JPS6016231B2 - 耐熱性酢酸キナ−ゼの製造法 - Google Patents
耐熱性酢酸キナ−ゼの製造法Info
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- JPS6016231B2 JPS6016231B2 JP54151660A JP15166079A JPS6016231B2 JP S6016231 B2 JPS6016231 B2 JP S6016231B2 JP 54151660 A JP54151660 A JP 54151660A JP 15166079 A JP15166079 A JP 15166079A JP S6016231 B2 JPS6016231 B2 JP S6016231B2
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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- C12N9/1258—Polyribonucleotide nucleotidyltransferase (2.7.7.8), i.e. polynucleotide phosphorylase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、耐熱性酢酸キナーゼの製造法に関するもので
ある。
ある。
酢酸キナーゼは、アセチルリン酸とァデノシンニリン酸
とから生物学的エネルギー源であるアデノシン三リン酸
を合成するために使われたりあるいは食品等の酢酸の定
量などに多用される酵素であり、通常、大腸菌より抽出
精製して得られている（ジヤーナス・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー、２１１巻、７３７頁、１９５叫王
、：メソッズ・ィン・ェンザィモロジー、１巻、５９１
頁）が、大腸菌から得られる酢酸キナーゼは、きわめて
不安定であるため工業的な使用には適さなかった。
とから生物学的エネルギー源であるアデノシン三リン酸
を合成するために使われたりあるいは食品等の酢酸の定
量などに多用される酵素であり、通常、大腸菌より抽出
精製して得られている（ジヤーナス・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー、２１１巻、７３７頁、１９５叫王
、：メソッズ・ィン・ェンザィモロジー、１巻、５９１
頁）が、大腸菌から得られる酢酸キナーゼは、きわめて
不安定であるため工業的な使用には適さなかった。
そのため、特閥昭５２−２５０磯号には、好熱性細菌バ
チルス・ステアロサーモフィラスを用い、熱安定性の高
い耐熱性酢酸キナーゼを採取する方法が提案されている
。しかしながら、この酢酸キナーゼは、菌体内酵素であ
るため、酵素精製工程の第一段階で培養した菌体を遠心
分離等で集菌し、その後、超音波処理や物理的な破壊方
法にて菌体より酵素を抽出することが必要である。この
工程は細菌の比重が小さいため、集菌に時間を労したり
また、バチルス属に属する細菌は比較的細胞壁が固いた
め、破壊が不充分で酵素の抽出効率が低いなどの欠点が
あり、工業的には大規模生産には通さなかった。そこで
、本発明者は耐熱性酢酸キナーゼの工業的な大規模生産
を可能にするために、細胞が沈降しやすく、かつ細胞壁
が破壊されやすい好熱性細菌を求めて、広く自然界より
スクリーニングを行なった結果、諸性質からバチルス・
ステアロサーモフィラスに属すると考えられるが、細胞
が極端に伸長し、パージエイズ・マニュアル・オブ・デ
ィタミネィディブ・バクテリオロジーの記載されている
通常のバチルス・ステアロサーモフィラスよりも数倍〜
数十倍大きな細胞を持つ新菌株を発見し、この新菌株が
耐熱性酢酸キナーゼを産出ししかも細胞が沈降しやすく
、かつ細胞壁が破壊されやすい好熱性細菌であることを
見し、出し、本発明に到達した。
チルス・ステアロサーモフィラスを用い、熱安定性の高
い耐熱性酢酸キナーゼを採取する方法が提案されている
。しかしながら、この酢酸キナーゼは、菌体内酵素であ
るため、酵素精製工程の第一段階で培養した菌体を遠心
分離等で集菌し、その後、超音波処理や物理的な破壊方
法にて菌体より酵素を抽出することが必要である。この
工程は細菌の比重が小さいため、集菌に時間を労したり
