JP3620863B2 - Interleukin 1 production induction method - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、特定の材料と血液とを接触させることによりインターロイキン１の産生を効果的に誘導し得るインターロイキン１の産生誘導方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
周知のごとく、生体の悪性腫瘍に対する免疫監視機構を担う抗腫瘍性細胞としては、キラー細胞、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞及び、活性化マクロファージ等が重要な役割を果たしている。また、これらの細胞から分泌されるインターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ等のサイトカインは、生体の持つ抗腫瘍性に大きく関与している因子である。近年、外科手術、放射線療法、化学療法と併用して、生体の持つ免疫監視機構を賦活することを目的とした免疫療法が、悪性腫瘍の治療法として盛んに行われてきている。このような、免疫療法剤として、例えば、レンチナンやシゾフィランの様な薬剤があるが、癌患者は免疫抑制状態にあり、かかる状態の中で抗腫瘍免疫に関係する上記の細胞や因子を誘導することはなかなか困難である。
【０００３】
このような困難を克服するために、最近、抗腫瘍免疫に関係する上記の細胞や因子を体外で誘導したり、直接体外から投与しようという試みがある。例えば、癌患者からリンパ球と腫瘍細胞とを体外に取りだし、遺伝子組み替えヒト・インターロイキンを加えて培養し、腫瘍を特異的に攻撃するリンパ球（ＬＡＫ細胞）を誘導した後に、癌患者体内に戻して、抗腫瘍効果を発揮する養子免疫療法が行われている。（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，Ｌｏｔｚｅ，Ｍ．Ｔ．，Ｍｕｕｌ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ａ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ １５７ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｕｓｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｏｒ ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ａｌｏｎｅ． Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１６：８８９−８９７，１９８７）。
【０００４】
しかしながら、癌患者から大量のリンパ球を取り出し、無菌的に長期間、インターロイキンの存在下で培養した後に、癌患者に注入するという操作を行うため、非常に手間がかかること並びに、培養に長時間を要すること及び高価なインターロイキンが必要であることなどの多くの問題があった。
【０００５】
また、遺伝子組み替え技術により、抗腫瘍免疫に関係する上記の種々のサイトカインを大量に得ることができるようになり、これらのサイトカインの直接投与（高久史麿 編集、南江堂、サイトカイン療法、１９９２）が行われている。しかしながら、遺伝子組み替え技術により得られたサイトカインは、その蛋白質分子内に糖鎖を持たなかったり、翻訳後修飾を受けていないものであり、本来患者体内で作られるサイトカインと異なっている。そのため、患者に直接投与しても血液中での寿命が短く、本来の効果が発揮できなかったり、様々な副作用が伴うという欠点を有している。
【０００６】
近年、上記欠点を克服するために、癌患者が本来持っている抗腫瘍免疫機能を体外循環システム等を利用して、体外で産生を誘導しようという試みがある。例えば、グラム陰性菌細胞壁由来のリポ多糖（特開昭５９−２１１４５号公報）やレクチン（特開昭６３−３３３３９号公報）の様な生理活性物質を不溶性担体に固定化し、体外に取り出した血液および血液成分と接触させることによって抗腫瘍免疫機能を誘導することが開示されている。しかしながら、これらの生理活性物質は、体内にはいった場合に、強い毒性を示す物質であり、不溶性担体からの脱離の可能性が皆無である保証がない。また、特開平３−２３６７９０号公報、特開平３−２４０４８５号公報には、それぞれグルクロン酸やＮ−アセチルノイラミン酸のような酸性糖を不溶性材料に固定化し、サイトカインを誘導する血液処理剤が開示されている。これらは不溶性担体から脱離しても生体に対する毒性はないが、このようなリガンドであっても、不溶性担体に固定化するための反応を行わねばならず、煩雑な過程が必要である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上述した従来技術の諸欠点を解消し、抗腫瘍免疫機能を賦活するサイトカインであるインターロイキン１を、血液からより簡便に、かつより安全に産生誘導し得る方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
