JPS60120821A - Leukocytic stimulating material for treating malignant tumor and method for stimulating - Google Patents

Abstract

PURPOSE:The titled stimulating material having a stimulating agent capable of inducing powerful tumor damaging cells safely with good operability by contact with a peripheral leukocytes through covalent bonds to an insoluble carrier. CONSTITUTION:A leukocytic stimulating material for treating malignant tumors obtained by bonding a stimulating agent, e.g. lectin having the action of activating lymphocytes, particularly T lymphocytes, inducing tumorous cells by contact with peripheral leukocytic cells through covalent bonds to an insoluble carrier, e.g. a fibrous material such as agarose or dextran, in the form of particles, fibers, hollow fibers or membranes, etc. The resultant material has the ability to activate human leukocytes more powerfully in the state of bonded to the insoluble carrier without dissolving the stimulating agent in a culture medium. Activated leukocytes are mixed with human tumorous cells to destroy most of the tumorous cells by damage and induce powerful tumor damaging cells. Thus the material is effective for cancers of the stomach, lungs, the breast, liver, etc.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、末梢血中の白血球を活性化して腫瘍障害性細
胞を誘導する機能を持つ悪性腫瘍治療用白血球刺激材お
よび刺激方法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a leukocyte stimulating material and method for treating malignant tumors, which has the function of activating leukocytes in peripheral blood and inducing tumor-toxic cells.

周知の如く、生体の悪性腫瘍に対する免疫監視機構をに
なう抗腫瘍細胞としては、キラーＴ細胞、ＮＫ細胞、活
性化マクロファージ、Ｋ細胞等が重要な役割をはたして
いることが報告されている。As is well known, it has been reported that killer T cells, NK cells, activated macrophages, K cells, and the like play important roles as antitumor cells that serve as an immune surveillance mechanism against malignant tumors in living organisms.

したがって、悪性腫瘍に対する免疫学的療法としては、
癌患者免疫細胞（白血球）を活性化して、これらの抗腫
瘍細胞を効率的に誘導することが考えられる。しかしな
がら、癌患者は一般的に、癌の進行とともに免疫能が低
下することが報告されており、癌患者生体中においては
、免疫応答を抑制する免疫抑制因子の存在あるいはサプ
レッサーＴ細胞、サプレッサーマクロファージの誘導活
性化が報告されている。Therefore, as immunological therapy for malignant tumors,
It is considered that cancer patient immune cells (white blood cells) are activated to efficiently induce these anti-tumor cells. However, it has been reported that the immune function of cancer patients generally decreases as the cancer progresses, and the presence of immunosuppressive factors that suppress the immune response or the presence of suppressor T cells and suppressor macrophages in cancer patients. Induced activation has been reported.

このような免疫能の抑制状態下にある癌患者生体中にお
いて、効率的な抗腫瘍細胞の誘導は困難であると言わな
ければならない。したがって、免疫抑制状態から解放さ
れた体外に患者白血球を取）出し、体外で効率的な抗腫
瘍細胞誘導活性化を行なうことは、効果の高す新しい癌
免疫療法になると考えられる。It must be said that it is difficult to efficiently induce antitumor cells in living cancer patients whose immune capacity is in such a suppressed state. Therefore, it is thought that taking patient's leukocytes out of the body, which has been released from the immunosuppressive state, and efficiently inducing and activating antitumor cells outside the body will become a new and highly effective cancer immunotherapy.

キラーＴ細胞は、抗腫瘍細胞の中で４１％に抗癌免疫に
おいて主役をはたしていると考えられているが、これを
体外で誘導活性化しようとする研究が精力的になされて
きた。すなわち、体外に取り出した癌患者末梢血白血球
に、摘出した患者腫瘍細胞を感作させ、患者白血球を活
性化して、特異的に患者腫瘍細胞だけを障害し、患者正
常細胞は障害しないキラーＴ細胞を誘導して、これを癌
患者体内にもどすことにより、癌を治療しようとする試
みである。Killer T cells are thought to play a major role in anti-cancer immunity, accounting for 41% of anti-tumor cells, and research has been intensively conducted to induce and activate them outside the body. In other words, the patient's tumor cells are sensitized to the cancer patient's peripheral blood white blood cells taken out of the body, and the patient's white blood cells are activated to produce killer T cells that specifically damage only the patient's tumor cells but not the patient's normal cells. This is an attempt to treat cancer by inducing it and returning it to the body of a cancer patient.

しかしながら、この方法で誘導したキラーＴ細胞は、治
療効果を期待できるほど強力ではないため、リンフ才力
インの１種であるＴ細胞増殖因子を用いて培養し、大量
に増殖させた後、患者に投与する方法が考えられている
。この方法は、Ｔ細胞増殖因子が遺伝子操作の技術によ
り工業的大量生産が可能とな９、大量のｉ細胞増殖因子
が使用できることが現実化してきたために実施可能では
あるが、キラーＴ細胞を体外で長期間培養することによ
る細胞の変質等の問題がある。また、そのほかにも実用
化するには困難な種々の問題点があり、例えば、キラー
Ｔ細胞の誘導のために患者腫瘍細胞と手術が必要なこと
、試みた癌患者の一部にのみキラーＴ細胞の誘導が可能
で、金側で誘導されるわけではないこと、操作が非常に
煩雑であること等、解決されなければならない問題点が
多い。However, the killer T cells induced by this method are not strong enough to be expected to have a therapeutic effect, so they are cultured using T cell growth factor, a type of lymphoid, and are grown in large quantities. A method of administering the drug is being considered. Although this method is possible because T-cell growth factors can be industrially mass-produced through genetic engineering techniques9 and it has become a reality that large amounts of i-cell growth factors can be used, it is not possible to use killer T cells in vitro. There are problems such as cell deterioration due to long-term culture. In addition, there are various other problems that make it difficult to put it into practical use, such as the need for surgery with patient tumor cells to induce killer T cells, and the fact that killer T cells are only available in some cancer patients. There are many problems that need to be solved, such as the ability to induce cells but not the gold side, and the extremely complicated operation.

