JPS60126085A - 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物 - Google Patents
新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物Info
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- JPS60126085A JPS60126085A JP58232508A JP23250883A JPS60126085A JP S60126085 A JPS60126085 A JP S60126085A JP 58232508 A JP58232508 A JP 58232508A JP 23250883 A JP23250883 A JP 23250883A JP S60126085 A JPS60126085 A JP S60126085A
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- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
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- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
・本発明は、新規グラスミド及びその脚製方法韮びに#
グラスミドを含有する新規微生物に関し、代謡産物であ
るキシラナーゼの菌体外生産(分泌)ニ関与する特、定
の遺伝情報を担うデオキシ1JyJft&′酸(DNA
)を組み込んだ新規ゲラスミrと、該グラスミドによっ
て形雀転換した新規像生物″f提供することを目的とす
るものである。
グラスミドを含有する新規微生物に関し、代謡産物であ
るキシラナーゼの菌体外生産(分泌)ニ関与する特、定
の遺伝情報を担うデオキシ1JyJft&′酸(DNA
)を組み込んだ新規ゲラスミrと、該グラスミドによっ
て形雀転換した新規像生物″f提供することを目的とす
るものである。
グラスミドは、微生物の細胞内に見出さn、る染色体外
遺伝子で、そのDNAの円形分子であり、近年、微生物
の遺伝子組み換えの手段として利用さn1発酵工業の分
野の研究におけるそのl−要件は益々増大して来ている
。
遺伝子で、そのDNAの円形分子であり、近年、微生物
の遺伝子組み換えの手段として利用さn1発酵工業の分
野の研究におけるそのl−要件は益々増大して来ている
。
近年、アミノ酸やペグチドのfIlrLみられるように
、微生物の生育に必要とする特定の侠求性や代謝産物の
生産能に関与する遺伝情報を担うDNAを組み込んだグ
ラスミドについての研究がなすn5また若干のグラスミ
ドが宿主微生物に導入さn。
、微生物の生育に必要とする特定の侠求性や代謝産物の
生産能に関与する遺伝情報を担うDNAを組み込んだグ
ラスミドについての研究がなすn5また若干のグラスミ
ドが宿主微生物に導入さn。
その形質転換株が得らnている。
本発明者は、バチルス(Baclllus ) 輌に^
する微生物の代謝が物であるキシラナーゼの菌体外生産
(分泌)に関与する遺伝情報を担うDNAを組み込んだ
新規テラスミドを1LFJすることに成功し、y!に前
記グラスミドをエシェリヒア・コリ(Escherlc
hla colt ) HB / Q /株に導入して
新規且つ有用な形質転換株、エシェリヒア・コリ(Es
cherlchla colt ) Ha 10 /
(pCX3//)を得ることに成功して本発明を完成す
るに至った。
する微生物の代謝が物であるキシラナーゼの菌体外生産
(分泌)に関与する遺伝情報を担うDNAを組み込んだ
新規テラスミドを1LFJすることに成功し、y!に前
記グラスミドをエシェリヒア・コリ(Escherlc
hla colt ) HB / Q /株に導入して
新規且つ有用な形質転換株、エシェリヒア・コリ(Es
cherlchla colt ) Ha 10 /
(pCX3//)を得ることに成功して本発明を完成す
るに至った。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において用いられる宿主微生物は、エシェリヒア
属の1ラスミドとして知らfるコリシンE、因子等の、
培養された細胞内で増殖し得る形式をとるグラスミド(
でフタ−DNA)に、外来の遺伝子DNAとしてバチル
ス属に属する微生物、例えばバチルス・Cl23菌(微
工研駒寄第73qq号)から調製されたDNA断片を組
み込んだグラスミド會含弔させ得る、エシェリヒア・コ
リによって代表されるエシェリヒア属に和する微生9勿
である。
属の1ラスミドとして知らfるコリシンE、因子等の、
培養された細胞内で増殖し得る形式をとるグラスミド(
でフタ−DNA)に、外来の遺伝子DNAとしてバチル
ス属に属する微生物、例えばバチルス・Cl23菌(微
工研駒寄第73qq号)から調製されたDNA断片を組
み込んだグラスミド會含弔させ得る、エシェリヒア・コ
リによって代表されるエシェリヒア属に和する微生9勿
である。
本発明VL使用さnる、キシラナーゼの菌体外生産に関
与する遺伝情報を担うDNAを含有する微生物の例とし
、ては、バチルス・C/ 25’d!J (做工研菌寄
第73’l’1号)を挙げることができる。バチルス・
CI2!;9には埼玉県入曲利く鶴ケ島内で採取さ′n
だ土壌より分離さrした微生物であり、次の狛学的性I
Nを有する。なお、珈学的性負の試験及び分類方法は、
[エアロビック・スボア・ホーミング・バクテリアJ
(” Aeroblc Spore−formlngB
acteria ” (Unltad 5tate D
epartment oずAgriculture、
Nov、 / q!; 、2 by N、R,Sm1t
h。
与する遺伝情報を担うDNAを含有する微生物の例とし
、ては、バチルス・C/ 25’d!J (做工研菌寄
第73’l’1号)を挙げることができる。バチルス・
CI2!;9には埼玉県入曲利く鶴ケ島内で採取さ′n
だ土壌より分離さrした微生物であり、次の狛学的性I
Nを有する。なお、珈学的性負の試験及び分類方法は、
[エアロビック・スボア・ホーミング・バクテリアJ
(” Aeroblc Spore−formlngB
acteria ” (Unltad 5tate D
epartment oずAgriculture、
Nov、 / q!; 、2 by N、R,Sm1t
h。
R,E、Gordon & F、E、C1ark ))
及び[パージl−スeマニュアル・オブ争デタミネイテ
ィブ・バクテリオロジーJ C/957年) [Ber
gey’s Manual ofDetermlnat
lve Bacterlology (/ 9 !;
7 ) ]に基づいて行わnた。
及び[パージl−スeマニュアル・オブ争デタミネイテ
ィブ・バクテリオロジーJ C/957年) [Ber
gey’s Manual ofDetermlnat
lve Bacterlology (/ 9 !;
7 ) ]に基づいて行わnた。
0菌学的諸性質
a)形態
/)大キサは0.5〜0.7μX3.0〜q、θμの桿
菌である。
菌である。
2)胞、子を形成し、大きさは0.6〜0.ざμ×1.