血液中の単球や好中球などの白血球は微生物のような異物と反応すると、種々の酵素、メディエーターを放出し、炎症反応を引き起こす。これらの反応は、材料と接触するときにも同様に引き起こされる。これは、材料が異物とみなされて起こるものであるが、この反応は材料の性質によって大きく変わってくる。一方、インターロイキン１は１９４０年代に白血球が産生する発熱物質として古くから知られている物質であるが、種々の生理活性を持ち、炎症反応においても産生される。そこで、本発明者らは、材料の性質を制御することによって、インターロイキン１の白血球からの産生を制御できるのではないかと考え、種々の材料と血液との接触によるインターロイキン１の産生誘導について、鋭意研究をおこなった。その結果、汎用の高分子材料である、ナイロン−６６、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン等の材料と血液との接触によって、インターロイキン１は、ほとんど産生誘導されなかったのに比較して、アガロースゲルまたはそれを修飾したアガロース誘導体ゲルと血液との接触によって、インターロイキン１が効率的に誘導されることを発見し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明によるインターロイキン１の産生誘導方法は、アガロースゲルまたはアガロース誘導体ゲルからなる材料と血液とを温度１５〜４２℃で接触させることを特徴とするものである。
【００１０】
本発明で使用されるアガロースは、紅藻類から抽出される天然多糖類である。アガロースはゲル化能を持ち、加熱したアガロース溶液を冷却すると、自然にゲル形成が起こる。それぞれの糖鎖は２本鎖となり、ついで凝集して束になり安定なゲルを形成する。このアガロースゲルのビーズは、血液と接触させると、著しく多くのインターロイキン１の産生を誘導した。
【００１１】
本発明で使用されるアガロース誘導体としては、アガロースに２，３−ジブロモプロパノールを強アルカリ条件下で作用させて架橋させ強度を高めた架橋型アガロースや、それにジエチルアミノエチル基等のイオン交換基をエーテル結合させたもの、４級アミン等で修飾したものなどが挙げられる。このアガロース誘導体からなるゲルのビーズは、血液と接触させると、著しく多くのインターロイキン１の産生を誘導した。
【００１２】
本発明において、アガロースゲルまたはアガロース誘導体ゲルからなる材料と血液とを接触させる方法については、血液と上記材料とが十分に接触され得る限り、任意の方法を用いることができる。例えば、繊維状の上記材料をカラムに充填し、該カラムに血液を循環させる方法や、粒径５０μｍ〜５ｍｍのビーズ状の上記材料をカラムに充填し、血液を循環させる方法を用いることができる。さらに、血液中に種々の形状の上記材料を浮遊させることにより、血液と上記材料を接触させてもよい。
【００１３】
上記材料と血液とを接触させる際の温度は、１５℃〜４２℃の範囲であり、好ましくは、３０℃〜４０℃の範囲である。接触温度が１５℃よりも低い場合、４２℃よりも高い場合には、インターロイキン１の産生誘導は低下する。
【００１４】
本発明では、上記材料と血液とを接触させることにより、上記材料と細胞との相互作用により、インターロイキン１の産生誘導が行われる。このインターロイキン１産生細胞とは、抹消血中の細胞に限らず、リンパ管、リンパ節または脾臓等から得られる細胞も含まれる。血液中には、インターロイキン１を産生するこれらの細胞が多く含まれている。血液中のこれらの細胞が、上記材料と作用し、インターロイキン１が産生誘導されるが、直接作用せずとも、上記材料と血液中の何らかの因子とが作用して誘導された別の因子を介して上記細胞により、インターロイキン１の産生が誘導されてもよい。
【００１５】
本発明では、アガロースゲルまたはアガロース誘導体ゲルからなる材料が、血液と接触されてインターロイキン１の産生誘導が行われるため、癌患者等の血液からインターロイキン１を産生誘導することができるため、本発明は癌などの治療に好適に用いることができる。また、本発明の方法によってインターロイキン１が産生誘導された血液を癌患者に戻すことにより、癌患者内因性のインターロイキン１を患者に与えることができるため、患者の体内において優れた抗腫瘍効果を発揮させることができる。
【００１６】
本発明を用いた癌治療法について以下に例示する。癌患者の血液を血液回路等を用いて連続的に体外に導き、繊維状またはビーズ状の上記インターロイキン１誘導材料を充填したカラム部にて、好ましくは体温付近の温度にて血液を上記材料と接触させ、血液内にインターロイキン１を産生誘導する。しかる後、この癌患者内因性のインターロイキン１を多量に含む血液および血液成分を癌患者体内に連続的に返血する。上記治療方法に用いられる装置としては、市販の体外循環システム等の上記操作過程を可能にする装置であれば任意のものを用いることができる。
【００１７】
また、本発明を用いた別の癌治療法としては、あらかじめ癌患者の血液を採血し、上記材料を内部に含有する血液バッグ内で上記材料と癌患者血液とを接触させ、インターロイキン１を産生誘導し、遠心分離等の手段を用いて血漿等を分離後、患者に投与する方法が挙げられる。また、上記方法によって得た癌患者内因性のインターロイキン１を多量に含む癌患者自身の血漿等を冷凍保存し、しかる後に、必要に応じて患者に投与することも可能である。
【００１８】
また、アガロースゲルまたはアガロース誘導体ゲルからなる材料を用いて簡便にインターロイキン１を誘導することができるため、その誘導活性を測定することにより、患者のインターロイキン１産生能力を調べることが可能である。即ち、患者の病態を反映する免疫学的パラメーターとして、このインターロイキン１産生能を利用することが可能である。
【００１９】
また、本発明によれば血液から内因性の天然型インターロイキン１を含有する血清または血漿を簡便に入手することが可能となり、これらの血清または血漿は、天然型インターロイキン１を得るための原材料として種々の用途に利用できる。
