JPS5942350A - Novel synthetic substrate and method for measuring activity - Google Patents

Abstract

NEW MATERIAL:A compound expressed by formula I (R is L-leucyl or gamma-L-glutamyl; X and Y are halogen) or a salt thereof. EXAMPLE:L-Leucyl-3,5-dibromo-4-hydroxyanilide. USE:A synthetic substrate for measuring the activity of leucine aminopeptidase (LAP) or gamma-glutamate-pyruvate transaminase (gamma-GTP) by reacting an amide compound expressed by formula I or a salt thereof with a peptidase contained in the test solution to liberate an aniline derivative, developing the color of the above-mentioned aniline derivative, and determining the colored compound by the colorimetry. PROCESS:An alpha-carboxyl group in L-leucine or a gamma-carboxyl group in L-glutamic acid is condensed with an aniline derivative to give the compound expressed by formula I . Functional groups taking no part in the condensation reaction are protected, and the condensation is carried out by the acid halide, acid anhydride, method, etc. The above-mentioned protecting groups are removed.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、式 （式中、ＲはＬ−ロイシル基またはγ−Ｌ−グルタミル
基、ＸおよびＹは同一かまたは異なシ、ハロゲン原子を
示す）で表わされるアミド化合物またはその塩およびと
Ｑアミド化合物を合成基質とする被験中のペプチダーゼ
の新規な活性測定法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention provides an amide compound represented by the formula (wherein R is an L-leucyl group or a γ-L-glutamyl group, and X and Y are the same or different, and represent a halogen atom) The present invention relates to a novel method for measuring the activity of a peptidase under test, using a salt thereof and a Q amide compound as a synthetic substrate.

ペプチダーゼは一般的にはペプチドのペプチド結合に作
用してアミン末端から切断してアミノ酸またはより低級
のペプチドを遊離させる酵素の総称として古くから知ら
れている。例えばロイシンアミノペプチダーゼ（臨床化
学においてＴｒｕｅＬＡＰともいう）やアリルアミグー
セ（臨床化学においてＣ１１ｎｉｃａｌＬＡＰともいう
、以下時としてＡＡと称する）などのアミノペプチダー
ゼ（以下Ｔｒｕｅ　ＬＡＰとＣ１１ｎｉｃａ７　ＬＡＰ
を併せて単にＬＡＰと称する）シスチンアミノペプチダ
ーゼ、プロリンアミノペプチダーゼ、アルギニンアミノ
ペプチダーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、γ−グル
タミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）などが知ら
れている。Peptidases have long been known as a general term for enzymes that act on the peptide bonds of peptides and cleave them from the amine terminus to liberate amino acids or lower peptides. For example, aminopeptidases (hereinafter referred to as True LAP and C11nica7 LAP) such as leucine aminopeptidase (also referred to as True LAP in clinical chemistry) and aryl amigose (also referred to as C11nicalLAP in clinical chemistry, hereinafter sometimes referred to as AA)
Cystine aminopeptidase, proline aminopeptidase, arginine aminopeptidase, alanine aminopeptidase, γ-glutamyl transpeptidase (γ-GTP), and the like are known.

上記酵素のうち、特にロイシンアミノペプチダーゼ（Ｌ
ＡＰ）やγ−クルタミルトランスペブチダーゼ（γ−Ｇ
ＴＰ）は、生体内のあらゆる組織に広く分布し、血清中
にも存在しておシ、病的条件によって増加することが知
られておシ、臨床検査上重要な酵素活性測定項目の対称
となっている酵素である。Among the enzymes mentioned above, especially leucine aminopeptidase (L
AP) and γ-glutamyl transpebutidase (γ-G
TP) is widely distributed in all tissues in the body, and is also present in serum. It is an enzyme that is

ＬＡＰはＬ−ペプチド、特にアミン末端がＬ−ロイシン
またはこれに関係あるアミノ酸であるペプチドを遊離ア
ミノ基をもつアミン末端残基を加水分解してＬ−ロイシ
ンを遊離させる酵素であって、生体内の各組織に広く分
布し、血清中にも存在していて、血清中の酵素量は生体
の状態により著しく変動することが知られておシ、急性
肝炎、肝癌、転移性肝癌、肝硬変症、胆道症などではＬ
ＡＰ活性が増加する。そこでＬＡＰ活性がかかる疾病の
１つの指標となり、この酵素活性を測定することは、こ
れら疾病の診断に必要欠くべからざる検査法の１つにな
っている。LAP is an enzyme that hydrolyzes L-peptides, especially peptides whose amine terminus is L-leucine or a related amino acid, to liberate L-leucine by hydrolyzing the amine-terminal residue with a free amino group. It is widely distributed in various tissues and is also present in serum, and the amount of enzyme in serum is known to vary significantly depending on the state of the body. L for biliary tract disease etc.
AP activity increases. Therefore, LAP activity is one of the indicators of such diseases, and measuring this enzyme activity is one of the indispensable testing methods for diagnosing these diseases.

γ−ＧＴＰは生体内でγ−グルタミルベプチドの代謝に
関与する酵素であり、γ−グルタミルペプチドを加水分
解すると共に、γ−グルタミル基を他のペプチドあるい
はアミノ酸に転移させる酵素であって、生体内の各組織
に広く分布し、血清中にも存在する。γ−ＧＴＰは病的
条件により著しく変動することが知られておシ、血清γ
−ＧＴＰは肝汁うつ滞型肝炎、閉寒性黄桓、原発性肝癌
、転移性肝癌などでは、著しい高値を示し、特に慢性肝
炎の非活動型では低値を示すが、活動型では高値を示す
など一般に慢性の肝疾患に特異的であシ、従来臨床的に
用いられて来た種々の逸脱酵素とは全く異なる診断学的
意義を有し、かかる血清γ−ＧＴＰ活性の測定はこのよ
うな扶病の診断および病態把握に必景欠くべからざる検
査法の１つになっている。γ-GTP is an enzyme involved in the metabolism of γ-glutamyl peptide in vivo, and is an enzyme that hydrolyzes γ-glutamyl peptide and transfers the γ-glutamyl group to other peptides or amino acids. It is widely distributed in various tissues in the body and is also present in serum. γ-GTP is known to fluctuate markedly depending on pathological conditions, and serum γ-GTP
- GTP shows extremely high levels in hepatic hepatitis, hepatitis japonica, primary liver cancer, metastatic liver cancer, etc. In particular, it shows low values in inactive forms of chronic hepatitis, but high values in active forms. The measurement of serum γ-GTP activity is generally specific to chronic liver diseases, and has a completely different diagnostic significance from the various deviant enzymes that have been used clinically. It has become one of the indispensable testing methods for diagnosing and understanding the pathological condition of dependent diseases.

従来、ＬＡＰ活性の測定法は多数報告されているが、そ
れらの大部分は合成基質よ、９ＬＡＰによって遊離され
るアミン化合物を比色定量することによｊ５ＬＡＰ活性
値を求める方法であって、それに用いる合成基質として
Ｌ−ロイシル−ｐ−ニトロアニリドを用い、ＬＡＰの酵
素作用により生成するｐ−ニトロアニリンの黄色を比色
定量する方法が挙けられるが、仁の比色定量の際、その
合成基質の呈色波長がオーバー・ラップする欠点があり
、また血清成分、特にビリルビン系色素による測定の影
響も免れることが出来ない欠点があった。Conventionally, many methods for measuring LAP activity have been reported, but most of them are methods for determining the j5LAP activity value by colorimetrically quantifying the amine compound liberated by 9LAP, which is a synthetic substrate. One method is to colorimetrically quantify the yellow color of p-nitroaniline produced by the enzymatic action of LAP using L-leucyl-p-nitroanilide as a synthetic substrate. There is a drawback that the coloring wavelengths of the substrates overlap, and there is also the drawback that measurements cannot be avoided by the influence of serum components, especially bilirubin dyes.

さらに、合成基質としてＬ−ロイシル−β−ナフチルア
ミドを用いる方法が挙げられるが、この方法では生成す
るβ−ナフチルアミンに５−二トロー２−アミノメトキ
シベンゼンジアゾテートなどをカップリングさせて色素
を形成させるがあるいは生成するβ−ナフチルアミンを
亜硝酸ナトリウムでジアゾ化し、Ｎ−（１−ナフチル）
−エチレンシアミンにカップリングさせるが、もしくは
ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドまたはｐ−ジメチ
ルアミノシンナムアルデヒドを縮合させて色素を形成せ
しめ、次いでこれを比色定量する方法であるが、反応過
程が複雑で、かつ厳密な操作を必要とするため、検査法
として伺不便であるはがりでなく、標準物質たるβ−ナ
フチルアミンの毒性が著しく、近年膀胱の膿瘍や癌を発
生することが明らかとなったため、発癌物質として、そ
の使用に特に厳密な注意を用するなどの欠点があった。Furthermore, there is a method using L-leucyl-β-naphthylamide as a synthetic substrate, but in this method, a dye is formed by coupling 5-nitro-2-aminomethoxybenzenediazotate to the β-naphthylamine produced. Alternatively, the resulting β-naphthylamine is diazotized with sodium nitrite to form N-(1-naphthyl).
- Coupling with ethylenecyamine or condensation of p-dimethylaminobenzaldehyde or p-dimethylaminocinnamaldehyde to form a dye, which is then colorimetrically determined, but the reaction process is complicated; The standard substance, β-naphthylamine, is extremely toxic and has recently been shown to cause bladder abscesses and cancer, so it is not a test method that is inconvenient as it requires strict procedures. As a substance, it had drawbacks such as requiring particularly strict precautions in its use.

