC, CPC, Triton X 100 ", the" Nonidet P40 ", etc.
On utilise de préférence le solvant d'extraction en volume égal à celui de l'homogénéisat ou du fluide biologique, et c'est de préférence un acide concentre, ayant par exemple une concentration d'environ 0,5 N à environ 2 N ; 11 acide perchiorique 2 N est un solvant d'extraction que l'on préfère tout particulièrement. Toute température inférieure à la température ambiante convient pour le procédé d'extraction, mais on préfère généralement une température de 4 C environ par exemple Les temps d'extraction varient habituellement de 10 minutes environ à une heure environ
Après l'extraction, on sépare le précipité par filtration ou centrifugation et on peut dialyser et purifier le surnageant. On peut utiliser de nombreux moyens de purification connus basés sur des principes différents.The extraction solvent is preferably used in volume equal to that of the homogenate or the biological fluid, and it is preferably a concentrated acid, having for example a concentration of about 0.5 N to about 2 N; Perchloric acid 2 N is an especially preferred extraction solvent. Any temperature below room temperature is suitable for the extraction process, but a temperature of about 4 ° C. is generally preferred, for example. The extraction times usually vary from about 10 minutes to about one hour.
After extraction, the precipitate is separated by filtration or centrifugation and the supernatant can be dialyzed and purified. Many known purification means can be used based on different principles.
C'est ainsi, par exemple, que l'on peut, sur la base des différences de charge électrique, utiliser pour la purification des résines échangeuses d'ions telles que, par exemple, "Sephadex" (marque déposée) DEAE, "Sephacel" (marque déposée) ou - . oge -5 , ou "Sephadex1, QAE ou SP. For example, it is possible, on the basis of differences in electrical charge, to use, for the purification of ion exchange resins such as, for example, "Sephadex" (registered trademark) DEAE, "Sephacel "(registered trademark) or -. oge -5, or "Sephadex1, QAE or SP.
Sur la base des différences de poids moléculaire et de volume hydrodynamique, on peut faire appel à des techniques de chromatographie, telles que, par exemple, la filtration sur gel et la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC).On the basis of differences in molecular weight and hydrodynamic volume, chromatographic techniques, such as, for example, gel filtration and high performance liquid chromatography (HPLC) can be used.
On peut obtenir un degré de purification plus élevé sur la base des différences de migration électrophorétique et de point isoélectrioue : c'est ainsi que l1on peut utiliser des techniques d'électrophorèse telles que, par exemple, 1 'électrophorèse de préparation sur support inerte, par exemple sur "Sephadex" marque poser, sur gel de p. olyacryl- amide, etc., ou l' "isoélectrofocalisation" sur plaques ou sur colonne. A higher degree of purification can be obtained on the basis of differences in electrophoretic migration and isoelectric point: thus electrophoresis techniques such as, for example, electrophoresis of inert carrier preparation can be used. for example on "Sephadex" mark pose, on gel of p. olyacrylamide, etc., or plate or column "isoelectric focusing".
Sur la base de la teneur glycidique, on peut obtenir un degré. de purification plus poussé, le cas échéant, en utilisant différentes lectines fixées à des résines, par exemple la "Sepharose" (marque déposée) 4B. On the basis of the glycidic content, a degree can be obtained. further purification, if necessary, using different lectins attached to resins, for example "Sepharose" (Trade Mark) 4B.
Les déterminants antigènes Pn à utiliser dans les procédés décrits ci-dessus pour la production des anticorps anti-K peuvent être obtenus à partir de plasma humain normal selon des modes opératoires classiques d'extraction et de purification. Pn antigen determinants for use in the methods described above for the production of anti-K antibodies can be obtained from normal human plasma according to standard procedures of extraction and purification.
C'est ainsi, par exemple, que l'on peut extraire du plasma humain normal avec, par exemple, un volume égal d'acide perchlorique ou avec tout autre solvant approprié tel que, par exemple, l'un de ceux qu ont été indiqués ci- dessus pour l'extraction du mélange antigène K/Pk de tissus d'adénocarclnome ; on peut également utilise des températures et des temps d'extraction similaires.On peut ensuite dialyser le produit de l'extraction d'une manière classique et le purifier par des techniques connues, par exemple par imuno-affinité avec des anticorps spécifiques aux déterminants pn, par exemple par chromatographie d'immuno- affinité contre des anticorps anti-K/Pk ou contre des anticorps anti-Pk ou encore contre des anticorps anti-Pn. Les déterminants antigènes pn se fixent ainsi aux anticorps et on les en détache par des méthodes connues, par exemple en utilisant un thiocyanate,- l'urée ou l'acide propionique, selon des modes opératoires classiques [J.W. Eveleigh, D.E. Thus, for example, one can extract normal human plasma with, for example, an equal volume of perchloric acid or with any other appropriate solvent such as, for example, one of those that have been indicated above for the extraction of the K / Pk antigen mixture from adenocarcinoma tissues; similar temperatures and extraction times can also be used. The extraction product can then be dialysed in a conventional manner and purified by known techniques, for example imuno-affinity with antibodies specific to for example by immunoaffinity chromatography against anti-K / Pk antibodies or anti-Pk antibodies or against anti-Pn antibodies. The pn antigen determinants thus bind to the antibodies and are detached therefrom by known methods, for example using a thiocyanate, urea or propionic acid, according to standard procedures [J.W. Eveleigh, D.E.
Levy, J. of Solid Phase Biochemistry, 2, 45, 1977]. Levy, J. of Solid Phase Biochemistry, 2, 45, 1977].
Les déterminants antigènes pk qui, le cas échéant, peuvent être également mis en jeu dans les procédés ci-dessus pour la préparation des anticorps anti-K peuvent être obtenus, par exemple, à partir du mélange des déterminants antigènes
K et pk, On peut faire subir à ce mélange, extrait par exemple de tissus d'adénocarcinome comme décrit ci-dessus, par exemple, une chromatographie de bio-absorption, en éluant, par exemple, une solution de ces mélanges, par exemple une solution dans le PBS, à travers une résine, la "Sepharose" 4B par exemple, portant des anticorps anti-Pn qui lui sont fixés.The antigenic determinants pk which, if appropriate, can also be involved in the above methods for the preparation of anti-K antibodies can be obtained, for example, from the mixture of antigen determinants.
This mixture, for example extracted from adenocarcinoma tissues as described above, can be subjected to, for example, a bioabsorption chromatography, for example by eluting a solution of these mixtures, for example a solution in PBS, through a resin, for example "Sepharose" 4B, carrying anti-Pn antibodies attached thereto.
Les déterminants antigéniques pk, par suite de leur réaction croisée avec les déterminants antigéniques Pn, se lient à la résine qui porte les anticorps anti-pn, et on les en détache d'une manière classigue, par exemple au moyen de thiocyanate ou d'urée selon des modes opératoires classiques, comme rapporté ci-dessus. The antigenic determinants pk, as a result of their cross-reaction with the antigenic determinants Pn, bind to the resin which carries the anti-pn antibodies, and are detached therefrom in a conventional manner, for example by means of thiocyanate or urea according to conventional procedures, as reported above.
Le contenu ou le degré de purification de la substance antigénique, c'est-à-dire des déterminants antigéniques K, Pk k et P n et des mélanges antigêniques K/P k est contrôlé, soit par voie radio-immunologique soit par voie immunochimique, à partir de leur activité-immunologique K et pk ou pn, selon des procédés classiques. C'est ainsi, par exemple, qu'un contrôle radio-immunologique de la teneur en déterminants K d'une substance antigénique peut être effectué par mesure de l'inhibition produite par ladite substance visà-vis de la capacité de fixation d'un système RIA 1 gI-K # anti-K. Un contrôle analogue d'un système RIA 125I-Pk#anti
Pk ou, respectivement, d'un système RIA 125I-Pn#anti-Pn, permet d'évaluer la teneur en Pk ou, respectivement, en Pn d'une substance antigénique.The content or degree of purification of the antigenic substance, i.e., antigenic determinants K, Pk k and P n and antigenic K / P k mixtures is controlled, either by radioimmunoassay or immunochemically. from their immunological activity K and pk or pn, according to conventional methods. Thus, for example, a radioimmunoassay of the K-determinant content of an antigenic substance can be performed by measuring the inhibition produced by said substance with respect to the binding capacity of a substance. RIA system 1 gI-K # anti-K. A similar control of a 125I-Pk # anti RIA system
Pk or, respectively, of an anti-Pn 125I-Pn # RIA system makes it possible to evaluate the content of Pk or, respectively, in Pn of an antigenic substance.
Les anticorps anti-P n et les anticorps a t. pk sont obtenus par les techniques d'immunisation connues, par exemple par les mêmes que celles décrites ci-avant pour obtenir de l'antisérum et des anticorps anti-K/P k
Selon l'invention, on peut produire des anticorps anti-K, anti-Pk et anti Pn monoclonaux contre un seul déterminant antigénique K, Pk ou Pn en suivant les modes opératoires connus qui sont généralement utilisés pour preparer des anticorps monoclonaux par exemple la technique connue de l'hybridome telle qu'elle est rapportée, par exemple, par
Kohler C. et Milstein C. dans Nature 256, 495-497, 1975.Anti-P n antibodies and antibodies were. pk are obtained by known immunization techniques, for example by the same as those described above to obtain antiserum and anti-K / P antibodies k
According to the invention, monoclonal anti-K, anti-Pk and anti Pn antibodies can be produced against a single antigenic determinant K, Pk or Pn by following the known procedures which are generally used to prepare monoclonal antibodies, for example the technique known from the hybridoma as reported, for example, by
Kohler C. and Milstein C. in Nature 256, 495-497, 1975.
Selon l'invention, n'importe quelle méthode connue pour la détermination d'un antigène, par exemple n'importe quelle méthode de dosage immunologique par exemple le dosage radio- immunologique (RIA), ou le dosage enzymo-immunologique (EIA) ou l'immunofluorescence ou l'immunoluminescence, ou encore l'immunodiffusion ou l'immuno-électrophorèse, peut être utilisée pour révéler ou quantîf 1er les déterminants antigéniques K qui sont spécifiques aux adénocarcinomes ou, le cas échéant, les déterminants antigéniques Pk qui sont associes aux déterminants K sur les adénocarcinomes
L'emploi d'un ou de plusieurs des déterminaits antigéniques K, Pk et K/Pk en mélange, que ce soit sous leur forme non maruée ou sous leur forme marquée, et des anticorps correspondants marqués ou non marqués, dans l'une quelconque desdites méthodes connues ci-dessus, permet de poser un diagnostic précoce des pathologies tumorales humaines qui sont connues sous le nom d'adénocarcinomes
Un antigène, ou un déterminant antigénique ou un mélange antigénique ou un anticorpsmarquésest, respectivement, un antigène ou un déterminant antigénique ou un mélange antigénique ou un anticorps qui a été marqué au moyen de n'importe quel type possible de moyen de marquage : il peut s'agir, par exemple, d'un radio-isotope, d'une enzyme, ou d'une substance fluorescente ou luminescente.Pour le marquage, on peut suivre n'importe quel mode opératoire connu et usuel, par exemple pour marquer les antigènes.According to the invention, any known method for the determination of an antigen, for example any immunoassay method, for example the radioimmunoassay (RIA), or the enzymoimmunoassay (EIA) or immunofluorescence or immunoluminescence, or immunodiffusion or immunoelectrophoresis, may be used to reveal or quantitate the antigenic determinants K which are specific for adenocarcinomas or, where appropriate, the antigenic determinants Pk which are associated to determinants K on adenocarcinomas
The use of one or more of the antigenic determinants K, Pk and K / Pk in admixture, whether in their unmixed form or in their labeled form, and corresponding labeled or unlabeled antibodies, in any one of of said methods known above, makes it possible to establish an early diagnosis of human tumoral pathologies which are known under the name of adenocarcinomas
An antigen, or an antigenic determinant or an antigenic mixture or a labeled antibody is, respectively, an antigen or an antigenic determinant or an antigenic mixture or an antibody that has been labeled by any possible type of labeling means: it may for example, a radioisotope, an enzyme, or a fluorescent or luminescent substance.For labeling, any known and usual procedure can be followed, for example to mark the antigens.
Pour marquer, par exemple, avec les radio-isotopes 125I ou 131l on peut suivre les techniques de la Chloramine
T ou de la Lactoperoxydase (LPO) [Nature 194, 495, 1962 et, respectlvement, Bioch. Bioph. Acta 251, 363, 19713 ou des variantes de ces techniques ; ou bien on peut utiliser le réactif de Bolton et Hunter [Biochem. J. 133, 529, 19731.To mark, for example, with the 125I or 131I radioisotopes one can follow the techniques of Chloramine
T or Lactoperoxidase (LPO) [Nature 194, 495, 1962 and, respectfully, Bioch. BioPh. Acta 251, 363, 19713 or variations of these techniques; or the Bolton and Hunter reagent [Biochem. J. 133, 529, 19731.
Pour marquer, par exemple, avec une enzyme, on peut suivre les techniques rapportées dans FEBS Letter 95, 311, 1978 ou dans J. Histochem. Cytochem. 22, 1084, 1974. For labeling, for example, with an enzyme, one can follow the techniques reported in FEBS Letter 95, 311, 1978 or in J. Histochem. Cytochem. 22, 1084, 1974.
