JPS5995900A - 測定用組成物 - Google Patents
測定用組成物Info
- Publication number
- JPS5995900A JPS5995900A JP20671982A JP20671982A JPS5995900A JP S5995900 A JPS5995900 A JP S5995900A JP 20671982 A JP20671982 A JP 20671982A JP 20671982 A JP20671982 A JP 20671982A JP S5995900 A JPS5995900 A JP S5995900A
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- JP
- Japan
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- composition
- glucose
- measurement
- hexokinase
- organic solvent
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、グルコース、ATP、 クレアチンホヌホ
キナーゼ(以下CPKという。)その他の各種ホスホト
ランヌフエフーゼ、グルコーヌヲ遊離スる各種グリコシ
ダーゼなどの測定用組成物に関するものである。
キナーゼ(以下CPKという。)その他の各種ホスホト
ランヌフエフーゼ、グルコーヌヲ遊離スる各種グリコシ
ダーゼなどの測定用組成物に関するものである。
従来、ヘキソキナーゼ(以下HKという。)あるいはグ
ルコキナーゼ(以下GKという。)とグルコース−6−
リン酸脱水素#素(以下・06PDHという。)とを共
役酵素とする方法、いわゆるHK/G6PDH系もしく
はGK / G6PDH系が臨床検査分野において、グ
ルコースやCPKの測定に用いられている。
ルコキナーゼ(以下GKという。)とグルコース−6−
リン酸脱水素#素(以下・06PDHという。)とを共
役酵素とする方法、いわゆるHK/G6PDH系もしく
はGK / G6PDH系が臨床検査分野において、グ
ルコースやCPKの測定に用いられている。
その測定原理は。
CPK
CP+ADP−−→C+ATP (
1)ATP+グμコース−巨匹】ブ臣主9ムーAI)p
十、G6p (2)G6P +NAD(Pl 旦廷
凋L6−PGA + NADu)+u (3)で示
される。
1)ATP+グμコース−巨匹】ブ臣主9ムーAI)p
十、G6p (2)G6P +NAD(Pl 旦廷
凋L6−PGA + NADu)+u (3)で示
される。
(上記略号はCP:クレアチンリン酸、C:クレアチン
、 ADP :アデノシンー51−二リン酸、 AT
P :アデノシン−5′−三リン酸、 06P ニゲル
コース−6−リン酸、 NAD(P)H:還元型ニコ
ナンアミドアデニンジヌクレチド(リン酸) 、 ’6
−PGA : 6−ホスホグルコン酸を表わす。) 上記反応式(1)、 (2)及び(3)を触媒する酵素
がおのおのCPK、HK又はGK、06PDHである。
、 ADP :アデノシンー51−二リン酸、 AT
P :アデノシン−5′−三リン酸、 06P ニゲル
コース−6−リン酸、 NAD(P)H:還元型ニコ
ナンアミドアデニンジヌクレチド(リン酸) 、 ’6
−PGA : 6−ホスホグルコン酸を表わす。) 上記反応式(1)、 (2)及び(3)を触媒する酵素
がおのおのCPK、HK又はGK、06PDHである。
しかしながら、従来のHK / G6PDH系によるグ
ルコース及びCPK測定用組成物は、溶液状態での室温
保存安定性が乏しく、液状化してからの試薬の室温(1
8〜35℃)での寿命は非常に短かったのであった。こ
のため、特開昭56−124397号公報や特開昭56
−169598号公報で、耐熱性のGKや耐熱性の06
PDHを用いた定量用組成物が提案されている。この組
成物は、室温保存安定性が改善されたとはいえ、その組
成物に含まれるカップリング酵素の不安定性及びSH化
合物の不安定性から、いまだ十分とはいえず、しかも長
期間安定に保つためには、比較的多量の酵素が必要であ
った。
ルコース及びCPK測定用組成物は、溶液状態での室温
保存安定性が乏しく、液状化してからの試薬の室温(1
8〜35℃)での寿命は非常に短かったのであった。こ
のため、特開昭56−124397号公報や特開昭56
−169598号公報で、耐熱性のGKや耐熱性の06
PDHを用いた定量用組成物が提案されている。この組
成物は、室温保存安定性が改善されたとはいえ、その組
成物に含まれるカップリング酵素の不安定性及びSH化