一方、ｒ−ＧＴＰ活性の測定法も多数報告されているが
、それらの大部分は合成基質よシγ−ＧＴＰによって遊
離されるアミン化合物を比色定量することによシγ−Ｇ
ＴＰ活性値を求める方法であって、それを用いる合成基
質としてｒ−Ｌ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドを用
い、γ−ＧＴＰの酵素作用により生成するｐ−ニトロア
ニリンの黄色を４１０　ｎｍで比色定量する方法が挙げ
られるが、血清成分、特にビリルビン系色素などの影響
を避けるため、各検体に対して検体ブランクを厳密に測
定しなければならず、正確な測定値を得ることが困難で
あるという欠点があった。また生成スるｐ−ニトロアニ
リンをｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒド、ｐ−ジ
メチルアミノベンズアルデヒドなどのアルデヒド化合物
と縮合させて長波長側の赤色で測定する方法も挙げられ
るが、発色感度に対する温度の影響が大きく、測定値の
再現性に問題があった。また生成するｐ−二）ロアニリ
ンをジアゾ化し、８．５−キシレノールと縮合させて生
ずる赤色を測定する方法が提案されたが反応操作段階が
多く簡便性に欠けるという欠点があった。さらに合成基
質としてγ−Ｌ−グルタミルーβ−ナフチルアミドを用
いる方法が挙げられるが、これらの方法としてγ−ＧＴ
Ｐにより遊離したβ−ナフチルアミンをジアゾニウム塩
として比色定量する方法、８−メチル−２−ベンゾチア
ゾリノンヒドラゾンと酸化剤で発色させて比色定量する
方法、または前記アルデヒド化合物を発色剤として縮合
させて比色定量する方法があるが、前記と同様β−ナフ
チルアミンの発癌性が一般に指摘されているところであ
シ、操作が煩雑で測定に長時間を要するなどの点で実用
性に欠けている。On the other hand, many methods for measuring r-GTP activity have been reported, but most of them are based on colorimetric determination of amine compounds liberated by γ-GTP from synthetic substrates.
This method uses r-L-glutamyl-p-nitroanilide as a synthetic substrate and colorimetrically measures the yellow color of p-nitroaniline produced by the enzymatic action of γ-GTP at 410 nm. One method is to quantify it, but in order to avoid the influence of serum components, especially bilirubin dyes, sample blanks must be precisely measured for each sample, making it difficult to obtain accurate measurements. There was a drawback. Another method is to condense the p-nitroaniline produced with an aldehyde compound such as p-dimethylaminocinnamaldehyde or p-dimethylaminobenzaldehyde and measure the red color on the long wavelength side, but the effect of temperature on color sensitivity is There was a problem with the reproducibility of measured values. A method has also been proposed in which the resulting p-di)loaniline is diazotized and condensed with 8,5-xylenol to measure the resulting red color, but this method has the drawback of requiring many reaction steps and lacking in simplicity. Furthermore, there are methods using γ-L-glutamyl-β-naphthylamide as a synthetic substrate;
A method for colorimetric determination of β-naphthylamine liberated by P as a diazonium salt, a method for colorimetric determination by developing color with 8-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone and an oxidizing agent, or a method for colorimetric determination using the above aldehyde compound as a color former. There is a method for colorimetric determination of β-naphthylamine, but as mentioned above, it has been generally pointed out that β-naphthylamine is carcinogenic, and it lacks practicality in that it is complicated to operate and requires a long time for measurement. .

本発明者らは、かかる欠点を有する従来のＬＡＰやγ−
ＧＴＰ活性測定法を改良すべく鋭意研究を続けた結果、
ＬＡＰやγ−ＧＴＰ活性測定に優れた性質を有する新規
な合成基質を見い出し、本発明を完成したものでおる。The present inventors have investigated conventional LAP and γ-
As a result of intensive research to improve the GTP activity measurement method,
We have completed the present invention by discovering a new synthetic substrate that has excellent properties for measuring LAP and γ-GTP activities.

本発明は、ペプチダーゼの合成基質として新規なアミド
化合物〔１）またはその塩であり、また本発明はアミド
化合物〔■〕またはその塩に、被験液に含有されている
ペプチダーゼを作用させて、式 （式中、ＸおよびＹは前記と同じ意味を有する）で表わ
されるアニリン誘導体を遊離せしめ、次いで該アニリン
誘導体を化学的発色手段により発色させて生成する発色
化合物を比色定量することを特徴とする測定法である。The present invention relates to a novel amide compound [1] or a salt thereof as a synthetic substrate for peptidase, and the present invention relates to a novel amide compound [1] or a salt thereof as a synthetic substrate for peptidase. (wherein X and Y have the same meanings as above) is liberated, and then the aniline derivative is colored by a chemical coloring means, and the resulting colored compound is colorimetrically quantified. This is a measurement method that

本発明においてペプチダーゼの合成基質として用いられ
るアミド化合物ＣＩ）は、ペプチド合成の常法によって
製造することができる。即ち、Ｌ−ロイシンのα−カル
ボキシル基やＬ−グルタミン酸のγ−カルボキシル基と
アニリン誘導体（Ｉｆ）との縮合反応により得られる。The amide compound CI) used as a synthetic substrate for peptidase in the present invention can be produced by a conventional method of peptide synthesis. That is, it is obtained by a condensation reaction between the α-carboxyl group of L-leucine or the γ-carboxyl group of L-glutamic acid and the aniline derivative (If).

上記の縮合反応に際しては、予め反応に関与してけなら
ない官能基、即ちＬ−ロイシンのα−アミン基やＬ−グ
ルタミン酸のα−アミノ基およびα−カルボキシル基を
保護するのがよい。α−７ミノ基の保護基としては通常
ペプチド合成に用いられるα−アミノ保睦基が用いられ
る。例えばｔ−ブナルオキシカルボニル、ｔ−アミルオ
キシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニト
ロベンジルオキシカルボニル、アダマンタチルオキシカ
ルボニル、０−ニトロフェニルチオ基ｆＸ、トが挙げら
れる。Ｌ−グルタミン酸のα−カルボキシル基はメチル
エステル、エチルエステル、ｔ　−ブチルエステル、ベ
ンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステル、ｐ−メ
トキシベンジルエステルなどで保護するのが好ましいが
、脱離の除α−アミノ基の保護基と共に一段階で脱離さ
れる条件で脱離されるような保護基で保睦するのが特に
好まシイ。例えばα−７ミノ基をベンジルオキシカルボ
ニル基、α−カルボキシル基をベンジルエステルで保護
するのがその一例である。In the above condensation reaction, it is preferable to protect in advance functional groups that are involved in the reaction, ie, the α-amine group of L-leucine and the α-amino group and α-carboxyl group of L-glutamic acid. As a protecting group for the α-7 amino group, an α-amino protective group which is usually used in peptide synthesis is used. Examples include t-bunaloxycarbonyl, t-amyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, p-nitrobenzyloxycarbonyl, adamantatyloxycarbonyl, and 0-nitrophenylthio group fX. The α-carboxyl group of L-glutamic acid is preferably protected with methyl ester, ethyl ester, t-butyl ester, benzyl ester, p-nitrobenzyl ester, p-methoxybenzyl ester, etc.; It is particularly preferable to use a protecting group that can be removed in one step together with the protecting group of the group. For example, an α-7mino group is protected with a benzyloxycarbonyl group, and an α-carboxyl group is protected with a benzyl ester.

上記縮合反応に用いるアニリン誘導体［１１）の例とし
ては、８，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリン、８
．５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリン、Ｂ−クロロ
−６−ブロモ−４−ヒドロキシアニリンなどが挙げられ
る。Examples of the aniline derivative [11) used in the above condensation reaction include 8,5-dibromo-4-hydroxyaniline, 8
．． Examples include 5-dichloro-4-hydroxyaniline and B-chloro-6-bromo-4-hydroxyaniline.

上記の縮合反応は、α−アミン基が保役されたＬ−ロイ
シンのα−カルボキシル基またはα−アミノ基およびα
−カルボキシル基が保護されたＬ−グルタミン酸のγ−
カルボキシル基を酸ハライド、酸無水物、酸アジド、酸
イミダゾリド、活性エステル、例えばシアンメチルエス
テル、ｐ−ニトロフェニルエステル、２．４−ジニトロ
フェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドエステルナトの活性
化アシル欝導体に変換してアニリン誘導体〔旧と反応さ
せるか、あるいはカルボジイミド、例えばＮ、Ｎ’−ジ
シクロへキシルカルボジイミド、ＮＩＮ′−カルボニル
イミダゾール、インオキサシリウム塩、例えばウッドワ
ード試薬などの縮合剤の存在下上記の保護されたＬ−ロ
イシンまたはＬ−グルタミン酸とアニリン誘導体（ｎ）
を反応させることにより行われる。The above condensation reaction involves the α-carboxyl group or α-amino group of L-leucine carrying an α-amine group and the
-γ- of L-glutamic acid with protected carboxyl group
The carboxyl group can be converted into acid halides, acid anhydrides, acid azides, acid imidazolides, active esters such as cyan methyl ester, p-nitrophenyl ester, 2,4-dinitrophenyl ester, N-hydroxysuccinimide ester, N-hydroxyphthalimide ester to the activated acyl deconductor and react with aniline derivatives [old] or carbodiimides such as N,N'-dicyclohexylcarbodiimide, NIN'-carbonylimidazole, inoxacillium salts such as Woodward's reagent, etc. The above protected L-leucine or L-glutamic acid and aniline derivative (n) in the presence of a condensing agent of
This is done by reacting.

上記の縮合反応においては、通常不活性有機溶媒、例え
ばジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメ
チルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、
ベンゼン、クロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエ
タンなどの溶媒中、両者はぼ等量を加え、室温またはそ
れ以下の温度で反応させることによシ行われる。上記の
反応経過はシリカゲルなどの薄層クロマトグラフィー（
ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）な
どによシ追跡できるので、出発物質のいずれかの消失を
待って適宜反応を終了すればよい。In the above condensation reaction, inert organic solvents such as dimethylformamide, dimethylacetamide, dimethylsulfoxide, tetrahydrofuran, dioxane,
This is carried out by adding approximately equal amounts of both in a solvent such as benzene, chloroform, dichloromethane, dichloroethane, etc., and reacting at room temperature or lower temperature. The above reaction process can be traced using thin layer chromatography (such as silica gel).
Since the reaction can be monitored by TLC), high performance liquid chromatography (HPLC), etc., the reaction can be appropriately terminated after waiting for the disappearance of any of the starting materials.

このようにして得られた反応生成物は、反応溶媒を留去
するかまたは留去することなく、非親水性有機溶媒、例
えばクロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、酢酸
ブチル、メチルイソブチルケトン、ベンゼン、ジエチル
エーテルなどに溶かし、酸性水およびアルカリ性水で洗
浄した後、溶媒を留去することによシ採取できる。さら
にｆｐＩ製する必要がある場合には、適当な再結溶媒で
再結晶化するか、あるいはシリカゲル、活性アルミナ、
吸着樹脂などの吸着剤を用いるカラムクロマトグラフィ
ーによシ精製することができる。The reaction product thus obtained can be treated with non-hydrophilic organic solvents, such as chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, butyl acetate, methyl isobutyl ketone, benzene, diethyl, with or without distilling off the reaction solvent. It can be collected by dissolving it in ether, washing it with acidic water and alkaline water, and then distilling off the solvent. If it is necessary to further produce fpI, it may be recrystallized with a suitable recrystallization solvent, or silica gel, activated alumina,
It can be purified by column chromatography using an adsorbent such as an adsorption resin.