Quand on utilise une méthode de dosage radioimmunologique (RIA) pour le diagnostic des adénocarcinomes, on peut utiliser n'importe quelle technique de RIA connue avoir par exemple Clin. Chem. 19 : 146, 19737. C'est ainsi, par exemple, que les déterminants antigéniques K qui sont spécifiques aux adénocarcinomes QU les déterminants antigéniques pk qui sont associés à ceux-ci sur les adénocarcinomes peuvent, à titre d'exemple, être quantifiés dans, par exemple, un fluide biologique ou un extrait de tissu, en les mettant en concurrence avec une quantité connue de radio-isotopes marqués, par exemple des déterminants antigéniques K ou, respectivement pk ou un mélange antigénique K/pk radiomarqués à l'iode 125 ou l'iode 131 pour la réaction avec une quantité limitée d'anticorps anti-K ou, respectivement, anti-pk. La réaction de mise en concurrence peut se faire d'une manière conventionnelle, par exemple par incubation à une température de 4"C environ à 400C environ, de préférence à la température ambiante, pendant un temps variant approximativement de 6 à 90 heures, de préférence pendant 15 à 16 heures environ. When using a radioimmunoassay (RIA) method for the diagnosis of adenocarcinoma, any known RIA technique may be used, for example, Clin. Chem. 19: 146, 19737. Thus, for example, the antigenic determinants K which are specific to adenocarcinomas QU the antigenic determinants pk which are associated with them on adenocarcinomas can, by way of example, be quantified in FIG. for example, a biological fluid or tissue extract, by competing with a known amount of labeled radioisotopes, for example antigenic determinants K or, respectively, pk or an antigenic K / pk mixture radiolabeled with iodine 125 or iodine 131 for reaction with a limited amount of anti-K or, respectively, anti-pk antibodies. The competitive reaction can be carried out in a conventional manner, for example by incubating at a temperature of about 4 ° C. to about 400 ° C., preferably at room temperature, for a period of time ranging from approximately 6 to 90 hours. preferably for about 15 to 16 hours.
On sépare ensuite de la fraction non fixée la fraction antigénique fixée aux anticorps, et on mesure la radio-activité dans la fraction fixée et/ou non fixée. The antigenic fraction attached to the antibodies is then separated from the non-fixed fraction and the radioactivity is measured in the fixed and / or non-fixed fraction.
La séparation de la fraction antigénique fixée d'avec la fraction non fixée peut se faire par des procédés connus, par exemple en utilisant des anticorps spécifiques aux immunoglobulines de l'espèce dans laquelle il a été donné naissance aux premiers anticorps, c'est-à-dire aux anticorps anti-K ou anti-Pk.La radio-activité dans la fraction fixée et dans la fraction non fixée peut être évaluée au moyen d'une courbe étalon, tracée par exemple avec un K étalon ou un pk étalon, ou bien en mesurant directement la chute possible de la capacité de fixation du K ou du Pk ou du K/Pk radiomarqué avec les anticorps anti-K ou anti-Pk, et ainsi, par exemple, une diminution de la radio-activité mesurée sur la fraction fixée est proportionnelle à la concentration de l'échantillon en K ou en pk
Lorsqu'on utilise une méthode de dosage enzymoimmunologique pour le diagnostic des adénocarcinomes, on peut utiliser n'importe quel procédé immunologique connu faisant appel à un marquage par enzyme par exemple aux procédés qui sont décrits dans J. Immunclogy 109, 129, 1972.Bien que de nombreuses enzymes puissent être utilisées avec succès comme parqueurs, des enzymes que l'on préfère tout particulièrement sont, par exemple, la peroxydase, la ss-galactosidase, 5 phosphatase alcaline et la glucose-oxydase.The separation of the bound antigenic fraction from the unfixed fraction can be by known methods, for example by using immunoglobulin-specific antibodies of the species in which the first antibodies were given, ie that is to say to the anti-K or anti-PK antibodies. The radioactivity in the fixed fraction and in the non-fixed fraction can be evaluated by means of a standard curve, drawn for example with a standard K or a standard pK, or by directly measuring the possible fall in the binding capacity of the radiolabeled K or Pk or K / Pk with the anti-K or anti-Pk antibodies, and thus, for example, a decrease in radioactivity measured on the fixed fraction is proportional to the concentration of the sample in K or pk
When using an enzymoimmunological assay method for the diagnosis of adenocarcinomas, any known immunological method using enzyme labeling may be used, for example, in the methods described in J. Immunclogy 109, 129, 1972. While many enzymes can be used successfully as parrers, particularly preferred enzymes are, for example, peroxidase,? -galactosidase, alkaline phosphatase and glucose oxidase.
C'est ainsi par exemple, que selon une méthode possible de dosage enzymo-immunologique, on peut quantifier les déterminants antigéniques K ou pk d'un échantillon de fluides biologiques ou d'extraits de tissu par un mode opératoire EIA du type sandwich, selon lequel on fait réagir l'échantillon, par incubation par exemple, avec des anticorps anti-K ou, respectivement, anti-Pk qui sont soit liés chimiquement sot absorbés passivement sur un support solide, sur des perles de polystyrène par exemple. Après avoir éliminé l'excès de réactif par des lavages, on ajoute les anticorps anti-K ou, respectivement1 anti-P marqués par enzyme, tels que, par exemple, les anticorps marqués par la ss-galactosidase, obtenus selon le mode opératoire décrit dans
FEBS Letters 95, 311-313, 1978. Après d'autres lavages, on ajoute le substrat enzymatique approprié par exemple de l'ortho-nitrophényl-galactopyranoside si c'est la ss-galactosidase que l'on utilise comme marqueur, et on mesure la couleur développée, son intensité étant proportionnelle à la concentration des déterminants antigéniques R ou, respectivement, pk dans l'échantillon. Pour l'application histochimique, on peut utiliser n'importe quel procédé immunohistochimique connu [Human Pathology 12, 590-596, 1981] pour repérer la présence de déterminants antigéniques K ou Pk sur les préparations histologiques, au moyen d'anticorps spécifiques anti-K ou anti-Pk, selon l'invention.La détermination histologique peut se faire sur des coupes de tissu congelées ou fixées et enveloppées de manière routinière, selon des modes opératoires classiques.For example, according to a possible method of enzymo-immunological assay, the antigenic determinants K or pk of a sample of biological fluids or tissue extracts can be quantified by a sandwich-type EIA procedure according to wherein the sample is reacted by incubation, for example, with anti-K or respectively anti-Pk antibodies which are either chemically bound or passively absorbed on a solid support, for example on polystyrene beads. After removing the excess reagent by washes, the enzyme-labeled anti-K or, respectively, anti-P antibodies are added, such as, for example, the ss-galactosidase labeled antibodies, obtained according to the procedure described. in
FEBS Letters 95, 311-313, 1978. After further washings, the appropriate enzymatic substrate, for example ortho-nitrophenyl-galactopyranoside, is added if s-galactosidase is used as the label, and measures the color developed, its intensity being proportional to the concentration of the antigenic determinants R or, respectively, pk in the sample. For histochemical application, any known immunohistochemical method can be used [Human Pathology 12, 590-596, 1981] to identify the presence of K or Pk antigenic determinants on histological preparations, using specific anti-human antibodies. K or anti-Pk, according to the invention. The histological determination can be done on tissue sections frozen or fixed and routinely wrapped, according to conventional procedures.
C'est ainsi, par exemple, que l'on peut faire incuber des coupes de tissu à la température ambiante dans un tampon aqueux avec des anticorps anti-K ou, respectivement, anti-Pk, de telle sorte que les anticorps anti-K ou anti-pk Pk se fixent sur les sites où les déterminants antigéniques K ou pk respectifs sont présents. On met ensuite en évidence les anticorps fixés par réaction ultérieure, par incubation par exemple, avec des anticorps marqués spécifiques aux immunoglobulines de l'espèce dans laquelle les premiers anticorps anti-K ou anti-Pk ont pris naissance. Thus, for example, tissue sections can be incubated at room temperature in an aqueous buffer with anti-K or anti-Pk antibodies, so that the anti-K antibodies or anti-pk Pk bind to sites where the respective antigenic determinants K or pk are present. The fixed antibodies are then detected by subsequent reaction, for example by incubation with labeled antibodies specific for immunoglobulins of the species in which the first anti-K or anti-Pk antibodies have originated.
On peut préparer lesdits anticorps marqués selon des modes opératoires connus en utilisant des marqueurs connus tels que, par exemple, des enzymes, par exemple la peroxydase, la B-galactosidase, la phosphatase alcaline, la glucoseoxydase, les complexes enzyme-anti-enzyme, par exemple le complexe peroxydase-antiperoxydase (PAP) ; des molécules fluorescentes, par exemple la fluorescéine ou la Xodamine ou des combinaisons IBiotinmAvidiX dans lesquelles 1' "Avidine" est elle-meme fixée à une enzyme ou à une substance fluorescente, par exemple du type susmentionné. These labeled antibodies can be prepared according to known procedures using known markers such as, for example, enzymes, for example peroxidase, β-galactosidase, alkaline phosphatase, glucoseoxidase, enzyme-anti-enzyme complexes, for example the peroxidase-antiperoxidase complex (PAP); fluorescent molecules, for example fluorescein or Xodamine or IBiotinmAvidiX combinations in which the "Avidin" is itself attached to an enzyme or a fluorescent substance, for example of the type mentioned above.
L'analyse microscopique finale de-la préparation histologique révèlera les sites où les déterminants antigéniques K ou pk recherchés sont présents : on observera des sites fluorescents lorsqu'un marqueur fluorescent sera utilisé, tandis que l'on observera des sites colorés lorsqu'on aura utilisé pour la détermination une enzyme marqueur et un substrat chromogène qui lui est spécifique. The final microscopic analysis of the histological preparation will reveal the sites where the desired K or pk antigenic determinants are present: fluorescent sites will be observed when a fluorescent marker is used, while colored sites will be observed when used for the determination of a marker enzyme and a specific chromogenic substrate.
Une combinaison particulièrement utile pour la mise en évidence histochimique des déterminants antigéniques K ou pk sur des coupes de tissu met en jeu l'enzyme ss-galacto- sidase en tant que marqueur et un indolyl-galactoside, par exemple le 5-bromo-4-chloro-indolyl-galactoside, en tant que substrat chromogène enzymatique : on peut suivre, par exemple, pour une telle détermination, la technique de l'immuno- qalactosidase qui est décrite, par exemple, dans Histochemis- try 76, 153-158, 1982. A particularly useful combination for the histochemical detection of K or pk antigenic determinants on tissue sections involves the enzyme β-galactosidase as a label and an indolyl-galactoside, e.g. 5-bromo-4. Chloro-indolyl-galactoside, as enzymatic chromogenic substrate: for example, the immunogalactosidase technique described in, for example, Histochemistry 76, 153-158, can be followed for such a determination. , 1982.
Mais, comme on l'a déjà dit, outre les méthodes de dosage immunologique exposées ci-dessus, on peut utiliser n'importe quelle autre méthode immunologique, selon 'invention, pour mettre en evidence la présence de déterminants antigéniques K spécifiques aux adénocarcinomes ou de déterminants antigéniques Pk associés, dans des fluides biologiques ou dans des extraits ou des coupes de tissus
Commue on l'a déjà dit également, en plus des procédés de diagnostIc des adénocarcinomes humains 7 invention procure également des combinaisons de réactifs permettant de mettre en oeuvre lesdits procédés.But, as already mentioned, in addition to the immunoassay methods described above, any other immunological method according to the invention can be used to demonstrate the presence of antigenic determinants K specific to adenocarcinoma or associated antigenic Pk determinants in biological fluids or in extracts or tissue sections
As has already been said, in addition to the methods for diagnosing human adenocarcinomas, the invention also provides combinations of reagents for carrying out said methods.
Bien que différentes combinaisons de réactifs soient prévues pour des méthodes analytiques différentes, une combinaison de réactifs permettant la mise en évidence des déterminants antigéniques K contient toujours, à titre de constituant essentiel, un anticorps spécifique anti-K, et une combinaison de réactif s permettant la mise en évidence des déterminants antigéniques Pk contient, à titre de constituant essentiel, un anticorps anti-Pk.Chacune desdites combinaisons de réactifs contient, de plus, d'autres constituants qui sont éventuellement différents dBune combinaison de réactifs l'autre, suivant la méthode analytique à laquelle la combinaison de réactifs est destinée, et ces constituants supplémentaires peuvent être, par exemple, choisis parmi les déterminants antigéniques K ou Pk marqués, les mélanges antigéniques K/Pk marqués, les anticorps anti-K ou anti-Pk marqués ou les anticorps marqués spécifiques aux immunoglobulines de l'espèces dans laquelle lesdits anticorps anti-K ou anti-Pk ont pris naissance. Although different combinations of reagents are provided for different analytical methods, a combination of reagents for the detection of antigenic determinants K still contains, as an essential component, an anti-K specific antibody, and a combination of reagents allowing the detection of the antigenic determinants Pk contains, as an essential constituent, an anti-Pk antibody. Each of said reagent combinations contains, in addition, other constituents which are possibly different from one combination of reagents to the other, depending on the analytic method to which the combination of reagents is intended, and these additional components may be, for example, selected from labeled K or Pk antigenic determinants, labeled K / Pk antigenic mixtures, labeled anti-K or anti-Pk antibodies, or labeled antibodies specific to immunoglobulins of the species in which it said anti-K or anti-Pk antibodies have originated.
En outre, d'autres constituants, facultatifs ou non, peuvent éventuellement se trouver dans les combinaisons de réactifs faisant l'objet de l'invention, tels que, par exemple, un système de séparation exempt de liaison, des témoins, des étalons, des tampons, des stabilisateurs, des agents antimicrobiens, des substances tensio-actives, des substrats enzymatiques et des activateurs. In addition, other constituents, optional or not, may optionally be found in the combinations of reagents that are the subject of the invention, such as, for example, a separation system without binding, controls, standards, buffers, stabilizers, antimicrobial agents, surfactants, enzyme substrates and activators.
C'est ainsi, par exemple, que pour une méthode de dosage radio-immunologique permettant la détection des déterminants antigéniques K ou pk dans des fluides biologiques ou dans des extraits de tissus selon la méthode
RIA décrite ci-dessus dans le présent mémoire descriptif, une combinaison de réactifs utilisable peut consister en une "trousse" contenant essentiellement 1) un anticorps anti-K ou, respectivement, anti-Pk ; 2) les déterminants antigéniques K ou Pk respectifs radio
marqués, ou encore un mélange antigénique K/Pk radio
marqué 3) des témoins ; et 4) des tampons.Thus, for example, for a radioimmunoassay method for detecting antigenic determinants K or pk in biological fluids or in tissue extracts according to the method.
RIA described above in this specification, a usable reagent combination may consist of a "kit" containing essentially 1) an anti-K or, respectively, anti-Pk antibody; 2) the respective antigenic determinants K or Pk radio
labeled, or an antigenic mixture K / Pk radio
marked 3) witnesses; and 4) buffers.
