JPS6010714B2 - 発酵法によるコリン・オキシダ−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は発酵法によるコリン・オキシダーゼの製造法に
関する。

さらに詳しくは、本発明は、新菌種コリネバクテリウム
・コリノキシダンス（Ｃｏひｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃ
ｈｏｌｉｎｏｘｙｄａ船）または新菌種コリネバクテリ
ウム・コリニフイラム（Ｃｏひｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｃｈｏｌｉｎｉｐｈｉｌｕｍ）に属する微生物を栄養培
地で培養することを特徴とするコリン・オキシダーゼの
製造法に関する。

コリン・オキシダーゼはコリンの定量に使用される。

従来、微生物起源によるコリン・オキシダーゼに関して
はアースロバクター属細菌によるものが報告されている
〔臨床病理２４（桶冊）４６１（１９７６）（臨床病理
学会講演要旨集）；脂質生化学研究会講演予稿集（１９
７７年６月１６日、１７日於京都）〕。

本出願人は、先にブレビバクテリウム属またはコリネバ
クテリゥム属に属するコリン・オキシダーゼ生産菌を用
いるコリン・オキシダーゼの製造法を出願した（侍願昭
５１−１３９１２０（特公昭弘−４３０７５号）、５１
一１５５６５５（特公昭５７一３０４６ｙ号））。

本発明者等は、さらに良好なコリン・オキシダーゼ生産
菌を得る目的で、新たに士壌よりコリン資化能のすぐれ
た微生物を分離して、これらの菌株を栄養培地に接種し
、培養を行なったところ、以下に示すコリネバクテリウ
ム属の新種に属する２菌株が優れたコリン・オキシダー
ゼ生産能を有することを見し、出し本発明を完成した。
次に本発明に使用されるコリネバクテリウム・コリノキ
シダンスＫＹ４７０７およびコリネバクテリウム・コリ
ニフイラムＫＹ４７０６と呼称する菌株の菌学的性質を
詳細に説明する。

これらの菌株の同定実験は、主としてマニュアル・オブ
・ミクロビオロジカルメソツズ（米国細菌学会線、１９
５７）および「微生物の分類と同定」（長谷川武治紙
東大出版会、１９７５）に準拠して行なつた。

コリネバクテリウム・コリノキシダンス ＫＹ４７０７（徴工研菌寄第４１１１号）（ＮＲＲＬ
Ｂ−１１、１斑）１ 細胞形態 肉汁寒天、３０℃培養：通常０．６〜０．８×１．５〜
２．０仏の短樟菌。

単独またはＶ字状の２対をなし、分岐した細胞も観察さ
れ、「 また古い培養では球状になる。即ち多形性であ
る。運動性あり。べん毛は非極べん毛１本。グラム陽性
。無胞子。非抗酸性。ロ 培養的性質 １ 肉汁寒天平板培養、３０ｏｏ 円形。

大きさは２〜３日で４〜５側。表面は平滑。

凸円状。周縁全縁。にふくい光沢あり。不透明。内容は
均質なバター質。初め白色で２〜３日後から黄色になる
。２ 肉汁寒天斜面培養「３０ｏｏ 生育良好。

糸状。３ 肉汁液体培養、３０ｑｏ 生育良好。

毛霧状の次薄。皮膜形成せず。４ 肉汁穿刺培養、３ぴ
○ 表面に良く生育。

内部生育は僅かで糸状。５ 肉汁ゼラチン穿刺培養、２
０ｑｏ 表面および穿刺線に沿って生育。

ゼラチンを液化する。

６リトマスミルク ミルクをアルカリ化し２週間で完全に透明になる。

ｍ 生理学的性質 １ 硝酸塩還元性：陽性 ２ 脱窒反応：陰性 ３ Ｍ旧テスト：陰性 ４ ＶＰテスト：陰性 ５ インドールの生成：陰性 ６ 硫化水素の生成：腸性 ７ でん粉の加水分解：陰性 ８ クエン酸の利用：コーサー培地およびクリステンセ
ン塔地において陽・性９ 無機窒素源の利用：アンモニ
ウム塩および硝酸塩ともに利用できる。