また、バチルス属に属する細菌は比較的細胞壁が固いた
め、破壊が不充分で酵素の抽出効率が低いなどの欠点が
あり、工業的には大規模生産には通さなかった。そこで
、本発明者は耐熱性酢酸キナーゼの工業的な大規模生産
を可能にするために、細胞が沈降しやすく、かつ細胞壁
が破壊されやすい好熱性細菌を求めて、広く自然界より
スクリーニングを行なった結果、諸性質からバチルス・
ステアロサーモフィラスに属すると考えられるが、細胞
が極端に伸長し、パージエイズ・マニュアル・オブ・デ
ィタミネィディブ・バクテリオロジーの記載されている
通常のバチルス・ステアロサーモフィラスよりも数倍〜
数十倍大きな細胞を持つ新菌株を発見し、この新菌株が
耐熱性酢酸キナーゼを産出ししかも細胞が沈降しやすく
、かつ細胞壁が破壊されやすい好熱性細菌であることを
見し、出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、バチルス・ステアロサーモフィラ
スに属するＵＫ７斑株を培養し、得られた培養物から耐
熱性酢酸キナーゼを採取することを特徴とする耐熱性酢
酸キナーゼの製造法である。
スに属するＵＫ７斑株を培養し、得られた培養物から耐
熱性酢酸キナーゼを採取することを特徴とする耐熱性酢
酸キナーゼの製造法である。
本発明に用いる菌株の菌学的性質を示す。
この菌学的性質の検討には、マニュアル・オブ・マイク
ロバイオロジカル・メソツズ（Ｍａｎ雌ｌｏｆＭｉＣｒ
。一 ｂｉ。ｌｏｇｃａＩ Ｍｅ比。ｄＳ；Ｓｏｃｉｅ
ｔｙ 。ｆＡｍｅｒｉｃａｎ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｉｓｔｓ， Ｍｃ Ｇｒａｗ 一 日ｉｌｌ節ｏｋＣｏ
ｍｐａｎｙ）、微生物の分類と同定（長谷川武治編著、
東京大学出版会）および培地学各論（坂崎利一著、納谷
書店）に記載されている方法、培地組成を用いた。また
、寒天培地場合には、寒天を３％（重量）加えた。〔形
態的所見〕 ６０ｏｏ、２岬時間培養。
ロバイオロジカル・メソツズ（Ｍａｎ雌ｌｏｆＭｉＣｒ
。一 ｂｉ。ｌｏｇｃａＩ Ｍｅ比。ｄＳ；Ｓｏｃｉｅ
ｔｙ 。ｆＡｍｅｒｉｃａｎ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｉｓｔｓ， Ｍｃ Ｇｒａｗ 一 日ｉｌｌ節ｏｋＣｏ
ｍｐａｎｙ）、微生物の分類と同定（長谷川武治編著、
東京大学出版会）および培地学各論（坂崎利一著、納谷
書店）に記載されている方法、培地組成を用いた。また
、寒天培地場合には、寒天を３％（重量）加えた。〔形
態的所見〕 ６０ｏｏ、２岬時間培養。
１ 細胞の形および大きさ；著しい長樟状、糸状。
０．８〜１．２×１０百数十ミクロン、時に数百ミクロ
ンを超すこともある。
ンを超すこともある。
２ 多形数；なし。
３ 運動性：なし。
４ 胞子：円筒形の内生胞子を細胞中央ないしは先端に
形成する。
形成する。
胞子のうはふくれない。５ グラム染色；陽・性。
６ 抗酸性；なし。
〔生育状態〕 ６０ｑＣ、２少時間培養。
１ 肉汁寒天平板培養。
形状：円形。
周緑；波状。
***；偏平。
光沢；なし。
表面：粗雑。
色調：半透明。
２ 肉汁寒天斜面培養。
生育度；良好。
形状；糸状。
３ 肉汁液体培養。
表面生育；わずかに菌環を形成する。
濁度；混濁。
沈笹；少量。
着色；脱色：なし。
４ 肉汁ゼラチン穿刺培養。
ゼラチン３０％添加、６０℃で適時培養した後、冷却し
て固化状態を判定：ゼラチン液化。
て固化状態を判定：ゼラチン液化。
５ 肉汁寒天穿刺培養。
形状：念珠状。
表面生育；良好。
リトマス、ミルク
リトマス退色ｐＨ６．０、ミルクは固化された後液化さ
れる。
れる。
〔生理学的性質〕 ６０℃、１〜２日培養。
１ 硝酸塩の還元；あり。
２ 脱窒反応；陰性。
３ Ｍ町テスト；腸性。
４ ＶＰテスト；陽・性。
５ インドールの生成；なし。
６ 硫化水素の生成：なし。
７ デンプンの加水分解；あり。
８ クエン酸の利用；なし。
９ 硝酸塩の利用；あり。
１０ アンモニウム塩の利用；あり。
１１ 色素の生成；なし。
１２ ウレアーゼ活性：なし。
１３ オキシターゼ活性：あり。
１４ カタラーゼ活性；あり。
１５ 生育ＰＨ；５．０〜８．５。
至通ｐＨ；６．０〜７．ふ
１６ 生育温度；４０〜７０ｑ○
至適温度：５０〜６３℃
１７ 酸素に対する態度；
好気的で良く生育するが、謙気下でも弱い生育が見られ