本発明者らは、従来の方法よシも飛躍的に実用性を向上
させた新規な腫瘍障害性細胞誘導活性化法、すなわち、
容易に入手できる物質を刺激剤として用ｂ１はとんどす
べての癌患者で強力な腫瘍障害性細胞を短時間で、かつ
操作性良く誘導活性化できる方法を見い出すべく種々の
リンパ球活性化物質を検索ｊ−た。これらのリンパ球活
性化物質の中で、レクチンは強力な腫瘍障害性細胞を誘
導したが、このものは一般的に高分子の異種蛋白てあり
、強い抗原性を有しており、かつ白血球に対し親和結合
する。The present inventors have developed a new method for inducing and activating tumor-toxic cells, which is dramatically more practical than conventional methods.
Using readily available substances as stimulants, b1 was developed using various lymphocyte activating substances in order to find a method to induce and activate potent tumor-toxic cells in almost all cancer patients in a short period of time and with ease of use. I searched for. Among these lymphocyte activating substances, lectins have been shown to induce strong tumor-toxic cells, but these are generally high-molecular, heterologous proteins, have strong antigenicity, and are highly reactive to leukocytes. binds with affinity to

したがって、患者白血球をレクチンで活性化した後、該
活性化白血球を充分洗浄してもレクチンが白血球膜面よ
シ除去されず、白血球とともに患者体内に持ち込まれる
可能性が高く、かかる強抗原性を有する異種蛋白が患者
に投与されることはさけなければならない。また、本腫
瘍障害性細胞誘導活性化法は、癌患者から白血球の採取
、白血球を刺激剤を含む適当な培地で培養、活性化白血
球の洗浄採集、患者に投与等の操作から成るが、これら
の操作はすべて無菌的に行なう必要があり、かなり煩雑
である。したがって、本療法を実施可能にするためには
、システムを工夫し操作性を向上させなければならない
。Therefore, after activating a patient's leukocytes with lectin, even if the activated leukocytes are thoroughly washed, the lectin will not be removed from the leukocyte membrane surface, and there is a high possibility that the lectin will be carried into the patient's body together with the leukocytes. It is important to avoid administering foreign proteins to patients. In addition, this tumor-toxic cell induction and activation method consists of operations such as collecting leukocytes from a cancer patient, culturing the leukocytes in an appropriate medium containing a stimulant, washing and collecting the activated leukocytes, and administering them to the patient. All operations must be performed aseptically and are quite complicated. Therefore, in order to make this therapy possible, the system must be devised and its operability improved.

本発明の目的は、上記の如き従来技術に基づく腫瘍障害
性細胞の誘導の問題点に鑑み、刺激剤が活性ｒＩｌ、白
血球とともに患者体内に投与されることなく安全に、か
つ操作性良く強力な腫瘍障害性細胞を誘導できる刺激材
および刺激方法ぎ提供せんとするものである。In view of the problems of inducing tumor-toxic cells based on the prior art as described above, the object of the present invention is to provide a stimulant that is safe, easy to use, and powerful without being administered into the patient's body together with active rIl and leukocytes. It is an object of the present invention to provide a stimulating material and method capable of inducing tumor-toxic cells.

本発明者らは、上記目的に沿って鋭意研究した結果、各
種の白血球刺激剤を共有結合で不溶性担体に結合させた
刺激材をヒト末梢血白血球に接触させたところ、驚くべ
きことに、非結合刺激剤を用いるよりも強力な腫瘍障害
性細胞が誘導され、しかも活性化白血球膜面上に刺激剤
は検出されないことを見い出した。すなわち、刺激剤が
培地中に溶解せずに不溶性担体に結合した状態で、より
強くヒトの白血球を活性化する能力を有し、活性化白血
球をヒト腫瘍細胞と混合したところ、４時間の培養でほ
とんどの腫瘍細胞が障害を受けて破壊され、強力な腫瘍
障害性細胞が誘導されていることを見い出し、本発明を
完成するに至った。As a result of intensive research in line with the above objectives, the present inventors surprisingly found that when human peripheral blood leukocytes were brought into contact with stimulation materials in which various leukocyte stimulants were covalently bonded to insoluble carriers, It was found that tumor-toxic cells were more strongly induced than when using a binding stimulant, and that the stimulant was not detected on the membrane surface of activated leukocytes. In other words, when the stimulant is not dissolved in the medium but bound to an insoluble carrier, it has the ability to more strongly activate human leukocytes, and when activated leukocytes are mixed with human tumor cells, they are cultured for 4 hours. The present inventors discovered that most tumor cells are damaged and destroyed, and that strong tumor-toxic cells are induced, leading to the completion of the present invention.

すなわち、本発明は、不溶性担体に、末梢血白血球と接
触することにより腫瘍障害性細胞を誘導可能な刺激剤が
、共有結合で結合されていることを特徴とする悪性腫瘍
治療用白血球刺激材に係シ、また、刺激剤が共有結合で
固定された不溶性担体と末梢血白血球を接触させ、該混
合物から活性化白血球を分離することを連続的あるいは
断続的に行なうことを特徴とする悪性腫瘍治療のための
白血球刺激方法に係る。That is, the present invention provides a leukocyte stimulating material for treating malignant tumors, characterized in that a stimulant capable of inducing tumor-toxic cells upon contact with peripheral blood leukocytes is bound to an insoluble carrier by a covalent bond. Furthermore, a malignant tumor treatment comprising contacting peripheral blood leukocytes with an insoluble carrier on which a stimulant is covalently immobilized, and separating activated leukocytes from the mixture continuously or intermittently. Relating to a leukocyte stimulation method for.

本発明における白血球とは、血液細胞の内界血球および
血小板を除いたいわゆる白血球を指すが、この白血球よ
シ顆粒球あるいはＢ細胞を除去した細胞分画も、本発明
における白血球の概念に含まれる。本発明において活性
化を行なう白血球は、公知の連続遠心分離法にて末梢血
より採取した白血球分画を用いてもよく、また公知のフ
ィコールパーク重層遠心分離法にて分離した単核細胞分
画でもよく、するいは末梢血単核細胞より公知のノイラ
ミニダーゼ処理羊赤血球とのロゼツト形成で分離濃縮し
たＴ細胞分画を使用しても、強力な腫瘍障害性細胞の誘
導が可能である。In the present invention, white blood cells refer to so-called white blood cells excluding inner blood cells and platelets, but the concept of white blood cells in the present invention also includes cell fractions in which granulocytes or B cells are removed from these white blood cells. . The leukocytes to be activated in the present invention may be a leukocyte fraction collected from peripheral blood by a known continuous centrifugation method, or a mononuclear cell fraction separated by a known Ficoll-Paque multilayer centrifugation method. Alternatively, strong tumor-toxic cells can be induced by using a T cell fraction separated and concentrated from peripheral blood mononuclear cells by rosette formation with known neuraminidase-treated sheep red blood cells.