【００２０】
【作用】
本発明では、アガロースゲルまたはアガロース誘導体ゲルからなる材料が血液と接触されるため、血液中のインターロイキン１を産生する細胞と該材料との相互作用が促進されることにより、あるいは上記材料と何らかの因子とが相互作用し、それによって誘導された別の因子により、インターロイキン１の産生が効率よく誘導され得る。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明の実施例及び比較例を挙げることにより、本発明を詳細に説明する。
まず、下記の実施例１〜６及び比較例１〜６に記載する方法にて、アガロースゲルまたはアガロース誘導体ゲルからなる材料、および各種比較材料を作製し、次いで得られた材料を用いて、インターロイキン１の産生誘導実験を行った。
【００２２】
実施例１
アガロース（ナカライ化学社製、電気泳動用特製試薬 ＧＰ−３６）を５重量％濃度で蒸留水に溶解させ、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理を行った。この溶液を６０℃に保温しておき、冷蒸留水中にマイクロシリンジを用いて滴下して、アガロースゲルビーズ（粒径５ｍｍ）を作製した。
このビーズを注射用生理食塩水（大塚製薬社製）で洗浄後、同じく注射用生理食塩水で洗浄した２ｍｌ用ポリプロピレンチューブ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 社製）に充填した。充填量はアガロースビーズ２０個とした。
【００２３】
実施例２
約２重量％濃度のアガロースよりなる、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 社製）の懸濁液３ｍｌを１５ｍｌ用ポリプロピレンチューブ（岩城硝子社製）に入れた。これを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上澄みを吸引して捨てた。この洗浄操作を３回行い、一晩４℃にて放置した。
このゲル担体５００μｌ（かさ体積）を実施例１と同様に、注射用生理食塩水（大塚製薬社製）で洗浄後、同じく注射用生理食塩水で洗浄した２ｍｌ用ポリプロピレンチューブ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 社製）に充填した。
【００２４】
実施例３
実施例２において、約２重量％濃度のアガロースよりなる、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂの代わりに、約６重量％濃度の架橋型アガロースよりなる、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 社製）を用いたことの他は、実施例２と同様に操作した。
【００２５】
実施例４
実施例２において、約２重量％濃度のアガロースよりなる、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂの代わりに、約６重量％濃度の、架橋型アガロースにジエチルアミノエチル基をエーテル結合で導入したＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 社製）を用いたことの他は、実施例２と同様に操作した。
【００２６】
実施例５
実施例２において、約２重量％濃度のアガロースよりなる、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂの代わりに、約４重量％濃度の、架橋型アガロースにエーテル結合を介してフェニル基を導入したＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 社製）を用いたことの他は、実施例２と同様に操作した。
【００２７】
実施例６
実施例２において、約２重量％濃度のアガロースよりなる、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂの代わりに、約６重量％濃度の、架橋型アガロースに４級アミンをＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 社製）を用いたことの他は、実施例２と同様に操作した。
【００２８】
比較例１
注射用生理食塩水（大塚製薬社製）で洗浄した２ｍｌ用ポリプロピレンチューブ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 社製）。
比較例２
ナイロン６６のビーズ（粒径２．５ｍｍ）を射出成形により作製した。これらをメタノールで洗浄後乾燥した。
このビーズを注射用生理食塩水（大塚製薬社製）で洗浄後、同じく注射用生理食塩水で洗浄した２ｍｌ用ポリプロピレンチューブ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 社製）に充填した。充填量はビーズ７０個とした。
【００２９】
比較例３
比較例２におけるナイロン６６のかわりに、ポリスチレンを使用したことの他は、比較例２と同様に操作した。
比較例４
比較例２におけるナイロン６６のかわりに、ポリメチルメタクリレートを使用したことの他は、比較例２と同様に操作した。
比較例５
比較例２におけるナイロン６６のかわりに、ポリエチレンテレフタレートを使用したことの他は、比較例２と同様に操作した。
比較例６
比較例２におけるナイロン６６のかわりに、ポリテトラフルオロエチレンプロピレン共重合体を使用したことの他は、比較例２と同様に操作した。
【００３０】