る。
る。
１８０一Ｆテスト；陰性。
１９ フェニルアラニンの脱アミノ反応；陰性。
２０ 塩化ナトリウムの耐性：
５％では生育するが、７％では生育できない。
‐２１ ビタミン要求
性：なし。
性：なし。
２２ チロジンの分解性；なし。
〔炭素源からの酸およびガスの生成〕６０℃、１〜２日
培養。
培養。
酸 ガス
ＩＬ−アラビノース
２ Ｄ−キシロース ＋
３ Ｄーグルコース 十
４ Ｄーマンノース ＋
５ Ｄ−フラクトース ＋
６ Ｄーガラクトース
７ 麦芽糖 十 一
８ ショ糖
９ 乳糖 − 一
１０ トレハロース ＋
１１Ｄ−ソルビツト
１２Ｄーマンニツト
１３イノシツト
１４グリセリン
１５ デンプン
以上の菌学的性質から、バージィのマニュアル・オブ・
デイタミネイデイブ・バクテリオロジー 第 ８ 版（
Ｂｅｒｇｅｙ’ ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ戊ｔｅ皿ｊ
ｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ鞘ｄ．）に基づ
き検索した結果、バチルス・ステアロサーモフィラス（
Ｂａｃｈｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｍｏｐｈｉｌ瓜
）に大略一致した。
デイタミネイデイブ・バクテリオロジー 第 ８ 版（
Ｂｅｒｇｅｙ’ ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ戊ｔｅ皿ｊ
ｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ鞘ｄ．）に基づ
き検索した結果、バチルス・ステアロサーモフィラス（
Ｂａｃｈｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｍｏｐｈｉｌ瓜
）に大略一致した。
そこでバチルス・ステアロサーモフイラスの標準菌株、
山ＭＩＩＯＯ１，１１００２，１１００３，１１００４
（以上東京大学応用微生物研究所保管株）、『０１２５
５０（財団法人発酵研究所保管株）との対比を行ったと
ころ、２，３の生理学的性質において、上記標準菌株と
異なっており、特に第１表および第１図の写真から明ら
かなように、細胞の大きさにおいて明確な差を有してい
る。本発明において、第１図の写真は、本発明に用いる
菌株と標準菌株バチルス・ステアロサーモフィラスｌＡ
ＭＩＩＯＯＩとを６０ｑｏ、２４時間寒天斜面培養した
ときの細胞の顕微鏡写真（１５０倍）であって、線状に
大きく伸長してみえる細胞が本発明に用いる菌株で、点
短樟状にみえる細胞が標準菌株である。
山ＭＩＩＯＯ１，１１００２，１１００３，１１００４
（以上東京大学応用微生物研究所保管株）、『０１２５
５０（財団法人発酵研究所保管株）との対比を行ったと
ころ、２，３の生理学的性質において、上記標準菌株と
異なっており、特に第１表および第１図の写真から明ら
かなように、細胞の大きさにおいて明確な差を有してい
る。本発明において、第１図の写真は、本発明に用いる
菌株と標準菌株バチルス・ステアロサーモフィラスｌＡ
ＭＩＩＯＯＩとを６０ｑｏ、２４時間寒天斜面培養した
ときの細胞の顕微鏡写真（１５０倍）であって、線状に
大きく伸長してみえる細胞が本発明に用いる菌株で、点
短樟状にみえる細胞が標準菌株である。
本発明に用いる菌株は、標準菌株に比べ、著しく伸長し
た細胞を持ち、前記のパージエイズ・マニュアルおよび
種々の報文にも巨大に伸長した細胞を持つバチルス・ス
テアロサーモフイラスの記載はまった〈見られないこと
から、本発明に用いる菌株は、まったく新しい菌株と考
えられるので、／ゞチルス・ステアロサーモフイラスＵ
Ｋ７８８と命名し、昭和５必王８月１０日に通産省工業
技術院微生物工業研究所へ寄託した。
た細胞を持ち、前記のパージエイズ・マニュアルおよび
種々の報文にも巨大に伸長した細胞を持つバチルス・ス
テアロサーモフイラスの記載はまった〈見られないこと
から、本発明に用いる菌株は、まったく新しい菌株と考
えられるので、／ゞチルス・ステアロサーモフイラスＵ
Ｋ７８８と命名し、昭和５必王８月１０日に通産省工業
技術院微生物工業研究所へ寄託した。
その微生物受託番号は徴工研菌寄第５１４１号である。
１ 各菌株の細胞サィズ ×６００Ｃ，２４時間肉汁寒天斜面培養した時の細胞の
