JPS5988099A - Novel measurement of enzymatic activity - Google Patents

Novel measurement of enzymatic activity

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JPS5988099A
JPS5988099A JP19886282A JP19886282A JPS5988099A JP S5988099 A JPS5988099 A JP S5988099A JP 19886282 A JP19886282 A JP 19886282A JP 19886282 A JP19886282 A JP 19886282A JP S5988099 A JPS5988099 A JP S5988099A
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acid
leucyl
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JPS6210160B2 (en
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Kunio Matsumoto
邦男 松本
Tsutomu Hirata
平田　勤
Yoshitaka Kagimoto
鍵本　佳孝
Susumu Watanabe
晋 渡辺
Akira Otsuka
明 大塚
Seiji Takahashi
清治 高橋
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KOKUSAN KAGAKU KK
Toyo Jozo KK
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KOKUSAN KAGAKU KK
Toyo Jozo KK
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Abstract

PURPOSE:To measure enzymatic activity simply in high precision, by treating a specimen solution continuing leucine aminopeptidase, etc. with a specific amide compound, treating the liberated amine prepared with an oxidase in the presence of a coupler, measuring the formed dyestuff. CONSTITUTION:A specimen solution containing leucine aminopeptidase or gamma- glutamyl transpeptidase is treated with an amide compound shown by the formula I (R1 is L-leucyl group, gamma-L-glutamyl group; R2, R3, R4, R5 and R6 are H, lower alkyl, etc.). The liberated amine shown by the formula II is treated with an oxidase (e.g., ascorbic acid oxidase) to dissipate an enzyme and to form a dyestuff in the presence of a coupler shown by the formula III (R7 is H, amino acid, etc.; R8, R9, R10, R11, and R12 are H, lower alkyl, etc.). Enzymatic activity is measured by subjecting the formed coloring compound to colorimetry.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はロイシンアミノペプチダーゼまたはγ−グルタ
ミルトランスベプチダーゼの酵素活性測定法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for measuring the enzyme activity of leucine aminopeptidase or γ-glutamyl transpeptidase.

ロイシンアミノペプチダーゼ（臨床化学にお込てＴｒｕ
ｅ　ＬＡＰ　　ともいう）やアリルアミダーゼ（臨床化
学においてＣ１１ｎｉｃａｌ　ＬＡＰともいう。以下時
として鮎と称する）のアミノペプチダーゼ（以下Ｔｒｕ
ｅ　ＬａＰと（：：１ｉｎｉｃａｌ　ＬＡＰを併せて単
に店と称する）けＬ−ペプチド、特にアミノ末端がＬ−
ロイシンまたはこれに関係あるアミノ酸であるペプチド
を遊離アミノ基をもつアミノ末端残基を加水分解してＬ
−ロイシンを遊離させる酵素であって、生体内の各組織
に広く分布し、血清中にも存在していて、血清中の酵素
量は生体の状態によル著しく変動することが知られてお
り、急性肝炎、肝癌、転移性肝癌、肝硬変症、胆道症な
どではＬＡＰ　活性が増加する。そこでＬＡＰ活性がか
かる疾病の１つの指標となり、この酵素活性を測定する
ことは、これら疾病の診断に必要欠くべからざる検査法
の１つになっている。Leucine aminopeptidase (Tru in clinical chemistry)
e LAP) and aminopeptidase (hereinafter Tru
e LaP (together referred to as ``inical LAP'') is an L-peptide, especially when the amino terminus is L-
A peptide that is leucine or a related amino acid is hydrolyzed at the amino terminal residue with a free amino group to obtain L.
- It is an enzyme that liberates leucine, and is widely distributed in various tissues in the body and is also present in the serum, and the amount of the enzyme in the serum is known to vary significantly depending on the condition of the body. , acute hepatitis, liver cancer, metastatic liver cancer, liver cirrhosis, biliary tract disease, etc., LAP activity increases. Therefore, LAP activity is one of the indicators of such diseases, and measuring this enzyme activity is one of the indispensable testing methods for diagnosing these diseases.

γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）は
生体内でγ−グルタミルペプチドの代謝に関与する酵素
であり、ｒ−グルタミルペプチドを加水分解すると共に
、γ−グルタミル基を他のペプチドあるいはアミノ酸に
転移させる酵素であって、生体内の各組織に広く分布し
、血清中にも存在する。γ−ＧＴＰは病的条件によル著
しく変動する仁とが知られており、血清γ−ＧＴＰは肝
汁うつ滞型肝炎、閉寒性黄痘、原発性肝癌、転移性肝癌
などでは、著しい高値を示し、特に慢性肝炎の非活動型
では低値を示すが、活動型では高値を示すなど一般に慢
性の肝疾患に特異的でおり、従来臨床的に用いられて平
た種々の逸脱酵素とは全く異なる診断学的意義を有し、
かかる血清γ−ＧＴＰ活性の測定はこのような疾病の診
断および病態把握に必要欠くべからざる検査法の１つに
なっている。γ-glutamyl transpeptidase (γ-GTP) is an enzyme involved in the metabolism of γ-glutamyl peptide in vivo, and it hydrolyzes r-glutamyl peptide and transfers the γ-glutamyl group to other peptides or amino acids. It is an enzyme that is widely distributed in various tissues in the body and is also present in serum. It is known that γ-GTP fluctuates markedly depending on pathological conditions, and serum γ-GTP significantly fluctuates in cases such as hepatic stasis-type hepatitis, cold jaundice, primary liver cancer, and metastatic liver cancer. In general, it is specific to chronic liver diseases, with low values in inactive forms of chronic hepatitis, but high values in active forms, and it has been compared with various abnormal enzymes that have been used clinically. have completely different diagnostic significance,
Measurement of serum γ-GTP activity has become one of the indispensable testing methods for diagnosing and understanding the pathological condition of such diseases.

従来、ＬＡＰ活性の測定法は多数報告されている力、；
、それらの大部分は合成基質よ、９ＬＡＰによって遊離
されるアミン化合物を比色定量することによｆｆＬＡＰ
活性値を求める方法であって、それに用いる合成基質と
してＬ−ロイシル−ｐ−ニトロアニリドを用い、ＬＡＰ
の酵素作用によ〕生成するｐ−ニトロアニリンの黄色を
比色定量する方法が挙げられるが、この比色定量の際、
その合成基質の呈色波長がオーバー・シップする欠点が
あシ、また血清成分、特にビリルビン系色素による測定
の影響も免れることが出来ない欠点があった。Conventionally, many methods for measuring LAP activity have been reported;
, most of them are synthetic substrates, ffLAP was determined by colorimetric determination of the amine compounds liberated by 9LAP.
This method uses L-leucyl-p-nitroanilide as a synthetic substrate to determine the activity value, and LAP
One method is to colorimetrically quantify the yellow color of p-nitroaniline produced by the enzymatic action of
The disadvantage is that the coloring wavelength of the synthetic substrate is overshipped, and the measurement is unavoidable due to the effects of serum components, especially bilirubin dyes.

さらに、合成基質としてＬ−ロイシル−β−ナフチルア
ミドを用いる方法が挙げられるが、この方法では生成す
るβ−ナフチルアミンに５−二トロー２−アミノメトキ
シベンゼンジアゾテートなどをカップリングさせて色素
を形成させるかあるい　５− は生成するβ−す７チルアミンを亜硝酸ナトリウムでジ
アゾ化し、Ｎ−（１−ナフチル）−エチレンシアミンに
カップリングさせるか、もしくはｐ−ジメチルアミノベ
ンズアルデヒドまたはｐ−ジメチルアミノシンナムアル
デヒドを縮合させて色素を形成せしめ、次いでこれを比
色定量する方法であるが、反応過程が複雑で、かつ厳密
な操作を必要とするため、検査法として尚不便であるば
かりでなく、標準物質たるβ−ナフチルアミンの毒性が
著しく、近年膀胱の腫瘍や癌を発生することが明らかと
なったため、発癌物質として、その使用に特に厳密な注
意を用するなどの欠点があった。Furthermore, there is a method using L-leucyl-β-naphthylamide as a synthetic substrate, but in this method, a dye is formed by coupling 5-nitro-2-aminomethoxybenzenediazotate to the β-naphthylamine produced. Alternatively, the resulting β-7tylamine is diazotized with sodium nitrite and coupled to N-(1-naphthyl)-ethylenecyamine, or p-dimethylaminobenzaldehyde or p-dimethylamino This is a method in which cinnamaldehyde is condensed to form a dye, which is then colorimetrically quantitated, but the reaction process is complicated and requires strict operations, so it is not only inconvenient as a testing method, but also β-naphthylamine, a standard substance, is highly toxic and has recently been found to cause bladder tumors and cancer, so its use as a carcinogen requires special precautions.

一方、γ−ＧＴＰ活性の測定法も多数報告されているが
、それらの大部分は合成基質よりγ−ＧＴＰによって遊
離されるアミン化合物を比色定量することによりγ−Ｇ
ＴＰ活性値を求める方法であって、それを用いる合成基
質としてγ−Ｌ−グルタミルーｐ−ニトロアニリドを用
い、γ−ＧＴＰＯ酵素作用により生成するｐ−ニトロア
ニリンの黄色を４１０　ｎｍで比色定量する方法が挙げ
ら　６− れるが、血清成分、特にビリルビン系色素などの影響を
避けるため、各検体に対して検体ブランクを厳密に測定
しなければならず、正′確な測定値を得ることが困難で
あるとｂう欠点があった。また生成するｐ−ニトロアニ
リンをｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒド、ｐ−ジ
メチルアミノベンズアルデヒドなどのアルデヒド化合物
と縮合させて長波長側の赤色で測定する方法も挙げられ
るが、発色感度に対する温度の影響が大きく、測定値の
再現性に問題があった。また生成するｐ−ニトロアニリ
ンをジアゾ化し、３．５−キシレノールと縮合させて生
ずる赤色を測定する方法が提案されたが反応操作段階が
多く簡便性に欠けるという欠点があった。さらに合成基
質としてγ−Ｌ−グルタミルーβ−ナフチルアミドを用
いる方法が挙げられるが、これらの方法としてγ−ＧＴ
Ｐにより遊離シたβ−ナフチルアミンをジアゾニウム塩
として比色定量する方法、３−メチル−２−ペンゾチア
ゾリノンヒド２シンと酸化剤で発色させて比色定量する
方法、または前記アルデヒド化合物を発色剤として縮合
させて比色定量する方法があるが、前記と同様β−ナフ
チルアミンの発癌性が一般に指摘されているところであ
り、操作が煩雑で測定に長時間を要するなどの点で実用
性に欠けている。On the other hand, many methods for measuring γ-GTP activity have been reported, but most of them are based on colorimetric determination of amine compounds released by γ-GTP from synthetic substrates.
A method for determining the TP activity value, using γ-L-glutamyl-p-nitroanilide as a synthetic substrate, and colorimetrically quantifying the yellow color of p-nitroaniline produced by the action of γ-GTPO enzyme at 410 nm. However, in order to avoid the influence of serum components, especially bilirubin pigments, sample blanks must be precisely measured for each sample, making it difficult to obtain accurate measurement values. It had the disadvantage of being difficult. Another method is to condense the p-nitroaniline produced with an aldehyde compound such as p-dimethylaminocinnamaldehyde or p-dimethylaminobenzaldehyde and measure the red color on the longer wavelength side, but this method has a large effect on temperature on color development sensitivity. , there was a problem with the reproducibility of measured values. A method has also been proposed in which the resulting p-nitroaniline is diazotized and condensed with 3,5-xylenol to measure the resulting red color, but this method has the drawback of requiring many reaction steps and lacking in simplicity. Furthermore, there are methods using γ-L-glutamyl-β-naphthylamide as a synthetic substrate;
A method for colorimetric determination of β-naphthylamine liberated by P as a diazonium salt, a method for colorimetric determination by developing color with 3-methyl-2-penzothiazolinonehydrodisine and an oxidizing agent, or a method for colorimetric determination of β-naphthylamine liberated by P, There is a method for colorimetric determination using condensation as a coloring agent, but as mentioned above, the carcinogenicity of β-naphthylamine has been generally pointed out, and the operation is complicated and measurement takes a long time, making it impractical. Missing.

そこで、本発明者らは、ＬＡＰ活性測定法に関し、鋭意
研究した結果、血清中に存在しな１式（式中　Ｒ１は水
酸基、アミン基またはジー低級アルキルアミノ基　Ｒ１
１は水素原子、低級アルキル基またはカルボキシル基を
示す）で表わされるアミド化合物がＬＡＰの合成基質と
してきわめて優れた物質であ□す、ＬＡＰの作用によル
遊離したアミン化合物がアスコルビン酸オキシダーゼま
たはラッカーゼなどの酸化酵素の作用によシ醒素を消費
して発色化合物を形成することを知力、この消費された
酸素量または生成された発色物質の量を比色定量するこ
とによりＬＡＰの活性測定法を見出した（特願昭５７−
１１５３４５号）。Therefore, the present inventors conducted intensive research on the LAP activity measurement method and found that one formula (wherein R1 is a hydroxyl group, an amine group, or a di-lower alkylamino group) is not present in serum.
1 represents a hydrogen atom, a lower alkyl group, or a carboxyl group) is an extremely excellent substance as a synthetic substrate for LAP.The amine compound liberated by the action of LAP is used for ascorbic acid oxidase or laccase. The activity of LAP is measured by colorimetrically quantifying the amount of oxygen consumed or the amount of color-forming substances produced. I discovered (patent application 1982-
No. 115345).

しかしながら、上記の合成基質を用いる方法では発色化
合物の極大吸収波長が高々５５０　ｎｍであり、生体試
料中の煩雑物による波長の影響をよシ少なくするために
は、よ多波長の高い発色化合物を形成できるような基質
が要求される。However, in the above method using a synthetic substrate, the maximum absorption wavelength of the color-forming compound is at most 550 nm, and in order to reduce the influence of wavelengths due to complication in the biological sample, it is necessary to use a color-forming compound with a higher multi-wavelength. A substrate that can be formed is required.

本発明者らは、上記に着目し、さらに酸化酵素で呈色す
る発色化合物がより安定かつより長波長側に極大吸収を
有する基質や測定法について鋭意研究した結果、後記一
般式〔１〕で表わされるアミド化合物がＬＡＰまたはγ
−ＧＴＰＯ良好な合成基質であるばかりでなく、生成さ
れたアミン化合物を後記一般式〔３〕で表わされるカプ
ラーの共存下酸化酵素を作用させることによ）、酸素を
消費して酸化縮合して得られる発色化合物が５５０〜７
５０１ｍの高波長を有し、しかも安定な色調を有するだ
けでなく、生体試料中の煩雑物による影響をすｔとんど
受けないことを知った。本発明は、上記の知見に基いて
完成されたものである。The present inventors focused on the above, and as a result of intensive research on substrates and measurement methods in which color-forming compounds that develop color with oxidases are more stable and have maximum absorption on the longer wavelength side, the following general formula [1] The amide compound represented is LAP or γ
-GTPO Not only is it a good synthetic substrate, but it can also be oxidized and condensed by consuming oxygen (by allowing the produced amine compound to act with an oxidase in the presence of a coupler represented by the general formula [3] below). The coloring compound obtained is 550-7
It has been found that not only does it have a high wavelength of 501 m and a stable color tone, but it is also completely unaffected by foreign substances in biological samples. The present invention was completed based on the above findings.