本発明において誘導活性化する腫瘍障害性細胞は、白血
球の中で顆粒球、半球、マクロファージを除くリンパ球
分画に属し、とシわけＴ細胞の性質を有している。The tumor-toxic cells to be induced and activated in the present invention belong to the lymphocyte fraction of white blood cells, excluding granulocytes, hemispheres, and macrophages, and have the characteristics of T cells.

本発明において用いる刺激剤としては、リンパ球を活性
化する作用を持った物質を使用するが、特に’ｌ’　＋
７ンバ球を活性化する物質が好ましい。Ｔリンパ球を活
性化する物質としてよく知られているものにレクチンが
あるが、本発明の目的を達成するためには、腫瘍障害性
細胞誘導能を有するレクチンを使用する。The stimulant used in the present invention is a substance that has the effect of activating lymphocytes, especially 'l' +
Substances that activate the 7-member bulb are preferred. Lectin is a well-known substance that activates T lymphocytes, and in order to achieve the object of the present invention, a lectin that has the ability to induce tumor-toxic cells is used.

すなわち、ファセオラス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌ
ｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ　）由来のアカインゲンマメレク
チン（ＰＨＡ）　、コンカナバリア・エンシフオルミス
（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉａ　ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ　
）由来のコンカナバリンＡ　（Ｃｏｎ　Ａ　）　、ライ
ステリア・アオリバンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ　ａｏｒｉ
ｂａｎｄａ　）由来（７）／ダクジマメレクチン（ＷＦ
Ａ）　、レンズ・キュリナリス（’Ｌｅｎｓｃｕｌｉｎ
ａｒｉｓ　）由来のレンズマメレクチン（ＬＣＨ）、フ
ィトラッカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａａｍ
ｅｒｉｃａｎａ　）由来のアメリカヤマゴボウレクチン
（ＰＷＭ）、クリシンｅ”ｖツクス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　
ｍａｘ　）由来のダイズレクチン（ＳＢＡ）、フオセオ
ラス・リメンシ、ｚ　（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｌｉｍｅ
ｎｓｉｓ　）由来のりママメレクチン（ＬＢＡ　）、ロ
ビナ・コンイドアカシア（Ｒｏｂｉｎａ　ｐｓｅｕｄｏ
ａｃａｃｉａ　）由来のニセアカシアレクチン（ＲＰＡ
　）　、ソホラ・ジャポニカ（８ｏｐｈｏｒａ　ｊａｐ
ｏｎｉｃａ　）由来のイヌエンジュマメレクチン（ＳＪ
Ａ　）、ビサム・サチバム（ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ
　）由来のエントウマメレクチン（ＰＳＡ　）、ビシア
・ファバ（Ｖｉｃｉａ　ｆａｂａ　）由来、のソラマメ
レクチン（ＶＦＡ　）等を使用する。中でも特にアカイ
ンゲンマメレクチン（ＰＨＡ）　、コンカナバリ：、ｙ
　Ａ　（Ｃｏｎ　Ａ　）、ノダクジマメレクチ／（ＷＦ
Ａ）、レンズマメレクチン（Ｌ　Ｃｕ　）　％アメリカ
ヤマゴボウレクチン（ＰＷＭ）は、強力に腫瘍障害性細
胞を誘導する。また、スタフィロコッカス・アウレウス
（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）由
来のプロティンＡも強力に腫瘍障害性細胞を誘導する。Namely, Phaseolus vulgaris (Phaseol
Red bean lectin (PHA) from Concanavalia ensiformis
Concanavalin A (Con A) derived from Wisteria aori
banda ) derived (7)/dark bean lectin (WF
A) , Lensculinalis
lentil lectin (LCH) from Phytolacca americana
ericana), pokeweed lectin (PWM) derived from Glycine e”vtux (Glycine
soybean lectin (SBA) derived from Phaseolus limensi, z (Phaseolus lime
Glue mamame lectin (LBA) from Robina pseudoacacia (Robina pseudocacia)
acacia) derived locust acacia lectin (RPA)
), Sophora japonica (8ophora jap
onica)-derived dog bean lectin (SJ
A), pisumsativum
), Vicia faba lectin (VFA), etc. are used. Among them, red bean lectin (PHA), Concanavali:,y
A (Con A), Nodakujimarekuchi/(WF
A) Lentil lectin (L Cu ) % Pokeweed lectin (PWM) potently induces tumor-toxic cells. Furthermore, protein A derived from Staphylococcus aureus also strongly induces tumor-toxic cells.

また、ヒト末梢血白血球をレクチンで刺激した培養上清
中に含まれるリンフ才力インも刺激剤として使用でき、
特にゲルクロマトグラフィー等公知の方法によって精製
したインターリューキン２　（ＩＬ２　）分画が強力な
刺激剤として使用できる。In addition, lymphin, which is contained in the culture supernatant obtained by stimulating human peripheral blood leukocytes with lectin, can also be used as a stimulant.
In particular, an interleukin 2 (IL2) fraction purified by known methods such as gel chromatography can be used as a powerful stimulant.