θ〜7.2μの卵形であって、胞子のうはふくらんでい
る。
θ〜7.2μの卵形であって、胞子のうはふくらんでい
る。
3)ダラム染色性は陽性である。
b)各培地における生育状態・
C)生理的性質
以上の諸性質全総括すると、前記バチルスCノコ5菌は
、好気性の有胞子細菌であることから、バチルス(Ba
clllus ) 属に属する微生物であることは明ら
かであるが、特に生育し得る範囲がpH//、QとSり
℃ま、でである点において明らかに公知の菌種と区別さ
れ、好アルカリ性細菌の新菌種と艙定することが妥当で
あると結論された。
、好気性の有胞子細菌であることから、バチルス(Ba
clllus ) 属に属する微生物であることは明ら
かであるが、特に生育し得る範囲がpH//、QとSり
℃ま、でである点において明らかに公知の菌種と区別さ
れ、好アルカリ性細菌の新菌種と艙定することが妥当で
あると結論された。
前@e ベクターDNAに組み込まれる、バチルスCl
25菌から#iMl製さfたDNA断片は、前記バチル
スJ[ii菌の代謝産物であるキシラナーゼの菌体外生
理(分泌)に関与する遺伝情@を担うDNAであり、前
記ベクターDNAとしては、天然に存在するものを抽出
したものの他、増殖に必做吹部分以外のDNAの部分が
一部欠落しているものでもよく、例えばcolE、の系
統、+p M s 9の系統1.1)BRJ 22の系
統、psc / 0 /の系統、R6にの系統、ラムダ
−ファージの系統等が挙げられる。
25菌から#iMl製さfたDNA断片は、前記バチル
スJ[ii菌の代謝産物であるキシラナーゼの菌体外生
理(分泌)に関与する遺伝情@を担うDNAであり、前
記ベクターDNAとしては、天然に存在するものを抽出
したものの他、増殖に必做吹部分以外のDNAの部分が
一部欠落しているものでもよく、例えばcolE、の系
統、+p M s 9の系統1.1)BRJ 22の系
統、psc / 0 /の系統、R6にの系統、ラムダ
−ファージの系統等が挙げられる。
また、前記ベクターoNAKM記DNA断片を組み込む
方法は、既知のいずnの方法も適用し得る。例えば、過
当な制限#素(Encionucl・as・)を選択、
処理してON−^を特定部位で切断し、次いで同様に処
理したベクターとして用いるDNAと混合し、リガーゼ
によって再結合する方法が用いらnる。このようにして
得られた前記DNA断片とベクターDNAの結合物を、
形質転換法によって受容菌であるエシェリヒア属の微生
物の菌体に導入し、遺伝形質として安定するまで増殖す
ると、所望の遺伝形質とベクターDNAの彬*W併せも
つ形質転換株が得られる。
方法は、既知のいずnの方法も適用し得る。例えば、過
当な制限#素(Encionucl・as・)を選択、
処理してON−^を特定部位で切断し、次いで同様に処
理したベクターとして用いるDNAと混合し、リガーゼ
によって再結合する方法が用いらnる。このようにして
得られた前記DNA断片とベクターDNAの結合物を、
形質転換法によって受容菌であるエシェリヒア属の微生
物の菌体に導入し、遺伝形質として安定するまで増殖す
ると、所望の遺伝形質とベクターDNAの彬*W併せも
つ形質転換株が得られる。
後述の実施例において得られる形責□転換株は、ベクタ
ーDNAとしてpBR322fラスミドのDNAを用い
、これにバチルス・Cl2S劇から調製されたDNA断
片を組み込んで得らf′した新規pCX 3 / /
fラスミドを、エシェリヒア・2988101株(エシ
ェリヒア・コリに一部 2株とエシェリヒア−398株
のハイブリッド株)に導入して形質転換反応により得ら
nる新規微生物であり、工、−7エリヒアーコリHB/
Q/ (pCXJ’//)(Escherlchla
coll HB /θ/(+)CX3//))(微工研
菌を第73qs号(FERMP−7311!r)と呼称
される。前記エシェリヒア・コリH8/ 0 / (p
CX 、、’ t t )の1)CX J / / グ
ラスミドの制限酵素切断地図は、第9図に示すとおりで
ある。
ーDNAとしてpBR322fラスミドのDNAを用い
、これにバチルス・Cl2S劇から調製されたDNA断
片を組み込んで得らf′した新規pCX 3 / /
fラスミドを、エシェリヒア・2988101株(エシ
ェリヒア・コリに一部 2株とエシェリヒア−398株
のハイブリッド株)に導入して形質転換反応により得ら
nる新規微生物であり、工、−7エリヒアーコリHB/
Q/ (pCXJ’//)(Escherlchla
coll HB /θ/(+)CX3//))(微工研
菌を第73qs号(FERMP−7311!r)と呼称
される。前記エシェリヒア・コリH8/ 0 / (p
CX 、、’ t t )の1)CX J / / グ
ラスミドの制限酵素切断地図は、第9図に示すとおりで