１０ 色素の生成：黄色、非水落性。

１１ ウレアーゼ：陽性 １２ カタラーゼ：腸性 １３ レシチナーゼ：陰性 １４ コリン・オキシダーゼ：腸性 １５ 最低生育温度範囲：１５〜３７０。

５および４２℃で生育微弱。

１６ 生育ｐＨ範囲：５〜９ １７ 酸素に対する態度：グルコースを炭素源とした○
−Ｆテストなどの結果から適性嫌気性。

１８ べプトンからアンモニアの生成：陽性１９ ェス
クリンの加水分解：陰性２０ セルロースの分解：陰性 ２１ 食塩耐性：７タ′ので生育、１０多′ｄ‘で非生
育。

２２ 溶血性：３一溶血 ２３ コリンの利用：腸性 ２４ クレアチンの利用；陽性 ２５ ペタィンの利用：腸性 ２６ 尿酸の利用：腸性 ２７ ビタミン要求性：なし ２８ 炭素源の利用性三Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクト
ース、Ｄ−マンノース〜Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロ
ース、Ｌーアラビノース、Ｄ−リボース、Ｌーラムノー
ス、シユークロース、マルトース、トレハ○−ス、セロ
ビオース、グリセリン、〇−マンニツト、０ーソルピツ
ト、〇ーイノシツト「Ｌ−イノシツト、酢酸、ＤＬ−乳
酸、ピルビン酸、コハク酸、エタノール、イヌリンを利
用する。

ラクトース、アドニツト、セルロース〜でん粉を利用し
ない。

２９ 炭水化物から酸およびガスの生成 ■ べプトン塔地を用いたときは酸生成はほとんど認め
られない。

■ トリプトン２多′夕、ＮａＣ１５タ′〆、Ｋ２ＨＰ
０４０．３夕／夕を基礎塔地として酸生成を検出。

■ Ｄーグルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトー
ス、Ｄーガラクトース、マルトース、シユークロース、
トレハ。

−ス（微弱）、Ｄーマンニツト、グリセリンから酸を生
成、ガスは生成しない。

■ Ｌーアラビノース、Ｄ−キシロース、ラクトース、
Ｄ−ソルビツト、イノシツト、でん粉から酸およびガス
を生成しない。

Ｗ 細胞化学的分析 Ｉ ＤＮＡのＧ−Ｃ比：６７．８％ ２ 細胞壁のジアミノ酸：リジン ３ 細胞壁の糠：ラムノース「ガラクトース、マンノー
スコリネバクテリウム・コリニフイラム ＫＹ４７０６（徴工研菌寄第４１１び烏）（ＮＲＲＬ
８一１１１５７）は、コリネバクテリワム・コリノキシ
ダンスＫＹ４７０７と以下の点を除いてほとんど同一で
ある。

１ 非運動性でべん毛を有せず。

２ でん粉の加水分解およびでん粉からの酸の生成：陽
性３ ラクトースを単一炭素源として利用する。

上に述べたような菌学的性質をもとにして、パージ一の
マニュアル・オプ・デタミナテイブ・バクテリオロジー
第８版（１９７４）および第７版（１９５７）〔以下単
にパージ‐第８版（または第７版）という〕、山田 ，
駒形：Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１
６、１０３（１９７０）および同１６「 ２１５（１９
７０）、Ｃｍｍｍｌｎｓ、Ｊ．袋ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．２８、３５（１９６２）、およびＵＳＰ３２２２２
＄（１９６３）を参考にして公知の菌群との異同を検討
した。上に託した２菌株はグラム陽性、無胞子、非抗酸
性、通性嫌気性、多形性の樺菌であることかり、パージ
‐第８版ＰＡＲＴ１７のＣｏｒ肌ｅｆｏ皿Ｇｒｏｕｐｏ
ｆＢａｃにｒｉａに含まれるべきものと考えられる。

このグループにはセルロモナス属、クルチア属、アース
ロバクター属およびコリネバクテリウム属の４属が含ま
れている。本２菌株はセルロモナス属、クルチア属およ
びアースロバクタ−属に属する繭株と以下の点において
区別される。

セルロモナス属に属する函株はセルロース分解能力を有
し、ビオチンおよびサィアミンを生育に必要とし、ＤＮ
ＡのＧ−Ｃ比が７１．７〜７２．７％〔山田・駒形：Ｊ
．蛇ｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６、２１５
（１９７０）〕である。