La trousse ci-dessus peut contenir en outre un second anticorps spécifique aux immunoglobulines de l'espèce dans laquelle l'anticorps anti-K ou anti-Pk respectif du constituant 1) a été développé, et, facultativement, des substances tensio-actives et/ou des agents stabilisateurs ou antimicrobiens. The above kit may further contain a second immunoglobulin-specific antibody of the species in which the respective anti-K or anti-Pk antibody of component 1) has been developed, and, optionally, surfactants and or stabilizing or antimicrobial agents.
Le K ou le Pk ou le K/Pk radiomarqué du constituant 2) de la trousse peut être, par exemple, K ou Pk ou K/Pk marqué avec le radio-isotope 125I ou 1311. The radiolabeled K or Pk or K / Pk of component 2) of the kit may be, for example, K or Pk or K / Pk labeled with 125I or 1311 radioisotope.
Les témoins 3) comprennent au moins un témoin négatif et un témoin positif, et les tampons 4) peuvent comprendre n'importe quel tampon ayant, par exemple, un pH compris entre 6,5 environ et 8 environ, égal de préférence à 7,2 environ. The controls 3) comprise at least one negative control and one positive control, and the buffers 4) can comprise any buffer having, for example, a pH of between about 6.5 and about 8, preferably equal to 7, About 2.
Les substances tensio-actives peuvent être, par exemple, le "Tween" 20 ou 80, le "Nonidet P40, le "Triton X100", etc. The surface-active substances may be, for example, "Tween" 20 or 80, "Nonidet P40," Triton X100 ", etc.
Les agents de stabilisation peuvent être, par exemple, la sérum albumine de boeuf, la gélatine, etc. Stabilizers may be, for example, beef serum albumin, gelatin, etc.
Un agent antimicrobien peut être, par exemple, l'azoture de sodium (NaN3). An antimicrobial agent may be, for example, sodium azide (NaN3).
Les tampons peuvent être, par exemple, des tampons de phosphate, éventuellement mélangés à des sels minéraux els que, par exemple, le chlorure de sodium
Dans une forme d réalisation tout particulièrement préférée, une trousse permettant la détection RIA des déterminants antigéniques K ou Pk contient : 1) un anticorps anti-K ou anti-Pk provenant d'une chèvre,
correctement dilué dans un mélange de :
- tampon de phosphate dont le pH est compris entre o,5
environ eL 8 environ, de préférence egal à 7,2 environ,
et dont la concentration molaire est comprise entre
20 mmoles environ et 130 mmoles environ, de préférence
égale à 70 mmolec environ
- chlorure de sodium dont la concentration molaire est
comprise entre 20 mmoles environ et 150 mmoles environ1
de préférence égale à 70 mmoles environ ,
- sel dîsodique d'EDTA dont la concentration molaire est
comprise entre 25 mmoles environ et 50 mmoles environ,
de préférence égale à 33 mmoles environ
- azoture de sodium dont la concentration molaire est
comprise entre 15 mmoles environ et 50 mmoles environ,
de préférence égale à 31 mmoles environ, et
- sérum normal de chèvre dont la concentration volume/
volume est comprise entre 0,0 % environ et 0,5%
environ de préférence égale à 0,1 % environ 2) Un tampon de référence (à utiliser pour déterminer la
capacité de fixation maximale du système anticorps ++
antigène radiomarqué) comprenant
- un tampon de phosphate dont le pH est compris entre
6,5 environ et 8 environ, de préférence égal à 7,2
environ, et dont la concentration molaire est comprise
entre 20 mmoles environ et 150 mmoles environ, de
préférence égale à 70 mmoles environ
- du chlorure de sodium dont la concentration molaire est
comprise entre 20 mmoles environ et 150 mmoles environ,
de préférence égale à 70 mmoles environ
- de l'azoture de sodium dont la concentration molaire
est comprise entre 15 mmoles environ et 50 mmoles
environ, de préférence égale à 31 mmoles environ ; et
- de la sérum albumine de boeuf dont la concentration
poids/volume est comprise entre 0,1 % environ et 1 %
environ, de préférence égale à 0,4 % environ 3) Un marqueur comprenant :
des déterminants antigéniques K ou Pk ou un mélange
antigénique K/Pk radiomarqués à l'iode 125, dilués dans le
tampon de référence 2) de manière à avoir une concentra
tion de 1,5 ng/ml avec une activité spécifique d'environ
60 mCi/mg ; 4) un antisérum anti-immunoglobulines de chèvre précipitant,
correctement dilué dans le tampon de référence 2) 5) un témoin négatif : plasma humain négatif à l'essai,
c'est-à-dire plasma humain normal ; et 6) un témoin positif : plasma humain positif à essai,
c'est-à-dire plasma humain provenant d'un patient atteint
d'adénocarcinome ou plasma humain normal auquel une
quantité connue de déterminants antigéniques K ou Pk ou
d'un mélange antigénique K/P k a été ajoutée.The buffers may be, for example, phosphate buffers, optionally mixed with inorganic salts such as, for example, sodium chloride
In a most preferred embodiment, a kit for RIA detection of antigenic determinants K or Pk contains: 1) an anti-K or anti-Pk antibody from a goat,
properly diluted in a mixture of:
- phosphate buffer whose pH is between 0.5
about eL 8, preferably about 7.2,
whose molar concentration is between
About 20 mmoles and about 130 mmoles, preferably
equal to about 70 mmolec
- sodium chloride whose molar concentration is
between about 20 mmol and about 150 mmol
preferably equal to about 70 mmol,
- EDTA sodium salt, the molar concentration of which is
between about 25 mmol and about 50 mmol,
preferably equal to about 33 mmoles
- sodium azide whose molar concentration is
between about 15 mmol and about 50 mmol,
preferably equal to about 31 mmol, and
- normal goat serum whose volume concentration /
volume is between about 0.0% and 0.5%
preferably about 0.1%. 2) A reference buffer (to be used to determine the
maximum binding capacity of the antibody system ++
radiolabeled antigen) comprising
a phosphate buffer whose pH is between
About 6.5 and about 8, preferably 7.2
approximately, and whose molar concentration is included
between about 20 mmoles and about 150 mmoles,
preferably equal to about 70 mmoles
sodium chloride whose molar concentration is
between about 20 mmol and about 150 mmol,
preferably equal to about 70 mmoles
- sodium azide whose molar concentration
is between about 15 mmol and 50 mmol
about, preferably about 31 mmol; and
- serum albumin of beef whose concentration
weight / volume is between about 0.1% and 1%
about 0.4%, preferably about 3). A marker comprising:
antigenic determinants K or Pk or a mixture
antigenic K / Pk radiolabeled with iodine 125, diluted in
reference buffer 2) so as to have a concentra
1.5 ng / ml with a specific activity of approximately
60 mCi / mg; 4) a goat anti-immunoglobulin antiserum precipitating,
correctly diluted in reference buffer 2) 5) negative control: negative human plasma tested,
that is, normal human plasma; and 6) a positive control: test positive human plasma,
that is, human plasma from a patient with
of adenocarcinoma or normal human plasma to which a
known quantity of antigenic determinants K or Pk or
a K / P antigenic mixture was added.
Pour une méthode de dosage enzymo-immunologique permettant la détection des déterminants antigéniques K ou pk dans des fluides biologiques ou dans des extraits de tissus selon la méthode EIA du type sandwich décrite ci-dessus dans le présent mémoire descriptif, on peut utiliser une combinaison de réactifs contenant essentiellement, par exemple 1) les anticorps anti-K ou respectivement antipk fixés à
une phase solide ; 2) les anticorps anti-K ou anti-Pk respectifs conjugués à
une enzyme 3) un substrat enzymatique ; 4) des témoins ; et 5) des tampons.For an enzymo-immunological assay method for detecting K or pk antigenic determinants in biological fluids or tissue extracts according to the sandwich-type EIA method described hereinabove, a combination of reagents containing essentially, for example 1) anti-K or antipk antibodies attached to
a solid phase; 2) the respective anti-K or anti-Pk antibodies conjugated to
an enzyme 3) an enzymatic substrate; 4) witnesses; and 5) buffers.
La combinaison de réactifs ci-dessus peut contenir en outre d'autres constituants tels que, par exemple, un agent de blocage de la réaction enzymatique et, en outre, ainsi qu'on l'a déjà di, des substances tensio-actives, des stabilisateurs, des agents antimicrobiens, des activateurs enzymatiques, etc. The combination of reagents above may further contain other components such as, for example, a blocking agent for the enzymatic reaction and, in addition, as already known, surface-active substances, stabilizers, antimicrobial agents, enzymatic activators, etc.
Les anticorps anti-K ou anti-P du constituant a) peuvent outre, par exemple absorbés sur des perles de polystyrène. The anti-K or anti-P antibodies of component a) can, for example, be absorbed on polystyrene beads.
Te constituant 2) conjugué à une enzyme peut hêtre, par exemple, des anticorps anti-K ou anti-Pk conjugués avec l'enzyme ss-galactosidase, selon des méthodes connues déjà exposées dans le présent mémoire descriptif. Component 2) conjugated to an enzyme may be, for example, anti-K or anti-Pk antibodies conjugated with the enzyme β-galactosidase, according to known methods already set forth in this specification.
Le constituant 3), substrat enzymatique, peut être, par exemple, n' importe quel substrat chromogène qui est spécifique à 'enzyme d constituant 2) g si c'est la X- galactosidase qui est utilisée comme enzyme, un substrat chromogène approprié peut être, par exemple, 1' ortho-nitro- phénylgalactopyranoside. Component 3), an enzyme substrate, may be, for example, any chromogenic substrate which is specific for the enzyme of component 2). If X-galactosidase is used as the enzyme, an appropriate chromogenic substrate can be used. for example, ortho-nitrophenylgalactopyranoside.
Les témoins 4) et les tampons 5) peuvent être ceux qui ont déjà été spécifies pour la trousse RIA. Controls 4) and buffers 5) may be those that have already been specified for the RIA kit.
L'agent de blocage éventuel de la réaction enzymatique peut être, par exemple, lorsque c'est la S- galactosidase qui est utilisée comme enzyme, un carbonate de métal alcalin, le carbonate de sodium par exemple. Dans une forme de réalisation particulièrement préférée, une trousse permettant la détection par la méthode précitée EIA de type sandwich, des déterminants antigéniques K ou Pk comprend 1) des anticorps anti-K ou respectìvement anti-Pk absorbés
sur des perles de polystyrène 2) un tampon diluant contenant
- un tampon de phosphate dont le pH est compris entre
6,5 environ et 8 environ, de préférence égal à 7,2
environ, et dont la concentration molaire est comprise
entre 50 mmoles environ et 150 mmoles environ, de
préférence égale à 70 mmoles environ
- du chlorure de sodium dont la concentration molaire
est comprise entre 50 mmoles environ et 150 mmoles
environ, de préférence égale à 70 mmoles environ
- de l'azoture de sodium dont la concentration molaire
est comprise entre 15 mmoles environ et 50 mmoles
environ, de préférence égale à 31 mmoles environ ;
et
- de la sérum albumine de boeuf dont la concentration
poidsjvolume est comprise entre 0,5 % environ et 3 z
environ, de préférence égale à 1 % environ ; 3) les anticorps anti-K ouanti-pk respectifs conjugués à de
la -galactosidase, correctement dilués dans le tampon
2) ; 4) un substrat enzymatique contenant
- de l'ortho-nitrophénylgalactopyranoslde dont la
concentration molaire est comprise entre 2 mmoles
environ et 4 mmoles environ, de préférence égale à
2,3 mmoles environ ; et
- un tampon de phosphate dont le pH est compris entre
6,5 environ et 8 environ, de préférence égal à 7,2
environ, et dont la concentration molaire est
comprise entre 10 mmoles environ et 30 mmoles environ,
de préférence égale à 15 mmoles environ ; 5) un agent de blocage de la réaction enzymatique, qui
contient du carbonate de sodium à une concentration
molaire comprise entre 0,25M environ et 2 M environ, de
préférence égale à 1 M environ 6) un témoin négatif : plasma humain négatif à l'essai,
c'est-à-dire plasma humain normal ; et 7) un témoin positif : plasma humain positif à essai,
c'est-à-dire plasma humain provenant d'un patient atteint
d'adénocarcinome, ou plasma humain normal auquel on a
ajouté une quantité connue de déterminants antigéniques
K ou pk ou d'un mélange antigénique K/pk
Pour le dosage histochimique des déterminants antigéniques K ou pk sur des coupes de tissus selon le mode opératoire déjà décrit dans le présent mémoire descriptif, une combinaison de réactifs utilisables peut être, par exemple, une trousse contenant essentiellement 1) des anticorps anti-K ou respectivement anti-Pk 2) des anticorps marqués par enzyme qui sont spécifiques aux
immunoglobulines de l'espèce dans laquelle les anticorps
anti-K ou anti-Pk respectifs du constituant 1) ont pris naissance 3) un substrat enzymatique ; et 4) des tampons. The possible blocking agent of the enzymatic reaction may be, for example, when it is S-galactosidase which is used as an enzyme, an alkali metal carbonate, sodium carbonate for example. In a particularly preferred embodiment, a kit for detection by the aforementioned sandwich-type EIA method of K or Pk antigenic determinants comprises 1) anti-K or anti-Pk antibodies absorbed
on polystyrene beads 2) a diluent buffer containing
a phosphate buffer whose pH is between
About 6.5 and about 8, preferably 7.2
approximately, and whose molar concentration is included
between about 50 mmol and about 150 mmol of
preferably equal to about 70 mmoles
- sodium chloride whose molar concentration
is between about 50 mmol and 150 mmol
about, preferably about 70 mmoles
- sodium azide whose molar concentration
is between about 15 mmol and 50 mmol
about, preferably about 31 mmol;
and
- serum albumin of beef whose concentration
weight is between about 0.5% and 3%
about, preferably about 1%; 3) the respective anti-K or anti-pk antibodies conjugated to
-galactosidase, properly diluted in the buffer
2); 4) an enzymatic substrate containing
ortho-nitrophenylgalactopyranoside, the
molar concentration is between 2 mmol
about 4 mmol, preferably equal to
About 2.3 mmoles; and
a phosphate buffer whose pH is between
About 6.5 and about 8, preferably 7.2
approximately, and whose molar concentration is
between about 10 mmol and about 30 mmol,
preferably equal to about 15 mmol; 5) an enzymatic reaction blocking agent, which
contains sodium carbonate at a concentration
molar range from about 0.25M to about 2M,
preferably equal to 1 M about 6) a negative control: negative human plasma under test,
that is, normal human plasma; and 7) a positive control: positive human plasma test,
that is, human plasma from a patient with
adenocarcinoma, or normal human plasma that has been
added a known amount of antigenic determinants
K or pk or antigenic mixture K / pk
For the histochemical assay of K or pk antigenic determinants on tissue sections according to the procedure already described herein, a combination of reagents that may be used may be, for example, a kit containing essentially 1) anti-K antibodies or respectively anti-Pk 2) enzyme-labeled antibodies that are specific to
immunoglobulins of the species in which the antibodies
respective anti-K or anti-Pk of component 1) have originated 3) an enzymatic substrate; and 4) buffers.