本発明は、ＬＡＰまたはγ−ＧＴＰを含有する被検液中
のＬＡＰまたはγ−ＧＴＰＯ酵素活性の　９− 測定において、一般式 （式中、Ｒ１はＬ−ロイシル基またはγ−Ｌ−グルタミ
ル基を示し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲ６は各々
水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコ
キシ基、アミノ基、置換アミン基、水酸基、カルボキシ
ル基またはスルホ基を示し、Ｒ５およびＲ６は一緒にて
炭素環を形成してもよい）で表わされるアミド化合物ま
たはその水溶性塩に該被検液を作用せしめ、遊離する一
般式 （式中、Ｒ２、Ｒ，、ＲいＲ５およびＲ６け前記と同じ
意味を有する）で表わされるアミンに一般弐Ｒ，Ｒ９ （式中％　Ｒ，は水素原子、アミノ基、ｆｆｆｉ換アミ
ノ基または水酸基を示踵Ｒ８、Ｒ，、Ｒｌｏ、Ｒ，１お
よびＲ１２は各々水素原子、ハロゲン原子、低級アルキ
ル基、低級アルコキシ基、アミノ基、時候アミノ基、水
酸基、カルボキシル基またはスルホ基を示し、Ｒ１□お
よびＲＩ２は一緒にて炭素環を形成してもよいが、Ｒ８
、Ｒ１１、ＲＩＯ，ＲｔｔおよびＲ１２のうち少なくと
も１つがアミノｉｋ　ｓ置換アミノ基または水酸基を示
す場合には、Ｒ７は水素原子でもよい）で表わされるカ
プラーの共存下曜酸累を消費して色素を形成する酸化酵
素を作用せしめ、次すで検出できる変化の量を測定する
ことを特徴とする酵素活性の測定法である。The present invention provides a method for measuring LAP or γ-GTPO enzyme activity in a test solution containing LAP or γ-GTP using the general formula (wherein R1 represents an L-leucyl group or a γ-L-glutamyl group). R2, R3, R4, R6 and R6 each represent a hydrogen atom, a halogen atom, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, an amino group, a substituted amine group, a hydroxyl group, a carboxyl group or a sulfo group, and R5 and R6 together represent The test solution is allowed to act on an amide compound or a water-soluble salt thereof represented by the general formula (where R2, R, , R, R5 and R6 are 2 R, R9 (in the formula, % R, represents a hydrogen atom, an amino group, an fffi-substituted amino group or a hydroxyl group); R8, R,, Rlo, R, 1 and R12 are Each represents a hydrogen atom, a halogen atom, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, an amino group, an optional amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group, or a sulfo group, and R1□ and RI2 may form a carbon ring together, R8
, R11, RIO, Rtt and R12 represents an amino substituted amino group or a hydroxyl group, R7 may be a hydrogen atom). This is a method for measuring enzyme activity, which is characterized by activating the oxidase that forms and then measuring the amount of change that can be detected.

本発明においてＬＡＰｔたはγ−ＧＴＰの合成基質とし
て用いられるアミド化合物〔１〕は、ペプチド合成の常
法によって製造することができる。The amide compound [1] used as a synthetic substrate for LAPt or γ-GTP in the present invention can be produced by a conventional method for peptide synthesis.

例えば、Ｌ−ロイシンのカルボキシル基やＬ−グルタミ
ン酸のγ−カルボキシル基とアミン〔２〕との縮合反応
により行われる。For example, it is carried out by a condensation reaction between the carboxyl group of L-leucine or the γ-carboxyl group of L-glutamic acid and amine [2].

上記の縮合反応に際しては、予め反応に関与してはなら
ない官能基、即ちＬ−ロイシンのアミン基やＬ−グルタ
ミン酸のアミン基およびα−カルボキシル基を保護する
のがよい。アミノ基の保護基としては、通常ペプチド合
成に用いられるα−アミノ保護基が用いられる。例えば
ｔ−ブチルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボ
ニル、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジル
オキシカルボニル、Ｏ−ニトロフェニルチオ基などが挙
げられる。Ｌ−グルタミン酸のα−カルボキシル基ハメ
チルエステル、エチルエステル、を−ブチルエステル、
ベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステル、ｐ−
メトキシベンジルエステルなどで保護するのが好ましい
が、脱離の際、アミン基の保護基と共に一段階で脱離さ
れる条件で脱離されるような保護基で保護するのが特に
好ましい。例えばアミン基をベンジルオキシカルボニル
基、α−カルボキシル基をベンジルエステルで保護する
のがその一例である。In the above condensation reaction, it is preferable to protect in advance the functional groups that should not participate in the reaction, ie, the amine group of L-leucine, the amine group of L-glutamic acid, and the α-carboxyl group. As a protecting group for an amino group, an α-amino protecting group that is normally used in peptide synthesis is used. Examples include t-butyloxycarbonyl, t-amyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, p-nitrobenzyloxycarbonyl, O-nitrophenylthio group, and the like. α-carboxyl group of L-glutamic acid methyl ester, ethyl ester, butyl ester,
Benzyl ester, p-nitrobenzyl ester, p-
It is preferable to protect with methoxybenzyl ester, etc., and it is particularly preferable to protect with a protecting group that can be removed in one step together with the protecting group of the amine group. For example, an amine group is protected with a benzyloxycarbonyl group, and an α-carboxyl group is protected with a benzyl ester.

上記縮合反応にルーるアミン〔２〕としては、アニリン
またはハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ
基、アミノ基、置換アミノ基、水酸基、カルボキシル基
またはスルホ基が１個またはそれ以上Ｔｔ俟されたアニ
リン誘導体が用いられる。The amine [2] used in the above condensation reaction has one or more aniline or halogen atoms, lower alkyl groups, lower alkoxy groups, amino groups, substituted amino groups, hydroxyl groups, carboxyl groups, or sulfo groups. Aniline derivatives are used.

例えばｏ−（ｍ−またはρ−）トルイジン、〇−（ｍ−
また１はｐ−）エチルアニリン、２．３−キシリジン、
２．４−キシリジン、２　Ｈ５−キシリジン、２．６−
キシリジン、３．４−キシリジン、３．５−キシリジン
、ｃ−（ｙｒＬ−またはＴ）−）アニシジン、２．５−
ジメトキシアニリン、２．５−ジェトキシアニリン、ｏ
−（ｍ−１たはＰ−）クロロアニリン、０−（？７Ｌ−
また＋ｒｉｐ−）ブロモアニリン、０−（ｍ　−ｔ　ｋ
　ｌｄ　ｐ　−）フェニレンシアアミン、Ｎ、Ｎ−ジメ
チル−ｍ−フェニレンジアミン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｐ
−フェニレンジアミ／、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニ
レンジアミン、Ｎ、Ｎ−シフロピルーｐ−フエニ１／ン
ジアミン、ｏ−（惜−またはｐ−）アミノフェノール、
ｏ−（ｍ−またはｐ−）　　アミノ安息香酸、ｐ−アミ
ノベンゼンスルホン酸、４−ヒドロキシ−３，５−ジク
ロロアニリン、４−ヒドロキシ−３，５−ジブロモアニ
リン、２−ヒト日１３− キシ−５−トルイジン、３（または４）−クロロ−０−
トルイジン、２（または４）−メチル−〇−フェニレン
ジアミン、２（または４）−メチル−ｍ−フェニレンジ
アミン、　　２　（ｔタハ４）−クロロ−脩−フェニレ
ンジアミン、４−メチル−惰−アミノ安息香酸、２（′
ｔたは３）−ヒドロキシ−〇−アミン安息香酸、４−ヒ
ドロキシ−常−アミノ安息香酸、４−クロロ−２−７ミ
ノフエノール、Ｎ−エチル、Ｎ−ヒドロキシエチル−ｐ
−７二二レンジアミン、４−メチル−２−アミンフェノ
ール、２−メトキシ−５−り四ロアニリン、３−クロロ
−ｏ　−）ロイシン、４−クロロ−ｏ　−）ロイシンな
どが挙げられる。上記アミン〔２〕としては、前記以外
にナフチールアミン系化合物が用いられる。例えばＣｔ
−す７グ・ルアミン、１−アミノ−６−ナフトールスル
ホン酸などが挙げられる。For example, o-(m- or ρ-) toluidine, 〇-(m-
In addition, 1 is p-)ethylaniline, 2,3-xylidine,
2.4-xylidine, 2H5-xylidine, 2.6-
Xylidine, 3.4-xylidine, 3.5-xylidine, c-(yrL- or T)-)anisidine, 2.5-
dimethoxyaniline, 2,5-jethoxyaniline, o
-(m-1 or P-)chloroaniline, 0-(?7L-
Also +rip-) bromoaniline, 0-(m -t k
ld p-)phenylenecyamine, N,N-dimethyl-m-phenylenediamine, N,N-dimethyl-p
-phenylenediamine/, N,N-diethyl-p-phenylenediamine, N,N-cyfropyr-p-phenylenediamine, o-(retained- or p-)aminophenol,
o-(m- or p-) aminobenzoic acid, p-aminobenzenesulfonic acid, 4-hydroxy-3,5-dichloroaniline, 4-hydroxy-3,5-dibromoaniline, 2-human day 13-xy- 5-Toluidine, 3 (or 4)-chloro-0-
Toluidine, 2(or 4)-methyl-〇-phenylenediamine, 2(or 4)-methyl-m-phenylenediamine, 2(ttah4)-chloro-su-phenylenediamine, 4-methyl-inert-aminobenzoin acid, 2('
or 3)-Hydroxy-〇-aminebenzoic acid, 4-hydroxy-normal-aminobenzoic acid, 4-chloro-2-7 minophenol, N-ethyl, N-hydroxyethyl-p
Examples include -722 diamine, 4-methyl-2-aminephenol, 2-methoxy-5-tritetraaniline, 3-chloro-o-)leucine, and 4-chloro-o-)leucine. As the amine [2], naphthylamine compounds other than those mentioned above are used. For example, Ct
-su7gluamine, 1-amino-6-naphtholsulfonic acid, and the like.

上記の縮合反応は、アミ７基が保護されたＬ−ロイシン
のカルボキシル基またはアミノ基およびα−カルボキシ
ル基が保護され九し−グルタミン酸のｒ−カルボキシル
基を酸ハライド、酸無水物、１４− 酸アジド、酸イミダゾリド、活性エステル例えばシアノ
メチルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、２．４
−ジニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドエステル
などの活性化アシル誘導体に変換してアミン〔２〕と反
応させるか、あるいはカルボジイミド例えば　Ｎ、Ｎ’
−シンクロへキシルカルボジイミド、Ｎ、Ｎ’−カルボ
ニルイミダゾール、イソオキサゾリウム塩例えばウッド
ワード試薬などの縮合剤の存在下上記の保護されたＬ−
ロイシンまたはＬ−グルタはン酸とアミン〔２〕を反応
させることによル行われる。The above condensation reaction is carried out by converting the carboxyl group of L-leucine with a protected amino group or the r-carboxyl group of L-leucine with a protected α-carboxyl group into an acid halide, an acid anhydride, or a 14-acid. Azides, acid imidazolides, active esters such as cyanomethyl ester, p-nitrophenyl ester, 2.4
- converted into activated acyl derivatives such as dinitrophenyl ester, N-hydroxysuccinimide ester, N-hydroxyphthalimide ester and reacted with amine [2], or with carbodiimide such as N, N'
- Synchhexylcarbodiimide, N,N'-carbonylimidazole, isoxazolium salt The above protected L- in the presence of a condensing agent such as Woodward's reagent
Leucine or L-gluta is produced by reacting phosphoric acid with amine [2].

上記の縮合反応においては、通常不活性有機溶媒、例え
ばジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメ
チルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、
ベンゼン、り目ロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエ
タンなどの溶媒中、両者はぼ等量を加え、室温またはそ
れ以下の温度で反応させることＫより行われる。上記の
反応経過れｔシリカゲルなどの薄層クロマトグラフィー
（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
などによル追跡できるので、出発物質のいずれかの消失
を待って適宜反応を終Ｔすればよい。In the above condensation reaction, inert organic solvents such as dimethylformamide, dimethylacetamide, dimethylsulfoxide, tetrahydrofuran, dioxane,
The reaction is carried out by adding approximately equal amounts of both in a solvent such as benzene, dichloroform, dichloromethane, dichloroethane, etc., and reacting at room temperature or lower temperature. Thin layer chromatography (TLC) such as silica gel, high performance liquid chromatography (HPLC)
Since the reaction can be monitored by the following methods, the reaction can be appropriately terminated after waiting for the disappearance of any of the starting materials.

このようにして得られた反応生成物は、反応溶媒を留去
するかまたは留去することなく、非親水性有機溶媒、例
えばクロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、酢酸
ブチル、メチルイソブチルケトン、ベンゼン、ジエチル
エーテルなどに溶かし、酸性水およびアルカリ性水で洗
浄した後、溶媒を留去することにより採取できる。さら
に精製する必要がある場合には、適当な再結溶媒で再結
晶化するか、あるいはシリカゲル、活性アルミナ、吸着
樹脂などの吸着剤を用いるカラムクロマトグラフィーに
よル精製することができる。The reaction product thus obtained can be treated with non-hydrophilic organic solvents, such as chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, butyl acetate, methyl isobutyl ketone, benzene, diethyl, with or without distilling off the reaction solvent. It can be collected by dissolving it in ether etc., washing it with acidic water and alkaline water, and then distilling off the solvent. If further purification is required, it can be purified by recrystallization with a suitable recrystallization solvent or by column chromatography using an adsorbent such as silica gel, activated alumina, or adsorption resin.

次いで得られた反応生成物の保護基を脱離するのである
が、この脱離化はペプチド化学における保護基の脱離化
法を用いて行われる。例えばアミン保護基がｔ−ブチル
オキシカルボニル基である場合には、２Ｎ塩化水素の酢
酸溶液、トリフルオロ酢酸、ギ酸などを用いる方法、ベ
ンジルオキシカルボニル基である場合には、パラジウム
−炭素触媒を用いる接触還元による方法、臭化水素酸の
酢酸溶液を用いる方法により行えばよい。Ｌ−グルタミ
ン酸のα−カルボキシル基の保護基がベンジルエステル
である場合には、パラジウム−炭素触媒を用いる接触還
元による方法で行えばよい。Next, the protective group of the resulting reaction product is removed, and this removal is carried out using a protective group removal method in peptide chemistry. For example, when the amine protecting group is a t-butyloxycarbonyl group, a method using a 2N hydrogen chloride acetic acid solution, trifluoroacetic acid, formic acid, etc. is used, and when the amine protecting group is a benzyloxycarbonyl group, a palladium-carbon catalyst is used. This may be carried out by a method using catalytic reduction or a method using an acetic acid solution of hydrobromic acid. When the protecting group for the α-carboxyl group of L-glutamic acid is a benzyl ester, catalytic reduction using a palladium-carbon catalyst may be used.

このようにして得られたアミド化合物〔１〕を反応液か
ら採取するには、先ず保護基の脱離化が酸分解による場
合には、中和し、接触還元による場合に！−を触媒を除
去した後、非親水性有機溶媒、例エバクロロホルム、ジ
クロロメタン、ジクロロエタン、酢酸エチル、酢酸ブチ
ル、メチルイソブチルケトン、ベンゼン、ジエチルエー
テルなど（Ｄ溶媒中、酸性水およびアルカリ性水で洗浄
した後、溶媒を留去することによ）採取できる。さらに
積層する必要がある場合には、適当な再結溶媒で再結晶
化するか、あるいはシリカゲル、活性アルミナ、吸着樹
脂などの吸着剤を用いるカラムクロマトグラフィーによ
り精製することができる。In order to collect the amide compound [1] thus obtained from the reaction solution, first, if the protecting group is removed by acid decomposition, it is neutralized, and if it is by catalytic reduction, it is first removed. - After removing the catalyst, evaporate into a non-hydrophilic organic solvent, e.g. chloroform, dichloromethane, dichloroethane, ethyl acetate, butyl acetate, methyl isobutyl ketone, benzene, diethyl ether, etc. (D solvent, wash with acidic water and alkaline water) After that, the solvent can be distilled off). If further stacking is required, it can be recrystallized with a suitable recrystallization solvent or purified by column chromatography using an adsorbent such as silica gel, activated alumina, or adsorption resin.

本アミド化合物〔１〕は必要に応じ、塩酸、硫酸、１７
− 硝酸、リン酸などの無機酸との塩、ギ酸、酢酸、プロピ
オン酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、シュウ酸などの
有機酸との塩を形成することができる。This amide compound [1] can be prepared using hydrochloric acid, sulfuric acid, 17
- Can form salts with inorganic acids such as nitric acid, phosphoric acid, and organic acids such as formic acid, acetic acid, propionic acid, malic acid, citric acid, tartaric acid, oxalic acid.