これに対し、本２菌株はセルロース分解能力を有さず、
ビオチンおよびサィアミンを生育に必要とせず、ＤＮＡ
のＧ−Ｃ比が総±０．５％である。したがって本２菌株
はセルロモナス属に属しない。クルチア属に属する菌株
は対数増殖期では規則的な形をし、分枝せず鎖状をなす
。また偏性好気性であり、硝酸塩を還元しない。

これに対し、本２菌株は対数増殖期では、不規則な形状
をなし、分枝するものもあり、鎖状をなさない。また通
性嫌気性であり、硝酸塩を還元する。したがって、本２
菌株はクルチア属に属しない。アースロバクター属に属
する菌株は一般に対数増殖期においてグラム陰性である
。

また偏性好気性であり、３７０ではこの属に属する菌株
の多くが生育できない。

さらに細胞壁構成糖としてガラクトースのみを有する。
これに対し、本２菌株は培養全般を通じてグラム腸性で
ある。また適性嫌気性であり、３７０でよく生育する。
さらに細胞壁機成糖としてガラストース、ラムノースお
よびマン／ースを有する。したがって、本２菌株はアー
スロバクター属に属しない。一方、本２菌株はコリネバ
クテリウム属に属する菌株についてのパージ−第８版（
５９９−６１力頁）の記載と矛盾しない。したがって、
本２菌株はコリネバクテリウム属に所属させるのが妥当
であると考えられる。一方、コリネバクテリウム属およ
びアースロバクター属に近いが分類が不確かな属として
プレビバクテリウム属およびミクロバクテリウム属であ
ることがパージ‐第８版の５９９頁に記載されている。

パージ‐第８版の６２５〜６２６頁においてＦｉｅ山ｅ
ｒらのプレビバクテリウム属に属する菌株はコリネバク
テリゥム属に属させるべきであるとの主張が記載されて
いる。

またパージ‐第８版の６２８頁においてＪｅ船ｅｎのミ
クロバクテリウム・テクテイクムおよびミクロバクテリ
ウム・リケフアシエンスはコリネバクテリウム属に属さ
せるべきであるとの主張が記載されている。そこで本２
菌株とパージ‐第８版に記載されたコリネバクテリウム
属の種々の種に属する菌株、およびパージ‐第７版に記
載されたプレビバクテリウム属およびミクロバクテリウ
ム属に属する種々の種に属する繭株とをこれらの文献の
記載を参照して比較した。

さらに必要に応じて、本２菌株と上記種々の種に属する
菌株とを比較するための実験を行った。コリネバクテリ
ウム属、ブレビバクテリウム属およびミクロバクテリウ
ム属の公知の種に属する菌株中、本２菌株と同様コリン
のみを炭素源とする培地で旺盛に生育できる菌株は、コ
リネバクテリウム・ムリセプテイクム、ブレビバクテリ
ウム・アルバム、ブレビバクテリウム・セリナムおよび
ブレビバクテリウム・マリスに属していた。

またコリンのみを炭素源とする培地に生育できないか微
弱な生育しかできないが、本２菌株と同様細胞壁のジア
ミノ酸としてリジンを含み、かつ他の性質が本２菌株と
比較的類似している菌株は、コリネバクテリウム・ポイ
ンセチアエ、ブレビバクテリウム・フルフム、ブレビバ
クテリウム・ヘルボルム、ブレビバクテリウム・インベ
リ＊＊アレおよびブレビバクテリウム・スルフレウムに
属していた。本２菌株とこれらの種に属する菌株との菌
学的性質の比較を第１表に示す。

第１表 注 ○：○ｏｒｙｎｅｂａＣｔｅｒｌｕｍ’Ｂ：Ｂｒｅ
ｕｉｂａｃｔｅｒｌｕｍ， Ｌｙｓ：リジン、 ＤＬ−
ＤＡＰ：ＤＬ−ジアミノピメリン酸※１：実験値※２：
ＵＳＰ ３２２２２５８ ※３：Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１
６，１０３（１９７０）※４：パージ−第７版 ※５：Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８，３５（
１９６２）第１表から判るようにＫＹ４７０７およびＫ
Ｙ４７０６菌株はともに菌学的性質において類縁の種に
属する菌株のいずれとも合致しない。