インターロイキン１の産生誘導試験
実施例１〜６及び比較例１〜６で得られた材料を用いて、インターロイキン１の産生誘導実験を行った。
インターロイキン１の産生誘導実験とその測定方法は以下のように行った。
（１）ビーズによるインターロイキン１産生誘導実験
各ゲルビーズを充填したポリプロピレンチューブにヘパリン採血した健常人新鮮血１．６ｍ１を加えて回転円盤に取り付けて、３７℃にて２時間、回転数２６ｒｐｍで転倒混和した。しかる後、血液を回収し、以下の方法で血漿中のインターロイキン１の濃度を測定した。
【００３１】
（２）血漿中インターロイキン１濃度測定方法
インターロイキン１産生誘導試験後の血液を遠心分離して血漿を採取し、血漿中のインターロイキン１−βの濃度をインターロイキン１−βモノクローナル抗体を用いて、免疫酵素抗体法（Ｍａｄｇｅｎｉｘ社製、商品名；ＩＬ１−β−ＥＡＳＩＡ^Ｒ ）にて測定した。この測定方法の検出限界濃度は１０ｐｇ／ｍｌであった。
【００３２】
また、採血直後の血液を遠心分離して血漿を採取して、血漿中のインターロイキン１−βの濃度を同様にして測定した。採血直後の血液の血漿中インターロイキン１−β濃度は何れも検出限界以下であった。
インターロイキン１の産生誘導実験の結果を表１に示す。
なお、表１および後述の表２において、ＩＬ１−βは、インターロイキン１−βを示す。
【００３３】
【表１】

【００３４】
実施例７
実施例２と同様に調製したＳｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂゲル担体を充填したポリプロピレンチューブにヘパリン採血した健常人新鮮血１．６ｍ１を加えて回転円盤に取り付けて、１５℃にて２時間、回転数２６ｒｐｍで転倒混和した。
実施例８
実施例２と同様に調製したＳｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂゲル担体を充填したポリプロピレンチューブにヘパリン採血した健常人新鮮血１．６ｍ１を加えて回転円盤に取り付けて、３０℃にて２時間、回転数２６ｒｐｍで転倒混和した。
実施例９
実施例２と同様に調製したＳｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂゲル担体を充填したポリプロピレンチューブにヘパリン採血した健常人新鮮血１．６ｍ１を加えて回転円盤に取り付けて、４０℃にて２時間、回転数２６ｒｐｍで転倒混和した。
実施例１０
実施例２と同様に調製したＳｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂゲル担体を充填したポリプロピレンチューブにヘパリン採血した健常人新鮮血１．６ｍ１を加えて回転円盤に取り付けて、４２℃にて２時間、回転数２６ｒｐｍで転倒混和した。
【００３５】
比較例７
実施例２と同様に調製したＳｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂゲル担体を充填したポリプロピレンチューブにヘパリン採血した健常人新鮮血１．６ｍ１を加えて回転円盤に取り付けて、１０℃にて２時間、回転数２６ｒｐｍで転倒混和した。
比較例８
実施例２と同様に調製したＳｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂゲル担体を充填したポリプロピレンチューブにヘパリン採血した健常人新鮮血１．６ｍ１を加えて回転円盤に取り付けて、４５℃にて２時間、回転数２６ｒｐｍで転倒混和した。
【００３６】
インターロイキン１の産生量の測定
実施例７〜１０及び比較例７、８のインターロイキン１の産生誘導実験で得られた血液を回収し、前述の方法と同様にして血漿中のインターロイキン１の濃度を測定した。
結果を表２に示す。
【００３７】
【表２】

【００３８】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、アガロースゲルまたはアガロース誘導体ゲルからなる材料と血液とが接触されるため、インターロイキン１の産生が効果的に誘導される。従って、癌患者の血液を用いることにより、癌患者由来の内因性インターロイキン１を患者に与えることが出来、新規な癌治療方法を提供することが可能となる。
【００３９】
また、アガロースゲルまたはアガロース誘導体ゲルからなる材料を用いて簡便にインターロイキン１を誘導することができるため、その誘導活性を測定することにより、患者のインターロイキン１産生能力を調べることが可能であるから、患者の病態を反映する免疫学的パラメーターとして、このインターロイキン１産生能を利用することが可能である。
【００４０】
また、本発明によれば血液から内因性の天然型インターロイキン１を含有する血清または血漿を簡便に入手することが可能となり、これらの血清または血漿は、天然型インターロイキン１を得るための原材料として種々の用途に利用できる。
【００４１】
また、本発明では、従来の生理活性物質固定化材料のように、固定化された生理活性物質等の脱離が発生しないため、安全性の点においても優れており、かつ特定の固定化リガンドも必要ないため効率的である。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a method for inducing production of interleukin 1 that can effectively induce production of interleukin 1 by bringing a specific material into contact with blood.