ある。
第9図から明らかなように、このグラスミドは、pBR
322グラスミドDNAの制限サイトのHl nd[[
サイトに前舊ピパチルスーC12夕菌のキシラナーゼの
菌体外生産(分路)に関与する遺伝情報?担うキシラナ
ーゼDNA断片が組み込まれているDNA円形分子、即
ちpBR3,22fラスミドDNA’と釣り、C00の
塩基対のDNAから成る9、01にbの新規なりNA円
形分子である。
322グラスミドDNAの制限サイトのHl nd[[
サイトに前舊ピパチルスーC12夕菌のキシラナーゼの
菌体外生産(分路)に関与する遺伝情報?担うキシラナ
ーゼDNA断片が組み込まれているDNA円形分子、即
ちpBR3,22fラスミドDNA’と釣り、C00の
塩基対のDNAから成る9、01にbの新規なりNA円
形分子である。
次に、前記エシェリヒア・コリHF310/(pCX
J / / )の酌学的性貴け、DNA受答酎で耐るエ
シェリヒア・コリH8101株の性質と、ペニシリン耐
性、キシラナーゼ生産性を除いて、同一であるか[:
Mo1ecular Clonlng A ’Labo
ratoryManual、p、50!(/91r2)
診照、遺伝形質:F、hsds20crB*mB)*r
ecAIJIare −/ tIl proA2 、
l5cY/ l galに2 、 rpsLシ(Sm’
) 、 xy4−5. mtl−/、 5upEqりλ
−〕、他の特性として、前記pcX l? / / グ
ラスミドの特性、即ちキシラナーゼ生産能の遺伝悄1M
全i+tうpcx J / / グラスミドによってキ
シラナーゼを菌体外に分泌し、蓄積せしめる特性を附加
して成る点がその特徴−である。
J / / )の酌学的性貴け、DNA受答酎で耐るエ
シェリヒア・コリH8101株の性質と、ペニシリン耐
性、キシラナーゼ生産性を除いて、同一であるか[:
Mo1ecular Clonlng A ’Labo
ratoryManual、p、50!(/91r2)
診照、遺伝形質:F、hsds20crB*mB)*r
ecAIJIare −/ tIl proA2 、
l5cY/ l galに2 、 rpsLシ(Sm’
) 、 xy4−5. mtl−/、 5upEqりλ
−〕、他の特性として、前記pcX l? / / グ
ラスミドの特性、即ちキシラナーゼ生産能の遺伝悄1M
全i+tうpcx J / / グラスミドによってキ
シラナーゼを菌体外に分泌し、蓄積せしめる特性を附加
して成る点がその特徴−である。
エシェリヒア・コリHe 10 / (pcx3/ /
)によるキシラナーゼの菌体外選択生妬(分泌)は、
後述の実施例で示さj、るように、菌体内生産を含めた
全酵素生産のgθ%以上に達し、且つ長時間その生産量
が持続さnる。これに対し、前記バチルス、 CI、7
3;菌によるキシラナーゼの菌体外生産(分泌)は、第
3図に示すように、培養後、徐々に長時間で最為に達し
、以後、急速に活性が減少して長時間の持続性を欠く点
において全く対照的である。
)によるキシラナーゼの菌体外選択生妬(分泌)は、
後述の実施例で示さj、るように、菌体内生産を含めた
全酵素生産のgθ%以上に達し、且つ長時間その生産量
が持続さnる。これに対し、前記バチルス、 CI、7
3;菌によるキシラナーゼの菌体外生産(分泌)は、第
3図に示すように、培養後、徐々に長時間で最為に達し
、以後、急速に活性が減少して長時間の持続性を欠く点
において全く対照的である。
従って、本発明は、前記エシェリヒア・コリHBtO/
(pcx3/ / )、すなわち、従来皆mであった
酵素蛋白の―体外生産(分泌)能を街し且つキシラナー
ゼkmめで有利に生産し得る似生物を創製、折供する点
において、新規性と有用性を具備するものである。甘た
、その生産物質は目的とする単一の高分子物債のみなら
ず、他の高分子物像や?ν数の酢素蛋白類がそれぞn菌
体外に著量に生産(分泌)され、併せて採増することが
でキル。シ11チ、前記エシェリヒア・コリHB10/
(pCx 3 / / )の培養によね、キシラナーゼ
と共にベニシリナーゼや従来、菌体内にのみ検出さ1て
いたアルカリホスファターゼ等が後述の実施例に記載の
如く、そnぞれ菌体外に著量に分泌されることが明らか
にさnた。
(pcx3/ / )、すなわち、従来皆mであった
酵素蛋白の―体外生産(分泌)能を街し且つキシラナー
ゼkmめで有利に生産し得る似生物を創製、折供する点
において、新規性と有用性を具備するものである。甘た
、その生産物質は目的とする単一の高分子物債のみなら
ず、他の高分子物像や?ν数の酢素蛋白類がそれぞn菌
体外に著量に生産(分泌)され、併せて採増することが
でキル。シ11チ、前記エシェリヒア・コリHB10/
(pCx 3 / / )の培養によね、キシラナーゼ