次いで得られた反応生成物の保護基を脱離するのである
が、この脱離化はペプチド化学における保護基の脱離化
法を用いて行われる。例えばα−アミン保護基がｔ−ブ
チルオキシカルボニル基である場合には、２Ｎ塩化水素
の酢酸溶液、トリフルオロ酢酸、ギ酸などを用いる方法
、ベンジルオキシカルボニル基である場合には、パラジ
ウム−炭素触媒を用いる接触還元による方法、臭化水素
酸の酢酸溶液を用いる方法により行えばよい。Ｌ−グル
タミン酸のα−カルボキシル基の保護基がベンジルエス
テルである場合には、パラジウム−炭素触媒を用いる接
触還元による方法で行えばよい。Next, the protective group of the resulting reaction product is removed, and this removal is carried out using a protective group removal method in peptide chemistry. For example, when the α-amine protecting group is a t-butyloxycarbonyl group, a method using a 2N hydrogen chloride acetic acid solution, trifluoroacetic acid, formic acid, etc. is used, and when it is a benzyloxycarbonyl group, a palladium-carbon catalyst is used. The reaction may be carried out by a method using catalytic reduction using a hydrobromic acid solution or a method using an acetic acid solution of hydrobromic acid. When the protecting group for the α-carboxyl group of L-glutamic acid is a benzyl ester, catalytic reduction using a palladium-carbon catalyst may be used.

このようにして得られたアミド化合物［１）を反応液か
ら採取するには、先ず保護基の脱離化が酸分解による場
合には、中オロし、接触還元による場合には触媒を除去
した後、非親水性有機溶媒、例えばクロロホルム、ジク
ロロメタン、ジクロロエタン、酢酸エチル、酢酸ブチル
、メチルイソブチルケトン、ベンゼン、ジエチルエーテ
ルナトの溶媒中、酸性水およびアルカリ性水で洗浄した
後、溶媒を留去することにより採取できる。さらに精製
する必要がある場合には、適当な再結溶媒で再結晶化す
るか、あるいはシリカゲル、活性アルミナ、吸着樹脂な
どの吸着剤を用いるカラムクロマトグラフィーによシ精
製することができる。In order to collect the amide compound [1) obtained in this way from the reaction solution, first, if the protecting group was removed by acid decomposition, it was oxidized, or if it was by catalytic reduction, the catalyst was removed. After washing with acidic water and alkaline water in a non-hydrophilic organic solvent such as chloroform, dichloromethane, dichloroethane, ethyl acetate, butyl acetate, methyl isobutyl ketone, benzene, diethyl ethernat, the solvent is distilled off. It can be collected by If further purification is required, it can be purified by recrystallization with a suitable recrystallization solvent or by column chromatography using an adsorbent such as silica gel, activated alumina, or adsorption resin.

本アミド化合物ＣＩ）は必要に応じ、塩酸、硫酸、硝酸
、リン酸などの無機酸との塩、ギ酸、酢酸、プロピオン
酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、シュウ酸などの有機
酸との塩を形成することができる。This amide compound CI) may be used as a salt with an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, or phosphoric acid, or with an organic acid such as formic acid, acetic acid, propionic acid, malic acid, citric acid, tartaric acid, or oxalic acid. can be formed.

次に、本アミド化合物ＣＩ）を用いるペプチダーゼ活性
測定法について述べる。本測定法においては、上記アミ
ド化合物（１）またはその塩に被験液に含有されている
ペプチダーゼ、特にＬＡＰまたはγ−〇ＴＰの作用によ
り遊離されるアニリン誘導体（ｎ）を定量するに当り、
化学的発色法を用いて発色化合物に導き、比色定量する
ものである。Next, a method for measuring peptidase activity using the present amide compound CI) will be described. In this measurement method, in quantifying the aniline derivative (n) released by the action of the amide compound (1) or its salt in the test solution, the peptidase, especially LAP or γ-〇TP,
A chemical coloring method is used to derive a coloring compound and perform colorimetric determination.

上記の化学的発色法としては、カプラー共存下でアニリ
ン誘導体〔ｌｌ）と酸化縮合させて発色化合物に導き比
色定量するのが好ましい。使用するカプラーとしては、
アニリン誘導体（Ｉｔ）と酸化縮合して発色化合物を形
成する芳香化合物であれば、どのような化合物でもよい
が、これらのうち代表的な芳香化合物としてはフェノー
ル系化合物、アミンフェノール系化合物、アニリン系化
合物またはナフトール系化合物が挙げられる。フェノー
ル系化合物の例としては、フェノール、サリチル酸、ｍ
−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、２．
６−ジヒドロキシ安息香酸、サリチル酸メチル、Ｏ−ク
レゾール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、０−エチ
ルフェノール、ｍ−エチルフェノール、２．８−キシレ
ノール、２．４−キシレノール、２．５−キシレノール
、８．６−キシレノール、２．６−キシレノール、０−
メトキシフェノール、ｍ−メトキシフェノール、ｐ−メ
トキシフェノール、２．６−シメトキシフエノール、０
−クロロフェノール、ｍ−クロロフェノール、ｐ−クロ
ロフェノール、２．４−ジクロロフェノール、２．６−
ジクロロフェノール、０−ブロモフェノール、ｍ−ブロ
モフェノール、ｐ−ブロモフェノール、２．４−ジブロ
モフェノール、２．６−ジブロモフェノール、２−メチ
ル−６−クロロフェノール、２−クロロ、−５−メチル
フェノール、０−カルボキシメチルフェノール、２−ヒ
ドロキシ−４−アミノエチルフェノールなどが挙けられ
、アミンフェノール系化合物の例としては、４−クロロ
−２−アミノフェノール、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−アミ
ンフェノール、４−メチル−２−アミンフェノール、６
−アミノ−２−ヒドロキシ安息香酸、２−アミノ−８−
ヒドロキシ安息香酸、０−アミンフェノール、ｍ−アミ
ノフェノール、ｐ−アきノフェノールなどが挙げられ、
アニリン系化合物の例としては、アニリン、０−トルイ
ジン、ｍ−トルイソｙ、ｐ−１ルイジン、Ｎ−メチルア
ニリン、Ｎ−エチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリ
ン、Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｏ
　−トルイジン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｐ−）ルイジン、
Ｎ、Ｎ−ジエチル−〇−トルイジン、Ｎ。As for the above-mentioned chemical coloring method, it is preferable to carry out oxidative condensation with the aniline derivative [ll] in the presence of a coupler to form a coloring compound, which is then subjected to colorimetric determination. The coupler to be used is
Any aromatic compound may be used as long as it forms a coloring compound through oxidative condensation with the aniline derivative (It), but typical aromatic compounds include phenolic compounds, aminephenol compounds, and aniline compounds. compounds or naphthol compounds. Examples of phenolic compounds include phenol, salicylic acid, m
-Hydroxybenzoic acid, p-hydroxybenzoic acid, 2.
6-dihydroxybenzoic acid, methyl salicylate, O-cresol, m-cresol, p-cresol, 0-ethylphenol, m-ethylphenol, 2.8-xylenol, 2.4-xylenol, 2.5-xylenol, 8 .6-xylenol, 2.6-xylenol, 0-
Methoxyphenol, m-methoxyphenol, p-methoxyphenol, 2.6-simethoxyphenol, 0
-chlorophenol, m-chlorophenol, p-chlorophenol, 2.4-dichlorophenol, 2.6-
Dichlorophenol, 0-bromophenol, m-bromophenol, p-bromophenol, 2.4-dibromophenol, 2.6-dibromophenol, 2-methyl-6-chlorophenol, 2-chloro, -5-methylphenol , 0-carboxymethylphenol, 2-hydroxy-4-aminoethylphenol, etc. Examples of aminephenol compounds include 4-chloro-2-aminophenol, N,N-diethyl-m-aminephenol. , 4-methyl-2-aminephenol, 6
-amino-2-hydroxybenzoic acid, 2-amino-8-
Examples include hydroxybenzoic acid, 0-aminephenol, m-aminophenol, p-acinophenol, etc.
Examples of aniline compounds include aniline, 0-toluidine, m-toluisoy, p-1 luidine, N-methylaniline, N-ethylaniline, N,N-dimethylaniline, N,N-diethylaniline, N, N-dimethyl-o
-toluidine, N,N-dimethyl-p-)luidine,
N, N-diethyl-〇-toluidine, N.

Ｎ−ジエチル−ｍ−）ルイジン、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｐ
−）ルイジン、０−クロロアニリン、ｍ−クロロアニリ
ン、ｍ−ブロモアニリン、アントラニル酸、８−アミノ
安息香酸、ｐ−ジメチルアミノ安息香酸、ｐ−クロロ−
０−）ルイジン、８−アミノ−４−メチル安息香酸、ｍ
−フェニレンジアミン、ＮｌＮ−ジメチル−ｍ−フェニ
レンジアミン、２−メチル−ｍ−フェニレンジアミン、
４−メチル−〇−フェニレンジアミン、４−メチル−ｍ
−フェニレンジアミン、２−クロロ−ｍ−フェニレンジ
アミン、８−クロロ−０−）ルイシン、２−メトキシ−
５−クロロアニリン、０−エチルアニリン、２．５−ジ
エチルアニリンフィール−Ｎ−ヒドロキシエチルアニリ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−ｍ−トルイジ
ンナトカ挙けられ、ナフトール系化合物の例としてはα
−ナフトール、β−ナフトール、２−カルボキシ−１−
ナフトール、４−クロロ−１−ナフトール、ｌ−ヒドロ
キシ−２−ナフトエ酸、１−ナフトール−２−スルホン
酸、１−ナフトール−８−スルホ／酸、ｌ−ナフトール
−４−スルホン酸、２−ナフトール−６−スルホン酸、
２−１−フトール−８，６−ジスルホン酸などが挙げら
れる。N-diethyl-m-)luidine, N,N-diethyl-p
-) Luidine, 0-chloroaniline, m-chloroaniline, m-bromoaniline, anthranilic acid, 8-aminobenzoic acid, p-dimethylaminobenzoic acid, p-chloro-
0-) luidine, 8-amino-4-methylbenzoic acid, m
-phenylenediamine, NlN-dimethyl-m-phenylenediamine, 2-methyl-m-phenylenediamine,
4-methyl-〇-phenylenediamine, 4-methyl-m
-phenylenediamine, 2-chloro-m-phenylenediamine, 8-chloro-0-)leucine, 2-methoxy-
Examples of naphthol compounds include 5-chloroaniline, 0-ethylaniline, 2.5-diethylaniline-N-hydroxyethylaniline, and N-ethyl-N-hydroxyethyl-m-toluidine.
-naphthol, β-naphthol, 2-carboxy-1-
Naphthol, 4-chloro-1-naphthol, l-hydroxy-2-naphthoic acid, 1-naphthol-2-sulfonic acid, 1-naphthol-8-sulfo/acid, l-naphthol-4-sulfonic acid, 2-naphthol -6-sulfonic acid,
Examples include 2-1-phthol-8,6-disulfonic acid.