[0002]
[Prior art]
As is well known, killer cells, NK cells, LAK cells, activated macrophages and the like play an important role as anti-tumor cells responsible for the immune surveillance mechanism for malignant tumors in the living body. In addition, cytokines such as interleukin, interferon, and TNF secreted from these cells are factors that are greatly involved in the antitumor properties of living organisms. In recent years, immunotherapy aimed at activating the immune surveillance mechanism of living bodies in combination with surgery, radiation therapy, and chemotherapy has been actively performed as a treatment method for malignant tumors. Examples of such immunotherapeutic agents include drugs such as lentinan and schizophyllan, but cancer patients are in an immunosuppressed state, and induce the above cells and factors related to antitumor immunity in such a state. It is very difficult.
[0003]
In order to overcome such difficulties, there have recently been attempts to induce the above cells and factors related to anti-tumor immunity outside the body or to administer them directly from outside the body. For example, after removing lymphocytes and tumor cells from a cancer patient, cultivating them by adding genetically modified human interleukins, inducing lymphocytes (LAK cells) that specifically attack the tumor, In return, adoptive immunotherapy that exerts an antitumor effect is performed. (Rosenberg, S.A., Lotze, MT, Mul, L.M. et al .: A Progress report on the treatment of 157 valents with advanced ceasing using liquefied hindered liquefied hindered liquefied hindered liquefied hindered liquefied hindered liquefied hindered liquefied hindered liquefied hindered liquefied hindered liquefied hindered liquefied interleukin 2 alone N. Engl. J. Med. 316: 889-897, 1987).
[0004]
However, since a large amount of lymphocytes are removed from a cancer patient, cultured in the presence of interleukin aseptically for a long period of time, and then injected into the cancer patient, it is very time-consuming and cultivated. There were many problems, such as taking time and requiring expensive interleukins.
[0005]
In addition, gene recombination technology makes it possible to obtain a large amount of the above-mentioned various cytokines related to anti-tumor immunity, and direct administration of these cytokines (Edited by Fumiaki Takahisa, Nankodo, Cytokine Therapy, 1992) It is broken. However, cytokines obtained by gene recombination techniques do not have sugar chains in their protein molecules or have not undergone post-translational modification, and are different from cytokines originally produced in patients. For this reason, even if it is directly administered to a patient, the life span in blood is short, the original effect cannot be exhibited, and various side effects are involved.
[0006]
In recent years, in order to overcome the above drawbacks, there has been an attempt to induce production outside the body using an extracorporeal circulation system or the like using an antitumor immune function originally possessed by cancer patients. For example, a biologically active substance such as a lipopolysaccharide derived from the cell wall of Gram-negative bacteria (Japanese Patent Laid-Open No. 59-21145) or a lectin (Japanese Patent Laid-Open No. 63-33339) is immobilized on an insoluble carrier and removed from the body. And inducing anti-tumor immune function by contacting with blood components. However, these physiologically active substances are substances that exhibit strong toxicity when entering the body, and there is no guarantee that there is no possibility of detachment from the insoluble carrier. JP-A-3-236790 and JP-A-3-240485 disclose blood treatment agents that induce cytokines by immobilizing acidic sugars such as glucuronic acid and N-acetylneuraminic acid on insoluble materials, respectively. It is disclosed. These are not toxic to the living body even if they are detached from the insoluble carrier, but even such a ligand must be subjected to a reaction for immobilization on the insoluble carrier, which requires a complicated process.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The object of the present invention is to eliminate the above-mentioned disadvantages of the prior art and provide a method that can induce production of interleukin 1, which is a cytokine that activates antitumor immune function, more easily and safely from blood. There is.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
When blood leukocytes such as monocytes and neutrophils react with foreign substances such as microorganisms, they release various enzymes and mediators, causing an inflammatory reaction. These reactions are similarly triggered when in contact with the material. This occurs when the material is regarded as a foreign material, but this reaction varies greatly depending on the nature of the material. On the other hand, interleukin 1 is a substance that has long been known as a pyrogen produced by leukocytes in the 1940s, but has various physiological activities and is also produced in inflammatory reactions. Therefore, the present inventors thought that the production of interleukin 1 from leukocytes could be controlled by controlling the properties of the material, and the induction of production of interleukin 1 by contact of various materials with blood. , I did my best research. As a result, interleukin 1 was hardly produced or induced by contact with blood such as nylon-66, polyethylene terephthalate, or polystyrene, which is a general-purpose polymer material. It was discovered that interleukin 1 is efficiently induced by contact of an agarose derivative gel modified with a blood and blood, and the present invention has been completed.