D'autres constituants peuvent être inclus dans la trousse ci-dessus tels que par exemple un agent de blocage servant à éliminer les interactions aspécifiques éventuellement gênantes, un agent colorant de contraste (pour les noyaux) et, en outre, ainsi qu'on l'a déjà dit, des substances tensic-actives, des stabilisateurs, des agents antimicrobiens, des activateur s d'enzyme, etc
Dans la combinaison de réactifs ci-dessus, on peut donner naissance, par exemple, aux anticorps anti-K ou antipk chez la chèvre, puis les anticorps du constituant 2) seront des anticorps anti-immunoglobulines de chèvre et seront cultivés, par exemple, chez l'âne. les anticorps marqués r)ar enzyme du constituant 2) peuvent être, par exemple, des anticorps marqués par la ss-galactosidase, obtenus par des techniques connues ainsi qu'on l'a déjà dit.Other components may be included in the above kit such as, for example, a blocking agent for removing potentially troublesome nonspecific interactions, a contrast dye (for the nuclei), and, in addition, have already said, surfactants, stabilizers, antimicrobial agents, enzyme activators, etc.
In the combination of reagents above, one can give rise, for example, anti-K or antipk antibodies in the goat, then the antibodies of component 2) will be anti-goat immunoglobulin antibodies and will be grown, for example, at the donkey. for example, the antibodies labeled with the enzyme of component 2) may be antibodies labeled with β-galactosidase, obtained by known techniques as has already been said.
Le constituant substrat enzymatique 3) peut être toute substance qui est spécifique à l'enzyme du constituant 2) et qui est capable de donner un produit cooré et insoluble par l'action de l'enzyme : si c'est la 6-galacto- sidase qui est utilisée comme enzyme, un substrat chromogène utile peut être, par exemple, un indolylgalactoside, en particulier le 5-bromo-4-chloro-indolyl- galactoside. The enzymatic substrate component 3) can be any substance which is specific for the enzyme of component 2) and which is capable of giving a product which is coorinated and insoluble by the action of the enzyme: if it is 6-galacto- sidase which is used as an enzyme, a useful chromogenic substrate may be, for example, an indolylgalactoside, in particular 5-bromo-4-chloroindolylgalactoside.
Les tampons peuvent être, par exemple, des tampons de phosphate ou "Tris" dont le pH est compris entre 6,5 , 5 environ et 8 environ et est de préférence égal å 7,3 environ. The buffers may be, for example, phosphate or "Tris" buffers having a pH of from about 6.5 to about 8 and is preferably about 7.3.
L'agent de blocage qui est éventuellement requis pour éliminer les interférences résultant d'interactions aspécifiques, peut être, par exemple, du sérum d'âne normal pour le cas où il est donné naissance aux anticorps du constituant 2) chez l' ne. The blocking agent that may be required to eliminate interferences resulting from nonspecific interactions may be, for example, normal donkey serum for the case where the antibodies of component 2) are born in the ne.
L'agent colorant de contraste peut contenir, par exemple, de l'acide carminique. The contrast dye may contain, for example, carminic acid.
Selon une forme de réalisation particulièrement préférée, une trousse permettant la démonstration histochimique des déterminants antigéniques K ou pk sur des coupes de tissus contient 1) un tampon de lavage comprenant
- un tampon "Tris" ou de phosphate dont le pH est compris
entre 6,5 environ et 8 environ et est de préférence
égal à 7,3 environ, et dont la concentration molaire
est comprise entre 5 mmoles et 100 mmoles environ et
est de préférence égale à 10 mmoles environ ; et
- du chlorure de sodium dont la concentration molaire
est comprise entre 50 mmoles environ et 200 mmoles
environ et est de préférence égale à 150 mmoles
environ 2) un tampon de blocage comprenant les mêmes constituants
que le tampon de lavage 1) ci-dessus et, de plus, du
sérum d'âne normal à une concentration volume/volume
comprise entre 1 % environ et 5 % environ et de
préférence égale à 3 % environ 3) des anticorps anti-K ou anti- respectifs, cultivés chez
la chèvre, correctement dilués dans le tampon 1) ci
dessus ; 4) des anticorps anti-immunoglobulines de chèvre conjugués
à la (3-galactosidase, cultivés chez l'âne et correctement
dilués dans le tampon 1) ci-dessus 5) un substrat enzymatique contenant
un tampon de phosphate dont le pH est compris entre 7
environ et 8 environ et est de préférence égal à 7,4
environ, et dont la concentration molaire est comprise
entre 5 mmoles environ et 50 mmoles environ et est de
préférence égale à 10 mmoles environ
- du chlorure de sodium dont la concentration molaire
est comprise entre 5 mmoles environ et 50 mmoles
environ et est de préférence égale à 10 mmoles environ
- du chlorure de magnésium dont la concentration molaire
est comprise entre 0,1 mmole environ et 2 mmoles
environ et est de préférence égale à 1 mmole environ
- du 5-bromo-4-chloro-indolylgalactoside dont la
concentration molaire est comprise entre 0,5 mmole
environ et 5 irmoles environ et est de préférence
égale à 1 mmole environ
- du ferrocyanure da potassium dont la concentration
molaire est comprise entre 3 mmoles environ et 10
mmoles environ et est de préférence égale à 6 mmoles
environ ; et
- du ferricyanure de potassium dont la concentratIon
molaire est comprise entre 3 mmoles environ et 10
mmoles environ et est de préférence égale à 6 ntmcles
environ ; 6) un agent colorant de contraste contenant
- de l'acide carminique dont la concentration poids/
volume est comprise entre 1 gXl et 10 g/l environ et
et est de préférence égale à 2,5 g/l environ ; et
- du sulfate de potassium et dealuminium dont la
concentration molaire est comprise entre 25 mmoles
environ et 150 mmoles environ et est de préférence
égale à 50 mmoles environ.According to a particularly preferred embodiment, a kit allowing the histochemical demonstration of the antigenic determinants K or pk on tissue sections contains 1) a washing buffer comprising
a buffer "Tris" or phosphate whose pH is included
between about 6.5 and about 8 and is preferably
equal to about 7.3, and whose molar concentration
is between 5 mmol and 100 mmol and
is preferably equal to about 10 mmol; and
- sodium chloride whose molar concentration
is between about 50 mmol and 200 mmol
about and is preferably equal to 150 mmol
about 2) a blocking buffer comprising the same constituents
washing buffer 1) above and, in addition, the
normal donkey serum at a volume / volume concentration
between about 1% and about 5% and
preferably about 3% 3) anti-K or anti-respective antibodies grown in
the goat, properly diluted in the buffer 1) ci
above ; 4) Conjugated goat anti-immunoglobulin antibodies
with 3-galactosidase, grown in the donkey and correctly
diluted in buffer 1) above 5) an enzymatic substrate containing
a phosphate buffer whose pH is between 7
approximately and approximately 8 and is preferably equal to 7.4
approximately, and whose molar concentration is included
between about 5 mmol and about 50 mmol and is
preferably equal to about 10 mmoles
- sodium chloride whose molar concentration
is between about 5 mmol and 50 mmol
about and is preferably about 10 mmol
magnesium chloride whose molar concentration
is between about 0.1 mmol and 2 mmol
about and is preferably equal to about 1 mmol
5-bromo-4-chloroindolylgalactoside, the
molar concentration is between 0.5 mmol
about 5 irmoles and is preferably
equal to about 1 mmol
- potassium ferrocyanide whose concentration
molar is between about 3 mmol and 10
mmoles and is preferably 6 mmol
about ; and
- potassium ferricyanide, the concentration of which
molar is between about 3 mmol and 10
mmoles and is preferably equal to 6 ntmcles
about ; 6) a contrast coloring agent containing
carminic acid whose weight concentration
volume is between 1 gXl and about 10 g / l and
and is preferably about 2.5 g / l; and
- potassium sulfate and dealuminium whose
molar concentration is between 25 mmol
about 150 mmol and is preferably
equal to about 50 mmol.
Dans les formes de réalisation préférées décrites ci-dessus pour les combinaisons de réactifs selon l'invention, les concentrations indiquées sont les concentrations par litre auxquelles chaque constituant est présent dans la solution ou dans le mélange utilisé pour effectuer l'essai. In the preferred embodiments described above for the combinations of reagents according to the invention, the concentrations indicated are the concentrations per liter to which each constituent is present in the solution or in the mixture used to carry out the test.
L'utilisation des combinaisons de réactifs qui font l'objet de la présente invention dans les méthodes analytiques connues permettant la détermination des antigènes, y compris les méthodes de dosage immunologique en phase liquide et les méthodes de dosage immunologique en phase solide et des déterminations histochimiques, permet d'améliorer d'une manière significative la possibilité de poser le diagnostic des adnocarcinomes humains. The use of the reagent combinations which are the subject of the present invention in known analytical methods for the determination of antigens, including liquid-phase immunoassay methods and solid-phase immunoassay methods and histochemical determinations significantly improves the ability to diagnose human adenocarcinoma.
La possibilité de détecter, selon l'invention, uniquement les déterminants antigéniques (K) qui sont spécifiques aux adénocarcinomes sans interférence découlant de la présence des déterminants antigéniques pn ou bien les déterminants antigéniques (P k) qui sont associés aux déterminants K sur les adénocarcinomes, permet de parvenir à de meilleurs diagnostics que ceux obtenus avec les trousses connues, disponibles dans le commerce, pour le dosage CEA en erfet, avec les procédés et les réactifs selon l'invention, on observe un nombre nettement réduit de faux résultats positifs. The possibility of detecting, according to the invention, only the antigenic determinants (K) which are specific for adenocarcinomas without interference resulting from the presence of the pn antigenic determinants or the antigenic determinants (P k) which are associated with the K determinants on adenocarcinomas , makes it possible to achieve better diagnoses than those obtained with the known commercially available kits for the CEA assay, with the methods and reagents according to the invention, there is a markedly reduced number of false positive results.
Les résultats obtenus à partir d'expériences menées avec les procédés et les réactif s selon l'invention sur de nombreux cas de pathologies non néoplastiques, y compris de nombreuses pathologies de dégénérescence inflammatoire, et aussi de pathologies néoplastiques, ont été caractérisés par des pourcentages de faux résultats positifs et, respectivement, de faux résultats négatifs, plus faibles que ceux observés dans les cas où on utilise les trousses connues pour le dosage CEA, utilisant des anticorps anti-CEA (par exemple l'essai CEA de Roche etla trousse CEA de Liso-phase). The results obtained from experiments carried out with the methods and reagents according to the invention on numerous cases of non-neoplastic pathologies, including numerous pathologies of inflammatory degeneration, and also of neoplastic pathologies, have been characterized by percentages. False positive results and, respectively, false negative results, lower than those observed in cases where the known CEA kits are used, using anti-CEA antibodies (eg Roche CEA test and CEA kit) of Liso-phase).
Lorsque, en particulier, on a procédé à des expériences comparatives par analyse de préparations histologiques avec les réactifs selon la présénte invention, d'une part, et avec des trousses disponibles dans le commerce, d'autre part, par exemple ',DAKO PAP KIT" et 'IIMMULOR HISTO
SET", on a observé que, alors que les trousses connues donnent une réaction positive même sur certaines cellules normales, avec un pourcentage d'erreur particulièrement élevé, par exemple dans le cas de l'analyse des tissus de la moelle des os, les réactifs selon l'invention révèlent exclusivement les cellules métastatiques d'adénocarcinome, sans aucun faux résultat positif, c'est-à-dire sans aucune coloration positive des cellules normales, des granulocytes par exemple, ce qui n'est pas du tout le cas avec les trousses disponibles dans le commerce auxquelles ils ont été comparés. Les nouveaux anticorps anti-K, polyclonaux ou monoclonaux, ou bien les anticorps anti-Pk, faisant l'objet de la présente invention, ainsi que les fragments d'anticorps anti-K ou anti-Pk, par exemple les fragments
Fab' ou F(ab')2, peuvent etre utilises comme marqueurs, par exemple, en médecine nucléaire et en chue radioimmunologique. C'est ainsi, par exemple, que l'on peut marquer lesdits anticorps ou fragments d'anticorps avec des radio-isotopes, par exemple i31 I, et injecter les radiomarqueurs ainsi obtenus dans le corps humain pour visualIser et localiser les éventuelles cellules ou masses d'sdéno- carcinome. La visualisation du marqueur peut se faire par des méthodes connues à l'aide d'instruments spéciaux, par exemple à l'aide d'une γ-caméra. Especially when comparative experiments have been carried out by analysis of histological preparations with the reagents according to the present invention, on the one hand, and with commercially available kits, on the other hand, for example, DAKO PAP. KIT "and 'IIMMULOR HISTO
SET ", it has been observed that while the known kits give a positive reaction even on certain normal cells, with a particularly high percentage of error, for example in the case of marrow tissue analysis, the The reagents according to the invention exclusively reveal adenocarcinoma metastatic cells, without any false positive result, that is to say without any positive staining of normal cells, granulocytes for example, which is not at all the case. The new anti-K, polyclonal or monoclonal antibodies, or the anti-Pk antibodies, the subject of the present invention, as well as the anti-human antibody fragments, were compared with the commercially available kits to which they were compared. K or anti-Pk, for example fragments
Fab 'or F (ab') 2 can be used as markers, for example, in nuclear medicine and radioimmunoassay. For example, it is possible to label said antibodies or antibody fragments with radioisotopes, for example, I31I, and to inject the radiolabel thus obtained into the human body in order to visualize and locate the possible cells or sdenocarcinoma masses. The display of the marker can be done by known methods with the aid of special instruments, for example by means of a gamma camera.
