JPS60136517A - 食物摂取の選択的阻害物質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ハンガリー特許第１７８，７０３号には、選択的な食欲
減退物質、すなわち食物摂取を選択的に抑制する物質の
製造法が記載されている。この物質はそれまで全く知ら
れていなかった物質で、新しい作用機構で働き、ヒトの
血漿から製造され、ザチェチンと命名された。この物質
は部分的にｆｋ’ＪＪされているにすぎなかったが、そ
れまで知られていた類似作用をもつ物質よりはるかに強
い作用を示した。

この物質は血漿の限外ろ過と、セファデックスＧ−１５
およびＥｉｏ−Ｇｅｌ　Ｆ　−２ｑ″″″ル上２工程ク
ロマトグラフイーを用いて精製された。

この物質がペプチドとしての性質をもっこと、またアミ
ノ酸の定量的な関係も確認された。アミノ酸のほか、加
水分触後に糖成分も誌められ、したがって、この満腹中
枢に特異的に作用する物質は糖蛋白であると考えられた
。

この発明はさらに改良され、活性分画はさらに分割でき
ること、すなわち付加的工程を加えることで精製できる
ことが明らかにされた。１９８２年６月６日付で抽圧さ
れたハンガリー特許出願第２７８３／８１号によれば、
前述の特許の方法で得られた活性物惜に比べて、３〜４
倍有効で、化学的組成もかなり異なる物質が得られてい
る。

この物質は、化学的に純粋かつ均一な活性物質と思われ
る。その物理的特性および最終的組成も明らかにされて
いる。

上述の方法によれば、血漿は限外ろ過後に重要な操作に
付された。すなわち、血漿ろ液はトリクロロ酢酸で処理
され、存在する血清蛋白（アルブミン等）が除去でれた
。その−足部分はアミコン（Ａｍ１ｃｏｎ　）膜を通過
できた。トリクロロ酢酸処理後、沈殿した血清蛋白を遠
心分離によって沈降させ、生物学的に有効なサチェチン
分画を含有する純粋な上清をデルカラム上でさらに精製
した。

最初の工程では、セ、ファデックスＧ−１５カラムから
の溶出に酢酸アンモニウム緩衝液を用いた。

活性を含む分画は空隙容量に、捕集され、適当に碗動し
たのちＢｌｏ−Ｇｅ１　Ｆ　−２カラム上で脱塩された
。

この塩を含まない分画は純度の尚い物質と考えることが
できた。この生成物は食物摂取に開平るすべての実験を
含めた生物学的研究にきわめて有用であった。

この工程では、サチェテンの活性に影響しない低分子量
のペプチドおよびグリコペプチドが残ったのみで、これ
は次に電気泳動および胸、和性クロマトグラフィーによ
って除去された。純粋な活性物質は％　Ｃｏｎ　−Ａセ
ファロ−ヌカラム上での親和性クロマトグラフィーによ
る分画とＢｌｏ−Ｇｅ１　Ｐ、−２カラム上での反後脱
塩後に凍結乾燥して得られた。

この方法で得られた物質は、ペプチド含蓄が低く（５〜
２５チ）、炭水化物含量が高い（６０〜９０％）糖蛋白
であることが明らかにされた。活性物質の分子量は５０
．０００〜７０．Ｃ１００ダルトンの範囲で、等電点は
中性、すなわちｐｌ　７．０〜７．１でめった。

本発明は最近の研究中に、上述の公知方法が者しく単純
化できることを発見し、完成されたものである。ある特
定の工程を挿入することにょシ、物理的性状の異なる、
選択的食欲摂取阻害物置を得ることができた。この物質
は化学的に均一で、したがって全く新規な生成物と考え
ることができた。この物質は、サチェチンーＤと命名さ
れた。

その単離方法は第１図に示すとおりである。以下にその
方法について詳述するっ ヒトおよび（または）動物の血清または血漿を、分子量
５０．０００ダルトンまでの範囲を通過させる膜フィル
ターを通してろ過する。この膜ろ過（または限外ろ過）
は、それぞれ平坦な膜またはカラムを通すことによって
実施できる（いわゆる中空繊維法−ｈｏｌｌｏｖｒ　ｆ
ｉｂｒｅ　ｔｅｃｈｎｉｃｓ−による）。