[0009]
That is, the method for inducing production of interleukin 1 according to the present invention is characterized in that a material comprising an agarose gel or an agarose derivative gel is brought into contact with blood at a temperature of 15 to 42 ° C.
[0010]
The agarose used in the present invention is a natural polysaccharide extracted from red algae. Agarose has a gelling ability, and when a heated agarose solution is cooled, gel formation occurs spontaneously. Each sugar chain becomes a double chain and then aggregates into a bundle to form a stable gel. The agarose gel beads induced significant production of interleukin 1 when contacted with blood.
[0011]
Examples of the agarose derivative used in the present invention include cross-linked agarose obtained by cross-linking agarose with 2,3-dibromopropanol under strong alkaline conditions to increase the strength, and an ion exchange group such as a diethylaminoethyl group as an ether. Examples thereof include those bonded, and those modified with quaternary amines. The gel beads comprising this agarose derivative induced a significant amount of interleukin 1 production when contacted with blood.
[0012]
In the present invention, any method can be used as a method of bringing a material comprising an agarose gel or an agarose derivative gel into contact with blood as long as the blood and the material can be sufficiently brought into contact with each other. For example, a method of filling the column with the fibrous material and circulating blood through the column, or a method of filling the column with the bead-shaped material having a particle size of 50 μm to 5 mm and circulating the blood can be used. . Furthermore, the blood and the material may be brought into contact with each other by suspending the material in various shapes in the blood.
[0013]
The temperature at the time of bringing the material into contact with blood is in the range of 15 ° C to 42 ° C, preferably in the range of 30 ° C to 40 ° C. When the contact temperature is lower than 15 ° C. or higher than 42 ° C., the production induction of interleukin 1 decreases.
[0014]
In the present invention, the production of interleukin 1 is induced by the interaction between the material and cells by bringing the material into contact with blood. This interleukin 1-producing cell is not limited to cells in peripheral blood, but also includes cells obtained from lymphatic vessels, lymph nodes, spleen, and the like. The blood contains many of these cells that produce interleukin-1. These cells in the blood act on the above-mentioned material to induce the production of interleukin 1, but even if it does not act directly, the above-mentioned material and some factor in the blood act on another factor induced. The production of interleukin 1 may be induced by the cells.
[0015]
In the present invention, since a material comprising an agarose gel or an agarose derivative gel is brought into contact with blood to induce production of interleukin 1, production of interleukin 1 can be induced from blood of cancer patients or the like. The invention can be suitably used for the treatment of cancer and the like. Moreover, since the interleukin 1 production-induced blood by the method of the present invention is returned to the cancer patient, the cancer patient's endogenous interleukin 1 can be given to the patient. Can be demonstrated.
[0016]
The cancer treatment method using the present invention is exemplified below. The blood of a cancer patient is continuously led out of the body using a blood circuit or the like, and the blood is supplied at a temperature close to body temperature, preferably at a temperature near the body temperature, in a column portion filled with the interleukin 1-derived material in the form of fibers or beads. To induce production of interleukin 1 in the blood. Thereafter, blood and blood components containing a large amount of the interleukin 1 endogenous to the cancer patient are continuously returned to the body of the cancer patient. Any device can be used as the device used in the treatment method as long as the device enables the above-described operation process, such as a commercially available extracorporeal circulation system.
[0017]
As another cancer treatment method using the present invention, blood of a cancer patient is collected in advance, the material and the blood of the cancer patient are contacted in a blood bag containing the material inside, and interleukin 1 is obtained. There is a method in which production is induced, plasma or the like is separated using means such as centrifugation, and then administered to a patient. It is also possible to cryopreserve the cancer patient's own plasma or the like containing a large amount of endogenous interleukin 1 obtained by the above method, and then administer it to the patient as necessary.
[0018]
In addition, since interleukin 1 can be easily induced using a material comprising an agarose gel or an agarose derivative gel, it is possible to examine the ability of the patient to produce interleukin 1 by measuring the induction activity. . That is, it is possible to utilize this interleukin 1 production ability as an immunological parameter that reflects the pathology of the patient.