従って両菌とも新菌種に属する菌株であると考え、ＫＹ
４７０７が属する菌種をコリネバクテリウム・コリノキ
シダンス、ＫＹ４７０６が属する菌種をコリネバクテリ
ウム・コリニフイラムと命名した。次に両菌を使用して
酵素生産を行なわせる場合の培養条件について説明する
。

本発明に使用する培地は炭素源、窒素源、無機物、その
他徴量の栄養素を程よく含有するものであれば合成塔地
、天然塔地何れも使用可能である。培地の炭素源として
はブドウ糖、累積、廉糖、糟蜜などの炭水化物、乳酸、
酢酸、コハク酸などの有機酸；コリン等が用いられる。

窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、
リン酸アンモニウム、尿素、グルタミン酸ナトリウム、
グリシン、アスパラギン酸ナトリウム、コリン等の無機
有機窒素化合物が使用できる。

さらに窒素源としてはまたべプトン、肉エキス、酵母エ
キス、コーン・スチープ・リカーなどの窒素含有天然物
も使用できる。無機物としてはリン酸ーカリゥム、リン
酸二カリウム、硫酸マグネシウム等が使用できる。

次に、本発明においては培地中にコリンをコリン・オキ
シダーゼの誘導物質として存在せしめることによって、
コリンオキシダーゼの生成量を増加せしめることができ
る。談議導物質としてのコリンとしては塩化コリン、硫
酸コリンなどのコリンの酸塩、フリーのコリンなどが使
用される。コリンの培地中への添加時期としては培地中
に最初から存在せしめてもよいし、培養中に渚地に添加
してもよい。培養中に添加する場合は使用菌の対数増殖
期の終了までに添加するのが好ましい。次に該誘導物質
としてのコリンの培地中での好適な濃度範囲を決定する
ために行なった実験の例を示す。実験例およびあとで示
す実施例におけるコリン・オキシダーゼの活性はコリン
・オキシダーゼによりコリンが酸化される際に生成する
過酸化水素をパーオキシダーゼで分解し、フェノール一
４ーアミノアンチピリン発色系に導く方法により測定す
る。

この測定法の詳細は次の通りである。すなわち、４ーア
ミノアンチピリン、フェノール各々０．０１ｍｏｌ′夕
を含む０．０８ｈｏｌ／そトリスバツフアー溶液（ｐＨ
７．０）にパーオキシダーゼを該溶液１００舷あたり５
００Ｕ含有させたものを発色液とする。該発色液３の‘
に活性を測定すべき酵素溶液０．１の‘、１／３仇ｈｏ
ｌ／〆塩化コリン溶液０．１Ｍを添加し、３７０で２０
分間反応後、５０肌凧の吸光度を測定する。活性の単位
Ｕは１分間にｌＡｍｏｌの基質を分解する酵素力価とす
る。実施例 １ 種菌としてコリネバクテリウム・コリノキシダンスＫＹ
４７０７およびコリネバクテリウム・コリニフィラムＫ
Ｙ４７０６を使用する。

塩化コリン０、０．１、０．５、１．０、５．０もしく
は１０．０夕／ｄ上、コーン・スチープ・リカー０．５
夕／ｄ‘、酵母エキス０．５夕／ｄ‘、ＫＨ２Ｐ０４０
．１夕／ｄ‘、ＭｇＳ０４・７日２００．０５夕／ｄ‘
およびグルタミン酸ソーダ０．５タ′ｄ‘（ｐＨ７．２
）よりなる各栄叢培地を７０泌客大型試験管に各１０の
‘分注し、１２０℃で１流ご殺菌する。