ついでろ液を蒸発させ、濃縮物から遠心分離またはろ過
により不溶部分を適当に除去し、この液体に、温度０℃
〜１０°Ｃで、濃度がｂ〜２５Ｗ／ｖ（ｌ量／容量）係
、好ましくは９〜１１Ｗ／ｖ％になるようにトリクロロ
酢酸を加える。沈殿した蛋白を、遠心分離またはろ過に
よって適当に除去し、得られた純粋な溶液を、分子量４
，０００ダルトン以下の空隙容量のゲル上クロマトグラ
フィーに付し、ｐ）１６．０〜７．０の緩衝液で溶出し
、生物学的活濃縮し、再び分子量３．０００〜４，００
０ダルトン以下の空隙容量のゲル上クロマトグラフィー
に付し、蒸留水（脱塩）で溶出し、得られた粗生成物は
凍結乾燥物とし、さらに精製または処理する。

本発明の方法によれば、この凍結乾燥粗生成物をＰＨ８
，１〜８．２の緩衝液、適当には２−アミノ−２−ヒド
ロキシメチル−１，３−プロノ々ンソオール塩酸塩（Ｔ
ｒｉｇ塩酸塩）の０．１モル溶液に溶解し、総重量に対
して０．０１〜０．２Ｎ重、適当に扛０．１　Ｍ置部の
トリプシン、ならびに同量のキモトリプシンを加える。

ついで、反応混合物を６７〜６８℃で、２０〜６０時間
、適当には２４時間、好ましくは間欠的攪拌もしくは連
続的振盪下に、消化に付す。反応開始５時間後に、半蓋
″（前述の量に対して）のトリプシンおよびキモトリプ
シンを混合物に追加し、消化を続ける。この混合物から
、トリクロロ酢酸での冷時処理、ついで分子量３．００
０〜４．０００ダルトン以下の空隙容量のゲル上クロマ
トグラフィーによシ、純粋な活性物刈を９ｊＲ’ｅ含ま
ない形で分離する。

本発明の方法の一実施態様によれば、精製操作は、Ａｍ
１ｃｏｎ　ＹＭ　−，１０平坦膜上、あるいは５０，０
００ダルトンで分離するカラム上Ａｍ１ｃｏｎ中空繊維
デバイス中、適当には圧力もしくは適当なボンデを用い
る限外ろ過によって始める。得られた限外ろ過液を減圧
下に蒸発させて濃縮し、不溶部分は製造遠心分離によっ
て分離するか、減圧下にｚｅｉｓｓろ板でろ去する。か
くして得られた、沈殿を含まない混合物を温度０〜１０
℃に冷却し、５５チドリクロロ酢酸を、濃度が５〜２５
′Ｉ／′ｖチ、好ましくは９〜１１　”／、　＊になる
ように加える。このように処理した溶液を温度θ〜５℃
に好ましくは１時間保持し、沈殿または白濁を同温度で
超遠心分離するかまたは減圧下にＺ６ｉｓＳろ板全通し
てろ過して除去すると、純粋な、鮮明な黄色の溶液が得
られる。上述の特許の記載から明らかなように、限外ろ
過後に存在する蛋白、たとえにアルブミンもトリクロロ
酢酸によって除去されるが、活性物置、すなわちサテエ
チンは溶液中に残る。

精製の次の工程としては、分子量４，０００り゛ルトン
以下の空隙容量のｒシカラム上におけるｒルクロマトグ
ラフイーが採用される。この工程はセファデックスＧ−
１５、ａ−１ＯｆたはＧ−２５ゲルを充填したカラム上
で実施できる。溶出には、揮発性で凍結乾燥により比較
的除去しやすい酢酸アンモニウムの０．１モル溶液が使
用されるうそのほか、生理食塩水（０，９％塩化ナトリ
ウム溶液）や各種のリン酸塩緩衝液も分離のために使用
できる。活性な分画はカラムの空隙容量に現われ（この
分画はカラム容量の６分の１に相当する溶出容量でｒル
から排出される）、これを合して、凍結乾燥によシ濃縮
する。