本発明におｈては、アミド化合物〔１〕は被検液中に存
在するＬＡＰまたはγ−ＧＴＰの作用によ多加水分解さ
れて、アミン〔２〕を形成するが、この遊離したアミン
〔２〕は、酸化酵素の作用によりカプラー〔３〕と酸化
縮合して発色化合物を形成する。上記で用いられるカプ
ラー〔３〕としては、酸化酵素の作用によシアミン〔２
〕と酸化縮合して５５０〜７５０　ｎｍに極大吸収を有
する発色化合物を形成するような芳香化合物であれば、
どのような化合物でもよ−が、これらのうち代表的な芳
香化合物としては、フェノール系化合物、アミノフェノ
ール系化合物、アニリン系化合物およびナフトール系化
合物が挙げられる。フェノール系化合物の例としては、
フェノール、サリチル酸、ｍ−ヒト四キシ安息香酸、ｐ
−ヒドロキシ安息香酸、２．６−ジヒドロキシ安息香酸
、サリチル酸メチル、１８− Ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、０
−エチルフェノール、常−エチルフェノール、２．３−
キシレノール、２．４−キシレノール、２．５−キシレ
ノール、３．５−キシレノール、２．６−キシレノール
、０−メトキシフェノール、ｍ−メトキシフェノール、
ｐ−メトキシフェノール、２．６−シメトキシフエノー
ル、０−クロロフェノール、ｍ−クロロフェノール、ｐ
−クロロフェノール、２．４−ジクロロフェノール、２
．６−ジクロロフェノール、０−ブロモフェノール、ｍ
−ブロモフェノール、ｐ−ブロモフェノール、２．４−
ジブロモフェノール、２．６−ジブロモフェノール、２
−メチル−６−１０ロフエノール、２−クロロ−５−メ
チルフェノール、０−カルボキシメチルフェノール、２
−ヒドロキシ−４−アミノエチルフェノールなどが挙げ
られ、アミノフェノール系化合物の例としては、４−ク
ロロ−２−アミノフェノール、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−
アミノフェノール、４−メチル−２−アミンフェノール
、５−ア＜　／−２−ヒドロキシ安息香酸、２−アミノ
−３−ヒドロキシ安息香酸、０−アミンフェノール、常
−アミンフェノール、ｐ−アミノフェノール、２．６−
ジクロロ−４−アミノフェノール、２．６−ジプロモー
４−アミノフェノールなどが挙げられ、アニリン系化合
物の例としては、アニリン、０−トルイジン、ｍ−トル
イジン、ｐ−）ルイジン、Ｎ−メチルアニリン、Ｎ−エ
チルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジ
エチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｏ　−）ルイジン
、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｐ−）ルイジン、Ｎ、Ｎ−ジエチ
ル−ｏ　−トルイジン、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイ
ジン、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｐ−トルイジン、ｏ−クロロ
アニリン、ｍ−クロロアニリン、ｍブロモアニリン、ア
ントラニル酸、３−アミノ安息香酸、ｐ−ジメチルアミ
ノ安息香酸、４−クロロ−ｏ−）　Ａ／イシン、３−ア
ミノ−４−メチル安息香酸、ｍ−７二二レンジアミン、
Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｍ−フェニレンジアミン、２−メチ
ル−惰−フェニレンジアミン、４−メチル−〇　−フェ
ニレンジアミン、４−メｆルー漢−フエニレンシアミン
、２−１０ロー倶−フェニレンジアミン、４−クロロ−
ｍ−フェニレンジアミン、３−クロロ−０−）ルイジン
、２−メトキシ−５−クロロアニリン、ｏ−エチルアニ
リン、２．５−ジェトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−
ヒドロキシエチルアニリン、Ｎ−、エチル−Ｎ−ヒドロ
キシエチル−情−トルイジンなどが挙げられ、ナフトー
ル系化合物の例としてはα−ナフトール、β−ナフトー
ル、１−ナフトール−２−カルボン酸、４−クロロ−１
−ナフトール、ｌ−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、■−
ナフトールー２−スルホン酸、１−ナフトール−３−ス
ルホン酸、１−ナフトール−４−スルホン酸、１−ナフ
トール−８−スルホン酸、２−ナフトール−６−スルホ
ン酸、２−ナフトール−７−スルホン酸、２−す７トー
ルー８−スルホン酸、２−ナフトール−３，６−ジスル
ホン酸、２−ナフトール−６，８−ジスルホン酸などが
挙げられる。In the present invention h, amide compound [1] is polyhydrolyzed by the action of LAP or γ-GTP present in the test solution to form amine [2], and this free amine [ 2] undergoes oxidative condensation with coupler [3] by the action of oxidase to form a color-forming compound. As the coupler [3] used above, cyamine [2] is produced by the action of oxidase.
] If it is an aromatic compound that forms a color-forming compound that has maximum absorption in the range of 550 to 750 nm by oxidative condensation with
Although any compound may be used, representative aromatic compounds include phenolic compounds, aminophenol compounds, aniline compounds, and naphthol compounds. Examples of phenolic compounds include:
Phenol, salicylic acid, m-human tetraxybenzoic acid, p
-Hydroxybenzoic acid, 2.6-dihydroxybenzoic acid, methyl salicylate, 18-O-cresol, m-cresol, p-cresol, 0
-Ethylphenol, ordinary-ethylphenol, 2.3-
xylenol, 2.4-xylenol, 2.5-xylenol, 3.5-xylenol, 2.6-xylenol, 0-methoxyphenol, m-methoxyphenol,
p-methoxyphenol, 2.6-simethoxyphenol, 0-chlorophenol, m-chlorophenol, p
-chlorophenol, 2,4-dichlorophenol, 2
．． 6-dichlorophenol, 0-bromophenol, m
-bromophenol, p-bromophenol, 2.4-
Dibromophenol, 2,6-dibromophenol, 2
-Methyl-6-10 lophenol, 2-chloro-5-methylphenol, 0-carboxymethylphenol, 2
Examples of aminophenol compounds include 4-chloro-2-aminophenol, N,N-diethyl-m-
Aminophenol, 4-methyl-2-aminephenol, 5-a</-2-hydroxybenzoic acid, 2-amino-3-hydroxybenzoic acid, 0-aminephenol, normal-aminephenol, p-aminophenol, 2 .6-
Examples of aniline compounds include dichloro-4-aminophenol, 2,6-dipromo-4-aminophenol, and examples of aniline compounds include aniline, 0-toluidine, m-toluidine, p-)luidine, N-methylaniline, and N-methylaniline. -ethylaniline, N,N-diethylaniline, N,N-diethylaniline, N,N-dimethyl-o-)luidine, N,N-dimethyl-p-)luidine, N,N-diethyl-o-toluidine, N,N-diethyl-m-toluidine, N,N-diethyl-p-toluidine, o-chloroaniline, m-chloroaniline, m-bromoaniline, anthranilic acid, 3-aminobenzoic acid, p-dimethylaminobenzoic acid, 4-chloro-o-) A/isine, 3-amino-4-methylbenzoic acid, m-7 22-diamine,
N,N-dimethyl-m-phenylenediamine, 2-methyl-phenylenediamine, 4-methyl-〇-phenylenediamine, 4-methyl-phenylenediamine, 2-10-phenylenediamine, 4-chloro-
m-phenylenediamine, 3-chloro-0-)luidine, 2-methoxy-5-chloroaniline, o-ethylaniline, 2.5-jethoxyaniline, N-ethyl-N-
Hydroxyethylaniline, N-, ethyl-N-hydroxyethyl-toluidine, etc. are mentioned, and examples of naphthol-based compounds include α-naphthol, β-naphthol, 1-naphthol-2-carboxylic acid, 4-chloro- 1
-Naphthol, l-hydroxy-2-naphthoic acid, ■-
Naphthol-2-sulfonic acid, 1-naphthol-3-sulfonic acid, 1-naphthol-4-sulfonic acid, 1-naphthol-8-sulfonic acid, 2-naphthol-6-sulfonic acid, 2-naphthol-7-sulfonic acid , 2-7thol-8-sulfonic acid, 2-naphthol-3,6-disulfonic acid, 2-naphthol-6,8-disulfonic acid, and the like.

上記の酸化酵素としては、酸素を消費して前記の遊離し
たアミン〔２〕と前記カプラー〔３〕とが酸化縮合して
発色化合物を形成させることのできる２１− 酸化酵素が用りられる。例えばアスコルビン酸オキシダ
ーゼ、ラッカーゼ、チロシナーゼ、アミノフェノールオ
キシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリフェノール
オキシダーゼなどが挙げられるが、カポチャ、キュウリ
、ハヤトウリなどから抽出、採取されるアスコルビン酸
オキシダーゼ（特開昭５６−８８７９３号）、ウルシや
担子菌Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　ｖｅｒａｉｃｏｌｏｒ、Ｒｈ
１ｚｏｐｕｓ属菌、Ｐｏ１ｙｐｏｒｕｓｖｅｒｓｉｃｏ
ｌｏｒのラッカーゼ［Ｊ、　Ｂｉｏｃｈａｍ、５０．２
６４（１９６１）　、Ｂｌｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、Ａｃｔａ、、７３　、　２０４　（１９６３）　、Ａ
ｃｔａ、Ｃｈｅｍ、５ｃａｎｄ、、　２１．２３６７　
（１９６７））などが使用される。As the above-mentioned oxidase, there is used a 21-oxidase which is capable of oxidative condensation of the above-mentioned liberated amine [2] and the above-mentioned coupler [3] by consuming oxygen to form a color-forming compound. Examples include ascorbic acid oxidase, laccase, tyrosinase, aminophenol oxidase, phenol oxidase, polyphenol oxidase, etc., including ascorbic acid oxidase extracted and collected from kapocha, cucumber, chayote, etc. and Basidiomycete Coriolus veraicolor, Rh
1zopus spp., Polyporus versico
lor laccase [J, Biocham, 50.2
64 (1961), Blochem, Biophys.
, Acta, , 73, 204 (1963), A
cta, Chem, 5cand,, 21.2367
(1967)) etc. are used.

次にＬＡＰまたはγ−ＧＴＰＯ酵素活性の測定にり騒で
更に詳しく説明する。ＬＡＰの酵素活性の測定を行うに
あたっては、先ずＬＡＰの合成基質であるＲ１がＬ−ロ
イシル基であるアミド化合物〔１〕またはその塩に被検
液中のＬＡＰを酵素反応させてアミン〔２〕を遊離させ
る。被検液としては血清を０．０１〜５−の範囲内で用
りられる。上記酵素反応は通常３７℃付近で５分以上反
応させ九２２− ばよい。この酵素の至適ｐＨは６．５〜８．０の範囲に
あるから、この範囲内で適宜ｐＨを設定すればよい。Next, the measurement of LAP or γ-GTPO enzyme activity will be explained in more detail. To measure the enzymatic activity of LAP, first, LAP in the test solution is enzymatically reacted with an amide compound [1] or its salt in which R1 is an L-leucyl group, which is a synthetic substrate of LAP, to form an amine [2]. release. As the test liquid, serum is used within the range of 0.01 to 5-5. The above enzymatic reaction is usually carried out at around 37°C for 5 minutes or more. Since the optimum pH of this enzyme is in the range of 6.5 to 8.0, the pH may be appropriately set within this range.

ＰＨを保持するための緩衝液としては、リン酸塩、ホウ
酸塩、パルビタール、炭酸塩、トリスヒドロキシメチル
アミノエタンなどの緩衝液が用いられる。ｒ−ＧＴＰの
酵素活性の測定を行うにあたっては、先ずγ−ＧＴＰＯ
合成基質であるＲ１がγ−Ｌ−グルタミル基であるアミ
ド化合物〔１〕またはその塩に被検液中のγ−ＧＴＰを
酵素反応させてアミン〔２〕を遊離させる。被検液とし
ては血清を０．０１〜５ｍ１３の範囲内で用いられる。As a buffer for maintaining pH, a buffer such as phosphate, borate, parbital, carbonate, trishydroxymethylaminoethane, etc. is used. To measure the enzymatic activity of r-GTP, first γ-GTPO
A synthetic substrate, an amide compound [1] in which R1 is a γ-L-glutamyl group, or a salt thereof is enzymatically reacted with γ-GTP in a test solution to liberate an amine [2]. As the test liquid, serum is used in an amount within the range of 0.01 to 5 m13.

上記酵素反応は通常３７℃付近で５分以上反応させれば
よい。The above enzymatic reaction may be carried out usually at around 37°C for 5 minutes or more.

この酵素の至適ｐＨは７．５〜９．０の範囲にあるから
、この範囲内で適宜ｐＨを設定すればよい。反応に際し
ては、受容体としてアミノ酸やペプチド例えばグリシル
グリシンの適当量を含むｐＨ７，５〜９．０の緩衝液中
で反応させ、試料中のγ−ＧＴＰ活性に比例して生存す
るアミン〔２〕を定量すればよい。ｐＨを保持するため
の緩衝液としては、リン酸塩、ホウ酸塩、バルビタール
、炭酸塩、トリエタノールアミン、グリシン、トリスヒ
ドロキシメチルアミノメタンなどの緩衝液が用いられる
。Since the optimum pH of this enzyme is in the range of 7.5 to 9.0, the pH may be appropriately set within this range. During the reaction, the reaction is carried out in a buffer solution of pH 7.5 to 9.0 containing an appropriate amount of an amino acid or peptide such as glycylglycine as a receptor, and the amine [2 ] can be quantified. As a buffer for maintaining pH, a buffer such as phosphate, borate, barbital, carbonate, triethanolamine, glycine, trishydroxymethylaminomethane, etc. is used.

生成したアミン〔２〕を定量するにあたっては、カプラ
ー〔３〕の共存下酸化酵素を作用させることにより、酸
化縮合して発色化合物を形成させるには、酸化酵素の至
適ｐＨ，通常ｐＨ６〜７　付近で酵素反応を行わせると
、発色反応は定量的に完結する。この場合、ＰＨＯ保持
のために使用できる緩衝液としては、リン酸塩、ホウ酸
塩、炭酸塩、酢酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメ
タンなどの緩衝液が用いられる。酵素反応は通常３７℃
付近で行われる。アミン〔２〕とカプラー〔３〕との酸
化縮合により生成する発色化合物はカプラー〔３〕の種
類により極大吸収波長が５５０〜７５０　ｎｍ　に巾広
く分布するが、通常は殆んど５７０〜７００ｎｍ付近に
極大吸収を有する青色系であ一す、呈色もきわめて高感
度で安定性もよく、マた温度による変動も殆んどなく、
生体試料中のビリルビンなどの夾雑物による影響も受け
にくいため、ＬＡＰやγ−ＧＴＰの酵素活性にきわめて
適している。When quantifying the generated amine [2], an oxidase is allowed to act in the presence of the coupler [3]. In order to form a color-forming compound through oxidative condensation, the optimum pH of the oxidase is usually pH 6 to 7. When an enzymatic reaction is performed nearby, the coloring reaction is quantitatively completed. In this case, buffers that can be used to retain PHO include phosphate, borate, carbonate, acetate, trishydroxymethylaminomethane, and the like. Enzyme reaction is usually at 37℃
It will be held nearby. The color-forming compound produced by the oxidative condensation of amine [2] and coupler [3] has a maximum absorption wavelength widely distributed in the range of 550 to 750 nm depending on the type of coupler [3], but it is usually around 570 to 700 nm. It has a blue color that has maximum absorption in
Since it is not easily affected by contaminants such as bilirubin in biological samples, it is extremely suitable for enzymatic activities of LAP and γ-GTP.

本発明においては、アミド化合物〔］〕のＬＡＰまたけ
γ−ＧＴＰによる酵素反応と、酸化酵素によるアミン〔
２〕とカプラー〔３〕の酸化縮合の酵素反応を同時に行
うことができる。その場合には、ＬＡＰまたはγ−ＧＴ
Ｐと酸化酵素の共通する至適ｐＨ内で行うのが有利であ
る。通常はｐＨ７，０付近で行われる。ＰＨを保持する
ための緩衝液としては、前述した緩衝液の中から適宜選
択して用いられる。In the present invention, an enzymatic reaction of an amide compound []] by γ-GTP across LAP and an amine reaction by an oxidase are carried out.
The enzymatic reaction of oxidative condensation of coupler [2] and coupler [3] can be carried out simultaneously. In that case, LAP or γ-GT
It is advantageous to carry out the reaction at a common optimum pH for P and the oxidase. It is usually carried out at a pH of around 7.0. The buffer for maintaining the pH is appropriately selected from the buffers mentioned above.

生成された発色化合物の定量にあたっては、その発色化
合物の特異的吸収波長による吸光度測定による比色定量
法により行うのが簡便である。その特異的吸収波長は、
形成される発色化合物の吸収波長を公知の手段により測
定した後、決定すればよく、通常５５０〜７７０　ｎｍ
　の範囲の特異的吸収波長をもって行う。It is convenient to quantify the produced color-forming compound by a colorimetric method by measuring absorbance at a specific absorption wavelength of the color-forming compound. Its specific absorption wavelength is
The absorption wavelength of the color-forming compound formed may be determined by measuring by known means, and is usually 550 to 770 nm.
with a specific absorption wavelength in the range of .

本発明においては、消費される酸素の量を定量すること
によ勺被検液中のＬＡＰまたはγ−ＧＴＰＯ酵素活性を
測定することができる。好ましくは酸素電極により測定
するのがよい。さらには、上２５− 記酸化酵素を公知の固定化法によ勺固定化した固定化酵
素と電極とを組み合せてなる酵素電極として使用するこ
とによって、よ）迅速かつ簡便に測定が可能とな〕、繰
シ返し測定に利用でき、自動分析装置に組み込んで測定
を行うことが可能となる。酸素電極で電気化学的変化と
して測定を行うことにより、高価な酵素の使用を著しく
少量にすることができる。これらの電極によって測定さ
れた値は、電気化学的変化として必要に応じて記録する
かまたは表示し、ＬＡＰ活性値やγ−ＧＴＰ活性値とし
て換算すればよ−。In the present invention, the LAP or γ-GTPO enzyme activity in the strawberry test liquid can be measured by quantifying the amount of oxygen consumed. It is preferable to measure using an oxygen electrode. Furthermore, by using an enzyme electrode consisting of an electrode and an immobilized enzyme obtained by immobilizing the oxidase described above by a known immobilization method, measurement can be performed quickly and easily. ], it can be used for repeated measurements and can be incorporated into an automatic analyzer to perform measurements. By performing the measurement as an electrochemical change with an oxygen electrode, the use of expensive enzymes can be significantly reduced. The values measured by these electrodes may be recorded or displayed as electrochemical changes as required, and converted into LAP activity values or γ-GTP activity values.