大きさを示す。
１ 各菌株の細胞サィズ ×６００Ｃ，２４時間肉汁寒天斜面培養した時の細胞の
大きさを示す。
本発明に用いるＵＫ７８８株を培養するに際して用いら
れる培地としては、細菌の一般的塔地であればよく、特
に液体塔地を用いることが好ましい。
れる培地としては、細菌の一般的塔地であればよく、特
に液体塔地を用いることが好ましい。
この培地の栄養源において炭素源として、たとえば、グ
ルコース、シユークロス、フルクト−ス、澱粉加水分解
物、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液の糖類、酢酸、乳酸等の有
機酸類、さらにはＵＫ７総株が資化しうるアルコール類
、油脂、脂肪酸およびグリセリン等が使用でき、窒素源
として、たとえば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム
、リン酸アンモニウム、尿素、アンモニア、硝酸塩アミ
ノ酸、ベプトン、肉エキス、酵母エキス等の無機または
有機物が使用できる。さらに無機塩類として、たとえば
カリウム、ナトリウム、リン酸亜鉛、鉄、マグネシウム
、マンガン、銅、カルシウム、コバルト等の各塩類、必
要に応じて徴量金属塩「 コーン・ステーブ・リカー、
ビタミン類、綾酸等を使用してもよく、細菌の一般的栄
養源が使用できる。これらの培地を用いて、ＵＫ７斑株
を２０午０〜８０ｑｏ、好ましくは４０ｑｏ〜７０℃最
適には５０ｏｏ〜６３００で約２〜６時間、好気的に培
養すればよい。
ルコース、シユークロス、フルクト−ス、澱粉加水分解
物、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液の糖類、酢酸、乳酸等の有
機酸類、さらにはＵＫ７総株が資化しうるアルコール類
、油脂、脂肪酸およびグリセリン等が使用でき、窒素源
として、たとえば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム
、リン酸アンモニウム、尿素、アンモニア、硝酸塩アミ
ノ酸、ベプトン、肉エキス、酵母エキス等の無機または
有機物が使用できる。さらに無機塩類として、たとえば
カリウム、ナトリウム、リン酸亜鉛、鉄、マグネシウム
、マンガン、銅、カルシウム、コバルト等の各塩類、必
要に応じて徴量金属塩「 コーン・ステーブ・リカー、
ビタミン類、綾酸等を使用してもよく、細菌の一般的栄
養源が使用できる。これらの培地を用いて、ＵＫ７斑株
を２０午０〜８０ｑｏ、好ましくは４０ｑｏ〜７０℃最
適には５０ｏｏ〜６３００で約２〜６時間、好気的に培
養すればよい。
この場合、回分培養法および連続培養法のどちらでも耐
熱性酢酸キナーゼを含有した菌体を得ることができるが
、回分培養法の場合には対数増殖後期まで培養すること
が好ましくまた連続培養法の場合には、物質環境型連続
培養法（ケモスタツト；ハルベルト、エルスワース、テ
リング、ジヤーナル・オブ・ジエネラル・ミクロバイオ
ロジー、１４巻、８号、６０１〜６２２頁、１９５６年
）で行ない、希釈率（発酵槽に培地液を供給する速度お
よび同時に発酵槽より抜出す速度を発酵槽中の培養液量
で割った値）をＵＫ７８８株の最大比増殖速度付近に制
御しながら培養すれば耐熱性酢酸キナーゼ含有量の高い
菌株を得ることができるので好ましい。次に得られた培
養物から耐熱性酢酸キナーゼを単離精製するには、まず
得られた培養物から、たとえば遠心分離や猿過などで菌
体を集菌し、次いで築菌した菌体を常法、すなわち菌体
を破壊後、遠心分離して得られた上澄に有機溶媒または
各種の塩類を加えて分画精製したり、恒体に吸着させて
精製するなどの方法で行なうことができる。
熱性酢酸キナーゼを含有した菌体を得ることができるが
、回分培養法の場合には対数増殖後期まで培養すること
が好ましくまた連続培養法の場合には、物質環境型連続
培養法（ケモスタツト；ハルベルト、エルスワース、テ
リング、ジヤーナル・オブ・ジエネラル・ミクロバイオ
ロジー、１４巻、８号、６０１〜６２２頁、１９５６年
）で行ない、希釈率（発酵槽に培地液を供給する速度お
よび同時に発酵槽より抜出す速度を発酵槽中の培養液量
で割った値）をＵＫ７８８株の最大比増殖速度付近に制
御しながら培養すれば耐熱性酢酸キナーゼ含有量の高い
菌株を得ることができるので好ましい。次に得られた培
養物から耐熱性酢酸キナーゼを単離精製するには、まず