該各塔地に前記菌株を１白金耳接種し、３０℃で２独特
間振遼培養する。

培養終了液を遠心分離して菌体を得、これをｐＨ８．０
の０．０風ｏｌ′そトリス・バッファ‐１０の‘に懸濁
し、超音波破砕する。

破砕液を遠Ｄ分離して上清液を得る。上清液を酵素液と
し、コリン・オキシグーゼを測定する。結果を第２表に
示す。

第２表 上記の実験例等より、コリン・オキシダーゼ誘導物質と
してのコＩＪンの培地中での濃度としては０．１〜１０
．０夕／ｄ‘が適当である。

第２表に示したコリネバクテリウム・コリノキシダンス
ＫＹ４７０７およびコリーネバクテリウム・コリノフイ
ラムＫＹ４７０６のコリン・オキシダーゼの生産活性は
従来の菌株によるもの（袴願昭５１一１３９１２び号（
特公昭５４一４３０７５号）「特腰昭５１一１５５６５
５号（椿公階５７−３０４６計号）参照）に比べてはる
かに高いものであって工業的により有利にコリン・オキ
シダーゼの生産を行なうことが可能となった。本発明に
おけるコリン・オキシダーゼ生産菌の培養は通常振濠培
養あるいは通気蝿梓培養で行なう。

培養温度は２５〜３５ｑｏが好適である。培地のｐＨは
７．０〜８．５の範囲にあることが望ましい。培養は１
〜３日間行なう。上に述べたような培養によって、培養
物中、主として菌体中にコリン’オキシダーゼが生成蓄
積する。

培養終了後、培養液から菌体を遠心分離等により取得し
、ついでこの菌体を菌体破砕機を用いるなど適当な手段
で破砕し、破砕液から遠心分離等によって上清液を得る
。

上清液よりコリン。

オキシダーゼの採取にあたっては通常の酵素精製に用い
られるあらゆる方法、例えば塩折、有機溶媒沈殿、透析
、イオン交換セルロースカラムクロマト、イオン交換セ
フアデツクスカラムクロマト、セフアデツクスカラムク
ロマト、凍結乾燥などの方法が使用できる。次に本発明
でそれぞれの菌株について得られるコリン・オキシダー
ゼの性質を示す。ｍ 作用 コリンを酸化してべタインアルデヒドを経てべタィンを
生成せしめる。

この反応経路は次式で示される。コリン０２ペタインア
ルデヒド＋比０２ ペタインアルデヒドヒヱベタイン＋Ｑ。

２ 【２）安定ｐＨ範囲 日２０ 実施例１および２で得られたコリネバクテリウム・コリ
ノキシダンスＫＹ４７０７およびコリネバクテリウム・
コリニフィラムＫＹ４７０６の酵素標品をそれぞれ１．
４Ｕ／の‘になるようにＰＨ８．０の０．０靴ｏｌ／そ
のトリスリミッファ‐に溶解する。

得られた溶液０．５叫と種々のｐＨの０．０５ｍｏｌ′
クトリス・バッファーとを混ぜてＰＨ６．０、７．０、
８．０、９．０または１０．０の溶液を得る。ついでこ
れらの溶液を４５午０で３０分保つ。処理液を酵素溶液
としてコリン・オキシダーゼの定量法に従し、吸光度を
測定する。結果を第１図に示す。第１図のＡおよびＢか
ら両菌株のコリン・オキシダーゼについて安定鮒につい
てほとんど差異がなく、それぞれ７．０〜８．０が安定
軸であることが判る。鰍 至薄舟範囲３７０に保った、
約４の‘客の酸素吸収測定用の反応容器（株式会社給水
イｂ学研究所製）に酸素電極を挿入する。

一方、実施例１および２で得られた両菌株の酵素標品を
１．６Ｕ／の‘になるようにｐＨ８０の０．０５ｍｏｌ
／そのトリス・バッファーに溶解する。得られた酵素溶
液０．１の【、０．１ｍｏｌ／そ塩化コリン水溶液０．
１泌、および舟６．５、７．０、８．０、８．５、９．
２５、１０．０または１０．５の０．０５ｍｏｌ′その
トリス・バッファー３．６の‘を前記反応容器に入れる
。溶液をスターラーで蝿拝しながら、溶存酸素の減少を
計縁計〔商品名：デスクトップリコーダー（戊ｓｋＴｏ
ｐＲｅｃｏｒｄｅｒ）、大倉電気株式会社製〕で記録す
る。反応後３の砂〜５分の間における溶存酸素の減少の
勾配を求める。各ｐＨ中「減少勾配が最も大きい場合を
１００の活性とした場合の相対活性を第２図に示す。第
２図のＡおよびＢから両菌株のコリン・オキシダーゼは
（反応）至通解範囲ではほとんど差異がなくいずれも７
．５〜９．５であることが判る。（４｝ 作用適温の範
囲実施例１および２で得られた両菌株の酵素標品をいず
れも０．５Ｕ′泌となるようにＰＨ８．０の０．０５ｍ
ｏｌ′そのトリス・バッファーに溶解して酵素溶液とす
る。