本発明で用いられる不溶性担体は、親水性担体、疎水性
担体いずれも使用できるが、疎水性担体を用いる場合に
は、特に担体への血清成分の非特異的吸着が生じるため
、親水性担体の方が好ましい結果を与える。不溶性担体
の形状は、粒子状、繊維状、中空糸状、膜状等いずれの
公知の形状も用いることができる。粒状もしくは球状不
溶性担体としては、粒径１ミクロン〜３０００ミクロン
のものが使用できる。粒径１ミクロン以下では活性化白
血球との分離が困難である。とくに粒径５０ミクロン以
上であれば、容易に活性化白血球とのｐ過分離が可能で
あり、粒径３０００ミクロン以」二では、白血球との担
体単位重量あたりの接触面積が低下するため好ましくな
り０さらに好１しくは、粒径８０〜２０００ミクロンの
ものが本発明において良好である。また、粒状もしくは
球状不溶性担体の比重が１．０７以上であれば、容易に
活性比白血球との遠心もしくは静置による分離が可能で
ある。また、平膜状あるいは中空糸状多孔性担体を使用
する場合、その孔径が、細胞は通過できないが培地成分
は自由に通過できる０、０５〜１０Ｓ′クロンのものを
使用すれば、膜内面に結合した白血球に膜外面より栄養
を補給でき、高濃度の白血球を刺激活性化することが可
能である。さらに好ましくは、０．１〜５ミクロンの孔
径の多孔性担体が良好に使用できる。The insoluble carrier used in the present invention can be either a hydrophilic carrier or a hydrophobic carrier, but when a hydrophobic carrier is used, non-specific adsorption of serum components to the carrier occurs. gives better results. The shape of the insoluble carrier may be any known shape such as particulate, fibrous, hollow fiber, or membrane. As the granular or spherical insoluble carrier, those having a particle size of 1 micron to 3000 micron can be used. If the particle size is 1 micron or less, it is difficult to separate it from activated leukocytes. Particularly, if the particle size is 50 microns or more, it is possible to easily separate the particles from activated leukocytes, and if the particle size is 3000 microns or more, the contact area per unit weight of the carrier with the leukocytes decreases, so it is preferable. 0 More preferably, particles having a particle size of 80 to 2000 microns are suitable in the present invention. Further, if the specific gravity of the granular or spherical insoluble carrier is 1.07 or more, it can be easily separated from active leukocytes by centrifugation or standing still. In addition, when using a flat membrane-like or hollow fiber-like porous carrier, use one with a pore size of 0.05 to 10 S'cron, which does not allow cells to pass through but allows medium components to freely pass through. Nutrients can be supplied to the leukocytes from the outer surface of the membrane, and it is possible to stimulate and activate a high concentration of leukocytes. More preferably, a porous carrier having a pore size of 0.1 to 5 microns can be used successfully.

不溶性担体の材質としては、アガロース系、デキストラ
ン系、セルロース系、ポリアクリルアミド系、ガラス系
、活性炭系、ボリアミド系、ポリエステル系、ポリウレ
タン系等の物質あるいは再生セルロース系、ナイロン、
アクリル、ポリエステル等公知の繊維性物質を一般に用
いることができる。Materials for the insoluble carrier include agarose-based, dextran-based, cellulose-based, polyacrylamide-based, glass-based, activated carbon-based, polyamide-based, polyester-based, polyurethane-based substances, regenerated cellulose-based, nylon, etc.
Generally known fibrous materials such as acrylic and polyester can be used.

刺激剤を不醪性担体の表面に同定する方法としては、共
有結合、イオン結合、物理吸着等あらゆる公知の方法を
用いることができるが、刺激剤の溶出性から考えると、
共有結合で固定して用いることが望ましい。そのために
は通常固定化酵素、アフイニテイクロマトグラフイで用
いられる公知の方法を用いることができる。例えば、臭
化水素（ＣＮＢｒ　）でアガロース、セファロース等を
活性化し、あるいはシリカガラスピーズをγ−アミノプ
ロピルトリエトキシシランと反応させてアルキルアミノ
ガラスを得、これをグルタルアルデヒドで活性化し、刺
激剤と結合させる等の方法を用いることができる。また
必要に応じて、不溶性担体と刺激剤の間に任意の長さの
分子（スペーサー）を導入して使用することもできる。All known methods such as covalent bonding, ionic bonding, and physical adsorption can be used to identify the stimulant on the surface of the insoluble carrier, but considering the dissolution properties of the stimulant,
It is preferable to use it by fixing it with a covalent bond. For this purpose, known methods commonly used in immobilized enzymes and affinity chromatography can be used. For example, by activating agarose, sepharose, etc. with hydrogen bromide (CNBr), or by reacting silica glass beads with γ-aminopropyltriethoxysilane to obtain alkylamino glass, which is activated with glutaraldehyde, it can be used as a stimulant. A method such as bonding can be used. Furthermore, if necessary, a molecule (spacer) of any length may be introduced between the insoluble carrier and the stimulant.

例えば、アガロースのヒドロキシル基とへキサメチレン
ジイソシアナートの片側のイソシアナート基を反応結合
させ、残ったインシアナート基吉刺激剤のアミノ基を反
応結合させるごと〈実施することができる。For example, it can be carried out by reaction bonding the hydroxyl group of agarose and the isocyanate group on one side of hexamethylene diisocyanate, and then reaction bonding the amino group of the remaining incyanate stimulant.

刺激剤結合不溶性担体による末梢血白血球の活性化は、
血清成分含有培地で行なうと強力な腫瘍障害性細胞の誘
導が可能である。すなわち、牛胎児血清、牛血清、馬血
清等の動物血清あるいはヒト血清を２〜２０％含有した
培地を調製する。好ましくはヒト血清を２〜２０％含有
した培地を調製する。この場合の培地は、動物細胞培養
に一般的に用いられる培地、例えば、ＲＰＭ１１６４０
培地、ＭＥＭ培地等が使用できる。才だ、血清成分例え
ば血清アルブミンを添加したＲＰＭ１１６４０培地でも
使用が可能である。Activation of peripheral blood leukocytes by a stimulant-bound insoluble carrier is
When carried out in a serum-containing medium, strong tumor-toxic cells can be induced. That is, a medium containing 2 to 20% of animal serum such as fetal bovine serum, bovine serum, horse serum, or human serum is prepared. Preferably, a medium containing 2 to 20% human serum is prepared. The medium in this case is a medium commonly used for animal cell culture, for example, RPM11640.
Medium, MEM medium, etc. can be used. However, RPM11640 medium supplemented with serum components such as serum albumin can also be used.

調製した培地中に、種々の方法で採取した末梢血白血球
を０．５〜３　Ｘ　１０６個／　ｍｌの細胞濃度で浮遊
させ、これに適当量の刺激剤結合不溶性担体を添加し、
温度２５〜４５Ｃで培養を行なう。温度２５Ｃ以下では
ほとんど有効な白血球の活性化が起こらず、温度４５Ｃ
以上では白血球の生存率が低下する。培養は市販の細胞
培養用のプラスチック製容器を使用し、ＣＯ２インキュ
ベーター中で行なえば簡便である。培養数時間で白血球
は刺激剤結合不溶性担体粒子表面に付着し活性化される
。Peripheral blood leukocytes collected by various methods are suspended in the prepared medium at a cell concentration of 0.5 to 3 x 106 cells/ml, and an appropriate amount of a stimulant-bound insoluble carrier is added thereto.
Culture is carried out at a temperature of 25-45C. At temperatures below 25C, there is almost no effective activation of white blood cells;
Above this, the survival rate of leukocytes decreases. Cultivation can be easily carried out in a CO2 incubator using a commercially available plastic container for cell culture. After several hours of culture, leukocytes adhere to the surface of the stimulant-bound insoluble carrier particles and are activated.