精製の次の工程も１分子２３，０００ダルトン以下の空
隙容量のゲル上クロマトグラフィーである。

Ｂｌｏ−Ｇｅ１　Ｐ　−２カラム上、メジウムとして蒸
留水を用いるのが適当でおる。この積装工程では、塩お
よび存在する可能性がある他の低分子酋夾雑物が除去さ
れる。サチェテン活性を有し、空隙Ｗ”Ａに現れる分画
を合し５て凍結乾燥すると、淡黄色または白色の粉末の
形で粗生成物が得られる。等電点ｐＩは、７．０〜７．
１である。この方法により、ヒト血清または血漿１１か
ら、凍結乾燥粗生成物８〜１０■が得られ、その１１ｖ
は２５　ＳＵ　（サチェチン単位）のサチェチン活性を
示し、食物摂取調節剤として使用できる。

この生成物のサテエチン活性は、生物学的活性の測定用
に本発明者らが作成した方法によって測定できる。サチ
ェテン１単位（ＳＵ　）とは５９６時間絶食させた体重
２００〜２４０ｇのＯＦＹ雌性ラットに脳室内投与した
場合、栄養開始初日における＊＊固型飼料の消費が平均
の２４．４±０．７６　ｇから１０．９に低下する童を
意味する。

かくして得られた、サチェテン活性を有する粗生成物は
、電気泳動法たとえばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ
）の存在下におけるアクリルアミドデル′電気泳動また
は％電点電気泳動によって検討した場合、蛋白染色によ
って数個のバンドが検知はれることから、まだ均一な物
質とは考えられない、。

均一な活性物質の製造を目的とした努力の過程で、従来
の方法とは異なる、より効率的かつ単純な方法が案出さ
れた。本発明の方法におけるこの工程には、蛋白分解の
ための消化が採用されている。これは夾雑物として認め
られるペプチドや蛋白は消化によって分解されるが、糖
蛋白であるザチェチンは蛋白消化に対してはるかに安定
であろうとの考え方に基づくものである。すなわち、本
発明の方法の一態様によれば、上述のＶＪＩｔ　Ｈ方法
によって得られた高純度の生成物を、ＰＨ８，１〜８．
２の緩和なアルカリ性緩衝液、好ましくはＴｒｉｓ地酸
塩の０．１モル溶液に溶解し、凍結乾燥生成物の総重量
に対して計算して０２０１〜０．２、好ましくは０．１
重量部のトリジシン、および等輩のキモトリプシンをこ
の溶液に加える。ついで、この混合物を、温度６６〜６
９℃、好ましくは６７〜６８℃に２０〜６０時間好まし
くは２４時間保持する。

反応混合物は振盪または攪拌するのが好ましい。

消化開始から５時間後に、最初加えた量の半量のトリジ
シンおよびキモトリプシンを混合物中に追加し、消化を
続ける。約２４時間後に、混合物を温度０〜１０℃まで
冷却し、トリクロロ酢酸を濃度が４〜６、好ましくは約
５ｗ／／チになるように■ 加える。ついで混合物を一１５〜５℃に、少くとも１時
間、最高２４時間まで保持する。沈殿した不溶部分を好
ましくは超遠心分離またはｚｅｉｓａろ板全通したろ過
によシ除去する。

精製の次工程では、消化に用いた過剰の酵素をトリクロ
ロ酢酸で除去したのち、トリクロロ酢酸、塩、使用した
緩衝液および他の低分子量フラグメントを除去する。本
発明の方法によれば、この工程は、分子量３，０００〜
４．０００ダルトン以下の空隙容量を有するｒル上、水
性メジウムで純粋な澄明反応混合物を溶出させることに
よって行うのが好ましい。純粋かつ均一なサチェチンは
ゲルから排出され、カラムの容量の６分の１に等しい各
相に出現する。脱イオン水によって得られた、活性物質
含有分ＩＩ！１ｌｔｌ−合し、凍結乾燥する。純白色の
、完全に純粋な、取り扱いやすい、均一な粉末が得られ
る。これ線サチェチン−Ｄと命名され、以前に得られた
均一のサテエテン生成物とは異なるものである。