得られた培養物から、たとえば遠心分離や猿過などで菌
体を集菌し、次いで築菌した菌体を常法、すなわち菌体
を破壊後、遠心分離して得られた上澄に有機溶媒または
各種の塩類を加えて分画精製したり、恒体に吸着させて
精製するなどの方法で行なうことができる。
これらの一例として、ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリー、８４蓋、１号、１斑〜２０３頁、１９７８王の
方法をあげることができる。その方法に従って精製を行
ない、得られた結晶の作用機構および物理的化学的性質
をバチルス・ステアロサーモフィラスの他の菌株から得
られた結晶と比較検討したところ、前記ジャーナル・オ
プ・バイオケミストリー、８４巻、１号、１９３〜２０
３頁、１９７８玉および特関昭５２−２５０８８号に記
載されている耐熱性酢酸キナーゼとまった〈同一であっ
た。本発明によって培養収穫した菌体の集菌は非常に容
易で、遠心分離する場合には従来８００の、１０分間を
要していたのが、その約１′５の時間で行なうことがで
き、従来実行不可能であった渡材による櫨過で集菌が可
能となり、この面でのメリットも測りしれないものがあ
る。
トリー、８４蓋、１号、１斑〜２０３頁、１９７８王の
方法をあげることができる。その方法に従って精製を行
ない、得られた結晶の作用機構および物理的化学的性質
をバチルス・ステアロサーモフィラスの他の菌株から得
られた結晶と比較検討したところ、前記ジャーナル・オ
プ・バイオケミストリー、８４巻、１号、１９３〜２０
３頁、１９７８玉および特関昭５２−２５０８８号に記
載されている耐熱性酢酸キナーゼとまった〈同一であっ
た。本発明によって培養収穫した菌体の集菌は非常に容
易で、遠心分離する場合には従来８００の、１０分間を
要していたのが、その約１′５の時間で行なうことがで
き、従来実行不可能であった渡材による櫨過で集菌が可
能となり、この面でのメリットも測りしれないものがあ
る。
また、菌体の破壊も従来１０ＫＨＺの超音波を出力２０
０Ｗで１５分間照射していたのが、その約１′５の時間
で同程度にまで破壊することができ、工業的に耐熱性酢
酸キナーゼを生産するうえで、大きな利点がある。次に
本発明を実施例により具体的に説明する。
０Ｗで１５分間照射していたのが、その約１′５の時間
で同程度にまで破壊することができ、工業的に耐熱性酢
酸キナーゼを生産するうえで、大きな利点がある。次に
本発明を実施例により具体的に説明する。
なお、実施例中の耐熱性酢酸キナーゼ含有量の測定には
、ＡＴＰの変化をニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド還元型（以後ＮＡＤＨと称す。）の変化にかえ、３４
仇蚊の吸光度で追跡する方法（ジヤーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー２４９筈、２５６７頁、１９
７４手）を用いて、耐熱性酢酸キナーゼの酵素活性を測
定して１分間あたり、１マイクロモルのＮＡＤＨの３４
０柳における吸光度を減少させる酵素活性を１単位（ユ
ニット以下Ｕという。）とした。実施例 １、比較例
１ グルコース２夕、（ＮＨ４）２Ｓ０４２夕、酵母エキス
（ディフィコ製）１夕、ＫＨ２Ｐ０４１夕、Ｎａ２ＨＰ
０４・１２ＬＯＩ夕、Ｍが０４・７日２００．１夕を水
道水１そに溶解した培地１００の【を、５００柵‘客三
角フラスコに入れ綿千全後、１０分間加圧蒸気殺菌（１
２１℃、１気圧）した。
、ＡＴＰの変化をニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド還元型（以後ＮＡＤＨと称す。）の変化にかえ、３４
仇蚊の吸光度で追跡する方法（ジヤーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー２４９筈、２５６７頁、１９
７４手）を用いて、耐熱性酢酸キナーゼの酵素活性を測
定して１分間あたり、１マイクロモルのＮＡＤＨの３４
０柳における吸光度を減少させる酵素活性を１単位（ユ
ニット以下Ｕという。）とした。実施例 １、比較例
１ グルコース２夕、（ＮＨ４）２Ｓ０４２夕、酵母エキス
（ディフィコ製）１夕、ＫＨ２Ｐ０４１夕、Ｎａ２ＨＰ
０４・１２ＬＯＩ夕、Ｍが０４・７日２００．１夕を水
道水１そに溶解した培地１００の【を、５００柵‘客三