[0019]
In addition, according to the present invention, serum or plasma containing endogenous natural interleukin 1 can be easily obtained from blood, and these serum or plasma is a raw material for obtaining natural interleukin 1. Can be used for various purposes.
[0020]
[Action]
In the present invention, since a material comprising an agarose gel or an agarose derivative gel is brought into contact with blood, the interaction between the cells producing interleukin 1 in the blood and the material is promoted, or the material is Interleukin 1 production can be efficiently induced by other factors induced by the interaction with the factor.
[0021]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail by giving examples and comparative examples of the present invention.
First, by using the methods described in Examples 1 to 6 and Comparative Examples 1 to 6 below, materials made of agarose gel or agarose derivative gel and various comparative materials were prepared, and then using the obtained materials, A production induction experiment of leukin 1 was conducted.
[0022]
Example 1
Agarose (manufactured by Nacalai Chemical Co., Ltd., special reagent for electrophoresis GP-36) was dissolved in distilled water at a concentration of 5% by weight, and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. This solution was kept at 60 ° C. and dropped into cold distilled water using a microsyringe to prepare agarose gel beads (particle size: 5 mm).
The beads were washed with physiological saline for injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) and then filled into a 2 ml polypropylene tube (manufactured by Eppendorf) which was also washed with physiological saline for injection. The filling amount was 20 agarose beads.
[0023]
Example 2
3 ml of a suspension of Sepharose 2B (Pharmacia LKB Biotechnology) made of agarose at a concentration of about 2% by weight was placed in a 15 ml polypropylene tube (Iwaki Glass Co., Ltd.). This was centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was aspirated and discarded. This washing operation was performed three times and left at 4 ° C. overnight.
In the same manner as in Example 1, 500 μl (bulk volume) of this gel carrier was washed with a physiological saline for injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.), and then washed into a 2 ml polypropylene tube (manufactured by Eppendorf) which was also washed with physiological saline for injection. Filled.
[0024]
Example 3
In Example 2, Sepharose CL-6B (manufactured by Pharmacia LKB Biotechnology) consisting of about 6 wt% cross-linked agarose was used instead of Sepharose 2B consisting of about 2 wt% agarose. Were operated as in Example 2.
[0025]
Example 4
In Example 2, DEAE Sepharose CL-6B (Pharmacia LKB Biotechnology in which diethylaminoethyl group was introduced into a bridged agarose with an ether bond at about 6% by weight instead of Sepharose 2B consisting of about 2% by weight of agarose. The same operation as in Example 2 was performed except that the product was used.
[0026]
Example 5
In Example 2, Phenyl Sepharose CL-4B (Pharmacia LKB) in which a phenyl group was introduced into a crosslinked agarose having a concentration of about 4% by weight via an ether bond instead of Sepharose 2B consisting of agarose having a concentration of about 2% by weight. The same operation as in Example 2 was carried out except that Biotechnology) was used.
[0027]
Example 6
In Example 2, Q Sepharose FF (Pharmacia LKB Biotechnology) was used instead of Sepharose 2B consisting of about 2% by weight agarose instead of Sepharose 2B at about 6% by weight cross-linked agarose with a quaternary amine. The other operations were the same as in Example 2.
[0028]
Comparative Example 1
2 ml polypropylene tube (Eppendorf) washed with physiological saline for injection (Otsuka Pharmaceutical).
Comparative Example 2
Nylon 66 beads (particle size 2.5 mm) were produced by injection molding. These were washed with methanol and dried.
The beads were washed with physiological saline for injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) and then filled into a 2 ml polypropylene tube (manufactured by Eppendorf) which was also washed with physiological saline for injection. The filling amount was 70 beads.
[0029]
Comparative Example 3
The same operation as in Comparative Example 2 was performed except that polystyrene was used instead of nylon 66 in Comparative Example 2.
Comparative Example 4
The same operation as in Comparative Example 2 was performed except that polymethyl methacrylate was used instead of nylon 66 in Comparative Example 2.
Comparative Example 5
The same operation as in Comparative Example 2 was performed except that polyethylene terephthalate was used instead of nylon 66 in Comparative Example 2.
Comparative Example 6
The same operation as in Comparative Example 2 was performed except that a polytetrafluoroethylenepropylene copolymer was used instead of nylon 66 in Comparative Example 2.
[0030]
Interleukin 1 production induction test An interleukin 1 production induction experiment was conducted using the materials obtained in Examples 1 to 6 and Comparative Examples 1 to 6.
The production induction experiment of interleukin 1 and the measuring method were performed as follows.