上記の通シ、本発明は各反応工程が簡単な之め、迅速か
つ正確にＬＡＰやγ−ＧＴＰＯ酵素活性値を測定するこ
とができる上に、生成する発色化合物が通常５５０〜７
５０　ｎｍ句近に極大吸収を有するため、生体試料中の
夾雑物による影響を受けにくい。そのため、本発明によ
るＬＡＰやγ−ＧＴＰの酵紫活性測定法はきわめて′Ｎ
度の高い方法である。In accordance with the above, each reaction step of the present invention is simple, so LAP and γ-GTPO enzyme activity values can be measured quickly and accurately.
Since it has maximum absorption near the 50 nm wavelength, it is less susceptible to contaminants in biological samples. Therefore, the method of measuring enzyme activity of LAP and γ-GTP according to the present invention is extremely
This is a sophisticated method.

また、本発明方法は、各反応工程が温和な酵素２６− 反応であす、シかも一段反応で簡便にＬＡＰやγ−ＧＴ
Ｐの酵素活性測定がなし得るものである上に、測定の自
動化が容易になし得るものであって、従来の化学的発色
法の二段反応では不可能であったレイト・アッセイを可
能にしたものである。In addition, in the method of the present invention, each reaction step is a mild enzymatic reaction, or a one-step reaction to easily produce LAP and γ-GT.
In addition to being able to measure the enzymatic activity of P, the measurement can be easily automated, making it possible to perform late assays that were not possible with conventional two-step reactions using chemical colorimetric methods. It is something.

次に参考例および実施例を挙げて本発明を具体的に説明
するが、これにより本発明を限定するものではない。Next, the present invention will be specifically explained with reference to reference examples and examples, but the present invention is not limited thereto.

なお、参考例中に記載の略号は次の意味を有する。In addition, the abbreviations described in the reference examples have the following meanings.

Ｌｅｕ　；　Ｌ−ロイシル ｒ−Ｇｌｕ　；　ｒ−Ｌ−グルタミル ＢＯＣ；ｔ−７”チルオキシカルボニルＯ８ｕ　；　Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステルＡｃＯＨ；酢酸 参考例Ｉ Ｌ−ロイシル−３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニ
リド・塩酸塩 ２．６−ジクロロ−４−アミノフェノール１．７８ｆｔ
（１０ミリモル）および炭酸水素ナトリウム０．９２ｙ
−（１５ミリモル）を水２５ｍ１に溶かし、これに０〜
５℃に冷却しつつＢ　ＯＣ−Ｌｅ　ｕ−Ｏ８ｕ　３．２
８Ｆ（１０ミリモル）のジオキサン（２５ｍｌ３　）溶
液を攪拌下部した。室温で一夜攪拌した後、３０℃以下
でジオキサンを減圧上留去した。残渣を酢酸エチル２０
０−に溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、Ｉ
Ｎ塩酸、飽和食塩水の順で各５０　ｍｅで３回づつ洗浄
した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した
後、減圧濃縮してＢＯＣ−Ｌ−ロイシル−３，５−ジク
ロロ−４−ヒドロキシアニリド２．９６Ｆを得た。次い
で、これを２Ｎ−ＨＣＪ３／ＡｃＯＨ１５ｍ１に溶かし
、室温で２時間攪拌した後、乾燥ジエチルエーテル１０
〇−を加えて結晶化し、乾燥エーテルで２回デカンテー
ションした。得られた結晶を減圧乾燥してＬ　−ロイシ
ル−３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド・塩酸
塩を得た。Leu; L-leucyl r-Glu; r-L-glutamyl BOC; t-7” thyloxycarbonyl O8u; N
-Hydroxysuccinimide ester AcOH; Acetic acid reference example I L-leucyl-3,5-dichloro-4-hydroxyanilide hydrochloride 2.6-dichloro-4-aminophenol 1.78ft
(10 mmol) and 0.92y of sodium bicarbonate
- (15 mmol) in 25 ml of water, add 0 to
While cooling to 5℃ B OC-Le u-O8u 3.2
A solution of 8F (10 mmol) in dioxane (25 ml3) was added to the bottom with stirring. After stirring at room temperature overnight, dioxane was distilled off under reduced pressure at a temperature below 30°C. The residue was dissolved in ethyl acetate 20
0-, saturated aqueous sodium bicarbonate solution, water, I
It was washed three times with 50 ml each of N-hydrochloric acid and saturated saline in that order. The ethyl acetate layer was dried over anhydrous magnesium sulfate and then concentrated under reduced pressure to obtain BOC-L-leucyl-3,5-dichloro-4-hydroxyanilide 2.96F. Next, this was dissolved in 15 ml of 2N-HCJ3/AcOH, stirred at room temperature for 2 hours, and then dissolved in 10 ml of dry diethyl ether.
The mixture was crystallized by adding 〇- and decanted twice with dry ether. The obtained crystals were dried under reduced pressure to obtain L-leucyl-3,5-dichloro-4-hydroxyanilide hydrochloride.

収　量　　１．８９Ｆ（収率８３．６％）分子式Ｃ１，
Ｉ（，６Ｎ、０２ＣＡ２＠　ｆ（（１融　点　；１２７
〜１３３℃（分解） シリカゲル薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）；Ｒｆ　＝
　０．６３　Ｃブタノール−酢酸−水（４：１：ｌ））
参考例２ Ｌ−ロイシル−３，５−シフクモ−４−ヒドロキシアニ
リド・塩酸塩 ２．６−ジプロモー４−アミンフェノール４．９０Ｆ−
（＋８．８　ミＩＪモル）および炭酸水素ナトリウム１
．１’１８ｙ−（２０ミリモル）を水７０　ｍｇに溶か
し、これに０〜５℃に冷却しっ”）ＢＯＣ−Ｌｅｕ−Ｏ
８ｕ６．０１　ｙ（１８，３ミリモル）のジオキサン（
７０ｍ１）溶液を攪拌上滴下した。室温で一夜攪拌した
後、３０℃以下でジオキサンを減圧上留去した。残渣を
酢酸エチル４００ｍＡに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウ
ム水溶液、水、ＩＮ塩酸、飽）日食塩水の１１＠で各１
００−で３回づつ洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸マ
グネシウムで乾燥した後、減圧濃縮してＢＯＣ−Ｌ−ロ
イシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド５
．８ｙ−を得た。次りでこれを２Ｎ　−ＨＣ８ＡｃＯＨ
３０ｍｌに溶がし、室温で２時間攪拌した鎌、乾燥エー
テルを訓えて結晶化させて２９− Ｌ−ロイシル３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリ
ド中塩酸塩を得た。Yield 1.89F (yield 83.6%) Molecular formula C1,
I(,6N,02CA2@f((1 melting point; 127
~133°C (decomposition) Silica gel thin layer chromatography (TLC); Rf =
0.63 C butanol-acetic acid-water (4:1:l))
Reference example 2 L-leucyl-3,5-sifukumo-4-hydroxyanilide hydrochloride 2,6-dipromo 4-aminephenol 4.90F-
(+8.8 miIJ mole) and sodium bicarbonate 1
．． Dissolve 1'18y- (20 mmol) in 70 mg of water and cool to 0 to 5°C.
8u6.01y (18.3 mmol) of dioxane (
70 ml of the solution was added dropwise while stirring. After stirring at room temperature overnight, dioxane was distilled off under reduced pressure at a temperature below 30°C. The residue was dissolved in 400 mA of ethyl acetate, and diluted with saturated aqueous sodium bicarbonate solution, water, IN hydrochloric acid, and saturated saline (11@) each.
Washed three times with 00-. After drying the ethyl acetate layer over anhydrous magnesium sulfate, it was concentrated under reduced pressure to obtain BOC-L-leucyl-3,5-dibromo-4-hydroxyanilide 5.
．． 8y- was obtained. Next, add this to 2N -HC8AcOH
The solution was dissolved in 30 ml and stirred at room temperature for 2 hours, and then crystallized using dry ether to obtain 29-L-leucyl 3,5-dibromo-4-hydroxyanilide hydrochloride.

収　量　２．５０５’（収率４９．７％）分子式　Ｃ１
，Ｈ，６Ｎ２０．Ｂｒ２（４１６、５４）シリカゲル薄
層クロマトグラフィ　（ＴＬＣ）；Ｒｆ　＝　０．６５
（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：１） 融　点；　１３１〜１３４℃（分解） 参考例３ γ−Ｌ−グルタミルー３，５−ジクｐロー４−ヒドロキ
シアニリド Ｎ、Ｎ−フタロイル−Ｌ−グルタミル酸無水物５．１６
Ｆ　（２０ミリモル）および４−アミノ−２，６−シク
ロロフエノール３．５６Ｆ（２０ミリモル）をジオキサ
ン５０−に溶かし、６０℃で２時間攪拌した。ジオキサ
ンを減圧上留去し、残渣にヒドラジン・ヒトラード１．
５−のメタノール（５０ｍ＠溶液全溶液、室温で２日間
放置した。メタノールを減圧上留去し、残渣に水を加え
た後、０．５Ｎ　−ＨＣｌ３でｐＨ３に調節して析出し
たγ−Ｌ−グルタ３０− ミル−３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド３．
９６　Ｆを得た。Yield 2.505' (yield 49.7%) Molecular formula C1
,H,6N20. Br2(416,54) silica gel thin layer chromatography (TLC); Rf = 0.65
(n-butanol:acetic acid:water=4:1:1) Melting point: 131-134°C (decomposition) Reference example 3 γ-L-glutamyl-3,5-dichloro-4-hydroxyanilide N,N-phthaloyl- L-glutamic anhydride 5.16
F (20 mmol) and 4-amino-2,6-cyclophenol 3.56F (20 mmol) were dissolved in dioxane 50- and stirred at 60°C for 2 hours. Dioxane was distilled off under reduced pressure, and 1.hydrazine/Hitler was added to the residue.
5-methanol (50 m @ total solution, left at room temperature for 2 days. Methanol was distilled off under reduced pressure, water was added to the residue, and the pH was adjusted to 3 with 0.5N HCl3 to precipitate γ-L. -Gluta 30- Mil-3,5-dichloro-4-hydroxyanilide 3.
96F was obtained.

収　量　　３．Ｑ６ｙ（収率７２．９チ）分子式　　Ｃ
Ｉ　ｌ　Ｈ１□Ｎ２０．Ｃ１０融　点　；２１４〜２１
７℃（分解） シリカゲルＴＩ、Ｃ；　Ｒ／＝０．４９　（ブタノール
：酢酸：水−４：　１　：　］） 参考例４ ｒ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキ
シアニリド Ｎ、Ｎ−７タロイルーＬ−グルタミン酸無水物２．１８
Ｆ　（８，４ミリモル）および４−アミノ−２，６−ジ
クロロフェノール２．２６１（８，４ミリモル）をジオ
キサン２０−に溶かし、６０℃で１．５時間攪拌した。Yield 3. Q6y (yield 72.9cm) Molecular formula C
I l H1□N20. C10 melting point; 214-21
7°C (decomposition) Silica gel TI, C; R/=0.49 (butanol:acetic acid:water-4:1: ]) Reference example 4 r-L-glutamyl-3,5-dibromo-4-hydroxyanilide N, N-7 talloyuru L-glutamic anhydride 2.18
F (8.4 mmol) and 2.261 (8.4 mmol) of 4-amino-2,6-dichlorophenol were dissolved in dioxane 20- and stirred at 60° C. for 1.5 hours.

ジオキサンを減圧上留去し、残渣にヒドラジン−ヒトラ
ード０．７ｍ！３のメタノール（２０ｍｌ）溶液を加え
、室温で２日間放置した。Dioxane was distilled off under reduced pressure, and the residue contained 0.7 m of hydrazine-Hittlede! A methanol (20 ml) solution of No. 3 was added, and the mixture was left at room temperature for 2 days.

メタノールを減圧上留去し、残渣に水を加えた後、０．
５　Ｎ−ＨＣＡでｐＨ３に調節して析出したγ−Ｌ−グ
ルタミルー３．５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド
２．１３５’を得た。After distilling off methanol under reduced pressure and adding water to the residue, 0.
The pH was adjusted to 3 with 5 N-HCA to obtain 2.135' of precipitated γ-L-glutamyl-3.5-dibromo-4-hydroxyanilide.

収　量　　２．１３Ｆ（収率６４．０饅）分子式　　Ｃ
，□Ｈ１，Ｎ２０．Ｂｒ。Yield: 2.13F (yield: 64.0) Molecular formula: C
, □H1, N20. Br.

融　点　　；　１９１〜１９４℃（分解）シリカゲルＴ
ＬＣ；　Ｒｆ　＝　０．５３　（ブタノール：酢酸：水
＝４：１：１） 実Ｍ例Ｉ　　　Ｌ−ロイシル−４−Ｎ、Ｎ−ジエチルア
ミノアニリド、１−ナフトール−２ −スルホン酸、ラッカーゼを用いる ＬＡＰ活性測定 り一ロイシルー４−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノアニリド會
二塩酸塩２ｍＭ５およびカプラーとして１−ナフトール
−２−スルホン酸カリウム塩０．５ｆｎＭを含有する０
、１Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を調製して基質溶
液とした。この基質溶液２．０−に、ポリポラス・ベル
シタ２−由来のラッカーゼ含有液１００　ｔｔＪ３　（
３３ＱＵ）および血清（ＬＡＰ活性；８７９Ｇ−、Ｒ単
位／ｍ１３　）　５　（１、−を加えて３７℃で反応さ
せて色素を形成させた（この形成色素の各波長における
吸収曲線は第１図に示す通）であり、その極大吸収波長
ｔｉ　６５５　ｎｍ付近であった。）。Melting point: 191-194℃ (decomposition) Silica gel T
LC; Rf = 0.53 (butanol:acetic acid:water=4:1:1) Practical Example I L-leucyl-4-N,N-diethylaminoanilide, 1-naphthol-2-sulfonic acid, LAP with laccase Activity measurements were carried out using a 0.0-100-hCl solution containing 2 mM of leucyl 4-N,N-diethylaminoanilide dihydrochloride and 0.5 nM of 1-naphthol-2-sulfonic acid potassium salt as a coupler.
, 1M! A J acid buffer (pH 7.0) was prepared and used as a substrate solution. To this substrate solution 2.0-, 100 ttJ3 (
33QU) and serum (LAP activity; 879G-, R units/m13) 5 (1,-) were added and reacted at 37°C to form a dye (the absorption curve of the formed dye at each wavelength is shown in Figure 1). (as shown), and its maximum absorption wavelength was around 655 nm).

この反応において、各反応時間ごとに、発色するこの色
素を連続的に波長６５５　ｎｍにて吸光度を測定した。In this reaction, the absorbance of this colored dye was continuously measured at a wavelength of 655 nm at each reaction time.

その結果を第２図に示した。The results are shown in Figure 2.

また同様に４１４Ｇ−Ｒ単位／ｒｎ１３を有する血清を
用いて行なった結果を第３図に示した。Similarly, the results using serum containing 414 G-R units/rn13 are shown in FIG.

この第２因および第３図に示す通り、本発明の測定法は
、血清ＬＡＰ活性を正確に測定し得るもので、さらに従
来の化学発色法と異なってＬＡＰの作用が始まると同時
に反応液が呈色してくるものでレイトアッセイが行なえ
る特色を有゛しているものであった。As shown in the second factor and FIG. 3, the measurement method of the present invention can accurately measure serum LAP activity, and unlike the conventional chemical coloring method, the reaction solution is released at the same time as the action of LAP begins. It developed a color and had the characteristic of being able to be used in late assays.

実ＭＮ２　　　Ｌ−ロイシル−４−Ｎ、Ｎ−ジエチルア
ミノアニリド、フェノール、ラッカ ーゼを周込るＬＡＰ活性測定 り一ロイシルー４−Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリド・二塩酸
塩２　ｍＭおよびカプラーとしてフェノール１ｍＭ　を
含有する０、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を調製し
て基質溶液とし友。この基質溶液２−にラッカーゼ含有
液１００　Ｌｅ　（３３０Ｕ）ｔｓ　ヨび血清３３− ５０μｌ３（ＬＡＰ活性；８７９Ｇ’−Ｒ単位Ｚ祷を加
えて３７℃で反応させて色素を形成せしめた。Actual MN2 L-leucyl-4-N, N-diethylaminoanilide, phenol, LAP activity measurement involving laccase - Contains leucyl-4-N, N-diethylanilide dihydrochloride 2 mM and phenol 1 mM as a coupler. Prepare 0.1M phosphate buffer (pH 7.0) and use it as the substrate solution. A laccase-containing solution 100 Le (330 U) and 50 µl of serum 33 (LAP activity; 879 G'-R units) was added to this substrate solution 2 and reacted at 37°C to form a dye.