角フラスコに入れ綿千全後、１０分間加圧蒸気殺菌（１
２１℃、１気圧）した。
次に培地を５０ｑｏに冷却後、同組成の寒天斜面培養に
生育したバチルス・ステアロサーモフィラスＵＫ７８８
（徴工研菌寄第５１４１号）株を楯菌し、５５ｑｏで回
転振糧培養（高崎製作所ＲＧＲＭ．２型１８ぴｐｍ）を
開始した。約５時間で菌の増殖が対数増殖後期となった
ので、培養を中止し、８００ぬ２分間遠心分離を行なっ
て菌体を集菌した。この時の菌体は６夕湿菌体ノクであ
った。この湿菌体１夕を２０の‘の０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕機（久保田商事
、２０ｍＭ型）を用いて破砕した時の漏出蛋白量を測定
した。また、比較のため、バチルス・ステアロサーモフ
ィラスｌＡＭＩＩＯＯＩ株（比較例１）を用いる以外は
実施例１と同様に行なった。その結果を第２図に示す。
生育したバチルス・ステアロサーモフィラスＵＫ７８８
（徴工研菌寄第５１４１号）株を楯菌し、５５ｑｏで回
転振糧培養（高崎製作所ＲＧＲＭ．２型１８ぴｐｍ）を
開始した。約５時間で菌の増殖が対数増殖後期となった
ので、培養を中止し、８００ぬ２分間遠心分離を行なっ
て菌体を集菌した。この時の菌体は６夕湿菌体ノクであ
った。この湿菌体１夕を２０の‘の０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕機（久保田商事
、２０ｍＭ型）を用いて破砕した時の漏出蛋白量を測定
した。また、比較のため、バチルス・ステアロサーモフ
ィラスｌＡＭＩＩＯＯＩ株（比較例１）を用いる以外は
実施例１と同様に行なった。その結果を第２図に示す。
なお、第２図は超音波処理時間と蛋白漏出量との関係を
示したもので、曲線Ａが実施例１、曲線Ｂが比較例１で
ある。
示したもので、曲線Ａが実施例１、曲線Ｂが比較例１で
ある。
第２図から明らかなように実施例１で用いた菌体は比較
例１で用いた菌体の約１／５の処理時間で菌体が破砕さ
れ、菌体中の蛋白質が漏出した。なお、蛋白質の定量に
はピウレット法（Ｇ℃ｒＭＩ１、Ａ．○．、 等、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー１７７、
７５１頁、１９４ｇ王）を用いた。次に超音波処理によ
って得られた菌体破砕液の耐熱性酢酸キナーゼ含有量を
測定したところ、９７．２Ｕ／夕湿菌体（１．２Ｕ／雌
蛋白）であり、比較例１から得られた耐熱性酢酸キナー
ゼ含有量とほぼ同じであった。
例１で用いた菌体の約１／５の処理時間で菌体が破砕さ
れ、菌体中の蛋白質が漏出した。なお、蛋白質の定量に
はピウレット法（Ｇ℃ｒＭＩ１、Ａ．○．、 等、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー１７７、
７５１頁、１９４ｇ王）を用いた。次に超音波処理によ
って得られた菌体破砕液の耐熱性酢酸キナーゼ含有量を
測定したところ、９７．２Ｕ／夕湿菌体（１．２Ｕ／雌
蛋白）であり、比較例１から得られた耐熱性酢酸キナー
ゼ含有量とほぼ同じであった。
実施例 ２
実施例１と同様にして５００の【客三角フラスコで培養
を行なった後、三角フラスコ１０本分の培養液を同組成
の培地２０そを入れ、あらかじめ加圧蒸気殺菌（１２１
℃、１気圧、１５分）した３０そ客ジャーファーメンタ
ー（丸菱理化装置、ＭＳＪ−Ｕ型、平羽根タービン式）
に接種した。
を行なった後、三角フラスコ１０本分の培養液を同組成
の培地２０そを入れ、あらかじめ加圧蒸気殺菌（１２１
℃、１気圧、１５分）した３０そ客ジャーファーメンタ
ー（丸菱理化装置、ＭＳＪ−Ｕ型、平羽根タービン式）
に接種した。
通気量２０そ／分、回転数４０仇ｐｍ、温度６０℃で培
養を開始したところ、直ちに菌の生育が見られ、増殖に
伴いｐＨの低下が起こったので小−ＮａＯＨにてＰＨ６
．５に調整しつつ３時間培養したところ、対数増殖後期
に達したので培養を中止し、８００に２分間遠心分離を
行なって湿菌体１２０夕を得た。湿菌体の耐熱性酢酸キ
ナーゼ含有量を実施例１と同様にして測定したところ、
１０５．３Ｕ／夕湿菌体（１．３Ｕ／の９蛋白）であっ
た。実施例 ３ 実施例２と同様にして、３０〆容ジャーファーメンター
で回分培養を行ない、対数増殖後期に達し培養液中の残
存グルコース濃度が０．０１重量％以下になった時、実