Une autre application das nouveaux anticorps anti-K, polyclonaux ou monoclonaux, ou ou des nouveaux anticorps anti
Pk, ou de fragments de ceux-ci, faisant l'objet de la présente invention est la thérapie des adénocarcinomes humains La possibilité utiliser des anticorps anti-K ou anti-pk respec-tifs spécifiques qui sont capables de reconnaître exclusivement les cellules d'adénocarcinome sans reconnaître les cellules normales, permet de réaliser une chimiothèrapie des tumeurs qui est spécifiquement et exclusivement dirigée sur les masses tumorales.Another application of new anti-K, polyclonal or monoclonal antibodies, or new anti-antibodies
Pk, or fragments thereof, which are the subject of the present invention is the therapy of human adenocarcinomas The possibility of using specific anti-K or anti-pk antibodies that are capable of recognizing cells exclusively. adenocarcinoma without recognizing normal cells, allows for tumor chemotherapy that is specifically and exclusively directed to tumor masses.
Pour cette application, on peut conjuguer lesdits nouveaux anticorps ou fragments d'anticorps précités avec des médicaments antitumoraux ou avec d'autres agents cytotoxiques, et injecter le produit résultant au patient de telle sorte que le médicament ou l'agent cytotoxique ne soit spécifiquement transporté par le porteur d'anticorps que vers les cellules ou les masses tumorales. For this application, said novel antibodies or antibody fragments can be conjugated with antitumor drugs or other cytotoxic agents, and the resulting product can be injected into the patient so that the drug or cytotoxic agent is not specifically transported. by the antibody carrier only to the cells or tumor masses.
Les médicamentsantitumoraux peuvent être, par exemple, la daunorubicine, la doxorubicine, l'épirubicine et le méthotrexate. Antitumoral drugs may be, for example, daunorubicin, doxorubicin, epirubicin and methotrexate.
Un agent cytotoxique peut être, par exemple la ricine. A cytotoxic agent may be, for example, ricin.
La conjugaison du médicament antitumoral ou de 1'agent cytotoxique, par exemple l'un de ceux qui ont été mentionnés ci-dessus, avec un anticorps anti-K ou anti-pK polyclonal ou monoclonal selon l'invention peut se faire selon des modes opératoires connus, par exemple ceux qui sont décrits dans J. Immun. Methods 59, 129-143 (1983). Les conjugués formés entre un médicament antitumoral ou un agent cytotoxique, par exemple l'un de ceux déjà indiqués, et un anticorps anti-K ou anti-Pk polyclonal ou monoclonal, constituent un autre objet de l'invention. The conjugation of the antitumor drug or the cytotoxic agent, for example one of those mentioned above, with a polyclonal or monoclonal anti-K or anti-pK antibody according to the invention can be carried out according to known procedures, for example those described in J. Immun. Methods 59, 129-143 (1983). The conjugates formed between an antitumor drug or a cytotoxic agent, for example one of those already indicated, and a polyclonal or monoclonal anti-K or anti-Pk antibody, constitute another subject of the invention.
La présente invention procure par conséquent également un procédé amélioré de chimiothérapie spécifique et focalisée des adénocarcinomes humains, dans lequel on fait en sorte que l'effet du médicament se développe exclusivement sur les cellules tumorales et que les cellules normales ne soient nullement affectées par le médicament. The present invention therefore also provides an improved method of specific and focused chemotherapy of human adenocarcinomas, wherein the effect of the drug is developed exclusively on the tumor cells and normal cells are not affected by the drug. .
Dans le présent mémoire descriptif, les abréviations EDTA, "Tris", PBS, PEG, HPLC, IgG, mCi, mM,
P/V, V/V, DEAE, SDS, DOC, CPC désignent respectivement l'acide éthylènediamine-tétra-acétique, le tris-(hydroxyméthyl)aminométhane, une solution saline tamponnée par phosphate, le polyéthylèneglycol, la chromatographie liquide à haute performance, une ou des immunoglobulines, le milli
Curie, le nombre de millimoles, le rapport poids/volume, le rapport volume/volume, la diéthylaminoéthyl cellulose, le dodécyl sulfate de sodium, le désoxycholate de sodium, et le chlorure de cétyl pyridinium
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter en aucune manière.In the present specification, the abbreviations EDTA, "Tris", PBS, PEG, HPLC, IgG, mCi, mM,
P / V, V / V, DEAE, SDS, DOC, CPC are respectively ethylenediamine tetraacetic acid, tris (hydroxymethyl) aminomethane, phosphate buffered saline, polyethylene glycol, high performance liquid chromatography , one or more immunoglobulins, the milli
Curie, number of millimoles, weight / volume ratio, volume / volume ratio, diethylaminoethyl cellulose, sodium dodecyl sulfate, sodium deoxycholate, and cetyl pyridinium chloride
The following examples illustrate the invention without however limiting it in any way.
EXEMPLE 1
On a congelé à - 80"C pendant 24 heures 100 g de métastases hépatiques d'adénocarcinome du côlon, puis on les a homogénéisées sous haute pression à l'aide d'un instrument "X-press" de LKB. On a repris lthomogenéisat avec trois volumes d'une solution aqueuse 0,025 M de saccharose, puis on lui a ajouté un volume égal de HCl04 2 N. Après centrifugation (10.000 g pendant 20 minutes à 40C) et dialyse du surnageant avec de l'eau distillé, on a effectué une precipitation avec du KCl 3 M pendant 24 heures à 40C sous agitation. On a à nouveau centrifugé le mélange (100.000 g pendant une heures à 40C), puis on a dialysé le surnageant avec un tampon de phosphate-0,005 M à pH 6,75. EXAMPLE 1
100 g of hepatic adenocarcinoma liver metastases were frozen at -80 ° C for 24 hours and then homogenized under high pressure using an LKB X-press instrument. with three volumes of a 0.025 M aqueous solution of sucrose, then an equal volume of 2N HCl04 was added thereto. After centrifugation (10,000 g for 20 minutes at 40 ° C.) and dialysis of the supernatant with distilled water, precipitated with 3M KCl for 24 hours at 40 ° C. with stirring The mixture was again centrifuged (100,000 g for one hour at 40 ° C.) and the supernatant was dialyzed with 0.005 M phosphate buffer at pH 6 75.
On a contrôlé l'extrait par RIA à partir de l'inhibition produite sur la capacité de fixation d'un système 125I-K # anti-K ou 125I-K/Pk # anti-K, puis on lui a fait subir une chromatographie dans une colonne de DEAE cellulose (1,6x 5 cm) préalablement équilibrée avec un tampon de phosphate 0,005 X à PH 6,75. On a procédé à des élutions successives avec 40 ml d'un tampon de phosphate 0,025 M à pH 6,75, avec 40 m d'un tampon de phosphate 0,05 M à pH 6,75, puis avec 40 ml d'un tampon de phosphate 0,1 M à pH 6,75.On a contrôlé chaque fraction éluée par RIA comme indiqué ci-dessus, puis on a concentre à 5 ml. On a encore purifié les fractions 0,025 M et 0,05 M par filtration sur gel (4 ml/heure) dans une colonne de "Sephadex" (marque déposée) G 200 (~ 1,6 cm ; hauteur 100 cm) tamponnée à pH 4,65 avec une solution aqueuse contenant du NaH2PO4 0,05 M et du NaCl à 0,9 %. On a ainsi élué deux pics et on a à nouveau contrôlé chacun d'eux par RIA, comme indiqué ci-dessus, et également avec un système 125I-Pk # anti-Pk afin de connaître sa teneur en activité antigénique K et Pk. Il a été confirmé que les deux pics correspondaient à un mélange de déterminants antigéniques K et pk avec une concentration en
K plus grande dans le premier pic que dans le second.The RIA extract was checked from the inhibition produced on the binding capacity of 125I-K # anti-K or 125I-K / Pk # anti-K system and then chromatographed. in a DEAE cellulose column (1.6x5 cm) previously equilibrated with 0.005 X phosphate buffer at pH 6.75. Successive elutions were carried out with 40 ml of a 0.025 M phosphate buffer at pH 6.75, with 40 m of a 0.05 M phosphate buffer at pH 6.75 and then with 40 ml of a 0.1 M phosphate buffer at pH 6.75. Each fraction eluted by RIA was checked as above, then concentrated to 5 ml. The 0.025 M and 0.05 M fractions were further purified by gel filtration (4 ml / hr) in a column of "Sephadex" G 200 (~ 1.6 cm, height 100 cm) buffered to pH. 4.65 with an aqueous solution containing 0.05 M NaH2PO4 and 0.9% NaCl. Two peaks were thus eluted and each of them was again controlled by RIA, as indicated above, and also with a 125I-Pk # anti-Pk system in order to know its antigenic activity content K and Pk. Both peaks were confirmed to be a mixture of antigenic determinants K and pk with a concentration of
K greater in the first peak than in the second.
EXEMPLE 2
On a centrifuge 5 litres de plasma humain normal à 5.000 g pendant 15 minutes à 4 C, puis on a extrait le surnageant avec un volume égal de HClO4 1,2 M.EXAMPLE 2
5 liters of normal human plasma were centrifuged at 5,000 g for 15 minutes at 4 ° C. and the supernatant was then extracted with an equal volume of 1.2M HClO4.
On a dialysé l'extrait avec de l'eau courante pendant 24 heures puis à nouveau avec de l'eau bidistillée pendant encore 24 heures. Après avoir concentré de 10 à 20 fois à l'aide d'une cellule "Amicon" et par dialyse avec du
PBS à pH 7,2, on a ajouté à l'extrait du "Tween" 80 à 0,5 % (pour éviter des interactions non spécifiques), puis on lui a fait subir une chromatographie dans une colonne de bic- absorption de "Sepharose" (marque déposée) 4B portant les anticorps anti-Pn liés à la résine.The extract was dialyzed with running water for 24 hours and then again with bidistilled water for another 24 hours. After concentrating 10 to 20 times with an "Amicon" cell and dialysis with
PBS at pH 7.2, was added to the 0.5% "Tween" 80 extract (to avoid nonspecific interactions), and then chromatographed in a 2 "bicsorption column. Sepharose ™ (Trade Mark) 4B carrying the anti-Pn antibodies bound to the resin.
La fraction s'est liée à la résine pendant le processus d'élution (déterminants antigéniques Pn), puis on l'a détachée de la résine elle-même au moyen d'une solution de thiocyanate d'ammonium dans du PBS 3 M, selon le mode opératoire décrit dans J. of Solid-Phase Biochemistry 2, 45, 1977. The fraction bound to the resin during the elution process (Pn antigenic determinants), then detached from the resin itself using a solution of ammonium thiocyanate in 3M PBS, according to the procedure described in J. of Solid-Phase Biochemistry 2, 45, 1977.
On a dialysé le produit obtenu avec de l'eau distillée et avec du PBS à pH 7,2, puis on l'a contrôlé par
RIA en mesurant l'inhibition de la capacité de fixation d'un système 125I-Pn # anti-Pn.The product obtained was dialyzed with distilled water and PBS pH 7.2, and then monitored by
RIA by measuring the inhibition of the attachment capacity of an anti-Pn 125I-Pn # system.
Il a été ainsi confirmé que le contenu correspondait à des déterminants antigéniques p n à une concentration de 50 /ml, déterminée par la méthode de Lowry. It was thus confirmed that the content corresponded to antigenic determinants p n at a concentration of 50 / ml determined by the Lowry method.
EXEMPLE 3
On a fait subir à une solution de PBS à pH 7,2, contenant du Tween 80 (0,5 %)- et le mélange antigénique K/Pk (1 mg/ml) obtenu dans l'Exemple 1 (premier pic d'élution), une chromatographie dans une colonne de bio-absorption de "Sepharose" 4 B fixant des anticorps antipk. EXAMPLE 3
A solution of PBS at pH 7.2, containing Tween 80 (0.5%) - and the K / Pk antigenic mixture (1 mg / ml) obtained in Example 1 (first peak of elution), a chromatography in a column of bioabsorption of "Sepharose" 4 B fixing antipk antibodies.
On a concentré à un petit volume la fraction non fixée contenant les déterminants antigéniques K, et on l'a contrôlée par RIA en mesurant l'inhibition de la capacité de fixation d'un système RIA 125I-K # anti-K. The unbound fraction containing the antigenic determinants K was concentrated to a small volume and was monitored by RIA by measuring the inhibition of the binding capacity of an 125 I-K anti-K RIA system.
Il a été ainsi confirmé que la fraction non fixée contenait des déterminants antigéniques K à une concentration de O,1 mg/ml dans le mélange de PBS et de Tween. It was thus confirmed that the unbound fraction contained antigenic determinants K at a concentration of 0.1 mg / ml in the mixture of PBS and Tween.
On a détache la fraction fixée, c'est-à-dire la fraction qui s'était liée aux anticorps anti-Pk de la colonne, par élution avec une solution de thiocyanate d'ammonium dans du PBS 3 M, selon le mode opératoire indiqué à l'Exemple 2. On a ensuite dialysé l'éluat avec de l'eau bidistillée puis avec du PBS, et on a contrôlé son contenu par RIA à partir de l'inhibition de la capacité de fixation d'un système RIA 125I-Pk # anti-Pk. Il a été ainsi confirmé que la fraction éludée contenait des déterminants antigéniques pk à une concentration de 0,15 mg/ml. The bound fraction, i.e. the fraction bound to the anti-Pk antibodies from the column, was detached by elution with ammonium thiocyanate solution in 3M PBS, according to the procedure. as in Example 2. The eluate was then dialyzed with bidistilled water and then with PBS, and its contents were controlled by RIA from the inhibition of the attachment capacity of a 125I RIA system. -Pk # anti-Pk. It was thus confirmed that the eluted fraction contained antigenic determinants pk at a concentration of 0.15 mg / ml.