と共にベニシリナーゼや従来、菌体内にのみ検出さ1て
いたアルカリホスファターゼ等が後述の実施例に記載の
如く、そnぞれ菌体外に著量に分泌されることが明らか
にさnた。
ごnは、本発明によって得られる1)CX J’ /
/ グラスミドに含1れる約ti 、oooの塩基対の
DNAが、代謝産物の菌体外生産(分泌)能を宿主に附
与していることを意味するものである。
/ グラスミドに含1れる約ti 、oooの塩基対の
DNAが、代謝産物の菌体外生産(分泌)能を宿主に附
与していることを意味するものである。
以下に、本発明のグラスミドのvI4製方法と該グラス
ミドを含有する前記旅装転換株、エシェリヒアaコリH
B10/ (pcXJ//)の調製方法並ひに帥記Jk
駕転換株による効果として、キシラナーゼを王とする柚
々の酵雰彊白の菌体外生産(分泌)Kついて、実施例に
より説明する。
ミドを含有する前記旅装転換株、エシェリヒアaコリH
B10/ (pcXJ//)の調製方法並ひに帥記Jk
駕転換株による効果として、キシラナーゼを王とする柚
々の酵雰彊白の菌体外生産(分泌)Kついて、実施例に
より説明する。
実施例1
(1) キシラナーゼ生産能の遺伝悄情をもつDNAの
調製 キシラナーゼを菌体外に生成、蓄積する能力を有する好
アルカリ性のバチルス・ci23;yl(微工研菌寄m
7341グ号)を培地[:(P/、−g):H1O,0
,酵母エキス!; 、(:’ % ポリヘクトンS 、
θ、に、HPO4/ 、θ、 MPSO4・りH2O
0、2をNs、Co510でpHis 、 0に1整し
たもの〕中、30℃で19時間振盪培養を行ない、対数
増殖後期の菌体を集菌後、フェノール法によるDNA抽
出法によってDNAを抽出、精製し、DNA5■を得た
。
調製 キシラナーゼを菌体外に生成、蓄積する能力を有する好
アルカリ性のバチルス・ci23;yl(微工研菌寄m
7341グ号)を培地[:(P/、−g):H1O,0
,酵母エキス!; 、(:’ % ポリヘクトンS 、
θ、に、HPO4/ 、θ、 MPSO4・りH2O
0、2をNs、Co510でpHis 、 0に1整し
たもの〕中、30℃で19時間振盪培養を行ない、対数
増殖後期の菌体を集菌後、フェノール法によるDNA抽
出法によってDNAを抽出、精製し、DNA5■を得た
。
(21DNA断片のベクターへの挿入
(11で得た染色体DNA/θμf!全とり、1iib
限エンドヌクレアーゼ+Indlll k加え137℃
で5分、IQ分、20分、30分、60分反応させて部
分的に切断した。一方、ベクターとして用いるテトラサ
イクリン抵抗性(Tst’)とアンビシリン抵抗性(A
mp’)をもつpBR322デラスミ ド’ON−A、
(Bethesda Re5earch Labora
tOries社(米国)製)をHlnd I[l で完
全に切断して45 ”C5夕分の熱処理後、前者と混合
し、T4ファージ由来のDNAリガーゼによって70℃
、2q時間DNA鎖の連結反応を行ない、65℃、5分
の熱処理後、反応液に3倍容のエタノールを加えてD−
NAを組み込んだプラスミドDNAを沈澱、採取した。
限エンドヌクレアーゼ+Indlll k加え137℃
で5分、IQ分、20分、30分、60分反応させて部
分的に切断した。一方、ベクターとして用いるテトラサ
イクリン抵抗性(Tst’)とアンビシリン抵抗性(A
mp’)をもつpBR322デラスミ ド’ON−A、
(Bethesda Re5earch Labora
tOries社(米国)製)をHlnd I[l で完
全に切断して45 ”C5夕分の熱処理後、前者と混合
し、T4ファージ由来のDNAリガーゼによって70℃
、2q時間DNA鎖の連結反応を行ない、65℃、5分
の熱処理後、反応液に3倍容のエタノールを加えてD−
NAを組み込んだプラスミドDNAを沈澱、採取した。
(3) キシラナーゼの菌体外HE産(分泌)遺伝子を
和うグラスミドによる形質転換 エシェリヒア・コリK −/ 2株とエシェリヒア・3
18株のハイブリッド株であるエシェリヒア・コリH8
191株(Mo1ecular ClonlngA L
aboratoryManual p、!; O’l
(/ 9 g 2 )参照〕(遺伝形’1ifi’ :
F 、 hsd S 20(r’i+ mi ’4r
ec A / 3. ara−/ +1. pro A
211ac Y /、 li’alK 、21 rp
$ L 、20(Sm’ L Xy、、e−5,mtl
−/、 、Sup E+lIλ−)をLB培地(純水l
)当りトリプトン(Dlfco ) / () y、酵
母エキス51、グルコースiy、Naα 10gを含み
、pH7、0に帥製したもの)IC)meK、接種し、
37℃で振盪培養を行ない、対数増畑後期捷で止置させ
た後に集菌した。こnを水冷下、最終濃度で。、0.?