施例１と同組成の新らしい栄養塔地を２４〆ノ時間の速
度で定量ポンプを用いて供Ｖ給し、同時に同速度でジャ
ーファーメンターより培養液を抜出すことで希釈率を菌
の最大比増殖速度付近に設定した物質環境型連続培養法
を実施した。
養を開始したところ、直ちに菌の生育が見られ、増殖に
伴いｐＨの低下が起こったので小−ＮａＯＨにてＰＨ６
．５に調整しつつ３時間培養したところ、対数増殖後期
に達したので培養を中止し、８００に２分間遠心分離を
行なって湿菌体１２０夕を得た。湿菌体の耐熱性酢酸キ
ナーゼ含有量を実施例１と同様にして測定したところ、
１０５．３Ｕ／夕湿菌体（１．３Ｕ／の９蛋白）であっ
た。実施例 ３ 実施例２と同様にして、３０〆容ジャーファーメンター
で回分培養を行ない、対数増殖後期に達し培養液中の残
存グルコース濃度が０．０１重量％以下になった時、実
施例１と同組成の新らしい栄養塔地を２４〆ノ時間の速
度で定量ポンプを用いて供Ｖ給し、同時に同速度でジャ
ーファーメンターより培養液を抜出すことで希釈率を菌
の最大比増殖速度付近に設定した物質環境型連続培養法
を実施した。
このときの培養温度は６０００で、ＰＨ６．８〜７．０
（４ＮＮａＯＨで自動調整）、通気量２０そ／分、回転
数６０仇ｐｍとし、発泡が見られたので、消泡剤（信越
化学ＫＭ−７０）を加えた。約４時間の連続培養を行な
った結果、連続培養開始時の菌体濃度５．８タ湿菌体／
〆（０．７５タ乾燥菌体／そ）．が定常的に保たれ、９
６その発酵液より、遠心分離によつて５５０夕の湿菌体
を得た。このようにして得た菌体中の耐熱性酢酸キナー
ゼ含有量を測定したところ、１３０Ｕ／タ湿菌体（１．
６Ｕ／ｍｏ蛋白）であり、連続培養法によって収穫した
菌体は単位菌体あたりの耐熱・曲酢酸キナーゼ含有量が
回分法での菌体と比べて高くなっている。図面の簡単な
説明第１図は本発明に用いる菌株と標準菌株バチルス・
ステアロサーモフイラスｌＡＭＩＩＯＯＩとを６０℃、
２独特間寒天斜面培養したときの細胞の顕微鏡写真（１
５坊音）で、第２図は超音波処理と蛋白漏出量との関係
を示す図である。
（４ＮＮａＯＨで自動調整）、通気量２０そ／分、回転
数６０仇ｐｍとし、発泡が見られたので、消泡剤（信越
化学ＫＭ−７０）を加えた。約４時間の連続培養を行な
った結果、連続培養開始時の菌体濃度５．８タ湿菌体／
〆（０．７５タ乾燥菌体／そ）．が定常的に保たれ、９
６その発酵液より、遠心分離によつて５５０夕の湿菌体
を得た。このようにして得た菌体中の耐熱性酢酸キナー
ゼ含有量を測定したところ、１３０Ｕ／タ湿菌体（１．
６Ｕ／ｍｏ蛋白）であり、連続培養法によって収穫した
菌体は単位菌体あたりの耐熱・曲酢酸キナーゼ含有量が
回分法での菌体と比べて高くなっている。図面の簡単な
説明第１図は本発明に用いる菌株と標準菌株バチルス・
ステアロサーモフイラスｌＡＭＩＩＯＯＩとを６０℃、
２独特間寒天斜面培養したときの細胞の顕微鏡写真（１
５坊音）で、第２図は超音波処理と蛋白漏出量との関係
を示す図である。
第１図
第２図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ バチルス・ステアロサーモフイラスに属するＵＫ−
７８８株（微工研菌寄第５１４１号）を培養し、得られ
た培養物から耐熱性酢酸キナーゼを採取することを特徴
とする耐熱性酢酸キナーゼの製造法。 ２ 回分培養法で対数増殖後期まで培養する特許請求の
範囲第１項記載の製造法。 ３ 希釈率を最大比増殖速度付近に設定して連続培養す
る特許請求の範囲第１項記載の製造法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP54151660A JPS6016231B2 (ja) | 1979-11-22 | 1979-11-22 | 耐熱性酢酸キナ−ゼの製造法 |
| DK496080A DK496080A (da) | 1979-11-22 | 1980-11-20 | Mikroorganismetkultur og dens anvendelse til fremstilling af intracellulaere produkter |
| DE8080107281T DE3070039D1 (en) | 1979-11-22 | 1980-11-21 | A biologically pure culture of strain ifo 14093 and a process for producing an intracellular component herefrom |