On a répété le même mode opératoire ci-dessus en utilisant une colonne de bio-absorption de "Sepharose" 4B fixant les anticorps antiP. Pendant l'élution du mélange antigénique k, les déterminants antigéniques pk se sont lies par réaction croisée avec les anticorps anti-Pn de la colonne, et cela a été prouve par le fait que des déterminants antigénlques P k, à une concentration de 0,1 5 mg/ml, ont été récupérés de la fraction fixée.Le contrôle du contenu en Pk a été à nouveau effectué par RIA, comme indiqué ci-dessus a l'aide d'un système RIA 125I-Pk # anti
Pk
EXEMPLE 4
On a émulsifié une solution dans le PBS du mélange antigénique K/P obtenu selon 1 Exemple 1, à une concentration de 1 mg/ml, avec un volume égal d1une suspension complète d'adj@vant de eursd. On a utilisé le mélange obtenu pour faire quatre inJectioes sous-cutanées en quatre endroits différents dans le dos d'une chèvre du Thibet. On a répété les injections trois fois a intervalles de quinze jours, Après la troisième injection, on a contrôlé la réponse immunologique : on a prélevé du sang de l'animal et on a contrôlé le titre du sérum de la manière suivante.On a fait incuber des dilutions en série du sérum pendant une nuit à 37 C avec 100 1 d'une solution de PBS contenant 1,5 ng/ml de déterminants antigéniques K radiomarqués à l'iode 125 ou bien, selon une autre méthode, d'un mélange antigénique K/Pk radiomarqué à l'iode 125.The same procedure was repeated above using a "Sepharose" bioabsorption column 4B binding the anti-P antibodies. During the elution of the antigenic mixture k, the antigenic determinants pk are crosslinked with the anti-Pn antibodies of the column, and this has been proved by the fact that antigenic determinants P k, at a concentration of 0, 1 5 mg / ml, were recovered from the fixed fraction.The Pk content control was again performed by RIA, as indicated above using a 125I-Pk # anti RIA system.
pk
EXAMPLE 4
A solution in PBS of the K / P antigenic mixture obtained according to Example 1 was emulsified at a concentration of 1 mg / ml, with an equal volume of a complete suspension of adjuvant εd. The resulting mixture was used to make four subcutaneous injections in four different places in the back of a Tibetan goat. The injections were repeated three times at fifteen-day intervals. After the third injection, the immunological response was checked: blood was taken from the animal and the serum titer was checked as follows. incubate serial dilutions of the serum overnight at 37 ° C with 100 L of a PBS solution containing 1.5 ng / ml 125 I radiolabeled antigenic determinants K or, alternatively, a K / Pk antigenic mixture radiolabeled with iodine 125.
après incubation, on a ajouté 0,1 ml d'un solution
PBS à 1/10 d'anti-immunoglobulines de chèvre cultivées chez le lapin et 0,1 ml d'une solution de PBS à 1/1000 d'un sérum normal de chèvre. On a ensuite centrifugé le mélange à 5000 g pendant 15 minutes à 4 C, on a enlevé le surnageant et on a mesuré la radio-activité à l'aide d'un compteur gamma sur le précipité. On a calculé le titre de l'antisérum sous la forme de a dilution d'anticorps capable de fixer 50 0 de l'antigène marqué total. On a constaté que l'antisérum K/Pk
obtenu avait un titre moyen de 1/50.000.after incubation, 0.1 ml of a solution was added
1/10 goat anti-immunoglobulin PBS in rabbits and 0.1 ml of 1/8000 PBS solution of normal goat serum. The mixture was then centrifuged at 5000 g for 15 minutes at 4 ° C., the supernatant was removed, and the radioactivity was measured with a gamma counter on the precipitate. The titre of the antiserum was calculated as an antibody dilution capable of binding 50% of the total labeled antigen. It has been found that K / Pk antiserum
obtained had an average title of 1 / 50,000.
En suivant un mode opératoire analogue mais en utilisant, à la place du mélange antigénique K/Pk, des déterminants antigeniques K ou des déterminants antigéniques pk obtenus selon l'Exemple 3, ou des déterminants antigéniques Pn obtenus selon l'Exemple 2, on a obtenu respectivement de l'antisérum anti-K, de l'antisérum antipk et de l'antisérum anti-P. By following a similar procedure but using, in place of the antigenic mixture K / Pk, antigenic determinants K or antigenic determinants pk obtained according to Example 3, or antigenic determinants Pn obtained according to Example 2, we have obtained respectively anti-K antiserum, antipk antiserum and anti-P antiserum.
EXEMPLE 5
On a traité 1 ml de l'antisérum anti-K/Pk obtenu à l'Exemple 4, par une solution de PEG 6.000 à 14 % dans 9 ml d'un tampon de "Veronal" 0,1 M à pH 8,6.EXAMPLE 5
1 ml of the anti-K / Pk antiserum obtained in Example 4 was treated with a 14% PEG 6.000 solution in 9 ml of a 0.1M Veronal buffer at pH 8.6. .
On a repris le précipité obtenu avec la plus petite quantité possible d'un tampon de phosphate 0,02 M ayant un pH de 8, et on l'a purifié sur DEAE cellulose. The resulting precipitate was taken up with the smallest possible amount of 0.02 M phosphate buffer having a pH of 8, and purified on DEAE cellulose.
On a fait à nouveau précipiter les protéines éluées dans le tampon de départ (5 ml) avec une solution de PEG 6.000 à 20 % dans un tampon de Veronal 0,1 M à pH 8,6 (45 ml). The eluted proteins were again precipitated in the starting buffer (5 ml) with a solution of PEG 6,000 at 20% in a 0.1 M Veronal buffer at pH 8.6 (45 ml).
On a repris le précipité avec du PBS et avec 1 ml de Tween 80 à 0,5 %, puis on l'a à nouveau purifié dans une colonne de bio-absorption de "Sephadex" 4B portant des antigènes K/Pk fixés.The precipitate was taken up with PBS and 1 ml of 0.5% Tween 80 and then purified again in a Sephadex bioabsorption column 4B carrying attached K / Pk antigens.
On a ensuite éliminé les immunoglobulines anti K/Pk qui étaient restées fixées à la colonne, par élution avec du thiocyanate d'ammonium selon le mode opératoire indiqué à l'Exemple 2, pour obtenir des anticorps anti-K/Pk. Anti-K / Pk immunoglobulins which remained attached to the column were then removed by elution with ammonium thiocyanate according to the procedure set forth in Example 2 to obtain anti-K / Pk antibodies.
Par un mode opératoire analogue, en partant des antisérums anti-K, anti-Pk et anti-Pn obtenus à l'Exemple k 4, on a obtenu respectivement des anticorps anti-K, anti-k et anti-Pn. By a similar procedure, starting from anti-K, anti-Pk and anti-Pn antisera obtained in Example k 4, anti-K, anti-k and anti-Pn antibodies were obtained respectively.
EXEMPLE 6
On a fait incuber pendant 24 heures à 370C, avec 8 ml de plasma humain normal, l'antisérum anti-K/Pk obtenu selon le mode opératoire de l'Exemple 4 (0,1 ml), et on a centrifugé le mélange à 5.000 g pendant 5 minutes à 40C. On a fait incuber à nouveau chaque fraction de 0,1 ml du surnageant pendant 24 heures à 370C avec 4 ml de plasma humain normal, et on l'a à nouveau centrifugée dans les mêmes conditions que celles indiquées ci-dessus.EXAMPLE 6
The anti-K / Pk antiserum obtained according to the procedure of Example 4 (0.1 ml) was incubated for 24 hours at 370 ° C. with 8 ml of normal human plasma, and the mixture was centrifuged at room temperature. 5,000 g for 5 minutes at 40C. Each 0.1 ml portion of the supernatant was re-incubated for 24 hours at 370 ° C. with 4 ml of normal human plasma, and again centrifuged under the same conditions as indicated above.
On a séparé le surnageant et on a contrôlé son activité immunologique à partir de sa capacité à fixer dans la même mesure un mélange antigénique K/Pk radiomarqué à l'iode 125, d'une part en présence et d'autre part en l'absence de plasma humain normal L'absence de réaction croisée avec le plasma humain normal, c'est-à-dire avec des déterminants antigéniques Pn, a prouvé que l'antisérum obtenu était de l'antisérum anti-K. The supernatant was separated and its immunological activity was monitored from its ability to bind to the same extent 125 I radiolabelled K / Pk antigenic mixture, both in the presence and on the other hand. Absence of Normal Human Plasma The absence of cross-reactivity with normal human plasma, i.e. with Pn antigenic determinants, proved that the antiserum obtained was anti-K antiserum.
On a porté le sérum obtenu aux dilutions appropriées et on l'a utilisé pour les déterminations immunologiques des déterminants antigéniques K sur du plasma humain ou sur d'autres fluides biologiques ou extraits de tissus
EXEMPLE 7
On a fait incuber pendant 24 heures à 370C I anti- sérum anti-K/Pk obtenu selon le mode opératoire de l'Exemple 4 (0,1 ml), avec une solution dans le PBS à 50 y/n1 de déterminants antigéniques Pn obtenus selon le mode opératoire de l'Exemple 2 (1,8 ml).Après incubation, on a centrifugé le mélange à 5.000 g pendant 15 minutes à 4 C
On a à nouveau fait incuber chaque fraction de 0,1 ml du surnageant pendant 24 heures à 370C avec la solution de PBS à 50 γ/ml de déterminants antigéniques Pn (1,8 ml). Après centrifugation dans les mêmes conditions que ci-dessus, on a porté le surnageant aux dilutions appropriées et on l'a utilisé comme antisérum anti-K pour les déterminations immunohistochimiques.The serum obtained was diluted appropriately and used for immunological determinations of antigenic determinants K on human plasma or other biological fluids or tissue extracts.
EXAMPLE 7
370C was incubated for 24 hours with anti-K / Pk antiserum obtained according to the procedure of Example 4 (0.1 ml), with a solution in PBS at 50 μl / ml of antigenic determinants Pn obtained by the procedure of Example 2 (1.8 ml). After incubation, the mixture was centrifuged at 5,000 g for 15 minutes at 4 ° C.
Each 0.1 ml portion of the supernatant was again incubated for 24 hours at 370 ° C. with the PBS solution at 50 μg / ml of Pn antigenic determinants (1.8 ml). After centrifugation under the same conditions as above, the supernatant was taken to appropriate dilutions and used as anti-K antiserum for immunohistochemical determinations.
On a contrôlé l'activité immunologique anti-K e l'antisérum à partir de sa capacité à révéler les cellules d'adénocarcinome mais pas les cellules normales, sur des coupes histologiques : pour cet essai, on a suivi la méthode de coloration par la peroxydase, telle qu'elle est décrite par Sternberger L.A. dans Immunocytochemistry - 2 Edition
John Wiley and Sons - New York, 1979.The anti-K immunological activity of the antiserum was checked from its ability to reveal adenocarcinoma cells but not normal cells, on histological sections: for this test, the staining method was followed by peroxidase, as described by Sternberger LA in Immunocytochemistry - 2 Edition
John Wiley and Sons - New York, 1979.
EXEMPLE 8
On a immunisé des souris BALB/c âgées de 8 semaines, par injection intrapéritonéale de l'émulsion obtenue en mélangeant des déterminants antigéniques K, préparés selon le mode opératoire de l'Exemple 3 (100 g) avec un volume égal d'un adjuvant de Freund complet
Au bout de 30 jours, on a répété les injections intrapéritonéales, avec des quantités moindres de déterminants antigéniques K. On a procédé à un contrôle de la réponse immunologique sur les animaux, comme indiqué à l'Exemple 4.EXAMPLE 8
BALB / c mice, 8 weeks old, were immunized by intraperitoneal injection of the emulsion obtained by mixing antigenic determinants K prepared according to the procedure of Example 3 (100 g) with an equal volume of adjuvant complete Freund
After 30 days, intraperitoneal injections were repeated, with lesser amounts of K antigenic determinants. Immunological response was monitored on the animals, as shown in Example 4.
En utilisant ensuite les animaux positifs au contrôle, on a procédé à une hybridation somatique avec des cellules de myélome de murine, selon le mode opératoire décrit dans Nature 256, 495-497, 1975. Then using the control positive animals, somatic hybridization was performed with murine myeloma cells according to the procedure described in Nature 256, 495-497, 1975.
On a évalue la spécificité des produits obtenus par essai RIA en mesurant la capacité de fixation d'un antigène 125I-K. The specificity of the products obtained by RIA test was evaluated by measuring the binding capacity of a 125I-K antigen.
On a ensuite isolé et cloné les hybrides qui se sont avérées positives à l'essai. Hybrids that tested positive were then isolated and cloned.
On a obtenu de grandes quantités d'anticorps monoclonal anti-K par injection intrapéritonéale à des souris
BALB/c de cellules secrétant l'anticorps anti-K monoclonal.Large amounts of anti-K monoclonal antibody were obtained by intraperitoneal injection into mice
BALB / c cells secreting monoclonal anti-K antibody.
La croissance de la tumeur due aux cellules injectées s'est manifestée par la production d'un liquide ascitique contenant jusqu'à 20 mg/ml d'anticorps anti-K monoclonaux. The growth of the tumor due to the injected cells was manifested by the production of an ascitic fluid containing up to 20 mg / ml of monoclonal anti-K antibodies.