合物の不安定性から、いまだ十分とはいえず、しかも長
期間安定に保つためには、比較的多量の酵素が必要であ
った。
そこで1本発明者らはかかる観点から、室温で長時間保
存することができ、しかも少量の酵素で有効で、経済性
に優れた測定用組成物を提供することを目的として鋭意
研究した結果、親水性有機溶媒を用いると、上記の目的
がすべて達成しうろことを見い出し1本発明を完成した
。
存することができ、しかも少量の酵素で有効で、経済性
に優れた測定用組成物を提供することを目的として鋭意
研究した結果、親水性有機溶媒を用いると、上記の目的
がすべて達成しうろことを見い出し1本発明を完成した
。
すなわち1本発明はグルコキナーゼ又はヘキソキナーゼ
と、グルコース−6−リン酸脱水素酵素とからなる測定
用組成物において、親水性有機溶媒を含有することを特
徴とする測定用組成物である。
と、グルコース−6−リン酸脱水素酵素とからなる測定
用組成物において、親水性有機溶媒を含有することを特
徴とする測定用組成物である。
本発明に用いられるグルコキナーゼ、ヘキソキナーゼ及
びグルコース−6−リン酸脱水素ffI素としては、微
生物由来のもの、動物由来のものなど各種のものを使用
することができるが、なかでも最適生育温度が50℃な
いし85℃である微生物の産生ずるものが安定性の面か
ら好ましい。そのような微生物としては、例えばバチル
ス・ステアロサーモフィルス、バチ〃スーサーモプロテ
オリテイ、ウス、バチルス・アシドカルダリウヌ、サー
モアクチノマイセス属、サーマス属、サーモミクロビラ
ム属、カルブリア属などの微生物があげられる。これら
の中でも特に好ましい微生物としては、バチルス・ステ
アロサーモフィルス(BacillusStearot
hermophilus )があげられl スフ70
’l−−−1=フイ〃スとしての具体例としては、
ATCC795!l 。
びグルコース−6−リン酸脱水素ffI素としては、微
生物由来のもの、動物由来のものなど各種のものを使用
することができるが、なかでも最適生育温度が50℃な
いし85℃である微生物の産生ずるものが安定性の面か
ら好ましい。そのような微生物としては、例えばバチル
ス・ステアロサーモフィルス、バチ〃スーサーモプロテ
オリテイ、ウス、バチルス・アシドカルダリウヌ、サー
モアクチノマイセス属、サーマス属、サーモミクロビラ
ム属、カルブリア属などの微生物があげられる。これら
の中でも特に好ましい微生物としては、バチルス・ステ
アロサーモフィルス(BacillusStearot
hermophilus )があげられl スフ70
’l−−−1=フイ〃スとしての具体例としては、
ATCC795!l 。
7954、8005. 10194. 12980.
NOA 1503 などがある。
NOA 1503 などがある。
本発明に用いられる親水性有機溶媒としては。
水と容易に混合しつる有機溶媒であれば、いかなるもの
でもよい。そのようなものとして9例えばメチルアルコ
ール、エチルアルコールナトノー価アルコール類、エチ
レングリコール、グリセリンなどの多価アルコール類、
N−N−モノメチルホルムアミド、 N−N−ジ
メチルホルムアミドなどのアミド類、アセトン、 n
−ブチルケトンなどのケトン類、ジオキサン、テトラヒ
ドロフランなどのエーテルm、 酸mメチル、酢酸エチ
ルなどエヌテル類、ジメチルヌルホキシトなどがあげら
れ、これを単独もしくは混合して用いることができる。
でもよい。そのようなものとして9例えばメチルアルコ
ール、エチルアルコールナトノー価アルコール類、エチ
レングリコール、グリセリンなどの多価アルコール類、
N−N−モノメチルホルムアミド、 N−N−ジ
メチルホルムアミドなどのアミド類、アセトン、 n
−ブチルケトンなどのケトン類、ジオキサン、テトラヒ
ドロフランなどのエーテルm、 酸mメチル、酢酸エチ
ルなどエヌテル類、ジメチルヌルホキシトなどがあげら
れ、これを単独もしくは混合して用いることができる。
この親水性有機溶媒を組成物に対して0.1〜50重景
%、好ましくは1〜60重量%、さらに好ましくは3〜
20重量%使用すればよい。
%、好ましくは1〜60重量%、さらに好ましくは3〜
20重量%使用すればよい。
次に本発明の組成物を調製するには、グルコース、
CPK、 ATP、その他の生体成分などの目的とす
る測定物の種類に適宜調製されるが9例えば測定スべき
ホスホトフンスフエフーゼの基質(リン酸供与体)、測
定すべきグリコシダーゼの基質。
CPK、 ATP、その他の生体成分などの目的とす
る測定物の種類に適宜調製されるが9例えば測定スべき