この反応において、各反応、時間ごとに発色する色素（
極大吸収波長６７０　ｎｍ付近）を連続的に波長６７０
　ｎｍにて吸光度を測定した。その結果は、第４図に示
す通リアあった。In this reaction, the dye (
(maximum absorption wavelength around 670 nm) continuously at wavelength 670 nm
Absorbance was measured at nm. The results were as shown in Figure 4.

この第４図に示す通り、本発明の測定法は血清ＬＡＰ活
性を簡便かつ正確に測定できるもので、かつＬＡＰの作
用が始まると同時に反応液が呈色してくるためレイトア
ッセイが行なえる特色を有したものであった。As shown in Fig. 4, the measurement method of the present invention allows serum LAP activity to be measured simply and accurately, and the reaction solution changes color as soon as the action of LAP begins, making it possible to perform a late assay. It had a

な寂、上記と同様に行なって生成した色素の各波長に対
する吸収面Ｓけ第５図に示す通シで、その極大吸収波長
域が６７０　ｎｍ付近であった。The absorption surface S for each wavelength of the dye produced in the same manner as above is shown in Figure 5, and the maximum absorption wavelength range was around 670 nm.

実施例３　　Ｌ−ロイシル−４−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミ
ノアニリド、カプラー（２，３−ジメチルフェノール、
２，４−ジメチルフェノール、２，５−ジメチルフェノ
ール、２．６−ジメチルフェノール）、ラッカーゼを周
込、るＬＡＰ活性測定 −３４＝ 実施例１の１−ナフトール−２−スルホン酸の代、りに
カプラーとしてそれぞれ２，３−ジメチルフェノール、
２，４−ジメチルフェノール、２．５−ジメチルフェノ
ール、２，６−ジメチルフェノールを用いて、Ｌ−ロイ
シル−４−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノアニリド・二塩酸塩
２　ｍＭおよびカプラー０．５？ｙＩＭを含有する０、
１Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０を調製して基質溶液と
した。この基質溶液２−にラッカーゼ溶液１００μＡ（
３３０Ｕ）および血清５０紹（ＬＡＰ活性；８７９Ｇ−
Ｒ単位／ｍｅ）を加えて３７℃にて反応させた。各反応
１０分後に発色する色素を、その色素の極大吸収波長に
よって吸光度を測定した。その結果は第１表に示す通り
であった。Example 3 L-leucyl-4-N, N-diethylaminoanilide, coupler (2,3-dimethylphenol,
Measurement of LAP activity involving laccase (2,4-dimethylphenol, 2,5-dimethylphenol, 2,6-dimethylphenol) and laccase-34= Instead of 1-naphthol-2-sulfonic acid in Example 1, and 2,3-dimethylphenol as couplers, respectively.
Using 2,4-dimethylphenol, 2,5-dimethylphenol, and 2,6-dimethylphenol, L-leucyl-4-N,N-diethylaminoanilide dihydrochloride 2 mM and coupler 0.5? 0 containing yIM,
1M! J acid buffer (pH 7.0 was prepared and used as a substrate solution. To this substrate solution 2-100 μA of laccase solution (
330U) and serum 50sho (LAP activity; 879G-
R units/me) was added and the reaction was carried out at 37°C. The absorbance of the dye that developed color after 10 minutes of each reaction was measured based on the maximum absorption wavelength of the dye. The results were as shown in Table 1.

実ｍ例４　　　Ｌ−ロイシル−４−Ｎ、Ｎ　−ジエチル
アミノアニリン、カプラー（１−ナンド−ルー２−スル
ホン酸、フェノール、２．３−Ｘ）メチルフェノール、
２．４−ジメチルフェノール、２．５−ジメチルフェノ
ール、２，６−ジメチルフェノール）、アスコルビン酸
オキシダーゼを用いるＬＡＰ活性測定 り一ロイシルー４−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノアニリン・
二塩酸塩２ｍＭ５および０．５ｍＭのカプラー（カプラ
ーとして、１−ナフトール−２−スルホン酸カリウム塩
、フェノール、２，３−ジメチルフェノール、２，４−
ジメチルフェノール、２，５−ジメチルフェノール、２
，６−ジメチルフェノールを各々使用）を含有する０、
１Ｍ’Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を基質溶液とし、こ
の２．０ｍｌに、ノ１ヤトウリ由来のアスコルビン酸オ
キシダーゼ含有ｆｆ　１００１Ｌｅ（１３０Ｕ）および
血清５０μ石（ＬＡＰ活、性；８７９Ｇ−Ｒ単位／−）
を加えて３７℃で反応させた。Example 4 L-leucyl-4-N, N-diethylaminoaniline, coupler (1-nando-2-sulfonic acid, phenol, 2.3-X) methylphenol,
(2,4-dimethylphenol, 2,5-dimethylphenol, 2,6-dimethylphenol), LAP activity measurement using ascorbic acid oxidase, leucyl-4-N,N-diethylaminoaniline,
dihydrochloride 2mM5 and 0.5mM coupler (as couplers 1-naphthol-2-sulfonic acid potassium salt, phenol, 2,3-dimethylphenol, 2,4-
Dimethylphenol, 2,5-dimethylphenol, 2
, 6-dimethylphenol) containing 0,
1 M'J acid buffer (pH 7.0) was used as the substrate solution, and 2.0 ml of this was added with ff 1001Le (130 U) containing ascorbate oxidase derived from Gyote gourd and 50 μl of serum (LAP activity, sex; 879G-R). Unit/-)
was added and reacted at 37°C.

各反応１０分後に発色する色素を、その色素の極大吸収
波長によって吸光度を測定した。その結果は第２表に示
す通ってあった。The absorbance of the dye that developed color after 10 minutes of each reaction was measured based on the maximum absorption wavelength of the dye. The results were as shown in Table 2.

実施例５　　Ｌ−ロイシル−４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミ
ノアニリド、ｌ−ナフトール−２ −スルホン酸、ラッカーゼを用いる ＬＡＰ活性測定 実ｍ　例１のＬ−ロイシル−４−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミ
ノアニリドの二塩酸塩の代りにＬ−ロイシル−４−Ｎ、
Ｎ−ジメチルアミノアニリド・二塩酸塩を同一濃度用い
、かつ血清としてＬＡＰ活性８７９Ｇ−Ｒ単位を用いて
、以下実施例１と同様に行な３７一 つた。Example 5 LAP activity measurement using L-leucyl-4-N,N-dimethylaminoanilide, l-naphthol-2-sulfonic acid, and laccase. L-leucyl-4-N instead of dihydrochloride,
The same procedure as in Example 1 was carried out using the same concentration of N-dimethylaminoanilide dihydrochloride and 879 G-R units of LAP activity as the serum.

その結果形成された色素の極大吸収波長域け６５０　ｎ
ｍ付近であ）、この６５０　ｎｍの吸収波長に基−て、
反応時間に対する吸光度を測定したもので、その結果を
第６図に示した。The maximum absorption wavelength range of the dye formed as a result is 650 nm.
m), and based on this absorption wavelength of 650 nm,
The absorbance was measured against reaction time, and the results are shown in FIG.

第６図に示す通り、本発明の測定法は良好ＫＬＡＰ活性
の測定をできるものであった。As shown in FIG. 6, the assay method of the present invention was able to successfully measure KLAP activity.

実施例６Ｌ−四イシルー４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノア
ニリド、フェノール、ラッカーゼを用いるＬＡＰ活性測
定 実施例２のＬ−ロイシル−４−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノ
アニリド・二塩酸塩の代シにｌ、　−ｏイシル−４−Ｎ
、Ｎ−ジメチルアミノアニリド・二塩酸塩を同一濃度を
用いて、以下実施例２と同様に行なった。Example 6 Measurement of LAP activity using L-leucyl-4-N,N-dimethylaminoanilide, phenol, and laccase In place of L-leucyl-4-N,N-diethylaminoanilide dihydrochloride in Example 2, l, -oisyl-4-N
, N-dimethylaminoanilide dihydrochloride were used at the same concentrations, and the same procedure as in Example 2 was carried out.

その結果形成された色素の極大吸収波長域は６５５　ｎ
ｍ付近であり、この６５５　ｎｍの吸収波長に基いて反
応時間に対する吸収度を測定した結果を第７図に示した
。第７図に示す通）、本発明の測定法はＬＡＰ活性を良
好に測定できるものであ３８− つた。The maximum absorption wavelength range of the dye formed as a result is 655 nm.
Figure 7 shows the results of measuring the absorbance versus reaction time based on this absorption wavelength of 655 nm. As shown in FIG. 7), the assay method of the present invention was able to satisfactorily measure LAP activity.

実ｍ例７　　　Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４＝
ヒドロキシアニリド、１−ナフトー ル−２−スルホン酸、アスコルビン酸 オキシダーゼを用するＬＡＰ活性測定 り一ロイシルーａ、ｓ−シフロモ−４−ヒドロキシアニ
リド・塩酸塩２ｍＭおよび１−ナフトール−２−スルホ
ン酸カリウム塩０　、５ｍＭを含有する０、１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）を調製して基質溶液とした。この
基質溶液２−にアスコルビン酸オキシダーゼ（１３０Ｕ
）およびアリルアミダーゼ（ベーリンガー社製；１００
ＯＧ−Ｒ単位／ｌｎ　４３　）を含有する溶液２　Ｏｎ
を加えて３７℃で反応させた。またこの反応時間ごとに
、反応によって発色する色素を６３０　ｎｍの波長にて
吸光度を測定した。その結果を第８図に示した。この第
８図に示す通り、本発明の担１ｊ定法は、ＬＡＰ活性を
良好に測定することができ、しかも反応液の呈色がＬＡ
Ｐの反応が始まると同時に生ずるためにレイトアッセイ
が行なえる特色を有するものであった。Example 7 L-leucyl-3,5-dibromo-4=
Hydroxyanilide, 1-naphthol-2-sulfonic acid, LAP activity measurement using ascorbic acid oxidase - leucyl a, s-sifuromo-4-hydroxyanilide hydrochloride 2mM and 1-naphthol-2-sulfonic acid potassium salt 0 , 0.1M phosphate buffer (pH 7.0) containing 5mM was prepared and used as a substrate solution. Ascorbic acid oxidase (130U) was added to this substrate solution 2-.
) and allylamidase (Boehringer; 100
Solution 2 On containing OG-R units/ln 43)
was added and reacted at 37°C. Further, at each reaction time, the absorbance of the dye that was colored by the reaction was measured at a wavelength of 630 nm. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 8, the carrier 1j method of the present invention can satisfactorily measure LAP activity, and the coloration of the reaction solution is similar to that of LA.
It has the feature that a late assay can be performed because the P reaction occurs at the same time as it starts.

なお、上記と同様に行なって生成した色素の各波長に対
する吸収曲線は第９図に示す通シである。The absorption curve for each wavelength of the dye produced in the same manner as above is shown in FIG.

実ｍ例ｓ’　　ｉ、−ロイシル−３，５−ジブロモ−４
−ヒドロキシアニリド、１〜ナフトー ル−２−スルホン酸、アスコルビン酸 オキシダーゼまたはラッカーゼを用い るＬＡＰ活性測定 実施例７と同様にして調整した基質溶液１．Ｏｍｌを酸
素電極を備えた反応セル（内容−！！：　１　ｍ１３）
に加え、３７℃に予加温した。次いでこれにアスコルビ
ン酸オキシダーゼ（３５０Ｕ）およびアリルアミダーゼ
（１００ＯＧ−Ｒ単位／犠石）を含有する溶液１００μ
２を加えて３７℃にて反応せしめ、その反応時間におけ
る酸素の消費のｉ′を酸素電極にて定量した。その結果
は第１０図に示す通シで、酸素電極によって良好に測定
できるものであった。Example s' i, -leucyl-3,5-dibromo-4
- Measurement of LAP activity using hydroxyanilide, 1-naphthol-2-sulfonic acid, ascorbic acid oxidase or laccase Substrate solution prepared in the same manner as in Example 7 1. Reaction cell with Oml oxygen electrode (Contents-!!: 1 m13)
and prewarmed to 37°C. This was then added with 100μ of a solution containing ascorbic acid oxidase (350U) and allylamidase (100OG-R units/sacrificial stone).
2 was added and reacted at 37°C, and the consumption of oxygen i' during the reaction time was determined using an oxygen electrode. The results were as shown in FIG. 10, and could be well measured using an oxygen electrode.

また上記のアスコルビン酸オキシダーゼの代りにラツセ
ーゼ（２５ｏＵ）ｅ用いて、以下同様に行なった結果は
Ｍ１１図に示す通夛でおり、良好に測定できるものであ
った。In addition, the same procedure was carried out using Lacase (25oU) e instead of ascorbic acid oxidase, and the results were the same as shown in Fig. M11, indicating that the measurement could be performed satisfactorily.

１１を例９　　　Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４
−ヒドロキシアニリド、カプラー（フ ェノール、２．５−ジメチルフェノール）、ラッカーゼ
を用いるＬＡＰ活性測定 実櫂例７の１−ナフトール−２−スルホン酸の代りにカ
プラーとして各々フェノール、２，５−ジメチルフェノ
ール（０、５ｍＭ）を用いて基質溶液を調製した。次い
でこの基質溶液２ｍＡにラッカーゼ（３３０Ｕ）および
アリルアミダーゼ（１００ＯＧ−Ｒ単位／ｍＡ）を含有
する溶液２０〃Ｊを加えて３７℃で１０分間反応せしめ
た。反応終了後、各々の形成色素の有する極大吸収波長
域に基いて反応によって発色する色素の吸光度を測定し
た。その結果は第３表に示す通りであった。Example 9 L-leucyl-3,5-dibromo-4
- Measurement of LAP activity using hydroxyanilide, coupler (phenol, 2,5-dimethylphenol), and laccase In place of 1-naphthol-2-sulfonic acid in Example 7, phenol and 2,5-dimethylphenol ( A substrate solution was prepared using 0.5mM). Next, 20 J of a solution containing laccase (330 U) and allylamidase (100 OG-R units/mA) was added to 2 mA of this substrate solution, and the mixture was reacted at 37°C for 10 minutes. After the reaction was completed, the absorbance of the dyes produced by the reaction was measured based on the maximum absorption wavelength range of each dye formed. The results were as shown in Table 3.

４１一 実施例１０　　Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−
ヒドロキシアニリド、フェノール、 チロシナーゼを用いるＬＡＰ活性測定 Ｌ−ｏインルー３．５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニ
リド・塩酸塩２．５城、フェノール０．５ｍＭを含有す
る０、１　Ｍ　！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）の基質溶
液を調製し、その２ｔｒＬ８に、チロシナーゼ溶液１０
０μａ（ａｏｏＵ）およびアリルアミダーゼ（１００Ｏ
Ｇ−Ｒ単位／ｍ−ｅ）　２０　ｔｄ３を加えて３７℃、
１０分間反応させた。41-Example 10 L-leucyl-3,5-dibromo-4-
LAP activity measurement using hydroxyanilide, phenol, and tyrosinase Loin-3,5-dibromo-4-hydroxyanilide hydrochloride 2.5%, 0.1M containing phenol 0.5mM! Prepare a substrate solution of J acid buffer (pH 7,0), and add 10% of tyrosinase solution to 2trL8.
0μa (aooU) and allylamidase (100O
G-R units/m-e) Add 20 td3 and heat to 37°C.
The reaction was allowed to proceed for 10 minutes.

次りで反応終了後反応によって形成された色素の吸収波
長（極大吸収波長域６１０ｎｍ付近）６１０ｎｍによっ
て吸収度を測定した結果、吸光度はＯＤ６ｍ。＝０．１
５８であシ、良好にＬＡＰ活性を測定できたものである
。Next, after the reaction was completed, the absorbance of the dye formed by the reaction was measured at 610 nm (maximum absorption wavelength range around 610 nm), and the absorbance was OD6m. =0.1
58, LAP activity could be measured satisfactorily.