上記の酸化縮合はｐｎを約４〜１２の範囲内で反応を行
わせることにより発色反応は定量的に完結する。上記ｐ
Ｈの維持のために緩衝液またはアルカリ水溶液としては
炭酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、水酸
化アルカリ水溶液などが有効に使用できる。In the above oxidative condensation, the coloring reaction is quantitatively completed by carrying out the reaction with pn within the range of about 4 to 12. above p
As the buffer solution or alkaline aqueous solution for maintaining H, carbonate buffer, phosphate buffer, borate buffer, alkali hydroxide aqueous solution, etc. can be effectively used.

上記の酸化縮合させるためにはアニリン誘導体（Ｉｌ）
とカプラーを酸化縮合することのできる酸化剤の存在下
で行われる。このような酸化剤としては、通常過ヨウ素
酸塩、クロシミ７１１次亜塩素酸塩などのハロゲンゝ不
酸化剤もしくは過ａ酸塩などの過酸化物系酸化剤、過酸
化水素などが挙けられるが、メタ過ヨウ素酸ナトリウム
は好適な一例である。For the above oxidative condensation, aniline derivative (Il)
and the coupler in the presence of an oxidizing agent capable of oxidative condensation. Examples of such oxidizing agents include periodate, halogen inoxidizing agents such as Kuroshimi 711 hypochlorite, peroxide-based oxidizing agents such as peralate, hydrogen peroxide, etc. However, sodium metaperiodate is a suitable example.

アニリン誘導体（ＩＩ）と上記カプラーとの酸化縮合に
より生成する発色化合物は、カプラーの種類によシ極大
吸収波長が約５５０〜７７０ｎｍに巾広く分布するが、
通常は殆んど５７０〜６８０ｎｍに極大吸収を有する有
色系色素であシ、呈色も極めて高感度で安定性も良く、
シかも温度による変動も殆んどなく、生体試料中のビリ
ルビンなどの大雑物による影響も受けにくいだめ、正の
誤差も殆んど受けることがないので、ＬＡＰやγ−ＧＴ
Ｐなどのペプチダーゼ活性測定に極めて好結果を与える
。The color-forming compound produced by the oxidative condensation of the aniline derivative (II) and the above coupler has a maximum absorption wavelength widely distributed in the range of about 550 to 770 nm, depending on the type of coupler.
Usually, it is a colored dye that has maximum absorption in the range of 570 to 680 nm, and its color development is extremely sensitive and stable.
There is almost no fluctuation due to temperature, and it is not easily affected by large substances such as bilirubin in biological samples, and there is almost no positive error, so LAP and γ-GT
It gives very good results in measuring the activity of peptidase such as P.

上記のアニリン誘導体〔Ｉ［）を呈色定量する他の方法
としては、ペンタシアノ鉄錯塩を過酸化物で処理して呈
色液を調製して発色させる方法が用いられる。上記の過
酸化物としては過ヨウ素酸ナトリウム塩、過ヨウ素酸カ
リウム塩、過マンガン酸カリウム、過酸化水素などが挙
けられるが、過酸化水素は最も好適な一例である。上記
鉄錯塩は重炭酸塩、例えば重炭酸ナトリウム、重炭酸リ
チウム、重炭酸カリウムなどと低分子デキストランを配
合するとさらに安定な鉄錯塩試薬が得られる。Another method for color quantitatively determining the above-mentioned aniline derivative [I[] is a method in which a pentacyanoiron complex salt is treated with a peroxide to prepare a coloring solution and color is developed. Examples of the above-mentioned peroxides include sodium periodate, potassium periodate, potassium permanganate, and hydrogen peroxide, with hydrogen peroxide being the most preferred example. When the above-mentioned iron complex salt is mixed with a bicarbonate such as sodium bicarbonate, lithium bicarbonate, potassium bicarbonate, etc., and low molecular weight dextran, a more stable iron complex reagent can be obtained.

また、これらの配合試薬は凍結乾燥した場合は、鉄錯塩
が非常に安定化され、呈色用反応試薬としてキット化す
る場合は凍結乾燥試薬とすることが望ましい。Furthermore, when these compounded reagents are freeze-dried, the iron complex salts are extremely stabilized, and when they are made into a kit as a coloring reaction reagent, it is desirable to use freeze-dried reagents.

上記の鉄錯塩を用いる呈色反応を行う場合には、酸性側
で反応を進行する方が好ましい。使用し得るｐＨとして
は８〜７であるのが好ましく、４〜５．５が最も好まし
い。上記のｐＨを維持するために通常弱酸性の緩衝液が
用いられるが、特に乳酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩な
どの緩衝液が好ましい。緩衝液の濃度は０．０１〜ＩＭ
の範囲内で使用し得るが、０．０５〜０．４Ｍの範囲の
１１１１１ｔ度が特に好ましい。When carrying out a color reaction using the above-mentioned iron complex salt, it is preferable to proceed with the reaction on the acidic side. The usable pH is preferably 8 to 7, most preferably 4 to 5.5. A weakly acidic buffer is usually used to maintain the above pH, and lactate, citrate, oxalate and other buffers are particularly preferred. Buffer concentration is 0.01-IM
11111t degree in the range of 0.05 to 0.4M is particularly preferred.

上記の鉄錯塩とアニリン誘導体（１１）との反応によっ
て形成される発色化合物は極大吸収波長が７００ｎｍ付
近に分布し一色調が安定なためＬＡＰやγ−ＧＴＰなど
のペプチダーゼ活性測定に適している。The color-forming compound formed by the reaction between the iron complex salt and the aniline derivative (11) has a maximum absorption wavelength around 700 nm and is stable in one color tone, so it is suitable for measuring the activity of peptidase such as LAP and γ-GTP.

さらにナトリウムペンタシアノアコフエリアートＮａ　
２（Ｆｅ　（ＣＮ）Ｂ・ＨＤ〕　を遊離したアニリン誘
導体〔■〕と反応させて発色化合物を形成せしめ、その
発色化合物の量を比色定量してＬＡＰやγ−ＧＴＰなど
のペプチダーゼ活性測定を行なってもよい。In addition, sodium pentacyanoacofeliato Na
2(Fe(CN)B・HD) is reacted with the liberated aniline derivative [■] to form a colored compound, and the amount of the colored compound is measured colorimetrically to measure the activity of peptidase such as LAP and γ-GTP. You may do so.

さらにまた、芳香族アミンを発色定量する方法、例えば
ジアゾカップリング法、アルデヒド系化合中を反応させ
て生成するシック塩基を定量する方法など公知の株々の
化学的発色法を適用してアニリン誘導体［［）を発色定
量することによｆｉＬＡＰやγ−ＧＴＰなどのペプチダ
ーゼ活性測定を行ってもよい。Furthermore, aniline derivatives can be obtained by applying various known chemical coloring methods, such as the method of colorimetrically quantifying aromatic amines, such as the diazo coupling method and the method of quantifying thick bases produced by reacting aldehyde compounds. Peptidase activity such as fiLAP and γ-GTP may be measured by colorimetrically quantifying [[).

次に、ＬＡＰの活性測定について更に詳しく説明する。Next, the measurement of LAP activity will be explained in more detail.

ＬＡＰの活性測定を行うに当っては、先−ｊＬＡＰの合
成基質であるし一ロイシル−８，５−ジハロゲノ−４−
ヒドロキシアニリドに被験液中のＬＡＰを酸素反応させ
てアニリン誘導体［１１）を遊離させる。被験液として
は血清を０．０１〜５−の範囲内で用いられる。上記酵
素反応は通常８７℃付近で５分取上反応させればよい。In measuring the activity of LAP, the synthetic substrate of -jLAP, leucyl-8,5-dihalogeno-4-
LAP in the test solution is reacted with hydroxyanilide with oxygen to liberate the aniline derivative [11]. As the test solution, serum is used within the range of 0.01 to 5-5. The above enzymatic reaction may be carried out for 5 minutes at around 87°C.

この反応の至適ｐＨは６．５〜８．０の範Ｈにあるから
、この範囲内で適宜ｐＨを設定すればよい。ｐＨを保持
するための緩衝液としては、リン酸塩、ノ（ルビタール
、ホウ酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタンなど
の緩衝液が用いられる。Since the optimum pH for this reaction is in the range H of 6.5 to 8.0, the pH may be appropriately set within this range. As a buffer for maintaining the pH, a buffer such as phosphate, rubital, borate, trishydroxymethylaminomethane, etc. is used.

生成したアニリン誘導体〔ＩＩ）を定量するに当っては
、ｐ−キシレノールなどのカプラー共存下でアルカリの
条件下メタ過ヨウ素酸ナトリウムなどの酸化剤で酸化縮
合させて発色化合物を形成して比色定量してもよく、ま
た過酸化水素などの酸化剤でペンタシアノアミノフェロ
エートを酸化して得た呈色試薬を用いて発色させ、比色
定量してもよい。To quantify the produced aniline derivative [II], a color-forming compound is formed by oxidative condensation with an oxidizing agent such as sodium metaperiodate under alkaline conditions in the presence of a coupler such as p-xylenol, and colorimetry is performed. It may be quantitatively determined, or it may be determined colorimetrically by developing a color using a coloring reagent obtained by oxidizing pentacyanoaminoferroate with an oxidizing agent such as hydrogen peroxide.