ホスホトフンスフエフーゼの基質(リン酸供与体)、測
定すべきグリコシダーゼの基質。
ADPないしその塩、 ATPないしその塩、グルコ
ース、 NADあるいはNADPないしその塩、マグ
ネシウムを含む塩、GK又はHK 、 G6PDH及
びトリス−me、 イミダゾール−酢酸、トリエタノー
ルアミン−塩酸などの緩衝液(pI45〜10)などを
配合すればよい。その他チオーμ化合物、キレート試薬
、特定の反応の阻害剤、防腐剤、界面活性剤及び安定化
剤などを必要に応じて適当量加えることができる。これ
らの配合順序は、どのような順序でもよい。また、これ
らの使用量としては9例えば次のような量であればよい
。
ース、 NADあるいはNADPないしその塩、マグ
ネシウムを含む塩、GK又はHK 、 G6PDH及
びトリス−me、 イミダゾール−酢酸、トリエタノー
ルアミン−塩酸などの緩衝液(pI45〜10)などを
配合すればよい。その他チオーμ化合物、キレート試薬
、特定の反応の阻害剤、防腐剤、界面活性剤及び安定化
剤などを必要に応じて適当量加えることができる。これ
らの配合順序は、どのような順序でもよい。また、これ
らの使用量としては9例えば次のような量であればよい
。
GK又はHK i O,1〜20ニツト/
d06PDHi O,1〜20;じ=ット/
d測定スべきホスホトヲシスフエフーゼ 、
0〜40mMの基質(リン酸供与体) 測定すべきグリコリムゼの基質 ; 0〜4
0mMADPないしその塩 +0〜20mMATP
ないしその塩 ;0−20mM0mMグルコース
; 0〜40mMNADあるいはNADPないしそ
の塩 1 0.1−10mMマグネシウムを含赴蓬
j 1〜10 mM緩衝液(pH5−10)
+ 10〜500 n+M本発明の組成物は、前
述のように臨床検査分野における重要測定項目であるグ
ルコース、CPK。
d06PDHi O,1〜20;じ=ット/
d測定スべきホスホトヲシスフエフーゼ 、
0〜40mMの基質(リン酸供与体) 測定すべきグリコリムゼの基質 ; 0〜4
0mMADPないしその塩 +0〜20mMATP
ないしその塩 ;0−20mM0mMグルコース
; 0〜40mMNADあるいはNADPないしそ
の塩 1 0.1−10mMマグネシウムを含赴蓬
j 1〜10 mM緩衝液(pH5−10)
+ 10〜500 n+M本発明の組成物は、前
述のように臨床検査分野における重要測定項目であるグ
ルコース、CPK。
ATPなどの測定ばかりでなく、ホヌホトラシスフエフ
ーゼ、あるいはグルコースを遊離するグリコシダーゼな
どの活性測定への応用も可能である。
ーゼ、あるいはグルコースを遊離するグリコシダーゼな
どの活性測定への応用も可能である。
本発明の組成物は、WA水性有機溶媒が共役酵素反応を
活性化するため、測定用試薬に用いる酵素量を減少する
ことができ、さらに測定用試薬の溶液状態での室温安定
性を高−めることができるようeこなったので、一度に
大量の試薬をglIal!シておくことができ1作業効
率が改曽される他、余剰の試薬を廃棄する頻度も減少さ
せることが可能となる。
活性化するため、測定用試薬に用いる酵素量を減少する
ことができ、さらに測定用試薬の溶液状態での室温安定
性を高−めることができるようeこなったので、一度に
大量の試薬をglIal!シておくことができ1作業効
率が改曽される他、余剰の試薬を廃棄する頻度も減少さ
せることが可能となる。
次に本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例1.比較例1
バチルス・ステアロサーモフィラスNCA−1503か
ら得られた耐熱性のGK2ユニッ)/d、同一菌体から
得られた耐熱性の06PDH2ユニツト/鴫NADP
2 mM 、 ATP2 mM 、 MgCIQ2
mM 、 ジメチルスルホキシド10重量優、トリ
ヌー塩酸緩衝液(pH8,5) 100 mMの濃度に
なるようにグルコース測定用組成物を作製した。
ら得られた耐熱性のGK2ユニッ)/d、同一菌体から
得られた耐熱性の06PDH2ユニツト/鴫NADP
2 mM 、 ATP2 mM 、 MgCIQ2
mM 、 ジメチルスルホキシド10重量優、トリ
ヌー塩酸緩衝液(pH8,5) 100 mMの濃度に
なるようにグルコース測定用組成物を作製した。
この組成物でグルコース濃度が既知の標準血清を被検液
としてエンドポイント法でグルコース測定を測定した。
としてエンドポイント法でグルコース測定を測定した。
なお、標準血清としては、標準血清中のグIV″2−ス
濃度が2001P/dd有するものを用いた。
濃度が2001P/dd有するものを用いた。
測定方法として、上記組成を30℃に保温し。