実施例１１　　Ｌ−ロイシル−２−メチル−４−アミノ
アニリド、１−ナフトール−２− スルホン酸、ラッカーゼを用いるＬＡ Ｐ活性測定 り一ロイシルー２−メチルー４−アきノアニリ４２− ド・二塩酸塩２ｔｙＭおよび１−ナフトール−２−スル
ホン酸カリウム塩０．５ｍＭを含有する０、１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）　を調製して基質溶液とした。Example 11 Measurement of LAP activity using L-leucyl-2-methyl-4-aminoanilide, 1-naphthol-2-sulfonic acid, and laccase. A 0.1M phosphate buffer (pH 7.0) containing 2tyM and 0.5mM of 1-naphthol-2-sulfonic acid potassium salt was prepared and used as a substrate solution.

この基質溶液２ｍｌに、ラッカーゼ溶液１００　ｔｔ、
ｅ（３３０Ｕ）およびアリルアミダーゼ溶液５０ｔｔ（
３（１００ＯＧ−Ｒ単位Ａ礒）を加えて３７℃、３０分
間反応させた。反応終了後、反応によって形成された色
素の極大吸収波長域（５６５ｎｍ付近）の波長５６５　
ｎｍに基いて、その発色した色素の吸光度を測定した。To 2 ml of this substrate solution, add 100 tt of laccase solution,
e (330U) and allylamidase solution 50tt (
3 (100 OG-R unit A) was added and reacted at 37°C for 30 minutes. After the reaction, the wavelength 565 of the maximum absorption wavelength range (near 565 nm) of the dye formed by the reaction
The absorbance of the colored dye was measured based on nm.

その結果、吸光度は０Ｄ５６１ｉ””０．１４３であっ
た。As a result, the absorbance was 0D561i""0.143.

実施例１２　　Ｌ−ロイシル−４−アミノアニリド、１
−ナフトール−２−スルホン酸、ラ ッカーゼ　シダーゼを用いるＬＡＰ活 性測定 り一ロイシルー４−アミノアニリド・二塩酸塩２．５ｍ
Ｍおよび、１−ナフトール−２−スルホン酸カリウム塩
０　、５　ｍＭを含有する０、１　Ｍリン酸緩衝液を調
製して基質溶液とした。この基質溶液２ｍｌに、ラッカ
ー−に’溶液１００　ｄ　（３３０Ｕ）　オヨびアリル
アミダーゼ溶液５０μ、６　（１０００Ｇ−Ｒ単位／−
を加えて３７℃で３０分間反応させた。反応終了後反応
によって形成された色素（極大吸収波長域５７　Ｏｎｍ
付近）の吸収波長５７０ｎｍに基いて発色した色素によ
る吸光度を測定した結果、吸光度はＯＤ、７゜＝　０．
１０８であった。Example 12 L-leucyl-4-aminoanilide, 1
- Naphthol-2-sulfonic acid, laccase LAP activity measurement using sidase - Leucyl-4-aminoanilide dihydrochloride 2.5m
A 0.1 M phosphate buffer solution containing 0.5 mM of M and 1-naphthol-2-sulfonic acid potassium salt was prepared and used as a substrate solution. To 2 ml of this substrate solution, add 100 d (330 U) of lacquer solution, 50 μ of allyl amidase solution, 6 (1000 G-R units/-
was added and reacted at 37°C for 30 minutes. After the reaction is completed, the dye formed by the reaction (maximum absorption wavelength range 57 Onm
As a result of measuring the absorbance of the colored pigment based on the absorption wavelength of 570 nm (around 570 nm), the absorbance was OD, 7° = 0.
It was 108.

実施例１３　　Ｌ−ロイシル−４−Ｎ、Ｎ−シクロピル
アミノアニリド、１−ナフトール− ２−スルホン酸、ラッカーゼを用いる ＬＡＰ活性測定 り一ロイシル−４−Ｎ、Ｎ−シクロピルアミノアニリド
・二塩酸塩２ｍＭおよび１−ナフトール−２−スルホン
酸カリウム塩Ｑ　、　５ｍＭ　′（ｉ−含有する０、１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を調製して基質溶液とし
た。この基質溶液２−にラッカーゼ溶液１００μ６（３
３０Ｕ）訃よびアリルアミダーゼが溶液５０１ｔＥ　（
１００ＯＧ−Ｒ単位／ｍ２）を加えて３７℃、１０分間
反応せしめた。反応終了後、反応によって形成した色素
（極大吸収波長域６５０　ｎｍ付近）の６５０　ｎｍの
吸収波長に基いて吸光度を測定した結果、その反応液の
吸光度はＯＤ６．。＝　０．４３０であった。Example 13 Measurement of LAP activity using L-leucyl-4-N, N-cyclopyraminoanilide, 1-naphthol-2-sulfonic acid, and laccase Leucyl-4-N, N-cyclopyraminoanilide dihydrochloric acid salt 2mM and 1-naphthol-2-sulfonic acid potassium salt Q, 5mM' (i-containing 0,1
M phosphate buffer (pH 7.0) was prepared and used as a substrate solution. To this substrate solution 2-100 μ6 of laccase solution (3
30U) Allylamide and allylamidase are in solution 501tE (
100 OG-R units/m2) was added and reacted at 37°C for 10 minutes. After the reaction was completed, the absorbance was measured based on the absorption wavelength of 650 nm of the dye formed by the reaction (maximum absorption wavelength range around 650 nm). As a result, the absorbance of the reaction solution was OD6. . = 0.430.

実施例１．４Ｌ−ロイシル−３，５−ジクロロ−４−ヒ
ドロキシアニリド、１−ナフトー ル−２−スルホン酸マタはフェノール、ラッカーゼを用
−るＬＡＰ活性測定 し一ロイシルー３．５−　シクロロー４−ヒドロキシア
ニリド・塩酸塩２ｍＭおよび１−ナフトール−２−スル
ホン酸カリウム塩０．５ｍＭを含有する０、１　Ｍ　！
Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を調製して基質溶液とした
。この基質溶液２ｍβにラッカーゼ溶液１００μ＃　（
３３０Ｕ）およびアリルアミダーゼ溶液２０　ａ８　（
１０００Ｇ−Ｒ単位／ｍ１）を加えて１ｏ分間反応せし
めた。反応終了後は反応によって発色する色素（極大吸
収波長域６３０　ｎｍ付近）を波長６３０ｎｍにて吸光
度を測定した。その結果、吸光度け００６．。＝　０．
５３５であった。Example 1. 4L-Leucyl-3,5-dichloro-4-hydroxyanilide, 1-naphthol-2-sulfonic acid, phenol, LAP activity measurement using laccase, L-leucyl-3,5-dichloro-4-hydroxy 0.1M containing 2mM of anilide hydrochloride and 0.5mM of 1-naphthol-2-sulfonic acid potassium salt!
A J acid buffer (pH 7.0) was prepared and used as a substrate solution. Add 2mβ of this substrate solution to 100μ# of laccase solution (
330U) and allylamidase solution 20a8 (
1000 G-R units/ml) was added and reacted for 10 minutes. After the reaction was completed, the absorbance of the dye (maximum absorption wavelength range around 630 nm) that developed due to the reaction was measured at a wavelength of 630 nm. As a result, the absorbance was 006. . = 0.
It was 535.

ま念上記の１−す７トールー２−スルホン酸の代りに０
．５ｙｘＭフェノールを用い、以下同様に行なった。そ
の結果、発色する色素の極大吸収波長域４５− は６１　Ｏｎｍ付近で、また波長６１０　ｎｍによる吸
光度はＯＤ、ｉｏ＝　０．１１１であった。Just in case, instead of the above 1-7to-2-sulfonic acid, use 0
．． The same procedure was performed using 5yxM phenol. As a result, the maximum absorption wavelength range 45- of the coloring dye was around 61 Onm, and the absorbance at a wavelength of 610 nm was OD, io=0.111.

実施例１５　　Ｌ−ロイシル−４−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒ
ドロキシエチルアミノアニリド、 ２．６−　シブ四モフェノール、ラッカーゼを用いるＬ
ＡＰ活性測定 り一ロイシルー４−Ｎ−エチルーＮ−ヒドロキシエチル
アミノアニリド・二塩酸塩２ｍＭおよび２．６−どブロ
モフェノール０．５　ｍＭを含有する０、１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）を調製し、この２ｍｌに、ラッカー
ゼ溶液ｉｏｏμＡ（３３０Ｕ）およびアリルアミダーゼ
溶液２０４　（ｉｏｏｏＧ−Ｒ単位４鹸を加えて３７℃
、５分間反応せしめた。その結某、反応によって発色す
る色素の極大吸収波長域は７０５　ｎｍ付近であシ、７
０５ｎｍ波長によるその反応液の吸光度は０Ｄ７ｏｌｌ
＝　１．４７であった。Example 15 L-leucyl-4-N-ethyl-N-hydroxyethylaminoanilide, 2.6-sibtetramophenol, L using laccase
AP activity measurement was carried out using 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) containing 2 mM of leucyl-4-N-ethyl-N-hydroxyethylaminoanilide dihydrochloride and 0.5 mM of 2,6-bromophenol. Add laccase solution iooμA (330U) and allylamidase solution 204 (ioooG-R unit 4) to 2ml of this solution and incubate at 37°C.
, and allowed to react for 5 minutes. As a result, the maximum absorption wavelength range of the dye that develops color by reaction is around 705 nm, 7
The absorbance of the reaction solution at 05nm wavelength is 0D7oll
= 1.47.

実施例１６　　Ｌ−ロイシル−アニリド、３，５−ジブ
ロモ−４−ヒドロキシアニリン、ラ ッカーゼを用いるＬＡＰ活性測定 ’Ｊｍ例ｘｓのＬ−ロイシル−４−Ｎ−エチル−４６一 Ｎ−ヒドロキシエチルアミノアニリドΦ二塩酸塩の代り
にＬ−ロイシル−アニリド・塩酸塩２ｍＭ濃度を用いて
、以下実施例１５同様にして行なった。その結果、反応
によって発色する色素の極大吸収波長域は６５５　ｎｍ
付近であり、その反応液０６５５ｎｍによる吸光度はＱ
Ｄ６．、−０．１７８　テあった。Example 16 LAP activity measurement using L-leucyl-anilide, 3,5-dibromo-4-hydroxyaniline, laccase 'Jm Example xs L-leucyl-4-N-ethyl-46-N-hydroxyethylaminoanilide Φ The same procedure as in Example 15 was carried out using L-leucyl-anilide hydrochloride at a concentration of 2 mM instead of the dihydrochloride. As a result, the maximum absorption wavelength range of the dye that develops color through reaction is 655 nm.
The absorbance of the reaction solution at 0655 nm is Q
D6. , -0.178 te.

実施例１７　Ｌ−ロイシル−２−エチルアニリン、３．
５−　シフ’ロモー４−ヒドロキシアニリン、ラッカー
ゼ金用匹るＬＡＰ活性 測定 実施例１５のＬ−ロイシル−４−Ｎ−野ルーＮ−ヒドロ
キシエチルアミノアニリド・二塩酸塩の代りにＬ−ロイ
シル−２−エチルアニリド塩酸塩２ｍＭ濃度を用いて、
以下実施例１５を同様に行なった。その結果、色素の極
大吸収波長域は６７５ｎｍ付近であシ、その反応液の６
７５　ｎｍ波長による吸光度はＯＤ６□、＝０．４２８
であった。Example 17 L-leucyl-2-ethylaniline, 3.
5-L-leucyl-2 in place of L-leucyl-4-N-N-hydroxyethylaminoanilide dihydrochloride in Example 15 for measuring LAP activity using laccase-based 4-hydroxyaniline. - using a 2mM concentration of ethylanilide hydrochloride,
Hereinafter, Example 15 was carried out in the same manner. As a result, the maximum absorption wavelength range of the dye was around 675 nm, and the reaction solution had a wavelength of 675 nm.
The absorbance at 75 nm wavelength is OD6□, = 0.428
Met.

実Ｍｔｌ’１Ｊ１８　　Ｌ−ｏインルー２−カルボキシ
アニリド、３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリン
または４−　Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノアニリン、ラッカ
ーゼを用いる ＬＡＰ活性測定 り一ロイシルー２−カルボキシアニリド・塩酸塩２ｒｐ
Ｍ、　　３．５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリン０
．５９Ｆ！Ｍを含有する０、１１ｖｉリン酸緩衝液ψＨ
７，のを調製し、この２ｍθに、ラッカーゼ溶液１００
μ２（３３０Ｕ）およびアリルアミダーゼ溶液５０μｍ
（１ｏｏｏＧ−Ｒｓ位／ｍＡ）を加えて３７℃、１０分
間反応せしめた。その結果、反応によって形成された色
素の極大吸収波長域は６４．５　ｎｍ付近であ〕、６４
５　ｎｍ波長による反応液の吸光度はＱＤ、、、＝０．
３９７であった。Mtl'1J18 Lo-in-2-carboxyanilide, 3,5-dibromo-4-hydroxyaniline or 4-N,N-diethylaminoaniline, LAP activity measurement using laccase - Leucyl-2-carboxyanilide hydrochloride 2rp
M, 3,5-dibromo-4-hydroxyaniline 0
．． 59F! 0,11vi phosphate buffer ψH containing M
7. Prepare laccase solution 100% to this 2mθ.
μ2 (330U) and allylamidase solution 50μm
(1oooG-Rs position/mA) was added and reacted at 37°C for 10 minutes. As a result, the maximum absorption wavelength range of the dye formed by the reaction is around 64.5 nm], 64
The absorbance of the reaction solution at a wavelength of 5 nm is QD, , = 0.
It was 397.

また上記の３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリン
の代カに４−μ、Ｎ−ジエチルアミノアニリン・二塩酸
塩０．５ｍＭを用いて、以下同様に行なった。その結果
、反応によって形成される色素の極大吸収波長域は６９
０　ｎｍ付近であＪ、６９０ｎｍ波長による反応液の吸
光度はＱＤ６．。＝　０．６１３であった。Further, the same procedure was carried out using 0.5 mM of 4-μ,N-diethylaminoaniline dihydrochloride in place of the above-mentioned 3,5-dibromo-4-hydroxyaniline. As a result, the maximum absorption wavelength range of the dye formed by the reaction is 69
J at around 0 nm, and the absorbance of the reaction solution at a wavelength of 690 nm is QD6. . = 0.613.

実施例１９　各種ＬＡＰ活性測定用合成基、カプラー、
ラッカーゼを用いるＬＡＰ活性 測定 各種ＬＡＰ活性測定用合成基質（Ｌ−ロイシル−３，５
−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド・塩酸！、Ｌ−ロ
イシル−４−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノアニリド・二塩酸
塩、Ｌ−ロイシル−４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノアニリ
ド・二塩酸塩）　２ｔｎ、Ｍおよびカプラー（Ｎ−エチ
ル−Ｎ−ヒドロキシエチルアニリン、２，６−ジブロモ
フエノール、２．４−ジクロロフェノール、２，６−シ
メトキシフエノール、アニリン・ｍ−トルイジン、マン
トシェル酸、ｍ−メチルフェノール、０−カルボキシメ
チルフェノール、Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−
ｍ−トルイジン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン、
０−エチルアニリン、α−ナフトール、ｍ−フェニレン
ジアミン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチ
ルアニリン、ｏ−クロロフェノール、ｍ−クロロフェノ
ール、ｍ−エチルフェノール、０−））キシフェノール
、４−クロロ−ｍ　−７エ４９− ニレンジアミン、２−メチル−６−クロロフェノール、
２−クロロ−５−メチルフェノール、４−り四ロー１−
ナフトール、１−ナフトール−２−カルボン酸）　０．
５ｍＭを含有する０、１Ｍ　！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）を調製し、この２−に、ラッカーゼ溶液１００　ｄ
　（３３０Ｕ）およびアリルアミダーゼ５０　ａｌｌ　
（１０００Ｇ−Ｒ単位／ｍ２）を加えて３７℃、１０分
間反応せしめた。反応終了後、発色する色素を、その色
素の極大吸収波長によって吸光度を測定した。その結果
は、第４表に示す通りであった。Example 19 Various synthetic groups for measuring LAP activity, couplers,
Measurement of LAP activity using laccase Various synthetic substrates for measuring LAP activity (L-leucyl-3,5
-dibromo-4-hydroxyanilide/hydrochloric acid! , L-leucyl-4-N, N-diethylaminoanilide dihydrochloride, L-leucyl-4-N, N-dimethylaminoanilide dihydrochloride) 2tn, M and coupler (N-ethyl-N-hydroxyethyl Aniline, 2,6-dibromophenol, 2,4-dichlorophenol, 2,6-simethoxyphenol, aniline/m-toluidine, mantochelic acid, m-methylphenol, 0-carboxymethylphenol, N-ethyl-N -Hydroxyethyl-
m-toluidine, N,N-dimethyl-m-toluidine,
0-ethylaniline, α-naphthol, m-phenylenediamine, N,N-dimethylaniline, N,N-diethylaniline, o-chlorophenol, m-chlorophenol, m-ethylphenol, 0-))oxyphenol, 4-chloro-m-7e49-nylenediamine, 2-methyl-6-chlorophenol,
2-Chloro-5-methylphenol, 4-di-4ro-1-
naphthol, 1-naphthol-2-carboxylic acid) 0.
0,1M containing 5mM! J acid buffer (pH 7,
0) and add 100 d of laccase solution to this 2-
(330U) and allylamidase 50 all
(1000 G-R units/m2) and reacted at 37°C for 10 minutes. After the reaction was completed, the absorbance of the colored dye was measured using the maximum absorption wavelength of the dye. The results were as shown in Table 4.