En opérant d'une manière analogue mais en utilisant pour l'immunisation des déterminants antigéniques Pk ou Pn, au lieu des déterminants antigéniques K, dn a obtenu respectivement des anticorps monoclonaux anti-Pk et des anticorps monoclonaux antip n
EXEMPLE 9
On a traité pendant 5 minutes, dans un bain de glace, une solution de déterminants antigéniques K préparés selon le mode opératoire de l'Exemple 3 (10 ssg) dans 20 l d'une solution de PBS à pH 7,2, avec une solution de Na125I (1 mCi) dans 10 jil de PBS, et 20 l d'une solution contenant de la chloramine T dans du PBS à une concentration de 0,5 mg/ml.By operating in an analogous manner but using for the immunization of the antigenic determinants Pk or Pn, instead of the antigenic determinants K, dn obtained respectively monoclonal antibodies anti-Pk and monoclonal antibodies antip
EXAMPLE 9
A solution of antigenic determinants K prepared according to the procedure of Example 3 (10 μg) in 20 μl of a solution of PBS at pH 7.2 was treated for 5 minutes in an ice bath with Na125I solution (1 mCi) in 10 μl of PBS, and 20 μl of a solution containing chloramine T in PBS at a concentration of 0.5 mg / ml.
On a ensuite ajouté au mélange 20 l d'une solution contenant du métabisulfite de sodium dans du PBS à une concentration de 2 mg/ml, et 20 iil d'une solution contenant de l'ioduré de potassium dans du PBS à une concentration de 20 mg/ml. On a purifié le produit de la réaction par HPLC afin d'éliminer l'iode 125 libre, et on a ainsi obtenu quantitativement des déterminants antigéniques K (125I-K) radiomarqués par l'iode 125. 20 l of a solution containing sodium metabisulfite in PBS at a concentration of 2 mg / ml, and 20 μl of a solution containing potassium iodide in PBS at a concentration of 20 mg / ml. The reaction product was purified by HPLC to remove free iodine 125, and 125 I-radiolabeled K (125I-K) antigenic determinants were quantitatively obtained.
Par un mode opératoire analogue, on a prépare des déterminants antigéniques Pk radiomarqués (125I-Pk) et des mélanges antigéniques K/Pk radiomarqués (125I-K/Pk). By a similar procedure, radiolabelled Pk antigenic determinants (125 I-Pk) and radiolabeled K / Pk antigenic mixtures (125 I-K / Pk) were prepared.
EXEMPLE 10
Gn a essaye, au moyen de l'antisérum anti-K obtenu à l'Exemple 6, des échantillons de sérum humain provenant de 335 patients hospitalisés atteints de maladies non néoplastiques, en utilisant les réactifs et la méthode analytique indiqués ci-dessous.EXAMPLE 10
Using anti-K antiserum obtained in Example 6, samples of human serum from 335 hospitalized patients with non-neoplastic diseases were tested using the reagents and the analytical method indicated below.
Réactifs (1) Tampon de éférence contenant
- 70 mmoles de tampon de phosphate à pH 7,2 ;
- 70 mmoles de chlorure de sodium ,
- 31 mmoles d'azoture de sodium ; et
- sérum albumine de boeuf à 0,4 t P/V.Reagents (1) Reference pad containing
70 mmol of phosphate buffer at pH 7.2;
70 mmol of sodium chloride,
31 mmol of sodium azide; and
albumin serum of beef at 0.4 t P / V.
(2) Antisérum anti-K obtenu comme à l'Exemple 6, correctement
dilué au 50/1000 dans
- 70 mmoles de tampon de phosphate à pH 7,2 ;
- 70 mmoles de chlorure de sodium ;
- 33 mmoles de sel disodique d'EDTA ;
- 31 mmoles d'azoture de sodium ; et
- sérum de chèvre normal à 0,1 % V/V.(2) Anti-K antiserum obtained as in Example 6, correctly
diluted to 50/1000 in
70 mmol of phosphate buffer at pH 7.2;
70 mmol of sodium chloride;
33 mmol disodium salt of EDTA;
31 mmol of sodium azide; and
- normal goat serum at 0.1% V / V.
(3) Marqueur radio-iodé contenant un mélange antigénique
125I-K/Pk dilué dans le tampon (1) de façon à avoir une
concentration de 1 5 ng/ml et une activité spécifique
de 60 mCi/mg. (3) Radio-iodinated marker containing an antigenic mixture
125I-K / Pk diluted in the buffer (1) so as to have a
concentration of 1 5 ng / ml and a specific activity
60 mCi / mg.
(4) Second antisérum : antisérum précipitant les immuno-
globulines de chèvre, ayant pris naissance chez le lapin
et correctement diluées dans le tampon (1).(4) Second antiserum: antiserum precipitating immune
Goat globulins, having originated in rabbits
and properly diluted in the buffer (1).
(5) Témoin négatif e plasma humain normal.(5) Negative control of normal human plasma.
(6) Témoin positif : plasma humain normal auguel a été
ajoutée une quantité connue de mélange antigénique K/Pk
Méthode analytique
"Zéro" Témoin Témoin Echan
négatif positif tillon
Tampon de référence (1) 0,5 ml - -
Témoin négatif (5) - 0,5 ml -
Témoin positif (6) - - 0,5 ml
Echantillon - - - 0,5 ml
Antisérum anti-K (2) 0,2 mi 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml
Mélanger, faire incuber pendant 5 heures à la température ambiante
Marqueur radio-iodé (3) 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml
Faire incuber pendant une nuit à la température ambiante
Second antisérum (4) 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml
Faire incuber pendant 1 heure à la température ambiante, centrifuger pendant 30 minutes à 4000 tours par minute, décanter et mesurer la radio-activité dans le précipité à l'aide d'un compteur gamma.(6) Positive control: normal human plasma auguel was
added a known amount of antigenic mixture K / Pk
Analytical method
"Zero" Witness Witness Echan
positive negative tillon
Reference buffer (1) 0.5 ml - -
Negative control (5) - 0.5 ml -
Positive control (6) - - 0.5 ml
Sample - - - 0.5 ml
Antiserum anti-K (2) 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml
Mix, incubate for 5 hours at room temperature
Radio-iodine marker (3) 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml
Incubate overnight at room temperature
Second antiserum (4) 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml
Incubate for 1 hour at room temperature, centrifuge for 30 minutes at 4000 rpm, decant and measure the radioactivity in the precipitate using a gamma counter.
Calcul : on a calculé l'indice de positivité P.I. en évaluant la radio-activité des échantillons et, respectivement, des témoins, par rapport à la radio-activité du zéro" selon les expressions suivantes activité de l'échantillon
P.I. (échantillon) = 100 - x 100
activité du "zéro"
P.I. (témoin) = 100 - x 100
activité du "zéro"
Une valeur de l'indice P.I. supérieure à 15 était considérée comme indiquant la présence d'adénocarcinome, tandis qu'une valeur de l'indice P.I. inférieure à 15 était considérée comme indiquant l'absence d'adénocarcinome.Calculation: the PI positivity index was calculated by evaluating the radioactivity of the samples and, respectively, of the controls, relative to the radioactivity of the zero "according to the following expressions sample activity
PI (sample) = 100 - x 100
activity of "zero"
PI (control) = 100 - x 100
activity of "zero"
A PI value greater than 15 was considered to indicate the presence of adenocarcinoma, while a PI value of less than 15 was considered to indicate the absence of adenocarcinoma.
On a également examiné en parallèle les 335 échantillons précités en utilisant deux trousses disponibles dans le commerce pour la détection du CEA humain, à savoir l'essai de CEA de Roche, et la trousse CEA de Liso-phase de Lepetit. The above 335 samples were also examined in parallel using two commercially available kits for the detection of human CEA, namely the Roche CEA assay, and the Liso-phase CEA kit from Lepetit.
Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau suivant :
The results obtained are summarized in the following table:
<tb> Faux <SEP> r6sultats <SEP> positifs
<tb> <SEP> Nombre <SEP> Pathologies <SEP> Essai <SEP> de <SEP> Essai <SEP> de <SEP> Notre
<tb> <SEP> de <SEP> cas <SEP> Roche <SEP> Lepetit <SEP> essai
<tb> <SEP> 30 <SEP> Cirrhose <SEP> du <SEP> foie <SEP> 4 <SEP> (13,2 <SEP> %) <SEP> 3 <SEP> (19 <SEP> %) <SEP> 2 <SEP> (6,6 <SEP> %)
<tb> <SEP> 17 <SEP> Maladies <SEP> inflamma- <SEP> 4 <SEP> (23,5 <SEP> %) <SEP> 5 <SEP> (23,5 <SEP> %) <SEP> 2 <SEP> (11,7 <SEP> %)
<tb> <SEP> toires <SEP> pulmonaires
<tb> <SEP> 18 <SEP> Broncho-pneumopa- <SEP> 3 <SEP> (16,6 <SEP> %) <SEP> 3 <SEP> (16,6 <SEP> %) <SEP> 1 <SEP> (5,5 <SEP> %)
<tb> <SEP> thies <SEP> obstructives
<tb> <SEP> 270 <SEP> Autres <SEP> maladies <SEP> non <SEP> 4 <SEP> (1,5 <SEP> %) <SEP> 4 <SEP> (1,8 <SEP> %) <SEP> 1 <SEP> (0,3 <SEP> %)
<tb> <SEP> néoplastiques
<tb> <SEP> 335 <SEP> Total <SEP> 15 <SEP> (4,5 <SEP> %) <SEP> 15 <SEP> (4,5 <SEP> %) <SEP> 6 <SEP> (1,8 <SEP> %)
<tb>
EXEMPLE 11
On a analysé des échantillons de sérum humain provenant de 84 patients atteints d'adénocarcinomes identifiés, en utilisant les réactif s et la méthode analytique qui sont décrits dans l'Exemple 10, et en utilisant en parallèle les deux trousses commerciales également mentionnées à l'Exemple 10.<tb> False <SEP> positive <SEP> results
<tb><SEP> Number <SEP> Pathologies <SEP><SEP> Test of <SEP><SEP> Test <SEP> Our
<tb><SEP> of <SEP> cases <SEP> Roche <SEP> Lepetit <SEP> test
<tb><SEP> 30 <SEP> Cirrhosis <SEP> of <SEP> liver <SEP> 4 <SEP> (13.2 <SEP>%) <SEP> 3 <SEP> (19 <SEP>%) <SEP> 2 <SEP> (6.6 <SEP>%)
<tb><SEP> 17 <SEP> Diseases <SEP> inflamma- <SEP> 4 <SEP> (23.5 <SEP>%) <SEP> 5 <SEP> (23.5 <SEP>%) <SEP > 2 <SEP> (11.7 <SEP>%)
<tb><SEP> lungs <SEP>
<tb><SEP> 18 <SEP> Broncho-pneumopa- <SEP> 3 <SEP> (16.6 <SEP>%) <SEP> 3 <SEP> (16.6 <SEP>%) <SEP> 1 <SEP> (5.5 <SEP>%)
<tb><SEP> obstructive thie <SEP>
<tb><SEP> 270 <SEP> Other <SEP> diseases <SEP> no <SEP> 4 <SEP> (1.5 <SEP>%) <SEP> 4 <SEP> (1.8 <SEP>% ) <SEP> 1 <SEP> (0.3 <SEP>%)
<tb><SEP> neoplastics
<tb><SEP> 335 <SEP> Total <SEP> 15 <SEP> (4.5 <SEP>%) <SEP> 15 <SEP> (4.5 <SEP>%) <SEP> 6 <SEP> (1.8 <SEP>%)
<Tb>
EXAMPLE 11
Human serum samples from 84 identified adenocarcinoma patients were analyzed using the reagents and analytical method described in Example 10, and using in parallel the two commercial kits also referred to Example 10
Les résultats sont résumés dans le tableau suivant.
The results are summarized in the following table.
<tb><Tb>
<SEP> Faux <SEP> résultats <SEP> négatifs
<tb> Nombre <SEP> Pathologies <SEP> Essai <SEP> de <SEP> Essai <SEP> de <SEP> Notre
<tb> de <SEP> cas <SEP> Roche <SEP> Lapetit <SEP> essai
<tb> <SEP> 60 <SEP> Adénocarcinomes <SEP> 5 <SEP> (8,3 <SEP> %) <SEP> 7 <SEP> (11,6 <SEP> %) <SEP> 2 <SEP> (3,3 <SEP> %)
<tb> <SEP> gastro- <SEP> intestinaux <SEP> i <SEP>
<tb> <SEP> 24 <SEP> Adénocarcinomes <SEP> 2 <SEP> (8,3 <SEP> %) <SEP> 2 <SEP> (8,3 <SEP> %) <SEP> 0 <SEP> (0 <SEP> %)
<tb> <SEP> du <SEP> poumon
<tb> 84 <SEP> Total <SEP> 7 <SEP> (8,3 <SEP> %) <SEP> 9 <SEP> (10,7 <SEP> %) <SEP> 2 <SEP> (2,4 <SEP> %)
<tb>
EXEMPLE 12
On a également examiné les mêmes échantillons de plasma humain que dans les Exemples 10 et 11, en utilisant les réactifs et l'autre méthode analytique qui sont indiqués ci-dessous.<SEP> False <SEP> negative <SEP> results
<tb> Number <SEP> Pathologies <SEP><SEP> Trial of <SEP><SEP> Trial of <SEP> Our
<tb> of <SEP> cases <SEP> Roche <SEP> Lapetit <SEP> test
<tb><SEP> 60 <SEP> Adenocarcinomas <SEP> 5 <SEP> (8.3 <SEP>%) <SEP> 7 <SEP> (11.6 <SEP>%) <SEP> 2 <SEP> (3.3 <SEP>%)
<tb><SEP> Gastrointestinal <SEP> intestinal <SEP> i <SEP>
<tb><SEP> 24 <SEP> Adenocarcinomas <SEP> 2 <SEP> (8.3 <SEP>%) <SEP> 2 <SEP> (8.3 <SEP>%) <SEP> 0 <SEP> (0 <SEP>%)
<tb><SEP> of the <SEP> lung
<tb> 84 <SEP> Total <SEP> 7 <SEP> (8.3 <SEP>%) <SEP> 9 <SEP> (10.7 <SEP>%) <SEP> 2 <SEP> (2, 4 <SEP>%)
<Tb>
EXAMPLE 12
The same human plasma samples were also examined as in Examples 10 and 11, using the reagents and the other analytical method which are shown below.