(1) Interleukin 1 production induction experiment using beads 1.6 ml of healthy human blood collected from heparin was added to a polypropylene tube filled with each gel bead and attached to a rotating disk, and tumbled at 37 ° C for 2 hours at 26 rpm. Mixed. Thereafter, blood was collected, and the concentration of interleukin 1 in plasma was measured by the following method.
[0031]
(2) Method for measuring plasma interleukin 1 concentration The blood after interleukin 1 production induction test is centrifuged to collect plasma, and the concentration of interleukin 1-β in the plasma is determined using an interleukin 1-β monoclonal antibody. Te, immune enzyme antibody method (Madgenix Co., Ltd., trade name; IL1-β-EASIA ^R) was measured by. The detection limit concentration of this measurement method was 10 pg / ml.
[0032]
Further, the blood immediately after blood collection was centrifuged to collect plasma, and the concentration of interleukin 1-β in the plasma was measured in the same manner. The plasma interleukin 1-β concentration in blood immediately after blood collection was below the detection limit.
Table 1 shows the results of the interleukin 1 production induction experiment.
In Table 1 and Table 2 described later, IL1-β represents interleukin 1-β.
[0033]
[Table 1]

[0034]
Example 7
1.6 ml of fresh healthy blood collected from heparin was added to a polypropylene tube filled with Sepharose 2B gel carrier prepared in the same manner as in Example 2 and attached to a rotating disk, and mixed by inverting at 26 rpm for 2 hours at 15 ° C. did.
Example 8
1.6 ml of fresh healthy blood collected from heparin was added to a polypropylene tube filled with Sepharose 2B gel carrier prepared in the same manner as in Example 2 and attached to a rotating disk, and mixed by inverting at 26 rpm for 2 hours at 30 ° C. did.
Example 9
1.6 ml of fresh healthy blood collected from heparin was added to a polypropylene tube filled with Sepharose 2B gel carrier prepared in the same manner as in Example 2 and attached to a rotating disk, and mixed by inverting at 26 rpm for 2 hours at 40 ° C. did.
Example 10
1.6 ml of fresh healthy blood collected from heparin was added to a polypropylene tube filled with Sepharose 2B gel carrier prepared in the same manner as in Example 2 and attached to a rotating disk, and mixed by inverting at 26 rpm for 2 hours at 42 ° C. did.
[0035]
Comparative Example 7
1.6 ml of healthy human blood collected from heparin was added to a polypropylene tube filled with Sepharose 2B gel carrier prepared in the same manner as in Example 2 and attached to a rotating disk, and mixed by inverting at 26 rpm for 2 hours at 10 ° C. did.
Comparative Example 8
1.6 ml of fresh healthy blood collected from heparin was added to a polypropylene tube filled with Sepharose 2B gel carrier prepared in the same manner as in Example 2 and attached to a rotating disk, and mixed by inverting at 26 rpm for 2 hours at 45 ° C. did.
[0036]
Measurement of interleukin 1 production amount The blood obtained in the interleukin 1 production induction experiments of Examples 7 to 10 and Comparative Examples 7 and 8 was collected, and the plasma was analyzed in the same manner as described above. The concentration of interleukin 1 was measured.
The results are shown in Table 2.
[0037]
[Table 2]

[0038]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, the production of interleukin 1 is effectively induced because the material made of agarose gel or agarose derivative gel is brought into contact with blood. Therefore, by using the blood of a cancer patient, endogenous interleukin 1 derived from the cancer patient can be given to the patient, and a novel cancer treatment method can be provided.
[0039]
In addition, since interleukin 1 can be easily induced using a material comprising an agarose gel or an agarose derivative gel, it is possible to examine the ability of the patient to produce interleukin 1 by measuring the induction activity. Therefore, it is possible to utilize this interleukin 1 production ability as an immunological parameter that reflects the pathology of the patient.
[0040]
In addition, according to the present invention, serum or plasma containing endogenous natural interleukin 1 can be easily obtained from blood, and these serum or plasma is a raw material for obtaining natural interleukin 1. Can be used for various purposes.
[0041]
Further, in the present invention, unlike the conventional physiologically active substance-immobilized material, since the detachment of the immobilized physiologically active substance does not occur, it is excellent in terms of safety and has a specific immobilized ligand. Is also efficient.

Claims (1)

アガロースゲルまたはアガロース誘導体ゲルからなる材料と血液とを温度１５〜４２℃で接触させることにより、インターロイキン１の産生を誘導することを特徴とするインターロイキン１の産生誘導方法。A method for inducing production of interleukin 1, which comprises inducing production of interleukin 1 by bringing a material comprising an agarose gel or an agarose derivative gel into contact with blood at a temperature of 15 to 42 ° C.