本発明の方法によって単離された、均一かつ純粋なサチ
ェチンーＤ活性物質の分子量ヲ、ドデシル硫酸す）　Ｉ
Ｊウム（日ＤＢ）を用いるゲル電気泳動によって測定し
たところ、４０，０００から５０．０００ダルトンであ
った。この生成物の純度および均一性は、５Ｄｓｌｆル
電気泳動において蛋白、炭水化物の両染色に対し感受性
を示す単一のバンドを与えることによっても証明された
うこの事実はこの生成物が糖蛋白の性質をもつことを示
すものでもある。生成物をＰＨ３〜１０および６〜５の
両性電解質、それぞれの存在に展開した等電点電気泳動
では、等電点はｐｉ値として約２．９〜６．１であった
。この値は前述の値と異なシ、ヒト血清中に存在する新
規物質と考えることができる。

この生成物の最終組成は次のとおりであったっ蛋白含−
７２０〜２６俤 炭水化物含！　５６〜６０係 非結合水　６〜１０チ 蛋白含量はマイクロビユレット法で測定し、加水分解後
にアミノ酸分析を行った。アミノ酸分析の結果は次のと
おシでめった。

Ａｓｐ　２．８３　％、Ｔｈｒ　１．（Ｓ　１　％、Ｓ
ｅｒ　１．２５　％、（）ｌｕ　３．６０　’１６、Ｐ
ｒｏ　１．３６　％　、Ｇｌｙ　ｏ、ａ　７％１Ａｌａ
　１．１８　％　、Ｏｙｓ　０．１６　％、Ｖａｌ　０
．９３　％、Ｍｅｔ　［１，１７％、■ＩＱ　０．７６
％、　Ｌｅｕ　１．２５　％、Ｐｂｅ　０．７７％、Ｌ
ｙｓ　３．６７％、　Ｈｉｓ　０．２２　％、Ａｒｇ　
０．６７チ すなわち、総アミノ酸含量は２２．７１　％、グルコサ
ミン含量は４．９０　％であった。

サンプル中の炭水化物含量の１例を示すと次のとおりで
ある。

フコース４，５係、マンノース８．０５係、ガラクトー
ス６０．６俤、グルコース１４．４チ、合計５６．５％ 以上の分析結果および性状から、消化過程を経て得られ
た生成物が新規で、これまでヒト血清から分離されたこ
とのない物質であることは明白である。ヒト血清１１か
ら、サテエチン活性約５０〜１　［１０１３Ｕ　／■の
純粋かつ均一な生成物約４〜６ｍりが得られる。

次に本発明を実施例によりさらに詳細に例示するが、こ
れは本発明を限定するものではない。

例１ ａ）ヒト血清３．ＯＤＯ＋＋＋／を、たえず攪拌しなか
ら６〜４気圧下に％Ａｍ１ｃｏｎ、　ＵＭ　−１［］の
膜を通してろ過する。得られた限外ろ液、約２．０００
　ｍｌｆ：減圧下に６０ｍ１まで蒸発させる。沈殿を含
む濃縮液を９，０００　＃で６０分間遠心分離したのち
上溝液を分離し、冷却、攪拌下に５５　％　ト１Ｊクロ
ロ酢酸１２＃Ｉ／を満願し、ついで混合物を温度５〜１
０℃に１時間保持する。沈殿した蛋白を除去するため、
混合物を約５℃、３０．０００９で、光学的に完全に澄
明な上溝液が得られるまで超遠心外ｌ１ＩＷに付す。こ
の成体をセファデックスＧ−１５カラム（５，９０ｃｒ
ｎ）上クロマトグラフィーに付し、０．１モル酢酸アン
モニウム緩衝液（ｐＨ６−６）で溶出する。５００〜６
００’ｍｌの分画を合して、凍結乾燥する。凍結乾燥残
渣を１０ｍ１の＃留水に溶解し−Ｂｉｏ−Ｇｅｌ　Ｐ　
−２）ｔ”ルカラム（２，５Ｘ　９０ｃＩｎ）に導入す
る。カラムラ蒸留水で溶出し、１６０〜１８０ｍ／の分
画を合し、凍結乾燥すると、塩を含まない粗すチェチン
２５ＩＲ９が、わずかに黄色を帯びた白色粉末として得
られる。

ｂ）粗生成物（上記ａで得られた）１００ｍｇを０．１
モルＴｒｉｓ塩酸塩緩衝液ＰＨ８，２に室温で振盪、撹
拌しながら溶解し、温度５　＃１１／／　ｍ／の溶液を
１４製する。得られたわずかに蛋白光を発する液に、ト
リノシン１０ｍｇとキモトリジシン１０■を加え、つい
で混合物を十分に撹拌する。わずかに沈殿を宮む混合物
を６７℃に保持した浴上に置き、ときどき振盪または攪
拌する。５時間後に、トリジシン５ｍｇとキモトリジシ
ン５〜を混合物に加え、６７℃でのインキュベーション
を１９時間続ケる。