MCa■2の溶液にj員次懸濁させてコンピテントな細
胞とした。この細胞懸濁液に、 +21で得たグラスミ
ドDNAの溶解液を加えて水冷下で6θ分反応させ、4
t2℃、7〜2分間ヒートショックを与えて前記シラス
ミドDNAを細胞内に取り造管せた。次いで、この細胞
懸濁沿を別途、前記LBs地に接種し、37℃、3〜.
!i′時間振盪培養して形質転換反応を行なった後、穿
菌、洗滌して得られた形質転換株の中から、エシェリヒ
ア・コリHB10/ (pcX3/ / )(機工研菌
寄第73ダタ号)を得た。
和うグラスミドによる形質転換 エシェリヒア・コリK −/ 2株とエシェリヒア・3
18株のハイブリッド株であるエシェリヒア・コリH8
191株(Mo1ecular ClonlngA L
aboratoryManual p、!; O’l
(/ 9 g 2 )参照〕(遺伝形’1ifi’ :
F 、 hsd S 20(r’i+ mi ’4r
ec A / 3. ara−/ +1. pro A
211ac Y /、 li’alK 、21 rp
$ L 、20(Sm’ L Xy、、e−5,mtl
−/、 、Sup E+lIλ−)をLB培地(純水l
)当りトリプトン(Dlfco ) / () y、酵
母エキス51、グルコースiy、Naα 10gを含み
、pH7、0に帥製したもの)IC)meK、接種し、
37℃で振盪培養を行ない、対数増畑後期捷で止置させ
た後に集菌した。こnを水冷下、最終濃度で。、0.?
MCa■2の溶液にj員次懸濁させてコンピテントな細
胞とした。この細胞懸濁液に、 +21で得たグラスミ
ドDNAの溶解液を加えて水冷下で6θ分反応させ、4
t2℃、7〜2分間ヒートショックを与えて前記シラス
ミドDNAを細胞内に取り造管せた。次いで、この細胞
懸濁沿を別途、前記LBs地に接種し、37℃、3〜.
!i′時間振盪培養して形質転換反応を行なった後、穿
菌、洗滌して得られた形質転換株の中から、エシェリヒ
ア・コリHB10/ (pcX3/ / )(機工研菌
寄第73ダタ号)を得た。
実施例コ
実施例1の(3)で得らf′した形質転換株、エシェリ
ヒア・コリHB / 0 / (pCX 、? / /
) (機工(iJIIii寄第73’lS号) (F
ERM P−’73り5)倉、L13培地(l!尚わト
リフトン10ハ酵母エキス5グ、グル、コース11、グ
リセロール、!17’、Na側/ Og−5’−に=
シ11 ン/ 0 ’W!を含む)100mlに・0.
5%のキシランを含むり0 に’ ml 容のフラスコ
でL?7℃にて撮盪培養した。細胞の生育(菌体量の測
定)は、乙60nmの吸光度(OD)で、酵素活性は、
酵素液0.0!5rnlにキシラン液(生化学工秦■m
>θ、/ml及びplH,Oのθ、2Mトリスマlzイ
)91衝NO,/rLcを7Jnして’IO”Cで19
分1IJ11*、 W−1させ、D N 9 (3、3
−dlnltrosallc−yllc acld )
/ mlを加えて700℃で5分間反応させた後に水
りmeを加えてりlomμの吸光度を測足し、1分間に
キシロースl■の還元力を生ずる酵素′#をキシラナー
ゼ/単位(U)とし−★。
ヒア・コリHB / 0 / (pCX 、? / /
) (機工(iJIIii寄第73’lS号) (F
ERM P−’73り5)倉、L13培地(l!尚わト
リフトン10ハ酵母エキス5グ、グル、コース11、グ
リセロール、!17’、Na側/ Og−5’−に=
シ11 ン/ 0 ’W!を含む)100mlに・0.