その0.6mlを光路長1aIのセルに入れ、セル室を
同じく50℃の恒温に保った分光光度計にて340皿の
吸光度(AO)を測定した。
同じく50℃の恒温に保った分光光度計にて340皿の
吸光度(AO)を測定した。
次にグルコース測定4μlをセルに添加し、酵素反応を
進行させ、10分後の540 nmの吸光度(A)を測
定した。
進行させ、10分後の540 nmの吸光度(A)を測
定した。
試料中のグルコース濃度は次式により算出した。
グルコース濃度(ダ/d4) −437(A Ao
)また、上記の組成物を30℃の恒温tVに保存し7日
後にこの保存組成物を用い、上記標準血清中のグルコー
ス測定を!l!施した。
)また、上記の組成物を30℃の恒温tVに保存し7日
後にこの保存組成物を用い、上記標準血清中のグルコー
ス測定を!l!施した。
また、比較のため、ジメチルスルフオキシドを添加せず
、他は実施例1と同様に行った。
、他は実施例1と同様に行った。
それらの結果を表1に示すが、実施例1においては、a
m当日及び30℃保存7日後とも同じ値が得られ1本発
明による安定化効果を示している。
m当日及び30℃保存7日後とも同じ値が得られ1本発
明による安定化効果を示している。
実施例2.比較例2
実施例1のGK及び06FDH濃度を5分の1に減じ、
以外は実施例1と同様に行った。
以外は実施例1と同様に行った。
また、比較のためジメチルスルフオキシドを添加せず、
他は上記と同様に行った。
他は上記と同様に行った。
その結果を表1に示す。
表1より、実施例2は実施例1とほぼ同一の測定値が得
られ、酵素濃度を減少せしめることが可能であることが
明らかである。
られ、酵素濃度を減少せしめることが可能であることが
明らかである。
実施例3.比較例6
実施例1のGKを酵母から得られたHK、耐熱性の06
PDHを乳酸菌より得られた06FDHにそれぞれ変え
る以外は実施例1と同様に行った。
PDHを乳酸菌より得られた06FDHにそれぞれ変え
る以外は実施例1と同様に行った。
また、比較のため、ジメチルスルホキシドを添加せず、
他は上記と同様tこ行った。
他は上記と同様tこ行った。
その結果を表1fこ示す。
表1から、 HK / G6PDH系においても本発
明の安定化効果が明らかである。
明の安定化効果が明らかである。
表1
実施例4〜51比較例4〜5
実施例1で用いた耐熱性のGK3−Lニラ) / w5
同じく耐熱性のG6PDH3! :、ット/ #/ 、
ADP I mM。
同じく耐熱性のG6PDH3! :、ット/ #/ 、
ADP I mM。
グルコース12 mM 、 NADP 1.6 mM
、酢酸マグネシウム5mM、 AMP4mM、
ジチオスレイトール10mM。
、酢酸マグネシウム5mM、 AMP4mM、
ジチオスレイトール10mM。
アジ化ナトリウム10mM、 クレアチンリン酸20
mM、グリセリン10重量%、イミダゾール−酢酸緩衝
液(pH6,7) 100 mMよりなるCPK測定用
組成物(実施例4)を作製した。
mM、グリセリン10重量%、イミダゾール−酢酸緩衝
液(pH6,7) 100 mMよりなるCPK測定用
組成物(実施例4)を作製した。
また、比較のためグリセリンを添加せず、他は上記と同
様に行って組成物(比較例4)を作製した。さら1こ実
施例4のG K 、 06PDHの濃度を6分の1に
減らした以外は実施例4と同様に行って測定用組成物(
実施例5)を作製した。また、比較のためグリセリンを
添加せず、他は実施例5と同様に行って組成物(比較例
5)を作製した。
様に行って組成物(比較例4)を作製した。さら1こ実
施例4のG K 、 06PDHの濃度を6分の1に
減らした以外は実施例4と同様に行って測定用組成物(
実施例5)を作製した。また、比較のためグリセリンを
添加せず、他は実施例5と同様に行って組成物(比較例
5)を作製した。
次に上記各組成物を30℃に保温し、その0.6mlを
光路長11のセルtこ入、れ1次に市販標準血清40μ
lを添加し、セル室を同じく60℃の恒温に保った分光
光度計tこて340nmの吸光度変化より検体中のCP
K活性の測定を実施した。
光路長11のセルtこ入、れ1次に市販標準血清40μ
lを添加し、セル室を同じく60℃の恒温に保った分光
光度計tこて340nmの吸光度変化より検体中のCP
K活性の測定を実施した。
次に、上記各組成物を60℃の恒温槽tこ保存し3日、
5日、7日後にこれら組成物及びそれぞれの日に新たt
こ調製した実施例4の組成物を用い。
5日、7日後にこれら組成物及びそれぞれの日に新たt
こ調製した実施例4の組成物を用い。
CPKを含む標準血清中のCPKの活性測定を実施した