次にｒ−ＧＴＰの活性測定について更に詳しく説明する
。γ−ＧＴＰＯ活性測定を行うに当っては、先ずγ−Ｇ
ＴＰの合成基質であるγ−Ｌ−グ） ルタミルー８．５−ジハロゲノ−４−ヒドロキシアニリ
ドに被検液中のγ−ＧＴＰを酵素反応させてアニリン誘
導体（ＩＩ）を遊離させる。被験液としてＬ血清を０．
０１〜５−の範囲内で用いられる。Next, the measurement of r-GTP activity will be explained in more detail. When measuring γ-GTPO activity, first γ-G
Aniline derivative (II) is released by enzymatically reacting γ-GTP in the test solution with γ-L-glutamyl-8,5-dihalogeno-4-hydroxyanilide, which is a synthetic substrate for TP. 0.0% L serum was used as the test solution.
It is used within the range of 01 to 5-.

上記酵素反応は通常８７℃付近で６分以上反応させれば
よい。この反応の至適ｐＨは７．５〜９．０の範囲にあ
るから、この範囲内で適宜ｐＨを設定すればよい。反応
に際しては受容体としてアミノ酸やペプチド、例えばグ
リシルグリシンの適当量を含むｐＨ７，５〜９．０の緩
衝液中で反応させ、試料中のγ−ＧＴＰ活性に比例して
生成するアニリン誘導体（ｎ）を定量すればよい。ｐＨ
を保持するだめの緩衝液としては、リン酸塩、バルビタ
ール、ホウ酸塩、炭酸塩、トリエタノールアミン、グリ
シｙ、）リスヒドロキシメチルアミノメタンなどの緩衝
液が用いられる。The above enzymatic reaction may be carried out usually at around 87° C. for 6 minutes or more. Since the optimum pH for this reaction is in the range of 7.5 to 9.0, the pH may be appropriately set within this range. During the reaction, the reaction is carried out in a buffer solution with a pH of 7.5 to 9.0 containing an appropriate amount of an amino acid or peptide such as glycylglycine as a receptor, and an aniline derivative ( n) may be quantified. pH
Buffers such as phosphate, barbital, borate, carbonate, triethanolamine, glycine, and hydroxymethylaminomethane are used as buffers for retaining the .

生成したアニリン誘導体（ＩＩ）を定量するに当っては
、ＬＡＰの活性測定におけると同様な化学的発色法を用
いて発色化合物に導き、比色定量す。In quantifying the produced aniline derivative (II), a chemical coloring method similar to that used in measuring the activity of LAP is used to derive a coloring compound, followed by colorimetric determination.

ればよい。That's fine.

前記したように本発明の合成基質を用いる測定法は、各
反応工程が簡便力ため、速やかに且つ正確なＬＡＰ、　
　γ−ＧＴＰなどのペプチダーゼ活性値を測定すること
ができるばかシでなく、生成すを受けに＜＜、ペプチダ
ーゼ活性測定が精度の高い方法である。As mentioned above, the measurement method using the synthetic substrate of the present invention allows for quick and accurate LAP, because each reaction step is simple.
It is not foolproof to be able to measure the activity value of peptidase such as γ-GTP, but measurement of peptidase activity is a highly accurate method depending on the production.

次に実施例を挙げて本発明を見体的に説明するが、これ
により何ら本発明を限定するものではない。EXAMPLES Next, the present invention will be explained in detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto in any way.

同、実施例中に記載の略記号は次の意味を有する。The abbreviations described in the examples have the following meanings.

Ｌｅｕ；Ｌ−ロイシル ｒ−Ｇｌｕ；γ−Ｌ−グルタミル ＢＯＣ；ｔ−ブチルオキシカルボニル Ｏ８ｕ；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルＡ　ｃ
　ＯＨ；酢　酸 実施例　ｌ Ｌ−ロイシル−８，５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニ
リド・塩酸塩 ２．６−ジクロロ−４−アミノフェノールｌ、７８１１
（１０ミリモル）および炭酸水素ナト、リウム０．９２
．ｐ（１５ミリモル）を水２５−に溶かし、これに０〜
５℃に冷却しツツＢＯＣ−Ｌｅ　ｕ−Ｏ８１１８，２８
＆（１０ミリモル　）のジオキサン（２５ｍ）溶液を攪
拌下部した。室温で一夜攪拌した後、８０℃以下でジオ
キサンを減圧下留去した。残渣を酢酸エチル２００ｍ１
に溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、ｌＮ塩
酸、飽和食塩水の順で各５０４で８回づつ洗浄した。酢
酸エチル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧
濃縮してＢＯＣ−Ｌ−ロイシル−８，５−ジクロロ−４
−ヒドロキシアニリド２．９６．９を得た。次いで、こ
れを２　Ｎ　−ＨＣｌ　／　Ａｃ０）ｌ　１５　ｔｎｌ
に溶かし、室温で２時間攪拌した後、乾燥ジエチルエー
テル１０〇−を加えて結晶化し、乾燥エーテルで２回デ
カ／チージョンした。得られた結晶を減圧乾燥してＬ−
ロイシル−８，５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド
・塩酸塩を得た。Leu; L-leucyl r-Glu; γ-L-glutamyl BOC; t-butyloxycarbonyl O8u; N-hydroxysuccinimide ester A c
OH; Acetic acid Example l L-leucyl-8,5-dichloro-4-hydroxyanilide hydrochloride 2,6-dichloro-4-aminophenol l, 7811
(10 mmol) and sodium bicarbonate, lithium 0.92
．． Dissolve p (15 mmol) in water 25- and add 0 to
Cool to 5°C and heat
A solution of & (10 mmol) in dioxane (25 m) was added to the bottom with stirring. After stirring overnight at room temperature, dioxane was distilled off under reduced pressure at a temperature below 80°C. The residue was dissolved in 200ml of ethyl acetate.
The solution was washed eight times with 504 each in the order of saturated sodium hydrogen carbonate aqueous solution, water, 1N hydrochloric acid, and saturated saline. After drying the ethyl acetate layer over anhydrous magnesium sulfate, it was concentrated under reduced pressure to give BOC-L-leucyl-8,5-dichloro-4.
-Hydroxyanilide 2.96.9 was obtained. This was then diluted with 2N-HCl/Ac0)l 15 tnl
After stirring at room temperature for 2 hours, 100% of dry diethyl ether was added to crystallize, and the mixture was deca/cheeseed twice with dry ether. The obtained crystals were dried under reduced pressure to obtain L-
Leucyl-8,5-dichloro-4-hydroxyanilide hydrochloride was obtained.

収　量　　１．８９．９（収率８８．６％）分子式　　
Ｃ１□■］１ａ　ＮｚＯｚｃノ、・Ｈｅノ融　点　；１
２７〜１８８°Ｃ（分解）シリカゲル薄層クロマトグラ
フィ（ＴＬＣ）；Ｒｆ＝０．６８（ブタノール−酢酸−
水（４：１：１））ＩＲチャート（ＫＢｒ）；第１図の
通シ実施例　２ Ｌ−ロイシル−８，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニ
リド・塩酸塩 ２．６−ジプロモー４−アミンフェノール４．９０ｇ（
ｉｓ、ａミリモル）および炭酸水素ナトリウム１．６８
ｇ（２０ミリモル）を水７０−に溶がし、これに０〜５
℃に冷却しっつＢＯＣ−Ｌ　ｅ’ｕ−Ｏ８ｕ６、０１．
！ｉ＋（１８，８ミＩＪモル）ノジオキサン（７゜ｇＬ
ｔ）溶液を攪拌下部下した。室温で一夜攪拌した後、８
０℃以下でジオキサンを減圧下留去した。Yield 1.89.9 (yield 88.6%) Molecular formula
C1□■]1a Melting point of NzOzc,・He; 1
27-188°C (decomposed) silica gel thin layer chromatography (TLC); Rf = 0.68 (butanol-acetic acid-
Water (4:1:1)) IR chart (KBr); Figure 1 diagram Example 2 L-leucyl-8,5-dibromo-4-hydroxyanilide hydrochloride 2,6-dipromo-4-aminephenol 4.90g (
is, a mmol) and sodium bicarbonate 1.68
Dissolve 70 g (20 mmol) of water and add 0 to 5
Cool to ℃ and then cool to BOC-L eu-O8u6, 01.
! i + (18,8 mmol) nodioxane (7゜gL
t) The solution was lowered under stirring. After stirring overnight at room temperature, 8
Dioxane was distilled off under reduced pressure below 0°C.

残渣を酢酸エチル４００ｍに溶がし、飽和炭酸水素す）
　ＩＪウム水溶液、水、ｌＮ塩酸、飽和食塩水の順で各
１００４で８回づつ洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸
マグネシウムで乾燥した後、減圧濃縮してＢＯＣ−Ｌ−
ロイシル−８，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド
５．８ｇを得た。次いでこれを２　Ｎ−Ｈｅ　ｌ　／Ａ
　ｃ　ＯＨ８０−に溶がし、室温で２時間攪拌した後、
乾燥エーテルを加えて結晶化させてＬ−ロイシル８．５
−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド・塩酸塩を得た。Dissolve the residue in 400ml of ethyl acetate and add saturated hydrogen carbonate)
It was washed eight times with 1004 each in the order of IJum aqueous solution, water, IN hydrochloric acid, and saturated saline. After drying the ethyl acetate layer over anhydrous magnesium sulfate, it was concentrated under reduced pressure to obtain BOC-L-
5.8 g of leucyl-8,5-dibromo-4-hydroxyanilide was obtained. Next, this was 2 N-He l /A
c After dissolving in OH80- and stirring at room temperature for 2 hours,
Add dry ether to crystallize L-leucyl 8.5
-dibromo-4-hydroxyanilide hydrochloride was obtained.