付着活性化された白血球と担体との分離は、刺激剤と白
血球の結合を阻害する物質を用いれば簡単に行なえる。Separation of the adhered and activated leukocytes from the carrier can be easily carried out by using a substance that inhibits the binding of the stimulant to the leukocytes.

例えばＣｏｎＡ、ＬＣＨを刺激剤として使用する場合に
はα−メチルマンノース、ＰＨＡ、ＬＢＡを、刺激剤と
して用いる場合にはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン
を分離剤として使用すれば、刺激剤結合不溶性担体より
活性化白血球を回収できる。For example, if ConA or LCH is used as a stimulant, α-methylmannose, PHA, or LBA is used as a stimulant, and N-acetyl-D-galactosamine is used as a separating agent. More activated leukocytes can be recovered.

このようにして回収した活性化白血球は、強力な腫瘍障
害細胞金含有することを見い出した。すなわち、活性比
白血球を各種ヒト腫瘍細胞に作用サセタトコろ、ＺＲ７
５−３０乳癌細胞、ＭＫＮ−１胃癌細胞、ＰＣ−９肺癌
細胞、Ｃ−１結腸癌細胞、ＮＢＴ−２膀胱癌細胞、ＮＲ
Ｃ−１２腎癌細胞等を強く障害した。捷た、ラジオアイ
ソトープで標識した刺激剤を不溶性担体に結合させ、こ
の刺激材を用いて活性化した末梢血白血球に放射活性は
検出されず、刺激剤を不溶性担体に共有結合で固定する
ことによシ、刺激剤が活性ｆヒ白血球とともに患者体内
に持ち込１れる可能性が完全に否定された。The activated leukocytes thus collected were found to contain potent tumor-damaging cell gold. That is, Saseta Tokoro, ZR7 has an effect on various human tumor cells by increasing the activity ratio of leukocytes.
5-30 breast cancer cells, MKN-1 gastric cancer cells, PC-9 lung cancer cells, C-1 colon cancer cells, NBT-2 bladder cancer cells, NR
It strongly damaged C-12 renal cancer cells. A stimulant labeled with a shredded radioisotope was bound to an insoluble carrier, and no radioactivity was detected in peripheral blood leukocytes activated using this stimulant. The possibility that the stimulant was introduced into the patient's body together with activated leukocytes was completely ruled out.

腫瘍障害性細胞誘導能を持つ刺激剤結合不溶性担体を実
際の臨床に用いる場合は、たとえば図面に示した稚瘍障
害性細胞誘導装置を用いる。この装置は容器１内に刺激
剤結合用体２を収容し、両端に白血球液流入口３および
流出口４を有し、それぞれフィルター５で区分されてい
る。このフィルター５は担体２が容器１外に流出するの
を防ぐものである。この容器１は洗浄装置６に連結され
ており、洗浄装置６は空気排出口９、洗浄液出口１０を
備えており、細胞が洗浄液排出口１０へ出るのを防止す
るためのフィルター８が設けられている。When a stimulant-bound insoluble carrier having the ability to induce tumor-toxic cells is used in actual clinical practice, the device for inducing tumor-toxic cells shown in the drawings is used, for example. This device houses a stimulant binding body 2 in a container 1, and has a leukocyte fluid inlet 3 and an outlet 4 at both ends, each of which is separated by a filter 5. This filter 5 prevents the carrier 2 from flowing out of the container 1. This container 1 is connected to a washing device 6, which is equipped with an air outlet 9 and a washing liquid outlet 10, and is provided with a filter 8 to prevent cells from exiting to the washing liquid outlet 10. There is.

この装置は、回分的に患者末梢血白血球より腫瘍障害性
細胞の誘導を行ない、操作性よく腫瘍障害性細胞の分離
、洗浄、回収を行なう装置である。This device induces tumor-toxic cells from patient's peripheral blood leukocytes in batches, and separates, washes, and collects the tumor-toxic cells with ease of operation.

すなわち、患者末梢血より連続遠心分離等の公知の方法
を用いて採取した白血球液を容器１の白血球液流入口３
より流入させ、白血球を刺激剤結合担体２に吸着させた
後、空気（５俤ＣＯ，）を飽和させた培養液を循環させ
、３７Ｃに保温し腫瘍障害性細胞の誘導活性化を行なう
。その後、洗浄装置６を連結し、空気排出口よジアスビ
レ−ターで吸引を行ないながら洗浄液（分離剤を含む）
を流入口３よシ流す。洗浄液は洗浄液排出口１０を通っ
て、その下に連結された容器にためられる。担体から洗
浄により分離した腫瘍障害性細胞は、フィルター８の上
部７に集められる。充分に洗浄を行なった後、容器１を
とりはずし、腫瘍障害性細胞を回収し、治療に用いる。That is, leukocyte fluid collected from a patient's peripheral blood using a known method such as continuous centrifugation is transferred to the leukocyte fluid inlet 3 of the container 1.
After the white blood cells are adsorbed onto the stimulant-bound carrier 2, a culture solution saturated with air (5 yen of CO) is circulated and kept at 37C to induce and activate tumor-toxic cells. After that, the cleaning device 6 is connected, and the cleaning liquid (including the separation agent) is removed while suction is being carried out through the air outlet and the diasbillator.
Flow through inlet 3. The cleaning liquid passes through the cleaning liquid outlet 10 and is collected in a container connected below. The tumor-toxic cells separated from the carrier by washing are collected in the upper part 7 of the filter 8. After thorough washing, the container 1 is removed, and the tumor-toxic cells are collected and used for treatment.