該酵素溶液を用い、反応温度（ＯＣ）を２０「３い３５
４０「４５または５０とする以外はコリン・オキシダー
ゼの定量法と同様にしてコリン・オキシダーゼの活性を
測定する。

結果を第３図に示す。第３図のＡおよびＢから両菌株の
コリン・オキシダーゼは作用適温の範囲にほとんど差異
がなくいずれも２０〜３５℃であることが判る。｛５｝
基質特異性 実施例１および２で得られた両菌株の酵素標品を０．９
Ｕ／私となるようにｐＨ８．０の０．０８ｈｏｌ′その
トリス・バッファーに溶解して酵素溶液とする。

該酵素溶液を用い、塩化コリンにかえ、第２表に示す各
基質を用いる以外はコリン・オキシダーゼの定量法と同
様にして測定を行なう。塩化コリンの場合の定量値を１
００とした場合の各基質の相対活性を第３表に示す。第
３表 次に本発明を実施例で具体的に説明する。

実施例 １ 種菌としてコリネバクテリウム・コリノキシダンスＫＹ
４７０７を使用する。

塩化コリン２夕／ｄ‘、コーン・スチープ−リカー０．
５夕／ｄ‘、酵母エキス０．５夕／ｄ‘、グルタミン酸
ソーダ０．５夕／ｄ‘、リン酸二カリウム０．１タ′の
、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５夕／ｄ‘（ＰＨ７
．２）よりなる種培養塔地を７０の‘客大型試験管に１
０の【分注し、１２０午０で１５分殺菌する。

該培地に前記菌株を１白金耳接種し、３０℃で４糊時間
振濠培養する。ついで得られる培養液のすべてを２〆客
三角フラスコに分注した前記と同じ種培養培地３００の
‘に接種し、３ぴＣ、４期馬間振濠培養する。培養終了
後、培養液のすべてを５そのジャーファーメンター中の
３．０その同上培地に接種し、３０３０、５０仇．ｐ．
ｍへ通気１夕／夕（培地）／ｍｉｎで生産培養を行ない
、１額時間で培養を終了する。コリンオキシダーゼ生産
量は培養液１凧【あたり１．２１Ｕである。培養終了液
からコリン・オキシダーゼを採取するため、該液を遠心
分離して菌体を得、これをＰＨ８０の０．０８ｈｏｌ′
クトリスリゞツフアー１そに懸濁したのち、ダイノ・ラ
ボラトリー・ミル（Ｄ飢ｏりｂｏｒａｔｏひ ｍｉｌｌ
）ＫＤＬ型（Ｗｍｙ Ａ、ＢａｃｈｏｆａｎＩｎｃ、Ｓ
ｗｉｐＭａｎｄにより製造されている）にて菌体を破砕
し、菌体破砕液を得る。菌体破砕液を遠心分離して上清
液を得る（前記培養終了液中のコリン・オキシダーゼの
生産量はこの上清液を酵素溶液としてコリン・オキシダ
ーゼの活性を測定することにより求められたものである
）。この上蒲液に硫酸アンモニウムを添加して、硫酸ア
ンモニウム３０％飽和とし、沈殿物を遠心分離により除
き、上清液を得る。

この上蒲液に硫酸アンモニウムを添加して、硫酸アンモ
ニウム６０％飽和とし、沈殿物を遠′０分離により集め
る。この沈殿物を斑８．０の０．０５ｍｏｌ′そのトリ
ス・バッファーに溶解し、同バッファーで一夜５℃でセ
ロハン・チューブを透析膜として透析する。透析チュー
ブ内液を０．０靴ｏｌ′そ塩化ナトリウムを含むトリス
・バッファー（ｐＨ８．０）で平衡にした１そのＤＥＡ
Ｅセルロースカラムにチアージし、０．０靴ｏｌ／そ塩
化ナトリウムを含むトリス・バッファー（ｐＨ８．０）
１そで洗浄後、塩化ナトリウム０．０５〜０．４８ｈｏ
ｌ／その濃度勾配で湊出を行なう。