すなわち、反応混合物は計２４時間インキュベートする
。消化終了後、混合物を温度θ〜５℃に冷却し、０．１
　Ｗ／ｖ％、すなわち２　Ｆ／の冷（約５℃）５５Ｗ／
ｖチドリクロロ酢酸を加え、混合物を完全に振、盪した
のち、−夜凍結するかまたは少なくとも１時間温度０〜
５℃に保持する。次に、沈殿を含むことがある、わずか
に蛋白光を帯びた混合物を、上述の温度、１５，０００
〜２０，０００　ｇで２５分間超遠心分離を行う。澄明
な上清をＢｌｏ−Ｇｅ１Ｆ−２ｒルカラム（５，０Ｘ４
５ｃＩｎ）に通し、カラムを蒸留水で溶出する。２５０
〜３２Ｑｍ／の分画を合し、凍結乾燥すると、塩を含′
！）′ない純粋なサテエテンーＤ（生物学的活性５０〜
１００ｓｔｙ／〜）５８Ｉｎｇが純白色の粉末として得
られる。

例２ ａ）ヒト血清３，０００ｍ／を、たえず攪拌しながら６
〜気圧下に、Ａｍ１ｃｏｎ中空繊維３０，０００カラム
を通してろ過する。得られた限外ろ液約２．０００ｍ／
を減圧下に６０ｍ１まで蒸発させる。沈殿を含む濃縮液
を’７１，０００　ｙで６０分間遠心分離したのち上溝
液を分離し、冷却、攪拌下に５５係トリクロロ酢ｔ’１
１２１２ｍ１を満願し、ついで混合物を温度５〜１０℃
に１時間保持する。混合物を温度約５℃、３０，０００
．９で、光学的に完全に澄明な上清液が得られるまで超
遠心分離して沈殿した蛋白を除去し、上清をセファデッ
クスＧ−１５カラム（５，９０ｃｍ）上クロマトグラフ
ィーに付し、０．１モル酢酸アンモニウム緩衝液（ｐ＋
−１６，６）で溶出する。５００〜６００　ｍｌの分画
を合して、凍結乾燥する。凍結乾燥残渣を１０ｍ／の蒸
留水に溶解し、Ｂｌｏ−Ｇｅ１　Ｐ　−２ゲルカラム（
２，５Ｘ９０ｃＩｎ）に導入する。カラＡを蒸留水で溶
出し、１３０〜１ＢＯｍｌの分画を合し、凍結乾燥する
と、塩を含まない粗すテエチン３Ｑ＋ｙがわずかに黄色
を帯びた白色粉末として得られる。

ｂ）粗生成物（上記例２のａで得られた）１００　＃１
１７全０．１モルＴｒｉ５塩酸塩緩衝液ＰＨ８，２に室
温で振盪、撹拌しながら溶解し、濃度５　ｍ９　／　ｍ
ｅの浴液を調製する。得られたわずかに蛋白光を発する
液に、トリプシン１０ｍｇとキモトリプシン１０ｍ９を
加え、ついで混合物を十分に攪拌する。

わずかに沈殿を含む混付物を６７℃に保持した浴上に置
き、ときどき振盪または攪拌する。５時間俵に、トリプ
シン５　ｍ９とキモトリゾシン５ｍｙ＋ａ合物に追加し
、６７℃でのインキュベ−ショｙｉ１９時間続ける。す
なわち、反応混合物は計２４時間インキュベートする。