5%のキシランを含むり0 に’ ml 容のフラスコ
でL?7℃にて撮盪培養した。細胞の生育(菌体量の測
定)は、乙60nmの吸光度(OD)で、酵素活性は、
酵素液0.0!5rnlにキシラン液(生化学工秦■m
>θ、/ml及びplH,Oのθ、2Mトリスマlzイ
)91衝NO,/rLcを7Jnして’IO”Cで19
分1IJ11*、 W−1させ、D N 9 (3、3
−dlnltrosallc−yllc acld )
/ mlを加えて700℃で5分間反応させた後に水
りmeを加えてりlomμの吸光度を測足し、1分間に
キシロースl■の還元力を生ずる酵素′#をキシラナー
ゼ/単位(U)とし−★。
紀1図け、前記LB培地に0.5%キシランを加えた培
地を用いた場合のキシラナーゼの活性、ν1jちキシラ
ナーゼの菌体外生産(分泌)能を示すグラフである。
地を用いた場合のキシラナーゼの活性、ν1jちキシラ
ナーゼの菌体外生産(分泌)能を示すグラフである。
前記形質転換株の菌体量は接種後、9〜12時間で蛇大
に達し、m1図に示すとおり、菌体外キシラナーゼの活
性はほぼ6時間後から増大しけじめ、73時間後に耐大
に達し、た(’−o、、?りLJ、/mど)。
に達し、m1図に示すとおり、菌体外キシラナーゼの活
性はほぼ6時間後から増大しけじめ、73時間後に耐大
に達し、た(’−o、、?りLJ、/mど)。
生産さnたキシラナーゼは明常に安定であh1第1図に
示さnるように、更・1、にぞのブ剪培養をりg時間ま
で継続しても生産量は減少せず、全酵雰活性のgθ%以
上に達し1次。こfiに対して、菌体内キシラナーゼは
、培養初期(接種後9図間)において若干認めらn′f
r:が、その生産は全/!!1活性の/θX8度であり
、s高で。−/3U/mAに過ぎず、しが本その活性は
徐々に波少し贋。瞥た、舘2図け、前記LB培地に、キ
シランに代えて0、!91;の皺を加えた培地を用いた
場合のキシラナーゼの活性を示すグラフであり、第1
図(7) 場合とは埋同様の傾向が紹められた。なお、
比較として、DNA供与菌の前記バチルス・C/コタ菌
(機工研菌寄第73ググ号)を培養してキシラナーゼ活
性を測定した。
示さnるように、更・1、にぞのブ剪培養をりg時間ま
で継続しても生産量は減少せず、全酵雰活性のgθ%以
上に達し1次。こfiに対して、菌体内キシラナーゼは
、培養初期(接種後9図間)において若干認めらn′f
r:が、その生産は全/!!1活性の/θX8度であり
、s高で。−/3U/mAに過ぎず、しが本その活性は
徐々に波少し贋。瞥た、舘2図け、前記LB培地に、キ
シランに代えて0、!91;の皺を加えた培地を用いた
場合のキシラナーゼの活性を示すグラフであり、第1
図(7) 場合とは埋同様の傾向が紹められた。なお、
比較として、DNA供与菌の前記バチルス・C/コタ菌
(機工研菌寄第73ググ号)を培養してキシラナーゼ活
性を測定した。
前記バチルス・C1,23菌の契合は、使用培地C(t
/a ) : *シーiン/θ、θ、酵母エキスs、o
、zリペグトン5 、0% K2HPO4/ 、 Q、
MPSO4−りH2Oθ −−2’t−Na3CO5/
0”’C’put、、Qf−調整したもの〕100m
1を含む50Orug答のフラスコに接種し、37℃で
振帰培養した。t@養沿の菌体外キレラナーゼ活性會g
時間毎に測足し、た。
/a ) : *シーiン/θ、θ、酵母エキスs、o
、zリペグトン5 、0% K2HPO4/ 、 Q、
MPSO4−りH2Oθ −−2’t−Na3CO5/
0”’C’put、、Qf−調整したもの〕100m
1を含む50Orug答のフラスコに接種し、37℃で
振帰培養した。t@養沿の菌体外キレラナーゼ活性會g
時間毎に測足し、た。
接種後、g時間で徐々に活性が上がり、グg時11j+
に至ってやっと活性は最高(中0.!;IJ/mlりに
達したが、以後急速に活性は減少した(第3図1照)。
に至ってやっと活性は最高(中0.!;IJ/mlりに
達したが、以後急速に活性は減少した(第3図1照)。
なお、実施例/の形質転換株の培養液に硫酸アンモニウ
ムを加えて塩析した後、沈澱を水に溶がして一夜流水で
透析し、pH!、5の2Q mM燐酸−燐酸lソーダー
緩衝液で平価化した0Mセルロースに吸着させた後に、
食塩濃囲kO,7Mがら0.7Mまで変化ζせ、てキシ
ラナーゼ+!I7溶出gせると、(7,+MIIT後で
溶出ざnる。活性のある区分を集めてセファデックス・
G −/ 00 (5eph −adsx G −/
00 ) によるグル濾過を行って精製キシラナーゼを
得た。また、前記バチルス・CI2!;*(機工研園寄
第734tq号)の培養液も同様に処理して精製し、1
百1様のキシラナーゼ會得た0両者のキシラナーゼの同
−性會みるためK %plJ活性、超速/し分析、電気
泳動及び分子量等を測定したところ、次のとおり両者の
同一性が確認さfiた。
ムを加えて塩析した後、沈澱を水に溶がして一夜流水で
透析し、pH!、5の2Q mM燐酸−燐酸lソーダー
緩衝液で平価化した0Mセルロースに吸着させた後に、
食塩濃囲kO,7Mがら0.7Mまで変化ζせ、てキシ
ラナーゼ+!I7溶出gせると、(7,+MIIT後で
溶出ざnる。活性のある区分を集めてセファデックス・
G −/ 00 (5eph −adsx G −/
00 ) によるグル濾過を行って精製キシラナーゼを
得た。また、前記バチルス・CI2!;*(機工研園寄
第734tq号)の培養液も同様に処理して精製し、1
百1様のキシラナーゼ會得た0両者のキシラナーゼの同
−性會みるためK %plJ活性、超速/し分析、電気
泳動及び分子量等を測定したところ、次のとおり両者の
同一性が確認さfiた。
a)pH4−夕は酢酸塩、p115〜g′はトリスマレ
イド、pH7〜9はトリス塩酸、pH9−//はグリシ
ン嵜−件ソーダを用いて夫々調整し、前記測定法によっ
てρIの影醤を脚べた結果、第5図のと′おり、両酵素
のρI活性の同一性が明らかにζnた。
イド、pH7〜9はトリス塩酸、pH9−//はグリシ
ン嵜−件ソーダを用いて夫々調整し、前記測定法によっ
てρIの影醤を脚べた結果、第5図のと′おり、両酵素
のρI活性の同一性が明らかにζnた。
b)超遠心分析では、両酵素と本に沈降定数約3、りS
の単一ピークを示した。
の単一ピークを示した。
C)ρIr3.3のディスク電気泳動で両酵素ともに一
本のバンドになってあり、アンフオラインによるエレク
トロホーカシングで単一のピークを示し、等電点は6.