コリン・オキシダーゼの溶出区分を集め、硫酸アンモニ
ウム６０％飽和とし、沈殿物を遠心分離により集める。
この沈殿物をｐＨ８．０の０．０５ｍｏｌ′そトリス・
バッファーに溶解し、ＰＨ８．０の０．０靴ｏｌ′そト
リス・バッファーで平衡にした５００の‘のセフアデツ
クス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−１５０（デキストラン誘
導体よりなる分子節の商標名：ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉ
ｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓｌｍ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．により製
造されている）にチアージし、同じバッファーで溶出す
る。コリン・オキシダーゼの溶出区分を集め、硫酸アン
モニウム６０％飽和とし、沈殿物を遠心分離により集め
る。この沈殿物をｐＨ８．０の０．０５ｍｏｌ／クトリ
ス・バッファーに溶解し、同バッファーで一夜５℃でセ
ロハンチューブを透析膜として透析する。透析後、０．
１ｍｏｌ／〆塩化ナトリウムを含む０．０８ｈｏｌ／そ
トリス・バッファー（ｐＨ８．０）で平衡にしたＤＥＡ
ＥーセフアデツクスＡ−５０（弱塩基性陰イオン交換樹
脂の商品名；ＰｈａｎｎａｃｉａＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃ
ａｌｓｌに．、Ｕ．Ｓ．Ａ．により製造されている）５
００の‘のカラムにチャージする。０．１ｍｏｌ／そ塩
化ナトリウムを含む０．０８ｈｏｌ／そトリス・バッフ
ァー（ｐＨ８．０）５００の【で樹脂を洗浄する。

次に塩化ナトリウム０．１〜０．５ｈｏｌ／その濃度勾
配で溶出を行なつ。コリン・オキシダーゼ溶出区分を集
め、ｐＨ８．０の０．０５ｍｏｌ／クトリス・バツフア
ーでセロハン・チューブを透析膜として透析後「凍結乾
燥する。約１３％の活性収率でコリン・オキシダーゼを
採取した。活性は４．５Ｕ′ｍｇ蛋白質である。実施例
２種菌としてコリネバクテリウム・コリニフイラムＫ
Ｙ４７０６を使用する。

実施例１に示した種培養塔地３００叫を２〆客三角フラ
スコに分注し、１２０００で１５分殺菌する。

該培地に前記菌株を１白金耳接種し、３０午○で４潮寿
間振顔培養する。培養終了後、培養液のすべてを５そジ
ャーファーメンター中の３．０その前記種培養培地と同
一組成の培地に接種し、３０３０、５０仇．ｐ．ｍ．、
通気１そ／夕（培地）／ｍｉｎで本培養を行ない、２幼
時間で培養を終了する。

コリン・オキシダーゼ生産量は培養液１泌あたり１．１
０Ｕである。培養終了液から実施例１と同様な方法によ
ってコリン・オキシダーゼの精製を行ない、約１２％の
活性収率でコリン・オキシダーゼを採取した。

活性４．２Ｕ／雌蛋白。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のコリン・オキシダーゼの安定ｐＨ範囲
を示す。 Ａはコリネバクテリウム・コリノキシダンスＫＹ４７０
７の菌体より得た酵素「 Ｂはコリネバクテリウム・コ
リニフイラムＫＹ４７０６より得た酵素による試験結果
を示す。第２図は本発明のコリン・オキシダーゼの至適
ｐＨ範囲を示す。ＡとＢの説明は第１図と同様である。
第３図は本発明のコリン・オキシダーゼの作用適温の範
囲を示す。ＡとＢの説明は第１図と同様である。英ー図 技ｚ図 ｇ３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ コリネバクテリウム・コリノキシダンスまたはコリ
   ネバクテリウム・コリニフイラムに属する微生物を栄養
   培地で培養することを特徴とするコリン・オキシダーゼ
   の製造法。 ２ 栄養培地がコリンまたはコリンの酸塩を含有するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の製造法。