消化終了後、混合物を温度０〜５℃に冷却し、０．１ｗ
／　％、すなわち２ｍｌの冷（約５℃）　５５　”／、
　、％　）　ＩＪジクロロ酸を加え、混合物を完全に振
盪したのち、−夜凍結するかまたは少なくとも１時間温
度０〜５℃に保持する。次に、沈殿を含むことがあるわ
ずかに蛋白光を帯びた混合物を、上述の温度、１５，０
００〜２０．０００９で２４分間超遠心分離を行う。澄
明な上清をＢｌｏ−Ｇｅ１　Ｆ　−２ゲルカラム（５，
０Ｘ　４５ｃｍ）に通し、カラム（５，０ｘ４５ｃｒｎ
）に通し、カラムを蒸留水で溶出する。２５０〜３２０
　ｍｌの分画を合し、凍結乾燥すると、塩を含まない純
粋なサチェテンーＤ（生物学的活性５０〜１００　ＳＵ
／ｍｙ）６２ｍｏが純白色の粉末として得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法の一態様を示すサチェチンーＤ単
離工程図で６り、第２図は本発明の方法の一態殊におけ
る最終ゲルクロマトグラフィーでのサチェチン活性の溶
出位置を示す図である。 第１頁の続き ［相］発明者　ベルタ　ノール　ハンガリア国ブダペス
ト　７．、マダツク　チル・　２−手続補正書（方式） ％式％ 事件との関係　特許出願人 図面の浄書（内容：こ変更なし）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　ヒトおよび（または）動物血液から、満腹中枢
   に選択的に作用して食物摂取を調節する物質を単離する
   にあたシ、ヒトおよび（または）動物血清または血漿を
   最高ｓ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏダルトンまでの分子量を透過さ
   せる限外ろ過に付し、ろ液の一部を＃発させ、得られた
   凝縮物から不溶部分を除去し、温度０℃〜１０℃で液相
   に対し５〜２５、適当には９〜１１Ｗ／ｖ（重量／容ｊ
   ／＃）％になるようにトリクロロ酢酸を加え、沈殿した
   蛋白質を除去し、得られた溶成を空隙容量が分子１ｉｉ
   ４．０００ダルトン以下のゲル上クロマトグラフィーに
   付し、−６，０〜７．０の溶液で溶出し、生物学的に活
   性な分画を磯癲し、再び空隙容量が分子量４．０００ダ
   ル）ｙ以下のゲル上クロマトグラフィーに付し、水で溶
   出して分画し、活性な分画を凍結乾燥し、凍結乾保分画
   をｐＨ８，１〜８．２の緩衝液に溶解し、この溶液に凍
   結乾燥生成物の総重蓋からｉｉ算して０．０１〜０．２
   重量の等量のトリプシンおよびキモトリプシンを加え、
   この混合物を温度６６℃〜６９℃で好ましくは時々振盪
   しながら２０〜３０時間消化し、１〜１０時間後にはじ
   めの酵素量から計算して半分のトリプシンおよびキモト
   リジシン等量を加えて消化を続け、ついで反応混合物に
   温度０℃〜１０℃で濃度４〜６ｗ／　チ好ましくは■ ５ｗ／ｖ％になるようにトリクロロ酢酸を加え、混合物
   を一１５℃〜５℃に１〜２４時間保持し、不溶部分を除
   去し、反応混合物を空隙容量が分子量４．０００ダルト
   ン以下のゲル上クロマトグラフィーに付し、水で溶出し
   て分画し、生物学的に活性な分画を凍結乾燥すること全
   特徴とする製造方法。 （２）　ヒトおよび（または）動物血清の限外ろ過は平
   坦な膜を通して行う特許請求の範囲第１項記載の製造方
   法。 （３）　ヒトおよび（または）動物血清の限外ろ過はカ
   ラＡ上で行う特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 （４）不溶部分および（または）沈殿した蛋白質の除去
   は超遠心または減圧ろ過によって行う特許請求の範囲第
   １項記載の製造方法。 （５）　ｐＨ６，０〜７．０の緩衝液は０．１モル濃度
   の酢酸アンモニウム溶液を用いて溶出を行う特許請求の
   範囲第１項記載の製造方法。 （ｆｉ）　ｐＨ６，０〜７．０の浴液で溶出後、生物学
   的に活性な分画を凍結乾燥または減圧上蒸発によって行
   う特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 （７）　ｐＨ８，１〜８．２の緩衝液として２−アミノ
   −２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩
   酸塩の０．１モル溶液を用いる特許請求の範囲第１項記
   載の製造方法。 （８ン　溶液へのトリプシンおよびキモトリジシンの添
   加は、凍結乾燥生成物の総重量から計算して［Ｊ、１１
   賃の等量行う特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 （９）　消化は温度６７℃〜６８℃で２４時曲行う特許
   請求の範囲第１項記載の製造方法。