本発明の刺激材および刺激方法は、以上述べてきたよう
に、患者末梢血白血球を効率よく活性化し、安全にかつ
操作性よく、強力な腫瘍障害性細胞を誘導するものであ
り、胃癌、肺癌、乳癌、肝癌等の癌治療に用いようとす
るものでおる。As described above, the stimulation material and stimulation method of the present invention efficiently activate patient's peripheral blood leukocytes and induce strong tumor-toxic cells safely and with good operability. It is intended to be used in the treatment of cancers such as breast cancer and liver cancer.

以下実施例により、本発明の実施の報様をより詳細に説
明する。Hereinafter, the implementation of the present invention will be explained in more detail with reference to Examples.

実施例１ 刺激材の調製は次のようにして何なった。すなわち、Ｃ
ＮＢｒＮＢｒ活性化セファローフ６Ｍ区エーデン、ファ
ルマシア社製１粒径２５０〜６５０ミク目ン）に、刺激
剤として、通常の方法によって各種の１９７７球活性化
物質を結合せしめ、過剰の活性基金グリシンでブロッキ
ングした後、ｐＨ４−０，１Ｍ酢酸バッファー、ｐＨ８
，５炭酸ナトリウムバツフアーでくシ返し洗浄後、生理
食塩水で洗浄、水切りして実験に供した。不溶性担体の
刺激剤保持量は、Ｗめに添加した刺激剤量より、結合反
応後の上清刺激剤量および洗浄液中の刺激剤量をさし引
いて結合量をめ計算したところ、不溶性担体１−あたシ
１〜３ηであった。なお、刺激剤量は２８０　ｎｍの吸
光度で測定した。Example 1 The preparation of the stimulant was as follows. That is, C
Various 1977 bulb activating substances were bound as a stimulant to NBrNBr-activated Sepharof 6M Eden (Particle size: 250-650 micrometers, manufactured by Pharmacia) by a conventional method, and the mixture was blocked with an excess of the active fund glycine. After that, pH 4-0, 1M acetate buffer, pH 8
, 5 After rinsing with sodium carbonate buffer, the tubes were washed with physiological saline, drained, and used for experiments. The amount of stimulant retained by the insoluble carrier was calculated by subtracting the amount of stimulant in the supernatant after the binding reaction and the amount of stimulant in the washing solution from the amount of stimulant added twice. 1-Attack was 1-3η. Note that the amount of stimulant was measured by absorbance at 280 nm.

ヒト白血球は次のようにして得た。すなわち、採血した
ヒト末梢血をハンクス液で２倍希釈し、フィコールパー
ク液（ファルマシア社製）に重層し、２０００　ｒｐｍ
で２０分間遠心分離した後、中間層の白血球層を分離し
て、これをノ・ンクス液で洗った後、自己血清を１０チ
添加したＲＰＭ１１６４０培地にツスイ）に２Ｘ１０’
／−の細胞ａ［で浮遊させる。この細胞浮誘液を１−ず
つ、細胞培養用の２　ｍｅウェル（ファルコン扁５０４
７　）に分注し、これに各種刺激剤結合不溶性担体を２
０μｔずつ添加し、ＣＯ，インキュベーター中で部層５
７Ｃで培養を行なう。培養１時間程で白血球の担体表面
上への付着が観察される。２４時間培養を竹なつｌζ後
、培養液をビベリティックして活性比白血球を担体表面
からはがして静置すると、担体は容器の底に沈下するの
で、上清細周液をとり、これをノ・ンクスで洗った後、
自己血清１０係添加ＲＰＭＩ培地に５　Ｘ　１０’／−
の細胞濃度で浮遊させる。Human leukocytes were obtained as follows. That is, collected human peripheral blood was diluted 2 times with Hank's solution, layered on Ficoll-Paque solution (manufactured by Pharmacia), and heated at 2000 rpm.
After centrifugation for 20 minutes, separate the white blood cell layer in the middle layer, wash it with Nox's solution, and transfer it to RPM11640 medium supplemented with 10 cells of autologous serum (2×10').
/- cells a [suspended. Add this cell suspension solution 1-1 each to 2 me wells for cell culture (Falcon flat 504 wells).
7), and add various stimulant-bound insoluble carriers to this.
Add 0 μt each and incubate the sublayer 5 in a CO incubator.
Cultivate at 7C. Adhesion of leukocytes to the carrier surface is observed after about 1 hour of culturing. After culturing for 24 hours, the culture solution is viberticed to peel off active leukocytes from the surface of the carrier and allowed to stand. The carrier sinks to the bottom of the container, so take the supernatant liquid and pour it into the container. After washing with
5 x 10'/- in RPMI medium supplemented with 10 parts of autologous serum.
Suspend at a cell concentration of .

この活性ｆヒ白皿球がＩＩ！Ｊｉ瘍細胞障害性を有する
かどうかは、仄のようなキラー活性測定法を用いて評価
した。培養プレートに付着して増殖する種々のヒト癌細
胞株を標的細胞として、５Ｘ１０４／ｄの細胞濃度で１
０％牛脂児血清添加ＲＰＭ１１６４０培地に浮遊させ、
これを１ｏμｔずっ１ｏμを容テラサキプレートに分注
し、ＣＯ，インキュベーター中で温度３７Ｕで培養する
。２４時間培養を行なうと、癌細胞は培養プレート底面
に強く付着する。This active f-white plate ball is II! Whether or not the drug had tumor cytotoxicity was evaluated using a killer activity assay method such as that described above. Various human cancer cell lines that adhere to and proliferate on culture plates were used as target cells at a cell concentration of 5 x 104/d.
Float in RPM11640 medium supplemented with 0% tallow serum,
Dispense 10μ of this into a Terasaki plate and culture in a CO incubator at a temperature of 37U. When cultured for 24 hours, cancer cells strongly adhere to the bottom of the culture plate.

これを培養液で洗った後、活性ｆヒ白血球浮遊液１０μ
ｔを添加し、３７ｃで４時間、ｃｏ、インキュベーター
中で培養し、プレートに付着している癌細胞を障害させ
る。障害を受けた癌細胞は、プレート底面への付着性を
喪失し、ハンクス液で洗うと活性化白血球とともに除去
される。生残してプレート底面に付着している癌細胞を
アセトンで固定踵ギムザ液で染色した後、顕微鏡で利−
数する。After washing this with culture solution, 10μ of active f leukocyte suspension was added.
t and cultured in a 37C co incubator for 4 hours to damage cancer cells adhering to the plate. Damaged cancer cells lose their adhesion to the bottom of the plate and are removed along with activated leukocytes when washed with Hank's salt solution. Cancer cells that survived and adhered to the bottom of the plate were fixed with acetone, stained with heel-Giemsa solution, and then examined using a microscope.
Count.