Réactifs (1) Anticorps anti-K obtenus selon le mode opératoire décrit
aux Exemples 5 et 6, absorbés sur des perles de poly
styrène (2) Tampons de diluant contenant
- 70 mmoles de tampon de phosphate à pH 7,2
- 70 mmoles de chlorure de sodium ;
- 31 mmoles d'azoture de sodium ; et
- sérum albumine de boeuf à 1 % (P/V) (3) Conjugué enzymatique contenant les mêmes anticorps
anti-K que ceux du réactif (1) ci-dessus, conjugués à de
la 2-galactosidase (selon le mode opératoire décrit
dans FEBS Letters 95, 311, 1978) et correctement dilués
dans le tampon (2).Reagents (1) Anti-K antibodies obtained according to the procedure described
in Examples 5 and 6, absorbed on poly beads
Styrene (2) Diluent Buffers Containing
70 mmoles of phosphate buffer at pH 7.2
70 mmol of sodium chloride;
31 mmol of sodium azide; and
- 1% bovine serum albumin (W / V) (3) Enzymatic conjugate containing the same antibodies
anti-K than those of reagent (1) above, conjugated to
2-galactosidase (according to the procedure described
in FEBS Letters 95, 311, 1978) and properly diluted
in the buffer (2).
(4) Substrat enzymatique contenant
- 15 mmoles de tampon de phosphate à pH 7,0 ; et
- 2,3 mmoles d'ortho-nitrophénylgalactoside.(4) Enzymatic substrate containing
15 mmol of phosphate buffer at pH 7.0; and
2.3 mmoles of ortho-nitrophenylgalactoside.
(5) Agent de blocage : carbonate de sodium 1 M.(5) Blocking agent: 1M sodium carbonate
(6) Témoin négatif : plasma humain normal.(6) Negative control: normal human plasma.
(7) Témoin positif : plasma humain normal auquel a été
ajoutée une quantité connue des mélanges antigéniques K/P k
Méthode analytique
"Zéro" Témoin Témoin Echantillon
négatif positif
Tampon de diluant (2) 0,2 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml
Témoin négatif (6) - 0,1 ml -
Témoin positif (7) - - O,i ml Echantilion - - - 0,1 ml
Anticorps anti-K (1) 1 perle 1 perle 1 perle 1 perle
Faire incuber en secouant pendant 5 heures à la température ambiante.(7) Positive control: normal human plasma to which
added a known quantity of antigenic mixtures K / P k
Analytical method
"Zero" Witness Witness Sample
negative positive
Diluent buffer (2) 0.2 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml
Negative control (6) - 0.1 ml -
Positive control (7) - - O, i ml Sampling - - - 0,1 ml
Anti-K antibodies (1) 1 pearl 1 pearl 1 pearl 1 pearl
Incubate by shaking for 5 hours at room temperature.
Jeter la phase liquide.Discard the liquid phase.
Laver 2 fois avec 2 ml d'une solution saline
Conjugué enzymatique (3) 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml
Faire incuber en secouant pendant 2 heures à la température ambiante.Wash twice with 2 ml of saline
Enzyme Conjugate (3) 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml
Incubate by shaking for 2 hours at room temperature.
Jeter la phase liquide.Discard the liquid phase.
Laver 2 fois avec 2 mi d'une solution saline
Substrat enzymatique (4) 1 mi 1 ml 1 ml I ml
Faire incuber pendant une heure à 37 C.Wash twice with 2 ml of saline
Enzymatic Substrate (4) 1 ml 1 ml 1 ml I ml
Incubate for one hour at 37 ° C.
Agent de blocage (5) 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Mesurer l'absorbance à 420 nm à l'aide d'un spectrophotomètre.Blocking agent (5) 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Measure the absorbance at 420 nm using a spectrophotometer.
Calcul
On a calcul l'indice de positivité P.I. par rapport à la densité optique (O.D.) du "zéro" selon l'expression:
O.D. de l'échantillon
P.I. =
O.D. du "zéro"
Une valeur de l'indice de positivité supérieure à 3 était considérée comme une indication de la présence d'adénocarcinome, tandis qu'une valeur de l'indice de positiovité inférieure à 3 était considérée comme une indication d'absence d'adénccarcinome.Calculation
The index of positivity PI was calculated with respect to the optical density (OD) of "zero" according to the expression:
OD of the sample
PI =
OD of "zero"
A value of the positivity index greater than 3 was considered an indication of the presence of adenocarcinoma, while a value of the positiovity index of less than 3 was considered as an indication of absence of adenocarcinoma.
On a observé des résultats similaires a ceux qui sont rapportés dans les Exemples 10 et 11. Similar results were observed to those reported in Examples 10 and 11.
EXEMPLE 13
On a examiné des coupes de tissus, fixées dans du formol et enveloppées dans de la paraffine, provenant d'un adénocarcinome de côlon humain, d'un adénocarcinome de mammifère humain et de la moelle d'os de patients atteints d'adénocarcinome de la poitrine, en utilisant les réactif s et la méftiode analytique qui sont indiqués ci-dessous :
Réactifs (1) Tampon de lavage contenant :
- 10 mmoles d'un tampon de phosphate à pH 7,3 1 et
- 150 mmoles de chlorure de sodium. EXAMPLE 13
Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections from human colon adenocarcinoma, human mammalian adenocarcinoma, and bone marrow from patients with adenocarcinoma of the prostate were examined. chest, using the reagents and analytical distrust that are shown below:
Reagents (1) Wash Buffer Containing:
10 mmol of a phosphate buffer at pH 7.3 1 and
150 mmol of sodium chloride.
(2) Tampon de blocage contenant
- 10 mmoles d'un tampon de phosphate à pH 7,3
- 150 mmoles de chlorure de sodium ; et
- sérum d'âne normal à 3 % (V/V).(2) Blocking buffer containing
10 mmol of a phosphate buffer at pH 7.3
150 mmol of sodium chloride; and
- normal donkey serum at 3% (V / V).
(3) Conjugué enzymatique contenant des anticorps d'anti
immunoglobulines de chèvre cultivés chez l'âne, marqués
avec de la 8-galactosidase (selon la méthode décrite
dans FEBS Letters 95, 311, 1978, et correctement dilués
dans le tampon (1).(3) Enzymatic conjugate containing anti-antibodies
Goat immunoglobulins grown in donkeys, marked
with 8-galactosidase (according to the method described
in FEBS Letters 95, 311, 1978, and properly diluted
in the buffer (1).
(4) Substrat enzymatique contenant
- 10 mmoles d'un tampon de phosphate à pH 7,4 ;
- 10 mmoles de chlorure de sodium ;
- 1 mmole de chlorure de magnésium ;
- 1 mmole de 5-bromo-4-chloro-indolyl galactoside ;
- 6 mmoles de ferrocyanure de potassium ; et
- 6 mmoles de ferricyanure de potassium.(4) Enzymatic substrate containing
10 mmol of phosphate buffer at pH 7.4;
10 mmol of sodium chloride;
1 mmol of magnesium chloride;
1 mmol of 5-bromo-4-chloroindolyl galactoside;
- 6 mmoles of potassium ferrocyanide; and
- 6 mmoles of potassium ferricyanide.
(5) Agent colorant de contraste contenant
- bisulfate de potassium et d'aluminium ; et
- de l'acide carminique.(5) Contrast coloring agent containing
- potassium bisulfate and aluminum; and
carminic acid.
(6) Anticorps anti-K cultivés chez la chèvre, obtenus selon
le mode opératoire de 11 Exemple 7, et correctement dilués
dans le tampon (1) ci-dessus.(6) Anti-K antibodies raised in goats, obtained according to
the procedure of Example 7, and properly diluted
in the buffer (1) above.
Méthode analytique
On a déparaffiné les coupes dans du xylol, dans la série d'alcools éthyliques de 100 % à 50 %, puis dans le tampon de lavage (1). On a ajouté le réactif éventuel en quantité telle que l'ensemble de la coupe était recouvert.Analytical method
The sections were deparaffinized in xylol, in the series of ethyl alcohols from 100% to 50%, and then in the washing buffer (1). The optional reagent was added in such a quantity that the entire cup was covered.
Tampon de blocage (2).Blocking buffer (2).
Faire incuber pendant 20 minutes à 370C en chambre humide.Incubate for 20 minutes at 370C in a humid chamber.
Eliminer l'excès de réactif par secouage.Remove excess reagent by shaking.
Ajouter les anticorps anti-K (6).Add the anti-K (6) antibodies.
Faire incuber pendant 2 heures à 370C en chambre humide.Incubate for 2 hours at 370C in a humid chamber.
Ajouter le conjugué enzymatique (3).Add the enzymatic conjugate (3).
Faire incuber pendant 30 minutes à 370C en chambre humide.Incubate for 30 minutes at 370C in a humid chamber.
Laver la coupe avec le tampon (1) pendant 5 minutes. Wash the cup with the pad (1) for 5 minutes.
Ajouter le substrat enzymatique (4).Add the enzymatic substrate (4).
Faire incuber pendant 30 minutes à 370C.Incubate for 30 minutes at 370C.
Eliminer l'excès de réactif par lavage.Remove excess reagent by washing.
Ajouter l'agent colorant de contraste (5)
Au bout d'une minute, laver la coupe à l'eau courante et observer au microscope éclairé.Add the contrast dye (5)
After one minute, wash the cup under running water and observe under a light microscope.
Selon une autre méthode, on a suivi le mode opératoire analytique ci-dessus en effectuant les incubations pendant une nuit à la température ambiante en chambre humide, excepté l'incubation avec le substrat enzymatique (4), que l'on a effectuée pendant une heure à la température ambiante en chambre humide. In another method, the above analytical procedure was followed by incubating overnight at room temperature in a humid chamber, except for incubation with the enzymatic substrate (4), which was carried out for a period of one hour. hour at room temperature in a humid chamber.
Toujours en variante du mode operatoire ci-dessus, après le lavage final à l'eau courante et avant l'examen au microscope, on a d'abord éclairci les coupes en les faisant tasser dans le tampon de lavage (1), dans la série des alcools éthyliques de 50 % à 100 %, et dans du xylol, puis on les a montées dans un"Eukitt" (marque déposée). Still as an alternative to the above procedure, after the final washing with running water and before the microscope examination, the sections were first clarified by settling them in the washing buffer (1), in the 50% to 100% ethyl alcohol series, and in xylol, and then mounted in an "Eukitt" (registered trademark).
L'analyse microscopique des coupes a révélé une coloration bleue intense exclusivement localisée au cytoplasme et à la membrane des cellules tumorales, sans aucune reaction de coloration positive dans les cellules des tissus normaux voisins, telles que les granulocytes par exemple. Microscopic analysis of the sections revealed an intense blue coloration exclusively localized to the cytoplasm and membrane of the tumor cells, without any positive staining reaction in cells of normal surrounding tissues, such as granulocytes for example.
Ces résultats se sont révélés très différents de ceux obtenus en analysant les mêmes préparations à l'aide des trousses disponibles dans le commerce pour la détection histochimique du complexe CEA par l'intermédiaire d'anticorps anti-CEA, à savoir le "DAKO PAP KIT" et le "IMMUNOLOK
HISTOSET KIT".These results proved to be very different from those obtained by analyzing the same preparations using commercially available kits for the histochemical detection of the CEA complex via anti-CEA antibodies, namely the "DAKO PAP KIT". "and the" IMMUNOLOK
HISTOSET KIT ".
Lesdits réactif s commerciaux ont fait preuve, en fait, d'une spécificité bien moindre, en ce sens qu'on a constaté qu'ils coloraient non seulement les cellules tumorales mais aussi, à un degré variable, les cellules des tissus normaux, l'erreur étant particulièrement importante dans le cas de l'analyse des tissus de moelle d'os. These commercial reagents have, in fact, shown much less specificity, in that they have been found to stain not only tumor cells but also, to a varying degree, normal tissue cells. This error is particularly important in the case of bone marrow tissue analysis.
On a suivi le meme mode opératoire que ci-dessus pour l'analyse de coupes de tissus congelées et on a obtenu des résultats analogues. The same procedure as above was followed for the analysis of frozen tissue sections and similar results were obtained.
EXEMPLE 14
On a conjugué la doxorubicine aux anticorps anti-K par une méthode de liaison covalente.EXAMPLE 14
Doxorubicin was conjugated to anti-K antibodies by a covalent binding method.
On a mélangé une solution de doxorubicine (40 mg/ml) dans une solution saline tamponnée par un phosphate 0,015 M à pH 7,2, avec un léger excès molaire de Nais4 0,1 M, et on l'a fait incuber pendant une heure à la température ambiante dans l'obscurité. A solution of doxorubicin (40 mg / ml) in 0.015 M phosphate buffered saline pH 7.2 was mixed with a slight molar excess of 0.1 M Nais4 and incubated for one hour. hour at room temperature in the dark.
A la fin de cette incubation, on a ajouté du glycérol 1 M jusqu'à une concentration finale 0,05 M. At the end of this incubation, 1M glycerol was added to a final concentration of 0.05M.
On a mélangé la solution de doxorubicine oxydée avec 1 ml d'une solution d'anticorps anti-K (20 mg/ml) dans un tampon de carbonate de potassium 0,15 M à pH 9,5, et on l'a fait incuber pendant une heure à la température ambiante. The oxidized doxorubicin solution was mixed with 1 ml of anti-K antibody solution (20 mg / ml) in 0.15 M potassium carbonate buffer pH 9.5, and incubate for one hour at room temperature.
A la fin de l'incubation, on a ajouté du NaBH4 jusqu'à une concentration finale de 0,3 mg/ml et on a laissé la réaction se faire pendant deux heures à 370C,
A la fin de la réaction, on a fait subir au mélange une chromatographie dans une colonne de filtration sur gel (15 x 1,5 cm) de "Bio-gel" (marque déposée) P 100, équilibrée dans du PBS.At the end of the incubation, NaBH4 was added to a final concentration of 0.3 mg / ml and the reaction allowed to proceed for two hours at 370 ° C.
At the end of the reaction, the mixture was subjected to chromatography in a gel filtration column (15 x 1.5 cm) of "Bio-gel" P 100, equilibrated in PBS.
Les fractions du volume exclu contenaient le médicament lié aux anticorps exempts du médicament non conjugué. Fractions of the excluded volume contained drug bound to the non-conjugated drug-free antibodies.
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