収　量　　２．５０ｇ（収率４９．７％）分子式　　Ｃ
ｌ２Ｈ１６Ｎ２０２Ｂｒ２（４１６，５４）シリカゲル
薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）；Ｒ７＝　０．６５　
［ｎ　７プタノール：酢酸：水＝４：ｌ：１） 融　点　；１８１〜１８４℃　（分解）ＩＲ，チャー）
（ＫＢｒ法）第２図に示す通り実施例　８ γ−Ｌ−グルタミルー８．５−ジクロロ−４−ヒドロキ
シアニリド Ｎ、Ｎ−フタロイル−Ｌ−グルタミル酸無水物５．１６
ｇ（２０ミリモル）および４−アミノ−２，６−ジクロ
ロフェノール８．５６，９（２０ミリモル）をジオキサ
ン５０ｇＬｔに溶かし、６０℃で２時間攪拌した。ジオ
キサンを減圧下留去し、残渣にヒドラジン台ヒトラード
１．５ｇｎ１のメタノール（５〇−）溶液を加え、室温
で２日間放置した。メタノールを減圧下留去し、残渣に
水を加えた後、０．５Ｎ−ＨＣｎでｐ　Ｈ８に調節して
析出したｒ−Ｌ−グルタミル−８，５−ジクロロ−４−
ヒドロキシアニリド８．９６　ｇを得た。Yield 2.50g (yield 49.7%) Molecular formula C
l2H16N202Br2 (416,54) silica gel thin layer chromatography (TLC); R7 = 0.65
[n7butanol:acetic acid:water=4:l:1) Melting point: 181-184℃ (decomposition) IR, char)
(KBr method) As shown in Figure 2 Example 8 γ-L-glutamyl-8.5-dichloro-4-hydroxyanilide N,N-phthaloyl-L-glutamic anhydride 5.16
g (20 mmol) and 4-amino-2,6-dichlorophenol 8.56,9 (20 mmol) were dissolved in 50 g Lt of dioxane and stirred at 60°C for 2 hours. Dioxane was distilled off under reduced pressure, and a solution of 1.5 gn1 of hydrazine-based Hitlerde in methanol (50-g) was added to the residue, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 days. Methanol was distilled off under reduced pressure, water was added to the residue, and the pH was adjusted to 8 with 0.5N-HCn to precipitate r-L-glutamyl-8,5-dichloro-4-
8.96 g of hydroxyanilide was obtained.

収　量　　８．９６ｇ　（収率７２．９％）分子式　　
ＣＩＩＨＩ□Ｎ　、０　、Ｃｌ融　点　；２１４〜２１
７℃（分解） シリカゲルＴＬＣ；　Ｒ７＝０．４９　（ブタノール：
酢酸：水＝４：１：１） ＩＲチャート（ＫＢｒ法）；第８図に示す通り実施例　
４ γ−Ｌ−グルタミルー８．５−ジブロモ−４−ヒドロキ
シアニリド Ｎ、Ｎ−７タロイルーＬ−グルタミン酸無水物２．１８
９（８，４ミリモル）および４−アミノ−２，６−ジク
ロロフェノール２．２６　ｐ　（８，４ミリモル）をジ
オキサン２０−に溶かし、６０℃で１．５時間攪拌した
。ジオキサンを減圧下留去し、残渣にヒドラジン・ヒト
ラード０．７−のメタノール（２０ｇｎｔ）溶液を加え
、室温で２日間放置した。Yield 8.96g (yield 72.9%) Molecular formula
CIIHI□N, 0, Cl melting point; 214-21
7°C (decomposed) silica gel TLC; R7=0.49 (butanol:
Acetic acid: water = 4:1:1) IR chart (KBr method); Examples as shown in Figure 8
4 γ-L-glutamyl-8.5-dibromo-4-hydroxyanilide N, N-7 talloy-L-glutamic anhydride 2.18
9 (8.4 mmol) and 2.26 p (8.4 mmol) of 4-amino-2,6-dichlorophenol were dissolved in dioxane 20- and stirred at 60° C. for 1.5 hours. Dioxane was distilled off under reduced pressure, and a methanol (20 gnt) solution of 0.7-hydrazine-Hittle was added to the residue, which was left to stand at room temperature for 2 days.

メタノールを減圧下留去し、残渣に水を加えた後、０．
５Ｎ−Ｉ−１ｃｌでｐ　Ｉ−Ｔ　８に調節して析出した
γ−Ｌ−ｆルタミル−８，５−ジブロモ−４−ヒドロキ
シアニリド２．１８．９を得た。After methanol was distilled off under reduced pressure and water was added to the residue, 0.
The p I-T was adjusted to 8 with 5N-I-1 cl to obtain precipitated γ-L-f rutamyl-8,5-dibromo-4-hydroxyanilide 2.18.9.

収　量　　２．１８．ｌｉｔ　　（収率６４．０％）分
子式　　Ｃ＋ｓＨ１ｔＮｘｏ　４Ｂ　ｒｌ融　点　；１
９１〜１９４°Ｃ（分解）シリカゲルＴＬＣ；Ｒｆ＝０
．５８　（ブタノール：酢酸：水＝４：１：１） ＩＲチャー）（ＫＢｒ法）第４図に示す通シ実施例　５ Ｌ−ロインＡ／−８、５−ジクロロ−４−ヒドロキシア
ニリド、メタ過ヨウ素酸ナトリウムーｐ−キシレノール
を用いるＬＡＰ活性測定 り一ロイシルー８．５−シクロロー４−ヒドロキシアニ
リド・塩酸塩を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に
溶解して基質溶液とした（　５　ｍ　Ｍ　）。Yield 2.18. lit (yield 64.0%) Molecular formula C+sH1tNxo 4B rl Melting point; 1
91-194°C (decomposed) silica gel TLC; Rf=0
．． 58 (butanol:acetic acid:water=4:1:1) IR char) (KBr method) Example 5 L-loin A/-8, 5-dichloro-4-hydroxyanilide, metafiltrate LAP activity measurement using sodium iodate-p-xylenol Leucyl-8,5-cyclo-4-hydroxyanilide hydrochloride was dissolved in 0.1M phosphate buffer (pH 7.0) to prepare a substrate solution (5 m M).

この基質溶液１−に、患者血清（２８６Ｇ−４４単位の
ＬＡＰ　）２０μノを加え良く混合し、８７℃にて２０
分間反応させた。反応後、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリ
ウム、１０ｍＭｐ−キシレノールを含有する０、２ＮＫ
ＯＨ溶液からなる酸化試薬液８−を加え反応せしめて発
色させた。To this substrate solution 1-, 20μ of patient serum (286G-44 units of LAP) was added, mixed well, and heated to 87℃ for 20 minutes.
Allowed to react for minutes. After the reaction, 0.2NK containing 2mM sodium metaperiodate, 10mM p-xylenol
An oxidizing reagent solution 8- consisting of an OH solution was added and reacted to develop color.

次いでこれを波長５８５ｎｍにおける発色液の吸光度を
測定したところＯ−Ｄ５８＋！＝　０．１８を得た。Next, when the absorbance of the coloring liquid was measured at a wavelength of 585 nm, it was O-D58+! = 0.18 was obtained.

すなわち、本発明の合成基質は、臨床上、重要とされて
いるＬＡＰに対して良く作用することが示された。In other words, the synthetic substrate of the present invention was shown to act well against LAP, which is clinically important.

実施例　６ Ｌ−ロイシル−８，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニ
リド、メタ過ヨウ素酸ナトリウムーｐ−キシレノールを
用いるＬＡＰ活性測定 り一ロイシルー８．５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニ
リド・塩酸塩を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に
溶解して基質溶液とした（５ｍＭ）。Example 6 Measurement of LAP activity using L-leucyl-8,5-dibromo-4-hydroxyanilide and sodium metaperiodate-p-xylenol. It was dissolved in 1M phosphate buffer (pH 7,0) to prepare a substrate solution (5mM).

この基質溶液１−に、患者血清（２５０Ｇ−Ｒ，単位の
ＬＡＰ　）２０μｌを加え良く混合し、８７℃にて２０
分間反応させた。反応後、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリ
ウム、１０ｍＭｐ−キシレノールを含有する０、２Ｎ−
ＫＯＨ溶液からなる酸化試薬液８−を加え、発色させた
。Add 20 μl of patient serum (250 G-R, unit of LAP) to this substrate solution 1-, mix well, and heat at 87°C for 20
Allowed to react for minutes. After the reaction, 0,2N- containing 2mM sodium metaperiodate, 10mM p-xylenol
An oxidizing reagent solution 8- consisting of a KOH solution was added to develop color.

次いで、これを波長５８５ｎｍにおける発色液の吸光度
を測定したところＯ，Ｄ、＝０．２２を得た。Next, when the absorbance of the coloring liquid was measured at a wavelength of 585 nm, O, D = 0.22 was obtained.

すなわち、本発明の合成基質は、臨床上、重要とされて
いるＬＡＰに対して良く作用することが示された。In other words, the synthetic substrate of the present invention was shown to act well against LAP, which is clinically important.

実施例　７ γ−Ｌ−グルタミルー８，５−ジクロロ−４−ヒドロキ
シアニリド、メタ過ヨウ素酸ナトリウムーｐ−キシレノ
ールを用いるγ−ＧＴＰ活性測定γ−Ｌ−グルタミル−
８，５−５ｍＭジクロロ−４−ヒドロキシアニリド及び
１００ｍＭグリシルグリシンを５０ｍＭ）リス塩酸緩衝
液（ｐＨ８，０）に溶解して基質溶液とした。この基質
溶液０．５−に、患者血清（１８０ｍＵ、／ｆＬ／のｒ
−ＧＴＰ）１０μｌを加え良く混合し、８７℃にて２０
分間反応させた。反応後、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリ
ウム＼　１０ｍＭｐ−キシレノールを含有する０、２Ｎ
　−Ｋ　ＯＨ溶液からなる酸化試薬９２−を加えて発色
させた。Example 7 γ-GTP activity measurement using γ-L-glutamyl-8,5-dichloro-4-hydroxyanilide, sodium metaperiodate-p-xylenol γ-L-glutamyl-
8,5-5mM dichloro-4-hydroxyanilide and 100mM glycylglycine were dissolved in 50mM) Lis-HCl buffer (pH 8,0) to prepare a substrate solution. Patient serum (180 mU, /fL/r
-GTP), mix well, and heat at 87℃ for 20 minutes.
Allowed to react for minutes. After the reaction, 0.2N containing 2mM sodium metaperiodate\10mM p-xylenol
-An oxidizing reagent 92- consisting of a KOH solution was added to develop color.

次いで　これを波長５８５ｎｍにおける発色液の吸光度
を測定したところＯ、Ｄ５．、＝　０．１１２を得た。Next, when the absorbance of the coloring liquid was measured at a wavelength of 585 nm, it was O, D5. , = 0.112 was obtained.

すなわち、本発明の合成基質は、臨床上、重要とされて
いるγ−ＧＴＰに対して良く作用することが示された。In other words, the synthetic substrate of the present invention was shown to act well on γ-GTP, which is clinically important.