キラー活性は次式により計算する。Killer activity is calculated using the following formula.

キラー活性＝ このようにして評価した各種刺激剤結合不溶性担体の腫
瘍障害性細胞誘導能を表１に示す。各種刺激剤結合セフ
ァロース６ＭＢでヒト末梢血白血球を２４時間刺激して
得た活性化白血球の腫瘍細胞障害活性を、標的細胞とし
て、ＺＲ７５−３０ヒト乳癌細胞、ＭＫＮ−１ヒト胃癌
細胞を使用するキラー活性測定法で評価を行なった。表
１に示したように、ＰＨＡ、　ＷＦＡ、　ＬＣＨ，ＰＷ
Ｍ、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａを結合１、ｉ−に７７０一ス
６ＭＢでヒト末梢血白血球を刺激すると、各種ヒト腫瘍
細胞株を強力に障害する腫瘍障害性細胞が誘導された。Killer activity = Table 1 shows the ability of the various stimulant-bound insoluble carriers to induce tumor-toxic cells evaluated in this manner. The tumor cytotoxic activity of activated leukocytes obtained by stimulating human peripheral blood leukocytes with various stimulant-conjugated Sepharose 6MB for 24 hours was investigated using ZR75-30 human breast cancer cells and MKN-1 human gastric cancer cells as target cells. Evaluation was performed using an activity measurement method. As shown in Table 1, PHA, WFA, LCH, PW
When human peripheral blood leukocytes were stimulated with 770 and 6MB to M, Protein A-conjugated 1,i-, tumor-toxic cells that strongly damaged various human tumor cell lines were induced.

Ｃｏｎ　Ａ結合セファロースは中程度に腫瘍障害性細胞
を誘導した。Con A-conjugated Sepharose moderately induced tumor-toxic cells.

比較例１ １０％自己血清添加ＲＰＭＩ　１６４０培地１ｔｄに末
梢血白血球２　Ｘ　１０’個を浮遊させ、刺激剤結合担
体を添加せず、無刺激で２４時間培養おるいは刺激剤を
結合しないセファロース６ＭＢを添加して２４時間培養
しても、腫瘍障害性細胞は誘導されなかった。Comparative Example 1 2 x 10' peripheral blood leukocytes were suspended in 1 td of RPMI 1640 medium supplemented with 10% autologous serum, and cultured for 24 hours without stimulation without adding a stimulant-bound carrier, or in Sepharose 6MB without a stimulant. Even when the cells were added and cultured for 24 hours, tumor-toxic cells were not induced.

比較例２ １０チ自己血清添加ＲＰＭ１１６４０培地１ｔｎｔに末
梢血白血球２　Ｘ　１０６個を浮遊させ、これに最適量
の担体非結合ＰＨＡ　（１０１１９／ｍＩりを添加して
２４時間培養を行ない、実施例１と同様にして、ＺＲ７
５−３０を標的細胞として腫瘍障害活性を測定したとこ
ろ、６０チの障害活性が観察された。表１に示したよう
に、ＰＨＡ結合担体を使用した場合、ＺＲ７５−３０を
標的細胞とすると７２％の障害活性が誘導された。すな
わち、刺激剤を不溶性担体に結合させると、腫瘍障害活
性誘導能は低下することなく、かえって増強された。Comparative Example 2 2 x 106 peripheral blood leukocytes were suspended in 1 tnt of RPM11640 medium supplemented with 10 ml of autologous serum, and an optimal amount of carrier-free PHA (10119/ml) was added thereto and cultured for 24 hours. Similarly, ZR7
When tumor-damaging activity was measured using 5-30 as target cells, 60-chi's damaging activity was observed. As shown in Table 1, when the PHA-conjugated carrier was used, 72% of the damaging activity was induced when ZR75-30 was used as the target cell. That is, when a stimulant was bound to an insoluble carrier, the ability to induce tumor-damaging activity was not reduced, but rather enhanced.

実施例２ １０％自己血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地１０ｒｎｔに
２　Ｘ　１０１′／　ｍｅの細胞ＩＩｋ度で末梢血白血
球を浮遊させ、これに刺１激材としてＣｏｎ　Ａ結合セ
ファロース６ＭＢ　（粒径２５０〜３５０ミクロン、刺
激剤保持量１．５　、ｍ９　／　ｍｅ　）　２００μｔ
を添加し、温度３７ＣでＣＯ，インキュベーター中で２
４時間培養を行なった後、α−メチルマンノースを０．
１Ｍの濃度で添加し、さらに３０分、ＣＯ，インキュベ
ーター中で培養した後、８０ミクロンメツシュのナイロ
ンネットで濾過して活性比白血球を刺激材と分離した。Example 2 Peripheral blood leukocytes were suspended in 10rnt of RPMI1640 medium supplemented with 10% autologous serum at a cell density of 2×101'/me, and 6MB of Con A-conjugated Sepharose (particle size 250-350 microns, Stimulant retention amount 1.5, m9/me) 200μt
and incubate in a CO incubator at a temperature of 37C.
After culturing for 4 hours, α-methylmannose was added to 0.
After adding the mixture at a concentration of 1M and culturing in a CO incubator for 30 minutes, the active leukocytes were separated from the stimulant by filtration through an 80 micron mesh nylon net.

このようにして得た活性化白血球５　Ｘ　１０’個を５
００個のＺＲ７５−３０標的細胞と混合培養したところ
、４時間で３５チのＺＲ７５−５３）乳癌細胞を障害し
た。5 x 10' activated leukocytes obtained in this way were
When mixed culture with 00 ZR75-30 target cells, 35 ZR75-53) breast cancer cells were damaged in 4 hours.