５０− 第４表 一５１一 実施例２０　γ−Ｌ−グルタミルー４−　Ｎ、Ｎ−ジエ
チルアミノアニリド、１−ナフトー ル−２−スルホン酸、ラッカーゼを用 いるγ−ＧＴＰ活性測定 γ−Ｌ−グルタミルー４−　Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノア
ニリド５　ｍＭ　ｓ　グリシルグリシン１００ｍＭ。50-Table 4-51-Example 20 γ-GTP activity measurement using γ-L-glutamyl-4-N,N-diethylaminoanilide, 1-naphthol-2-sulfonic acid, and laccase γ-L-glutamyl-4-N , N-diethylaminoanilide 5mM s glycylglycine 100mM.

ｌ−ナフトール−２−スルホン酸カリウム０　、５ｍ　
Ｍを含有する５　０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８，ωを調
製して基質溶液とした。この基質溶液２７に、ラッカー
ゼ溶液１００　ｔｉＪ３　（１０００Ｕ／ｍ−＃）およ
び血清５０　ｔｉ１３　＠−ＧＴＰ活性；　４１６　ｍ
Ｕ／ｍ−＃）を加えて３７℃で反応させた。反応によっ
て発色する色素（極大吸収波長域６５５　ｎｍ付近）を
各反応時間に対して連続的に波長６５５　ｎｍにて吸光
度を測定した。その結果は第１２図に示す通りであった
。Potassium l-naphthol-2-sulfonate 0,5m
A 50 mM borate buffer (pH 8, ω) containing M was prepared as a substrate solution. To this substrate solution 27, 100 tiJ3 (1000 U/m-#) of laccase solution and 50 ti13@-GTP activity of serum were added. m
U/m-#) was added and reacted at 37°C. The absorbance of the dye (maximum absorption wavelength range around 655 nm) that develops due to the reaction was measured continuously at a wavelength of 655 nm for each reaction time. The results were as shown in FIG.

ま之上記の血清の代りにγ−ＧＴＰ活性１０　ＦｒｍＵ
／・−を有する血清を用いて、以下同僚に行なった結果
は、第１３図に示す通りであった。Mano Instead of the above serum, γ-GTP activity 10 FrmU
The results obtained by colleagues using the serum containing /.- were as shown in FIG. 13.

この第１２図および第１３図に示す通シ、本発明はγ−
ＧＴＰ活性を良好に測定できるもので、５３− またγ−ＧＴＰＯ作用が始まると同時に反応液が呈色し
てくるためレイトアッセイが行えるものであった。As shown in FIGS. 12 and 13, the present invention is γ-
The GTP activity could be measured satisfactorily, and a late assay could be performed because the reaction solution began to change color at the same time as the 53- and γ-GTPO action started.

なおこの形成色素の各波長に対する吸収曲線は第１４図
に示す。The absorption curve of this formed dye for each wavelength is shown in FIG.

実姉例２１　γ−Ｌ−グルタミルー４−　Ｎ、Ｎ−ジエ
チルアミノアニリド、１−す７トー ルー２−スルホン酸、ラッカーゼを用 いるγ−ＧＴＰ活性測定 実施例２０と同様に調製した基質溶液１−を、酸素電極
を備えた反応せる（内容量１−）に加えて、３７℃に予
加温した。次いでこれにラッカーゼ（２００Ｕ）および
血清（γ−ＧＴＰ活性４１６ｒｎｔｒ／ｍβ）を含有す
る溶液１００ｄを加えて３７℃で反応させた。反応にお
いて消費される酸素の童を酸素電極によって測定した結
果、反応時間に対する酸素消費率は第１５図に示す通シ
であり、酸素消費率に基いて良好にγ−ＧＴＰ活性が測
定できるものであった。Actual Sister Example 21 γ-GTP activity measurement using γ-L-glutamyl-4-N,N-diethylaminoanilide, 1-7to-2-sulfonic acid, and laccase Substrate solution 1- prepared in the same manner as Example 20 was heated with oxygen. A reactor (inner volume 1-) was equipped with electrodes and prewarmed to 37°C. Next, 100 d of a solution containing laccase (200 U) and serum (γ-GTP activity 416 rntr/mβ) was added thereto, and the mixture was reacted at 37°C. As a result of measuring the amount of oxygen consumed in the reaction using an oxygen electrode, the oxygen consumption rate with respect to the reaction time was as shown in Figure 15, which indicates that γ-GTP activity can be measured well based on the oxygen consumption rate. there were.

実施例２２　γ−Ｌ−グルタミルー４−　Ｎ、Ｎ−ジー
５４＝ エチルアミノアニリド、１−す７トー ルー２−スルホン酸、アスコルビン酸 オキシダーセを用いるγ−ＧＴＰ活性 測定 実施例２０と同様にして調製した基質溶液２ｍ＆を用い
、これに、アスコルビン酸オキシダーゼ溶液１００μａ
（１００Ｕ）および血清５０　ｔｔ−１３＠　−ＧＴＰ
活性：　４１６　ｍＵ／ｍＡ　）を加えて３７℃で各々
５分間、１０分間反応させた。次いで反応終了後反応に
よって発色する色素（極大吸収波長域６５５　ｎｔｎ付
近）を各反応時間ごとに波長６５５ｎｍにて吸光朋を測
定した。その結果、反応５分後の吸光度は００，５．”
”０．９４９．１０分後の吸光度は０Ｄ６５５＝１．８
９５であった。Example 22 γ-L-glutamyl-4-N,N-di54 = γ-GTP activity measurement using ethylaminoanilide, 1-7toll-2-sulfonic acid, and ascorbic acid oxidase Prepared in the same manner as in Example 20 Using 2 m of substrate solution, add 100 μa of ascorbic acid oxidase solution to this.
(100U) and serum 50 tt-13@-GTP
Activity: 416 mU/mA) was added and reacted at 37°C for 5 minutes and 10 minutes, respectively. Next, after the reaction was completed, the absorbance of the dye (maximum absorption wavelength range around 655 ntn) that was developed by the reaction was measured at a wavelength of 655 nm for each reaction time. As a result, the absorbance after 5 minutes of reaction was 00.5. ”
”0.949.The absorbance after 10 minutes is 0D655=1.8
It was 95.

実施例２３　γ−Ｌ−グルタミルー３，５−ジクロロ−
４−ヒドロキシアニリド、１−ナ フトール−２−スルホン酸、ラッカー ゼまたはチロシナーゼを用いろγ−Ｇ ＴＰ活性測定 γ−Ｌ−グルタミルー３，５−ジクロロ−４−ヒドロキ
シアニリド５ｍＭ５　グリシルグリシン１００ｍＭ１１
−ナフトール−２−スルホン酸カリウム塩０．５ｙｄＭ
を有する５　０　ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７，１）を調
製して基質溶液とした。この基質溶液２−に、ラッカー
ゼ溶液１００μ＃（１００Ｕ）および血清６０ｔＬＩ３
（γ−ＧＴＰ活性；　４１６ｔｎＬい紹）を加えて３７
℃、１０分間反応させた。反応終了後、反応によって発
色する色素（極大吸収波長域６３　Ｏｎｍ付近）を波長
６３０　ｎｍにて吸光度を測定した。その結果、吸光度
はＱＤ、、＝１　、０４４　　であった。Example 23 γ-L-glutamyl-3,5-dichloro-
Measurement of γ-G TP activity using 4-hydroxyanilide, 1-naphthol-2-sulfonic acid, laccase or tyrosinase γ-L-glutamyl-3,5-dichloro-4-hydroxyanilide 5mM5 Glycylglycine 100mM11
-Naphthol-2-sulfonic acid potassium salt 0.5ydM
A 50 mM borate buffer (pH 7.1) having the following properties was prepared and used as a substrate solution. To this substrate solution 2-, laccase solution 100μ# (100U) and serum 60tLI3
(γ-GTP activity; 416tnL introduction) and 37
℃ for 10 minutes. After the reaction was completed, the absorbance of the dye (maximum absorption wavelength range around 63 Onm) that developed due to the reaction was measured at a wavelength of 630 nm. As a result, the absorbance was QD, = 1,044.

また上記のラッカーゼの代りに子ロシナーゼ溶液１００
ｄ（１００Ｕ）を用−１以下同様に行なった。その結果
、発色する色素の極大吸収波長域は６３０ｎｍ付近であ
り、また波長６３０　ｎｍによる吸光度はＱＤ６．。＝
１．０４２であった。Also, instead of the above laccase, 100% of the rosinase solution
d (100U) was used in the same manner as below. As a result, the maximum absorption wavelength range of the coloring dye is around 630 nm, and the absorbance at a wavelength of 630 nm is QD6. . =
It was 1.042.

実施例２４　各種γ−ＧＴＰ活性測定用合成基質、カプ
ラー、ＡＳＯＤを用りるγ−ＧＴＰ活性測定 各種γ−ＧＴＰ活性測定用合成基質（γ−Ｌ　−グルタ
ミン−４−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノアニリドγ−Ｌ−グ
ルタミル−４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノアニリド、γ−
Ｌ−グルタミルー４−　Ｎ、Ｎ−ジ−プロピルアミノア
ニリド、Ｌ−γ−グルタミルー３．５−ジブロモ−４−
ヒドロキシアニリド）　５　ｍＭ　。Example 24 Various synthetic substrates for measuring γ-GTP activity, couplers, measuring γ-GTP activity using ASOD Various synthetic substrates for measuring γ-GTP activity (γ-L-glutamine-4-N, N-diethylaminoanilide γ -L-glutamyl-4-N, N-dimethylaminoanilide, γ-
L-glutamyl-4- N,N-di-propylaminoanilide, L-γ-glutamyl-3,5-dibromo-4-
hydroxyanilide) 5 mM.

グリシルグリシン１００　ｍＭ　、およびカプラー（ｌ
−ナフトール−２−スルホン酸カリウム塩、２，５−ジ
メチルフェノール、２．６−ジブロモフエノール、フェ
ノール、２，６−シメトキシフエノール、Ｎ、Ｎ−ジエ
チルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアニ
リン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｍ−フェニレンジアミン、０
−エチルアニリン、ｍ−クロロフェノール、ｏ−メチル
フェノール、ｏ−メトキシフェノール、α−ナフートル
）　０　、５ｓＭを含有する５　０　ｍＭホウ酸緩衝液
φＨ８，０）？ｌ−１Ｍ製して基質溶液とした。この基
質溶液２ｍ１３にＡＳＯＤ溶液１００μβ（１００Ｕ）
および血清（γ−ＧＴＰ活性４１６ｍ１い−）５０頭を
加えて３７℃、５分間反応せしめた。反応ボく１埃、反
応によって形成された色素の極大吸収波長に基いてその
色素の吸光度を測定した。その結果は第５表に示す通シ
５７− であった。100 mM glycylglycine, and coupler (l
-Naphthol-2-sulfonic acid potassium salt, 2,5-dimethylphenol, 2,6-dibromophenol, phenol, 2,6-simethoxyphenol, N,N-diethylaniline, N-ethyl-N-hydroxyethylaniline , N,N-dimethyl-m-phenylenediamine, 0
- 50 mM borate buffer containing ethylaniline, m-chlorophenol, o-methylphenol, o-methoxyphenol, α-nahuthol) 0,5 sM φH8,0)? 1-1M and used as a substrate solution. Add 100μβ (100U) of ASOD solution to 2ml of this substrate solution.
and serum (γ-GTP activity: 416ml) were added to the mixture from 50 animals and reacted at 37°C for 5 minutes. The absorbance of the dye formed by the reaction was measured based on the maximum absorption wavelength of the dye. The results were as shown in Table 5.

第５表 Ａ　：　γ−Ｌ−グルタミルー４−Ｎ、Ｎ−ジエチルア
ミノアニリドＢ　：　γ−Ｌ−グルタミルー４−Ｎ、Ｎ
−ジメチルアミノアニリドＣ：　γ−Ｌ−グルタミルー
４−Ｎ、Ｎ−ジプロピルアミノアニリドＤ　：　γ−Ｌ
−グルタミルー３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニ
リドTable 5 A: γ-L-glutamyl-4-N,N-diethylaminoanilide B: γ-L-glutamyl-4-N,N
-dimethylaminoanilide C: γ-L-glutamyl-4-N,N-dipropylaminoanilide D: γ-L
-glutamyl-3,5-dibromo-4-hydroxyanilide