実施例８ γ−Ｌ−グルタミルー８，５−ジブロモ−４−ヒドロキ
シアニリド、メタ過ヨウ素酸ナトリウムーｐ−キシレノ
ールを用いるγ−ＧＴＰ活性測定γ−Ｌ−グルタミル−
８，５−ジブロモ−４−５ｍＭヒドロキシアニリドおよ
び１００ｍＭグリシルグリシンを５０　ｍ　Ｍ　）リス
塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解して基質溶液とした。Example 8 γ-GTP activity measurement using γ-L-glutamyl-8,5-dibromo-4-hydroxyanilide, sodium metaperiodate-p-xylenol γ-L-glutamyl-
8,5-dibromo-4-5mM hydroxyanilide and 100mM glycylglycine were dissolved in 50mM) lithium-hydrochloric acid buffer (pH 8,0) to prepare a substrate solution.

この基質浴液０．　５−に患者面ｆｆ（１８０ｍＵ／−
の１−Ｇ　Ｔ　Ｐ　）　１０μｍを加え良く混合し、８
７℃にて２０分間反応させた。反応後、２ｍＭメタ過ヨ
ウ素酸ナトリウム、１０ｍＭｐ−キシレノールを含有す
る０、２Ｎ−ＫＯＨ溶液からなる酸化試薬液２記を加え
て発色させた。This substrate bath solution 0. 5- patient surface ff (180 mU/-
Add 1-G T P ) 10 μm and mix well.
The reaction was carried out at 7°C for 20 minutes. After the reaction, two oxidizing reagent solutions consisting of a 0.2N KOH solution containing 2mM sodium metaperiodate and 10mM p-xylenol were added to develop color.

次いで、これを波長５８５ｎｍにおける発色液の吸光度
を測定したところ０　、　Ｄ５．、＝　０．１４０を得
た。Next, when the absorbance of the coloring liquid was measured at a wavelength of 585 nm, it was found to be 0, D5. , = 0.140 was obtained.

すなわち、本発明の合成基質は、臨床上、重要とされて
いるγ−ＧＴＰに対して良く作用することが示された。In other words, the synthetic substrate of the present invention was shown to act well on γ-GTP, which is clinically important.

実施例９ Ｌ−ロイシル−８，５−シフロモー４−ヒドロキシアニ
リド、メタ過ヨウ素酸ナトリウムー２−クロロ−５−メ
チルフェノールを用いるＬＡＰ活性測定 り一ロイシルー８．５シフロモー４−ヒドロキシアニリ
ド・塩酸塩を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶
解して基質溶液とした（５ｍＭ）。この基質溶液ｌ−に
、患者血清（２５０Ｇ−４単位のＬＡＰ）２０μｌを加
え良く混合し、８７℃にて２０分間反応させた。反応後
、２ｍＭメタ過ヨウ累酸ナトリウム、５ｍＭ２−クロロ
−５−メチルフェノールを含有する０、２Ｎ−ＫＯＨ溶
液からなる酸化試薬液８−を加え発色させた。Example 9 LAP activity measurement using L-leucyl-8,5-sifuromo-4-hydroxyanilide, sodium metaperiodate-2-chloro-5-methylphenol - Leucyl-8,5-sifuromo-4-hydroxyanilide hydrochloride It was dissolved in 0.1M phosphate buffer (pH 7,0) to prepare a substrate solution (5mM). To this substrate solution 1-, 20 μl of patient serum (250 G-4 units of LAP) was added, mixed well, and reacted at 87° C. for 20 minutes. After the reaction, an oxidizing reagent solution 8- consisting of a 0,2N-KOH solution containing 2mM sodium metaperiodate and 5mM 2-chloro-5-methylphenol was added to develop color.

次いで、これを波長６８５ｎｍにおける発色液の吸光度
を測定したところ、０　、　Ｄ、、、＝　０．８８を得
た。Next, when the absorbance of the coloring liquid was measured at a wavelength of 685 nm, 0, D,...=0.88 was obtained.

すなわち、本発明の合成基質は、ＬＡＰに対して良く作
用することが示された。That is, it was shown that the synthetic substrate of the present invention acts well on LAP.

実施例１０ γ−Ｌ−グルタミルー８，５−ジブロモ−４−ヒドロキ
シアニリド、メタ過ヨウ素酸ナトリウムー２−クロロ−
５−メチルフェノールを用いるγ−ＧＴＰ活性測定 γ−Ｌ−グルタミルー８，５−ジブロモ−４−５ｍＭヒ
ドロキシアニリドおよび１００ｍＭグリシルグリシンを
５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解して基
質溶液とした。この基質溶液０．５ｇＬｔに患者血清（
１８０ｍＵ／−のｒ−ＧＴＰ）ｌＯμノを加え良く混合
し、８７℃にて２０分間反応させた。反応後、２ｍＭメ
タ過ヨウ素酸ナトリウム、５ｍＭ２−ｐロワー５−メチ
ルフェノールを含有する０、２Ｎ−ＫＯＨ溶液からなる
酸化試薬液２ｇＬｔを加えて発色させた。Example 10 γ-L-glutamyl-8,5-dibromo-4-hydroxyanilide, sodium metaperiodate-2-chloro-
γ-GTP activity measurement using 5-methylphenol γ-L-glutamyl-8,5-dibromo-4-5mM hydroxyanilide and 100mM glycylglycine were dissolved in 50mM) Lis-HCl buffer (pH 8,0) to prepare a substrate solution. And so. Add patient serum (0.5gLt) to this substrate solution (
180 mU/- of r-GTP) was added, mixed well, and reacted at 87°C for 20 minutes. After the reaction, 2 g of an oxidizing reagent solution consisting of a 0,2N-KOH solution containing 2 mM sodium metaperiodate and 5 mM 2-p-lower-5-methylphenol was added to develop color.

次いで、これを波長６８５ｎｍにおける発色液の吸光度
を測定したところ０　、　Ｄ、３．＝　０．２１４を得
た。Next, when the absorbance of the coloring liquid was measured at a wavelength of 685 nm, it was found to be 0, D, 3. = 0.214 was obtained.

すなわち、本発明の合成基質は、γ−ＧＴＰに対して良
く作用することが示された。That is, the synthetic substrate of the present invention was shown to act well on γ-GTP.

実施例１Ｉ Ｌ−ロイシル−８，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニ
リド、ナトリウムペンタシアノアミノフェロエートを用
いるＬＡＰ活性測定 ナトリウムペンタシアノアミノフェロエート２ｇを水２
０−に溶解し、０．８％過酸化水素６０ｄを加え、更に
ｌＯ％重炭酸ナトリウム液２０ｇＬｔを加えた。次にデ
キストランＴｌ０（ファルマシア社製１４ｇを加え、呈
色原液を調製した。反応停止・呈色原液１ｇＬｔに１％
食塩および０．５％Ｔｗｅｅｎ　８０を含有する０、２
Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ４，５）５０−を加えて調製
した。Example 1I Measurement of LAP activity using L-leucyl-8,5-dibromo-4-hydroxyanilide, sodium pentacyanoaminoferroate 2 g of sodium pentacyanoaminoferroate was mixed with 2 g of water.
0-, added 60 d of 0.8% hydrogen peroxide, and further added 20 g Lt of 1O% sodium bicarbonate solution. Next, 14 g of dextran Tl0 (manufactured by Pharmacia) was added to prepare a coloring stock solution.1%
0,2 containing salt and 0.5% Tween 80
It was prepared by adding 50% of M citrate buffer (pH 4,5).

０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し九Ｆ＞　
ｍ　Ｍ　Ｌ−ロイシル−８，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩１＠／に患者血清（２５０Ｇ−Ｒ
単位のＬＡＰ）２０μｌを加え良く混合し、８７℃にて
２０分間反応させた。反応後、反応停止・呈色液５−を
加え、室温に２０分間放置し、呈色させた後、７００ｎ
ｍにて吸光度を測定した。その結果、０．Ｄ７゜。＝　
０．２１であった。9F> dissolved in 0.1M phosphate buffer (pH 7,0)
m M L-leucyl-8,5-dibromo-4-hydroxyanilide hydrochloride 1@/ to patient serum (250G-R
20 μl of LAP) was added, mixed well, and reacted at 87° C. for 20 minutes. After the reaction, add the reaction stop/coloring solution 5-, leave it at room temperature for 20 minutes, let the color develop, and then add 700n
Absorbance was measured at m. As a result, 0. D7°. =
It was 0.21.

実施例１２ γ−Ｌ−グルタミルー８．５−ジブロモ−４−ヒドロキ
シアニリド、ナトリウムペンタシアノアミノフェロエー
トを用いるγ−ＧＴＰ活性測定５０ｍＭ）リス塩酸緩衝
液（ｐＨ８，０）に溶解した５ｍＭγ−Ｌ−グルタミル
ー８．５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド、１００
ｍＭグリシルグリシン溶液ｌ−に患者血清（１８０ｍＵ
／−のｒ−ＧＴＰ）２０μノを加えて良く混合し、８７
℃にて２０分間反応させた。反応後、実施例１１に記載
した反応停止・呈色液５−を加え、室温に２０分間放置
し、呈色させた後、７００ｎｍに吸光度を測定した。そ
の結果、０　、　Ｄ７ｏｏ−０，１８２であった。Example 12 γ-GTP activity measurement using γ-L-glutamyl-8.5-dibromo-4-hydroxyanilide, sodium pentacyanoaminoferroate 5mM γ-L- dissolved in Lis-HCl buffer (pH 8,0) Glutamyl-8,5-dibromo-4-hydroxyanilide, 100
Patient serum (180 mU
/- r-GTP) and mix well, 87
The reaction was carried out at ℃ for 20 minutes. After the reaction, the reaction stopping/coloring solution 5- described in Example 11 was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 20 minutes to develop color, and then the absorbance was measured at 700 nm. The result was 0, D7oo-0,182.