。それぞれの日tこ新たにV@製した実施例4の組成物
による測定値を1004Jとし、30℃保存の組成物t
こよる測定値の相対比を示したものが第1図である。図
中の1は、実施例4,2は実施例5゜6は比較例4,4
は比較例5を示すものである。
。それぞれの日tこ新たにV@製した実施例4の組成物
による測定値を1004Jとし、30℃保存の組成物t
こよる測定値の相対比を示したものが第1図である。図
中の1は、実施例4,2は実施例5゜6は比較例4,4
は比較例5を示すものである。
第1図より本発明の組成物が長期間にわたって安定であ
ることが明らかである。
ることが明らかである。
第1図は、各種CPK測定用組成物を用いて横軸tこ示
す保存日数後の標準血清のCPK活性測定を実施し、そ
の実施日に新たに作製した実施例4の測定用組成物によ
り得られた標準血清のCPK活性値に対する相対比を縦
軸に示したものであって、1は実施例4,2は実施例5
,6は比較例4,4は比較例5を示す。 特許出願人 ユニチカ株式会社
す保存日数後の標準血清のCPK活性測定を実施し、そ
の実施日に新たに作製した実施例4の測定用組成物によ
り得られた標準血清のCPK活性値に対する相対比を縦
軸に示したものであって、1は実施例4,2は実施例5
,6は比較例4,4は比較例5を示す。 特許出願人 ユニチカ株式会社
Claims (4)
- (1)グルコキナーゼ又はヘキソキナーゼと、グルコー
ス−6−リン酸脱水素酵素とからなる測定用組成物にお
いて、親水性有機溶媒を含有することを特徴とする測定
用組成物。 - (2)グルコキナーゼが、最適生育温度が50℃ないし
85℃である微生物の産生するグルコキナーゼである特
許請求の範囲第1項記載の測定用組成物。 - (3)へキソキナーゼが、最適生育温度が50℃ないし
85℃である微生物の産生ずるヘキソキナーゼである特
許請求の範囲第1項記載の測定用組成物。 - (4)グルコース−6−リン酸脱水素f孝素が、最適生
育温度が50℃ないし85℃である微生物の産生ずるグ
ルコース−6−リン酸脱水素酵素である特許請求の範囲
第1項記載の測定用組成物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP20671982A JPS5995900A (ja) | 1982-11-24 | 1982-11-24 | 測定用組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP20671982A JPS5995900A (ja) | 1982-11-24 | 1982-11-24 | 測定用組成物 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5995900A true JPS5995900A (ja) | 1984-06-02 |
Family
ID=16527968
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP20671982A Pending JPS5995900A (ja) | 1982-11-24 | 1982-11-24 | 測定用組成物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5995900A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0119722A2 (en) * | 1983-02-16 | 1984-09-26 | Unitika Ltd. | Measuring composition |
US4740458A (en) * | 1984-10-05 | 1988-04-26 | Unitika Ltd. | Reagent for assaying creatine kinase |
-
1982
- 1982-11-24 JP JP20671982A patent/JPS5995900A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0119722A2 (en) * | 1983-02-16 | 1984-09-26 | Unitika Ltd. | Measuring composition |
US4740458A (en) * | 1984-10-05 | 1988-04-26 | Unitika Ltd. | Reagent for assaying creatine kinase |
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