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第１図けＬ−ロイシル−４−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノア
ニリド、１−ナフトール−２−スルホン酸、ラッカーゼ
、血清を用いる反応による形成色素の各波長に対する吸
収曲線を示し、 第２図および第３図は、Ｌ−ロイシル−４−Ｎ、Ｎ−ジ
エチルアミノアニリド、１−ナフトール−２−スルホン
酸、ラッカーゼ、血清を用いる反応による反応時間に対
して連続的に吸光度の増加全測定した吸光度変化の曲線
を示し、 第４図はＬ−ロイシル−４−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノア
ニリド、フェノール、ラッカーゼ、血清を用いる反応に
よる反応時間に対して連続的に吸光度の増加を測定した
吸光度変化の曲線を示し、第５図はそのときに形成され
る色素の各波長に対する吸収曲線を示し、 第６図はＬ−ロイシル−４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノア
；リド、１−ナフトール−２−スルホン酸、ラッカーゼ
、血清を用いる反応による反応時間に対して連続的に吸
光度の増加を測定した吸光度変化の曲線を示し、 第７図はＬ−ロイシル−４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノア
ニリド、フェノール、ラッカーゼ、血清を用いる反応に
よる反応時間に対して連続的に吸光度の増加を測定した
吸光度変化の曲線を示し、第８図はＬ−ロイシル−３，
５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド、１−ナフトー
ル−２−スルホン酸、アスコルビン酸オキシダーゼ、ア
リルアミダーゼ溶液を用いる反応による反応時間に対し
て連続的に吸光度の増加を測定した吸光度変化の曲線を
示し、 第９図はそのときに形成される色素の各波長に対する吸
収曲線を示し、 第１０図はＬ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒド
ロキシアニリド、１−ナフトール−２−スルホン酸、ア
スコルビン酸オキシダーゼ、アリルアミダーゼを用いる
反応による反応時間に対する酸素消費率の曲線を示し、 第１１図はＬ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒド
ロキシアニリド、１−ナフトール−２−スルホン酸、ラ
ッカーゼ、アリルアミダーゼを用りる反応による反応時
間に対する酸素消費率の曲線を示し、 第１２図および第１３図はＬ−γ−グルタミルー４−Ｎ
、Ｎ−ジエチルアミノアニリド、グリシル−クリシン、
１−ナフトール−２−スルホン酸、２ツカーゼ、血清を
用いる反応による反応時間に対して連続的に吸光度の増
加を測定した岐光度変化の曲線を示し、 第１４図はそのときの形成色素の各波長に対す６１− る吸収曲線を示し、 第１５図けγ−Ｌ−グルタミルー４−Ｎ、Ｎ−ジエチル
アミンアニリド、グリシル−グリシン、ｌ−ナフトール
−２−スルポン酸、ラッカーゼ、血清を用りる反応によ
る反応時間に対する酸素の消費率の曲線を示す。 ６２− 第１図 ４００　　　　５００　　　　　ｅＤリ　　　　ＩＵＵ
第３図 ｏ５０ 分 １１１１ ｎｍ １０　　　　　　　　５　　　　　　　　０１０　　　
　　　　　　５　　　　　　　　　０４００　　　５０
０　　　６００　　　　７００ｎｍ０　　　　　　　　
　１　　　　　　　　　　２Ｏ１２゛ 特開昭５９−８８０９９（２０） 手続補正書（自発） 昭和５８年７月２日 昭和５７９−特許願　第１９８８６２　　号２、発明の
名称 新規な酵素活性の測定法 ３、　補正をする者 事件との関係　特許出願人 １１＋！ｉ　　　静岡県田力郡大仁町三福６３２番地の
１名　称　東洋醸造株式会社 ４、代理人 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 （１）明細書中框９ページ上から３行目及び下から５行
目「煩雑物」とあるを「夾雑物」と訂正する。 （２）　　明細書中框４２ページ下から８行目「吸収度
」とあるを「吸光度」と訂正する。 （３）明細書中框４３ページ下から７行目Ｆシダーゼ」
とあるを削除する。 （４）　　明細書中温４８ページ下から６行目「−μ、
Ｎ」とあるをｒ−Ｎ、ＮＪと訂正する。 （５）明細書中框５３ページ下から１０行目１（α−Ｇ
ＴＰＪとあるをｒ（ｒ−ＧＴＰＪと訂正する。 （６）明細書中温５４ページ下からＩＯ行０Ｆ反応せる
」とあるを「反応セル」と訂正する。 （力　明細書第５５ページ上から７行目Ｆ（α−」とあ
るを「（γ−」と訂正する。 （８）明細書９第５６ページ上から５行目「血清６０μ
ノ」とあるを［血清５０μｌＪと訂正する。 （９）明細書９第５９ページ下から１１行目と１０行目
との間に改行して次文を挿入する。 実施例２５ Ｌ−ロイシル−３，５−シクロロー４−ヒドロキｉ− シアニリドまたはＬ−ロイシル−３，５−ジブロム−４
−ヒドロキシアニリド、２，５−ジメチルフェノール、
Ａ　Ｓ　ＯＴ）を用するＬＡＰ活性活性測定口イシル−
３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド・塩酸塩２
　ｍＭまたはＬ−ロイシル−３，５−ジブロム−４−ヒ
ドロキシアニリド・塩酸塩２ｍＭおよび２，５−ジメチ
ルフェノール２ｍＭを含有する０、１ＭＩＩＭリン酸緩
衝液Ｈ７，０）を調製して基質溶液とした。これらの基
質溶液２　ｍｌに、各々ＡＳＯＤ（１３０Ｕ）および患
者血清（ＬＡＰ活性：１１１３Ｇ−Ｒ単位／ｍｌ）　２
０　ｔＪを加えて３７℃で１０分間反応させた。反応終
了後、形成色素の有する極大吸収波長域に基いて反応に
よって発色する色素の吸光度を測定１．た。その結果、
Ｌ−ロイシル−３，５−シクロロー４−ヒドロキシアニ
リドを用いた場合は”Ｄ、５ｓｓ＝　０　、５８６　　
であり、Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロム−４−ヒドロ
キシアニリドを用いた場合は０．Ｄ５８５＝　０．７５
６であった。 実施例２６ ２− Ｌ−ロイシル−３，５−シＩロロー４−ヒドロキシアニ
リド、２．５−ジメチルフェノール、ラッカーゼを用い
るＬＡＰ活性測定 り一ロイシル−３，５−シクロロー４−ヒドロキシアニ
リド塩酸塩２？ＦＬＭおよび２．５−ジメチルフェノー
ル２ｍＭをａ゛有する０、１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）を調製し、て基質溶液とした。この基質溶液２ｍ
ｌに、ラッカーゼ（３３０Ｕ）およびアリルアミダーゼ
（ｌｏｏｏａ−Ｒ牟位／ｍ１）ｅ含有する溶液２０μノ
を加えて３７℃で１０分間反応せしめた。反応終了後、
形成色素の有する極大吸収波長域に基いて反応によって
発色する色素の吸光層を測定１．た。その結果、０．１
）、５８５＝０．３８６　　であった。 実施例２７ γ−Ｌ−グルタミルー３，５−ジクロロ−４−ヒドロキ
シアニリド、２，５−ジメチルフェノール、ＡＳＯＤを
用いるγ−ＧＴＰ活性測定 Ｌ−γ−グルタミル−３，５−ジクロロ−４−ヒドロキ
シアニリド５７ＦＬＭ　％グリシルグリシン１００ｔｎ
、Ｍ　。 ３− およヒ、２，５−ジメチルフェノール０．５ｍＭ？：含
有−する５０祭Ｍホウ酸緩衝液（ｐｆ（８，０）を調製
して基質溶液とした。この基質溶液２ｍｌにＡＳＯＤ溶
液１．００　ｔＪ　（１００Ｕ）および血清（γ−ＧＴ
Ｐ活性４１６ｍσ／ｍｌり５０　ｕ　ｌｊを加えて３７
℃、５分間反応せＬ２めた。反応終了後、反応によって
形成された色素の極大吸収波長に基すてその色素の吸光
度を測定［、た。その結果、Ｏ，Ｄ、５８．＝　０．５
４７であった。 実施例２８ γ−Ｌ−グルタミルー３，５−ジクロロ−４−ヒドロキ
シアニリドまたはγ−Ｌ−グルタミル＝３．５−　　ジ
ブロム−４−ヒドロキシアニリド、２，５−ジメチルフ
ェノール、ラッカーゼを用いるγ−ＧＴＰ活性測定 し−γ−グルタミルー３．５−　シクロロー４−ヒドロ
キシアニリド５ｍＭまたはＬ−γ−グルタミルー３．５
−ジブ四ムー４−ヒドロキシアニリド５　ｍＭグリシル
グリシン１００　ｍＭおよび２，５−ジメチルフェノー
ル０　、５　ｍＭを含有する５　０　ｍＭホウ酸緩衝液
（ｐＨ８，０）を調製して基質溶液とした。これらの基
質溶液２ｍ１ｌに各々ラッカーゼ溶液１００μ１（１０
０Ｕ）および血清（γ−ＧＴＰ活性４１６ｒｎＵ／ｍｌ
　）　５０μｌｊを加えて３７℃、５分間反応せしめた
。反応終了後、反りちによって形成された色素の４傘大
吸収波長に基いてその色素の吸光度を測定した。その結
果Ｌ−γ−グルタミルー３，５−ジクロロ−４−ヒドロ
キシアニリドを用いた場合は０、Ｄ、　ｓｓｓ　＝Ｑ　
、　４７６であり、Ｌ−γ−グルタミルー３．５〜ジブ
ロム−４−ヒドロキシアニリドを用いた場合けＯ，Ｄ、
、８．　＝　０．５２６であった。 以上Figure 1 shows the absorption curves for each wavelength of the pigment formed by the reaction using L-leucyl-4-N, N-diethylaminoanilide, 1-naphthol-2-sulfonic acid, laccase, and serum. The figure shows a continuous increase in absorbance versus reaction time due to a reaction using L-leucyl-4-N, N-diethylaminoanilide, 1-naphthol-2-sulfonic acid, laccase, and serum. The curve of absorbance change measured in total. FIG. 4 shows a curve of absorbance change in which the increase in absorbance was continuously measured against reaction time in a reaction using L-leucyl-4-N, N-diethylaminoanilide, phenol, laccase, and serum. Figure 5 shows the absorption curve for each wavelength of the dye formed at that time, and Figure 6 shows L-leucyl-4-N,N-dimethylaminol;lide, 1-naphthol-2-sulfonic acid, and laccase. Figure 7 shows a curve of absorbance change in which the increase in absorbance was continuously measured against reaction time in a reaction using serum. Fig. 8 shows a curve of absorbance change obtained by continuously measuring the increase in absorbance against reaction time in a reaction using L-leucyl-3,
5-dibromo-4-hydroxyanilide, 1-naphthol-2-sulfonic acid, ascorbic acid oxidase, shows a curve of absorbance change in which the increase in absorbance is continuously measured against reaction time in a reaction using an allylamidase solution, Figure 9 shows absorption curves for each wavelength of the dyes formed at that time, and Figure 10 shows L-leucyl-3,5-dibromo-4-hydroxyanilide, 1-naphthol-2-sulfonic acid, and ascorbic acid. FIG. 11 shows a curve of oxygen consumption rate versus reaction time in a reaction using oxidase and allyl amidase, and FIG. Figures 12 and 13 show curves of oxygen consumption rate versus reaction time for reactions using amidase, and Figures 12 and 13 show
, N-diethylaminoanilide, glycyl-chrysine,
Figure 14 shows a curve of light intensity change in which the increase in absorbance was continuously measured against reaction time in a reaction using 1-naphthol-2-sulfonic acid, 2-tucase, and serum. Figure 15 shows the absorption curve of 61- to wavelength, and the reaction using γ-L-glutamyl-4-N, N-diethylamine anilide, glycyl-glycine, l-naphthol-2-sulfonic acid, laccase, and serum. Figure 2 shows a curve of oxygen consumption rate versus reaction time. 62- Fig. 1 400 500 eDli IUU
Figure 3 o50 min 1111 nm 10 5 010
5 0400 50
0 600 700nm0
1 2O12゛Japanese Unexamined Patent Publication No. 1988-88099 (20) Procedural amendment (spontaneous) July 2, 1982 Patent Application No. 198862 2. Title of invention Novel method for measuring enzyme activity 3. Make amendments. Relationship with patent applicant case 11+! i 1 name of 632 Mifuku, Ohito-cho, Tajiki-gun, Shizuoka Prefecture Name Toyo Jozo Co., Ltd. 4, Agent 6, Number of inventions increased by amendment 7, Subject of amendment (1) 3 lines from the top of page 9 of the middle frame of the specification In the fifth line from the bottom, the words ``complicated objects'' are corrected to read ``contaminated objects.'' (2) In the middle frame of the specification, on the 8th line from the bottom of page 42, the word "absorbance" is corrected to "absorbance." (3) F Sidase, line 7 from the bottom of page 43 in the center frame of the specification.”
Delete certain. (4) Specification middle temperature page 48, line 6 from the bottom “-μ,
Correct "N" to r-N, NJ. (5) Center frame of the specification, page 53, line 10 from the bottom (α-G
Correct TPJ to r (r-GTPJ. (6) Correct ``react at IO line 0F from the bottom of page 54 of the specification'' to read ``reaction cell.'' (7 from the top of page 55 of the specification Line F (α-) is corrected to “(γ-”). (8) Specification 9, page 56, 5th line from the top: “Serum 60μ
Correct the text ``No'' to 50 μlJ of serum. (9) Insert the following sentence with a line break between the 11th line and the 10th line from the bottom of page 59 of specification 9. Example 25 L-leucyl-3,5-cyclo-4-hydroxyi-cyanilide or L-leucyl-3,5-dibrom-4
-hydroxyanilide, 2,5-dimethylphenol,
LAP activity assay using ASOT
3,5-dichloro-4-hydroxyanilide hydrochloride 2
A 0,1 MIIM phosphate buffer H7,0) containing 2 mM or L-leucyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilide hydrochloride and 2 mM 2,5-dimethylphenol was prepared and used as a substrate solution. . Add ASOD (130 U) and patient serum (LAP activity: 1113 G-R units/ml) to 2 ml of these substrate solutions, respectively.
0 tJ was added and the reaction was carried out at 37°C for 10 minutes. After the reaction is complete, measure the absorbance of the dye that is colored by the reaction based on the maximum absorption wavelength range of the formed dye.1. Ta. the result,
When L-leucyl-3,5-cyclo-4-hydroxyanilide is used, "D, 5ss = 0, 586
and 0.0 when L-leucyl-3,5-dibromo-4-hydroxyanilide is used. D585=0.75
It was 6. Example 26 2-L-leucyl-3,5-cyclo-4-hydroxyanilide, 2,5-dimethylphenol, LAP activity measurement using laccase Leucyl-3,5-cyclo-4-hydroxyanilide hydrochloride 2 ? FLM and 2,5-dimethylphenol 2mM in 0.1 M phosphate buffer (pH 7)
, 0) was prepared and used as a substrate solution. 2m of this substrate solution
20 μm of a solution containing laccase (330 U) and allylamidase (LOOOA-R position/ml) was added to the solution, and the mixture was reacted at 37° C. for 10 minutes. After the reaction is complete,
Measure the light absorption layer of the dye that develops color by reaction based on the maximum absorption wavelength range of the forming dye.1. Ta. As a result, 0.1
), 585=0.386. Example 27 γ-GTP activity measurement using γ-L-glutamyl-3,5-dichloro-4-hydroxyanilide, 2,5-dimethylphenol, and ASOD L-γ-glutamyl-3,5-dichloro-4-hydroxyanilide 57FLM % Glycylglycine 100tn
,M. 3- Oyohi, 2,5-dimethylphenol 0.5mM? : A 50M borate buffer (pf(8,0)) was prepared and used as a substrate solution.To 2 ml of this substrate solution was added 1.00 tJ (100U) of ASOD solution and serum (γ-GT
Add 50 u lj to P activity 416 mσ/ml and 37
The reaction was carried out at ℃ for 5 minutes and L2 was discharged. After the reaction was completed, the absorbance of the dye formed by the reaction was measured based on the maximum absorption wavelength of the dye. As a result, O, D, 58. = 0.5
It was 47. Example 28 γ-GTP activity using γ-L-glutamyl-3,5-dichloro-4-hydroxyanilide or γ-L-glutamyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilide, 2,5-dimethylphenol, and laccase Measured - γ-glutamyl-3.5-cyclo-4-hydroxyanilide 5mM or L-γ-glutamyl-3.5
A 50 mM borate buffer (pH 8.0) containing 5 mM of 4-hydroxyanilide, 100 mM of glycylglycine, and 0,5 mM of 2,5-dimethylphenol was prepared and used as a substrate solution. Add 100 μl (10 μl) of laccase solution to 2 ml of each of these substrate solutions.
0U) and serum (γ-GTP activity 416rnU/ml
) 50 μlj was added and reacted at 37° C. for 5 minutes. After the reaction was completed, the absorbance of the dye formed by the warp was measured based on the four major absorption wavelengths of the dye. As a result, when L-γ-glutamyl-3,5-dichloro-4-hydroxyanilide was used, 0, D, sss = Q
, 476, and when using L-γ-glutamyl-3.5-dibromo-4-hydroxyanilide, O, D,
, 8. = 0.526. that's all

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）　　ロイシンアミノペプチダーゼまたはγ−グル
タミルトランスペプチダーゼを含有する被検液中のロイ
シンアミノペプチダーゼまたはγ−グルタミルトランス
ペプチダーゼの酵素活性の測定において、一般式 （式中、ＲｏけＬ−ロイシル基またはｒ−Ｌ−グルタミ
ル基を示し、Ｒ，、Ｒ３、ＲいＲ５およびＲ６は各々水
素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキ
シ基、アミノ基、置換アミノ１１水酸基、カルボキシル
基またはスルホ基を示し、ＲｓおよびＲ６は一緒にて炭
素Ｍを形成してもよい）で表わされるアミド化合物また
はその水溶性塩に該被検液を作用せしめ、遊離する　１
− 一般式 （式中、Ｒ１１％Ｒ３、Ｒ１、Ｒ１およびＲ６は前記と
同じ意味を有する）で表わされるアミンに一般式（式中
、Ｒ７は水素原子、アミン基、置換アミノアルコキシ基
、アミノ基、置換アミン基、水酸基、カルボキシル基マ
九はスルホ基を示し、Ｒ１１およびＲ，２１１−緒にて
炭素環を形成してもよいが、Ｒ８、Ｒｇ　　、Ｒ１ｏ’
　％　’Ｒ１１およびＲｌｍのうち少なくとも１つがア
ミノ基、置換アミノ基または水酸基を示す場合には、Ｒ
７は水素原子でもよい）で表わされるカプラーの共存下
酸素を消費して　２− 色素を形成する酸化酵素を作用せしめ、次いで検出でき
る変化の量を測定することを特徴とする酵素活性の測定
法。(1) In measuring the enzymatic activity of leucine aminopeptidase or γ-glutamyl transpeptidase in a test solution containing leucine aminopeptidase or γ-glutamyl transpeptidase, the general formula (wherein Ro, L-leucyl group or r -L-glutamyl group, R, R3, R5 and R6 each represent a hydrogen atom, a halogen atom, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, an amino group, a substituted amino-11 hydroxyl group, a carboxyl group or a sulfo group, Rs and R6 may be taken together to form carbon M) or a water-soluble salt thereof is reacted with the test solution to liberate 1
- An amine represented by the general formula (wherein R11%R3, R1, R1 and R6 have the same meanings as above) is added to the amine represented by the general formula (wherein R7 is a hydrogen atom, an amine group, a substituted aminoalkoxy group, an amino group) , a substituted amine group, a hydroxyl group, a carboxyl group represents a sulfo group, and R11 and R,211 may together form a carbocyclic ring, but R8, Rg, R1o'
% 'When at least one of R11 and Rlm represents an amino group, a substituted amino group or a hydroxyl group, R
A method for measuring enzyme activity, which comprises activating an oxidase that consumes oxygen to form a 2-dye in the presence of a coupler represented by (7 may be a hydrogen atom), and then measuring the amount of detectable change. . （２）酸化酵素がラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダ
ーゼまたはチロシナーゼである特許請求の範囲第１項記
載の測定法。(2) The measuring method according to claim 1, wherein the oxidizing enzyme is laccase, ascorbate oxidase, or tyrosinase.
JP19886282A 1982-09-01 1982-11-15 Novel measurement of enzymatic activity Granted JPS5988099A (en)

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