3にあった。
本のバンドになってあり、アンフオラインによるエレク
トロホーカシングで単一のピークを示し、等電点は6.
3にあった。
d)分子量は、両酵素ともLSDS−ポリアクリルアミ
ド法により約グθ、θ0θと測定さnた。
ド法により約グθ、θ0θと測定さnた。
実施例13
目11記エシェリヒア # コリHa/θ/ (pCX
3//)(機工研菌寄第り31134g) (FERM
p−7,3115)の菌体外生産物質について、ゲラ
スミ)” (pCX 3/ / ) k導入しないエシ
ェリヒア・コリH8197株及び1)8R322fラス
ミドを導入したエシェリヒア・コリHBl?)1株の生
産物質と比較して、キシラナーゼ以外の酵紫蛋白類を調
べた結果を第1表に示す。
3//)(機工研菌寄第り31134g) (FERM
p−7,3115)の菌体外生産物質について、ゲラ
スミ)” (pCX 3/ / ) k導入しないエシ
ェリヒア・コリH8197株及び1)8R322fラス
ミドを導入したエシェリヒア・コリHBl?)1株の生
産物質と比較して、キシラナーゼ以外の酵紫蛋白類を調
べた結果を第1表に示す。
なお、培養条件は、実施例ユのキシランを加えた1B培
地で、被二シリナーゼについては、37℃にて20時間
振盪培養し、アルカリホスファターゼ及びβ−ガラクト
シダーゼについテハ、15時間それぞれ培養した結果で
ある。また、アルカリホスファターゼ及びβ−ガラクト
シダーゼの酵素活性は、波長グ20nmにおける吸光度
(OD)を測定して表わしたものである。
地で、被二シリナーゼについては、37℃にて20時間
振盪培養し、アルカリホスファターゼ及びβ−ガラクト
シダーゼについテハ、15時間それぞれ培養した結果で
ある。また、アルカリホスファターゼ及びβ−ガラクト
シダーゼの酵素活性は、波長グ20nmにおける吸光度
(OD)を測定して表わしたものである。
第1図及び泥ユ図は、本発明方法で用いたエシェリヒア
−:IすHB / 0 / (pCX 、? / /
)によるキシラナーゼ生産活性を、第3図は、バチル
ス・C/2g菌によるキシラナーゼ生産活性全それぞれ
示すグラフである。第グ図は、エシェリヒア・:l I
J HB / 0 / (pCX 3 / / )のプ
ラスミド(rIcx 、3 / / )の制限酵素切断
地図であり、第5図は、エシェリヒア−コリHB /
0 / (pCX、?//)とバチルス・CI2に菌の
産生するキシラナーゼのPB活性の同一性を示すグラフ
である。 特許出願人 理 化 学 研 究 所 鬼3図 I 培 1 時 間(にr) 第4図 : pBR322ブラ又ミドDNA Q区酩公郡図湖: Rf)ttス・c tzsoNA
K片(キシラチー乞’DNA断片) 特許庁長官 若杉和夫 殿 1.事イろ1の表示 昭和58年特許願第232508
号3、補正をする者 事件との関係 出願人 名称 (679)理化学研究所 4、代理人 図面中、第1図および第2図を別紙の通り訂正する。
−:IすHB / 0 / (pCX 、? / /
)によるキシラナーゼ生産活性を、第3図は、バチル
ス・C/2g菌によるキシラナーゼ生産活性全それぞれ
示すグラフである。第グ図は、エシェリヒア・:l I
J HB / 0 / (pCX 3 / / )のプ
ラスミド(rIcx 、3 / / )の制限酵素切断
地図であり、第5図は、エシェリヒア−コリHB /
0 / (pCX、?//)とバチルス・CI2に菌の
産生するキシラナーゼのPB活性の同一性を示すグラフ
である。 特許出願人 理 化 学 研 究 所 鬼3図 I 培 1 時 間(にr) 第4図 : pBR322ブラ又ミドDNA Q区酩公郡図湖: Rf)ttス・c tzsoNA
K片(キシラチー乞’DNA断片) 特許庁長官 若杉和夫 殿 1.事イろ1の表示 昭和58年特許願第232508
号3、補正をする者 事件との関係 出願人 名称 (679)理化学研究所 4、代理人 図面中、第1図および第2図を別紙の通り訂正する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1) 宿主にキシラナーゼの菌体外生産能を与えるグ
ラスミドであって、その制限サイトのHl ndllサ
イトにバチルス(Bacillus ) 属に属する微
生物のキシラナーゼの菌体外生産に関与する遺伝情@を
担うデオキシリポ核酸(DNA)断片を却み込んだグラ
スミド。 (21グラスミドがpCX 、3 / / グラスミド
である特許請求の範囲第(11項記載のグラスミド。 (3) グラスミドのベクターがpBRJ 22 グラ
スミドのDNAである特許請求の範囲第+11項記載の
1ラスミド。 (4) バチルス属VtJf4する微生物がノfチルス
” (Baclllus )・C/ 25 ’elJ
(微工研菌寄第qatItI号)である特許請求の範囲
第+1111項記載ラスミド。 (5) 宿主がエシェリヒア(Escherlchla
)私に楓t4微ヶ物苓ああ特許、え。1第(n *
le *’F)グラスミド。 (6) エシェリヒア属に属する微生iがエシェリヒア
・コリ(Escherlchla colt ) であ
る特許請求の範囲第(6)項記載のグラスミド。 (7) キシラナーゼの菌体外生産能を与えるDNA断
片を制限酵素を用いて調製すること、前記DNA断片の
キシラナーゼの画体外生産に関与する遺伝情報を妨害し
ない制限酵素を用いてグラスミドのベクターDNAを制
限すること、制限さnた前記グラスミドのベクターDN
Aの制限サイトのHlnd m サイトに前記DNA断
片を縮み換えること及び組換えらnたグラスミド會抽出
することから成るキシラナーゼの―体外生版に関与する
遺伝情報を担うDNA断片を組み込んだグラスミドの調
製方法。 (81グラスミドがpCX 3/ / グラスミドであ
る特許請求の範囲第(7)項記載の調製方法。 (9) グラスミドのベクターとして、ρBRJ22f
ラスミドのDNA’i用いる特許請求の範囲第())項
記載のグラスミドの調製方法。 α(I DNA断片が共チルス(Baclllus )
114に属する微生物のDNAから調製されたDNA
である竹許稍求の範囲第(7)項記載のグラス−ミドの
調製方法。 011 バチルス属に属する微生物がバチルス(Bac
lllus )−CI’25 菌’(微工研―寄第り3
ダ弘号)である特許請求の範囲第(1(I項記載のグラ
スミドの調製方法。二 0X5 キシラナ・÷ゼの菌体外生産能を有するエシェ
リヒア・コリH8101(pCx3/1)(Esche
rlchla call Ha10/ (pCX 3/
/ ) 〕。
Priority Applications (12)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58232508A JPS60126085A (ja) | 1983-12-09 | 1983-12-09 | 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物 |