実施例３ 活性化白血球と静置沈降法により容易に分離可能な不溶
性担体を得るために、以下の実験を行なツタ。８径３０
０ミクロンのシリカガラスに、公知の方法を用いてＰＨ
Ａを結合させた。すなわち、シリカガラスピーズをγ−
アミノフ゛ロピルト１）エトキシシランと反応させてア
ルキルアミノガラスを得、これをグルタルアルデヒド°
で活性ｆヒしてＰＨＡを結合させた。このようにして調
製し；１ＰＨＡ結合ガラスピーズ（刺激剤保持量５０μ
？　／ｍｅ　）　ｋ、１０チ自己血清添加ＲＰＭ１１６
４０培月１１０−に２Ｘ　１０６／−の細胞濃度で末梢
血白血球を浮遊さ＋ｔた培養液に添加し、温度Ｓ３Ｃで
ＣＯ，インキュベーク−中で２４時間培養を行ない、白
ＩＩＩＩ球を活性化させた。活性化白血球を回収するた
めに、培養液を強くピペッティングし静置すると、すく
°にガラスピーズは沈降し、上清より活性（ヒ白［１１
［球を旧１収した。おるいは培養液をピペッティングし
た後、フィコールパーク液に重層し、１０００　ｒｐｍ
、１０分間遠心分離すれば、液界面より活性化白血球を
回収することができる。このようにして得た活性化白血
球５　Ｘ　１０４個を５００個（７）ＺＲ７５−３０標
的細胞と混合培養したところ、４時間で６８チのＺＲ７
５−３０乳癌細胞を障害した。Example 3 In order to obtain an insoluble carrier that can be easily separated from activated leukocytes by a static sedimentation method, the following experiment was conducted. 8 diameter 30
0 micron silica glass using a known method.
A was combined. In other words, silica glass beads are
Aminophyllopyrt 1) React with ethoxysilane to obtain alkylamino glass, which is converted into glutaraldehyde.
It was activated to bind PHA. Prepared in this way: 1 PHA-conjugated glass beads (stimulant holding amount 50μ
? /me) k, 10 chi autologous serum addition RPM116
Peripheral blood leukocytes were added to the suspended culture medium at a cell concentration of 2X 106/- for 40 days, and cultured for 24 hours in a CO, incubator at a temperature of S3C to activate white III cells. I let it happen. In order to collect activated leukocytes, the culture solution was pipetted vigorously and left to stand. The glass beads quickly sedimented and the active leukocytes (white blood cells [11
[I collected the old ball. After pipetting the culture solution, layer it on Ficoll-Paque solution and incubate at 1000 rpm.
Activated leukocytes can be recovered from the liquid interface by centrifugation for 10 minutes. When 5 x 104 activated leukocytes thus obtained were mixed cultured with 500 (7) ZR75-30 target cells, 68 ZR7 cells were detected in 4 hours.
5-30 breast cancer cells were injured.

実施例４ セルロースアセテート中空繊維（外ｉ１，１５１１１１
１　＊内径１．００ｍｍ、長さ５０ｍｍ、平均孔径０．
３ミクロン）を臭化水素で活性化した後、公知の方法を
用いてＰＨＡを結合させてＰＨＡ結合中空繊維を調製し
た（刺激剤保持量５００μｍ／１）。この中空繊維の一
方の端をとじ、内部にヒト末梢血白血球Ｉ　Ｘ　１０？
を注入して注入口をとじ、自己血清を１０チ添加し７’
ＣＲＰＭ１１６４１］培地５−中に入れ、温度３７Ｃで
ＣＯｔインキュベーター中で培養を行なった。２４時間
後に中空繊維の両方の端を切断して、ピペットで中空繊
維内部に培養液を強く流通させて活性化白血球を回収し
次。この活性化白血球５　Ｘ　１０４個を５００個０Ｚ
Ｒ７５−５０標的細胞と混合培養したところ、４時間で
７２俤のＺＲ７５−３０乳癌細胞を障害した。Example 4 Cellulose acetate hollow fiber (external i1, 151111
1 *Inner diameter 1.00mm, length 50mm, average pore diameter 0.
3 microns) with hydrogen bromide, and then bound PHA using a known method to prepare PHA-bound hollow fibers (stimulant retention amount 500 μm/1). One end of this hollow fiber is closed, and human peripheral blood leukocytes I x 10?
Close the injection port, add 10 g of autologous serum, and add 7'
CRPM11641] medium 5- and cultured in a COt incubator at a temperature of 37C. After 24 hours, both ends of the hollow fiber were cut, and the activated leukocytes were collected by strongly circulating the culture solution inside the hollow fiber with a pipette. 500 0Z of these activated white blood cells 5 x 104
When cocultured with R75-50 target cells, 72 ZR75-30 breast cancer cells were damaged in 4 hours.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

図面は本発明の悪性腫瘍治療用白血球刺激材および刺激
方法を用いる腫瘍障害性細胞誘導装置の１例を示す説明
図である。 １・・・・・・容器　２・・・・・・刺源・剤結合担体
（刺激材）３・・・・・・白血球液流入口　４・・・・
・・液流出口　５・・・・・・フィルター　６・・・・
・・洗浄装置　７・・・・・・活性比白血球貯留部　８
・・・・・・フィルター　９・・・・・・空気排出口１
０・・・・・・洗浄液排出口 ↑ イ 巨／９ ＼１０The drawing is an explanatory diagram showing an example of a tumor-toxic cell inducing device using the leukocyte stimulating material and stimulation method for malignant tumor treatment of the present invention. 1... Container 2... Stimulation source/drug binding carrier (stimulant) 3... White blood cell fluid inlet 4...
...Liquid outlet 5...Filter 6...
...Washing device 7...Activity ratio leukocyte storage section 8
... Filter 9 ... Air outlet 1
0...Cleaning liquid outlet ↑ Big/9 ＼10

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）不溶性担体に、末梢血白血球と接触することによ
り１ＩｉｌＩ瘍障害性細胞を誘導可能な刺激剤が、共有
結合で結合されていることを特徴とする悪性腫瘍治療用
白血球刺激材。(1) A leukocyte stimulating material for treating malignant tumors, characterized in that a stimulant capable of inducing 1IilI tumor-toxic cells upon contact with peripheral blood leukocytes is bound to an insoluble carrier by a covalent bond. （２）刺激材が共有結合で固定された不溶性担体と末梢
血白血球を接触させ、該混合物から活性化白血球を分離
することを連続的あるいは断続的に行なうことを特徴と
する悪性腫瘍治療のための白血球刺激方法。(2) For the treatment of malignant tumors, which involves bringing peripheral blood leukocytes into contact with an insoluble carrier to which a stimulating material is covalently immobilized, and separating activated leukocytes from the mixture, either continuously or intermittently. leukocyte stimulation method.