| EP80107281A EP0029976B1 (en) | 1979-11-22 | 1980-11-21 | A biologically pure culture of strain ifo 14093 and a process for producing an intracellular component herefrom |
| CA000365250A CA1159784A (en) | 1979-11-22 | 1980-11-21 | Process for producing heat-resistant acetate kinase |
| US06/209,096 US4349631A (en) | 1979-11-22 | 1980-11-21 | Process for producing heat-resistant acetate kinase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP54151660A JPS6016231B2 (ja) | 1979-11-22 | 1979-11-22 | 耐熱性酢酸キナ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5675095A JPS5675095A (en) | 1981-06-20 |
| JPS6016231B2 true JPS6016231B2 (ja) | 1985-04-24 |
Family
ID=15523424
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP54151660A Expired JPS6016231B2 (ja) | 1979-11-22 | 1979-11-22 | 耐熱性酢酸キナ−ゼの製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4349631A (ja) |
| JP (1) | JPS6016231B2 (ja) |
| CA (1) | CA1159784A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58155099A (ja) * | 1982-03-12 | 1983-09-14 | Unitika Ltd | コリンエステラ−ゼ定量用試薬 |
| JPS62278992A (ja) * | 1986-05-28 | 1987-12-03 | Unitika Ltd | ジアデノシン四リン酸又はその誘導体の製造方法 |
| US20060166236A1 (en) * | 2004-12-15 | 2006-07-27 | Chong-Sheng Yuan | Allosteric enzyme coupled immunoassay (AECIA) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5225088A (en) * | 1975-08-22 | 1977-02-24 | Kazutomo Imahori | Process for preparing a novel thermoresistant acetate kinase |
-
1979
- 1979-11-22 JP JP54151660A patent/JPS6016231B2/ja not_active Expired
-
1980
- 1980-11-21 US US06/209,096 patent/US4349631A/en not_active Expired - Lifetime
- 1980-11-21 CA CA000365250A patent/CA1159784A/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1159784A (en) | 1984-01-03 |
| JPS5675095A (en) | 1981-06-20 |
| US4349631A (en) | 1982-09-14 |
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