DK138984A DK138984A (da) | 1983-03-08 | 1984-02-29 | Plasmid, fremgangsmaade til fremstilling heraf, mikroorganismer indeholdende samme samt fremgangsmaade til dyrkning af mikroorganismen |
FI840843A FI85721C (fi) | 1983-03-08 | 1984-03-02 | Foerfarande foer extracellulaer produktion av penicillinas, plasmid anvaend vid foerfarandet och foerfarande foer konstruktion av plasmiden. |
AT84102440T ATE61410T1 (de) | 1983-03-08 | 1984-03-07 | Plasmide, verfahren zu ihrer bereitung, mikroorganismen, die diese plasmide enthalten, und verfahren zur kultivierung der mikroorganismen. |
EP88121510A EP0316023B1 (en) | 1983-03-08 | 1984-03-07 | Plasmids, methods for their construction, microorganisms carrying them and methods for the extracellular production of xylanase by cultivation of the microorganisms |
DE19843486163 DE3486163T2 (de) | 1983-03-08 | 1984-03-07 | Plasmide, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende Mikroorganismen und Methoden zur extrazellulären Herstellung von Xylanase durch Züchten dieser Mikroorganismen. |
DE8484102440T DE3484207D1 (de) | 1983-03-08 | 1984-03-07 | Plasmide, verfahren zu ihrer bereitung, mikroorganismen, die diese plasmide enthalten, und verfahren zur kultivierung der mikroorganismen. |
EP84102440A EP0121138B1 (en) | 1983-03-08 | 1984-03-07 | Plasmids, methods for contruction of the same, microorganisms carrying the plasmids and methods for cultivation of the microorganisms |
AT88121510T ATE90387T1 (de) | 1983-03-08 | 1984-03-07 | Plasmide, verfahren zu ihrer herstellung, sie enthaltende mikroorganismen und methoden zur extrazellulaeren herstellung von xylanase durch zuechten dieser mikroorganismen. |
CA000449095A CA1226833A (en) | 1983-03-08 | 1984-03-08 | Plasmids, methods for construction of the same, microorganisms carrying the plasmids and methods for cultivation of the microorganism |
US06/590,636 US4624922A (en) | 1983-12-09 | 1984-03-19 | Plasmid, method for construction of the same, microorganism carrying the plasmid and method for cultivation of the microorganism |
FI890246A FI86438C (fi) | 1983-03-08 | 1989-01-17 | Plasmider som inducerar extracellulaer sekretion av xylanas, metoder foer framstaellning av dem och metoder foer produktion av xylanas. |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58232508A JPS60126085A (ja) | 1983-12-09 | 1983-12-09 | 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS60126085A true JPS60126085A (ja) | 1985-07-05 |
JPH0142675B2 JPH0142675B2 (ja) | 1989-09-13 |
Family
ID=16940426
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58232508A Granted JPS60126085A (ja) | 1983-03-08 | 1983-12-09 | 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS60126085A (ja) |
-
1983
- 1983-12-09 JP JP58232508A patent/JPS60126085A/ja active Granted
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MOI.GEN.GENET=1983 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0142675B2 (ja) | 1989-09-13 |
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