実施例１８ Ｌ−ロイシル−８，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニ
リド、ナトリウムペンタシアノアコフェリアートを用い
るＬＡＰ活性測定法 り一ロイシルー８．５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニ
リド、塩酸塩を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に
溶解して基質溶液（５、ｍ　Ｍ　）とした。この基質溶
液ｌ−に患者血清（２５０Ｇ−Ｒ単位のＬＡＰ　）２０
μｌを加え良く混合し、８７℃にて１５分間反応させた
。反応後、１％−ナトリウムペンタシアノアコフェリア
ート８０−に０．２ＭＥＤＴＡ　・２Ｎａ　（ｐＨ１１
）溶液９０−を加えて１１！Ｊ製した溶液４−を加え８
７℃にて１５分間反応させた。反応呈色後、７８０ｎｍ
にて吸光度を測定した。その結果、０．Ｄ７．。−０，
２８２であった。Example 18 LAP activity measurement method using L-leucyl-8,5-dibromo-4-hydroxyanilide, sodium pentacyanoacopheriate Leucyl-8,5-dibromo-4-hydroxyanilide, hydrochloride at 0.1 M It was dissolved in phosphate buffer (pH 7,0) to prepare a substrate solution (5, mM). Add 20 liters of patient serum (250 G-R units of LAP) to this substrate solution.
μl was added, mixed well, and reacted at 87° C. for 15 minutes. After the reaction, 0.2M EDTA 2Na (pH 11
) Add solution 90-11! Add solution 4- prepared by J and add 8
The reaction was carried out at 7°C for 15 minutes. After reaction coloring, 780nm
The absorbance was measured at As a result, 0. D7. . -0,
It was 282.

１％−ナトリウムペンタシアノアコフェリアートは、１
％−ニトロプルジッドナトリウムＮａ（Ｆｅ（ＯＮ）、
ＮＤ）−１％炭酸す）　Ｉｊ　’；７ムｉヲ１５分間、
紫外線照射して作製した。1%-sodium pentacyanoacoferiate is 1
%-nitropurgide sodium Na(Fe(ON),
ND)-1% carbonic acid) Ij'; 7mm for 15 minutes,
It was made by irradiating it with ultraviolet light.

実施例１４ γ−Ｌ−グルタミルー８．５−ジブロモ−４−ヒドロキ
シアニリドを用いたγ−ＧＴＰＯ検量線γ−Ｌ−グルタ
ミル−８，５−ジブロモ−４−５ｍＭヒドロキシアニリ
ドおよび１００ｍＭグリシルグリシンを５０ｍＭ）リス
塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解して基質溶液とした。Example 14 γ-GTPO calibration curve using γ-L-glutamyl-8,5-dibromo-4-hydroxyanilide γ-L-glutamyl-8,5-dibromo-4-5mM hydroxyanilide and 100mM glycylglycine at 50mM ) It was dissolved in Lis-HCl buffer (pH 8,0) to prepare a substrate solution.

この基質溶液０．５−に血清ｒ　−Ｇ　Ｔ　Ｐ　（７４
〜８７０ｍＵ／ｍ　）　１０ｐｌを加えて良く混合し、
８７℃にて２００分間反応せた。反応後、２ｍＭメタ過
ヨウ素酸ナトリウム１０　ｍ　Ｍ　ｐ−キシレノールを
含有する０、２Ｎ−ＫＯＨ溶液からなる酸化試薬液２−
を加えて発色させた。Serum r -G T P (74
~870mU/m ) Add 10pl and mix well.
The reaction was carried out at 87°C for 200 minutes. After the reaction, an oxidizing reagent solution 2- consisting of a 0,2N-KOH solution containing 2mM sodium metaperiodate and 10mM p-xylenol was added.
was added to develop color.

次いで、これを波長５８５ｎｍにおける発色液の吸光度
を測定した。その結果を第５図に示し友。Next, the absorbance of the coloring liquid was measured at a wavelength of 585 nm. The results are shown in Figure 5.

この結果よシ血渭γ−ＧＴＰが良好に測定されることが
示され友。These results demonstrate that blood γ-GTP can be measured well.

【図面の簡単な説明】 第１［ｊ：Ｌ−ロイシル８．５−ジクロロ−４−ヒドロ
キシアニリド、塩酸塩のＩＲチャート、第２図はＢ　ｏ
　Ｃ−Ｌ　−ロイシル−８，５−ジブｏ　モー　４−ヒ
ドロキシアニリドのＩＲチャート、第８図はγ−Ｌ−グ
ルタミルー８，６−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド
のＩＲチャート、第４図はγ−Ｌ−グルタミルー８．５
−シフ’ロモー４−ヒドロキシアニリドのＩＲチャート
、第５図はγ−ＧＴＰの検量線である。 ４１−[Brief explanation of the drawings] 1 [j: IR chart of L-leucyl 8.5-dichloro-4-hydroxyanilide, hydrochloride, Figure 2 is B o
IR chart of C-L-leucyl-8,5-dibutyl-4-hydroxyanilide, Figure 8 is an IR chart of γ-L-glutamyl-8,6-dichloro-4-hydroxyanilide, Figure 4 is IR chart of γ- L-glutamyl 8.5
- IR chart of siphromo-4-hydroxyanilide, FIG. 5 is a calibration curve of γ-GTP. 41-

Claims (1)

【特許請求の範囲】 （１）式 （式中、几はＬ−ロイシル基またはγ−Ｌ−ブルタミル
基、ＸおよびＹは同一かまたは異なシ、ハロゲン原子を
示す）で表わされるアミド化合物またはその塩。 （２）ＲがＬ−ロイシル基であシ、ハロゲン原子が臭素
原子または塩素原子である特許請求の範囲第１項記載の
アミド化合物またはその塩。 （３）Ｌ−ロイシル−８，５−ジブロモ−４−ヒドロキ
シアニリドまたはＬ−ロイシル−８，５−ジクロロ−４
−ヒドロキシアニリドである特許請求の範囲第２項記載
のアミド化合物またはその塩。 （４）Ｒがγ−Ｌ−グルタミル基であｐ１ハロゲン原子
が臭素原子または塩素原子である特許請求の　　　□範
囲第１項記載のアミド化合物またはその塩。 （５）　　ｒ−Ｌ−グルタミル−８，５−ジブＣ１モー
　４−ｔニトロキシアニリドまたはγ−Ｌ−グルタミル
ー８゜５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリドである特
許請求の範囲第４項記載のアミド化合物またはその塩。 （６）式 （式中、ＲはＬ−ロイシル基またはγ−Ｌ−グルタミル
基、ＸおよびＹは同一かまたは異なシ、ハロゲン原子を
示す）で表わされるアミド化合物またはその塩に、被験
液に含有されているペプチダーゼを作用させて、式 （式中、ＸおよびＹは前記と同じ意味を有する）で表わ
されるアニリン誘導体を遊離せしめ、次いで該アニリン
誘導体を化学的発色手段により発色させて生成する発色
化合物を比色定量することを特徴とする測定法。 （７）　　アミド化合物がＬ−ロイシル−８，５−ジノ
・ソゲノー４−ヒドロキシアニリドであシ、ペプチダー
ゼがＬ−ロイシンアミノペプチダーゼである特許請求の
範囲第６項記載の測定法。 （８）Ｌ−ロイシル−８，６−ジツ＼ロゲノー４−ヒド
ロキシアニリドがＬ−ロイシル−８，５−ジブロモ−４
−ヒドロキシアニリドまたはＬ−ロイシル４．５−ジク
ロロ−４−ヒドロキシアニリドである特許請求の範囲第
７項記載の測定法。 （９）　　アミド化合物がγ−Ｌ−グルタミルー８．５
−ジハロゲノ−４−ヒドロキシアニリドであり、ペプチ
ダーゼがγ−グルタはルトランスペプチダーゼである特
許請求の範囲第６項記載の測定法。 αＯｒ−Ｌ−グルタミル−８，５−ジハロゲノ−４−ヒ
ドロキシアニリドがγ−Ｌ−グルタミルー８．６−ジプ
ロモー４−ヒドロキシアニリドまたはγ−Ｌ−グルタミ
ルー８．５−シクロロー４−ヒドロキシアニリドである
特許請求の範囲第７項記載の測定法。 （１１）化学的発色手段がカプラーを共存させて酸化縮
合を行い、発色させる方法である特許請求の範囲第６項
記載の測定法。 （１２）カプラーが該アニリン誘導体と酸化縮合して発
色化合物を形成する芳香族化合物である特許請求の範囲
第１１項記載の測定法。 （１８）芳香族化合物がフェノール系化合物、アミノフ
ェノール系化合物、アニリン系化合物またはナフトール
系化合物である特許請求の範囲第１２項記載の測定法。 （１４）化学的発色手段がペンタシアノ鉄錯塩を用いて
発色させる方法である％軒請求の範囲第６項記載の測定
法。[Scope of Claims] An amide compound represented by the formula (1) (in the formula, 几 is an L-leucyl group or a γ-L-butamyl group, and X and Y are the same or different, and represents a halogen atom) or its salt. (2) The amide compound or its salt according to claim 1, wherein R is an L-leucyl group and the halogen atom is a bromine atom or a chlorine atom. (3) L-leucyl-8,5-dibromo-4-hydroxyanilide or L-leucyl-8,5-dichloro-4
- The amide compound or salt thereof according to claim 2, which is a hydroxyanilide. (4) The amide compound or its salt according to claim 1, wherein R is a γ-L-glutamyl group and the p1 halogen atom is a bromine atom or a chlorine atom. (5) The amide according to claim 4, which is r-L-glutamyl-8,5-dibuC1-mo4-t nitroxyanilide or γ-L-glutamyl-8,5-dichloro-4-hydroxyanilide. compound or its salt. (6) An amide compound represented by the formula (wherein R is an L-leucyl group or a γ-L-glutamyl group, and The contained peptidase is activated to liberate the aniline derivative represented by the formula (wherein X and Y have the same meanings as above), and the aniline derivative is then colored by chemical coloring means to produce it. A measurement method characterized by colorimetrically quantifying a color-forming compound. (7) The measuring method according to claim 6, wherein the amide compound is L-leucyl-8,5-dino sogeno-4-hydroxyanilide, and the peptidase is L-leucine aminopeptidase. (8) L-leucyl-8,6-ditsu\rogeno-4-hydroxyanilide is L-leucyl-8,5-dibromo-4
-hydroxyanilide or L-leucyl 4,5-dichloro-4-hydroxyanilide. (9) The amide compound is γ-L-glutamyl 8.5
-dihalogeno-4-hydroxyanilide, and the peptidase is γ-gluta transpeptidase. A patent claim in which αOr-L-glutamyl-8,5-dihalogeno-4-hydroxyanilide is γ-L-glutamyl-8,6-dipromo-4-hydroxyanilide or γ-L-glutamyl-8,5-cyclo-4-hydroxyanilide The measuring method described in item 7. (11) The measuring method according to claim 6, wherein the chemical coloring means is a method of performing oxidative condensation in the coexistence of a coupler to develop color. (12) The measuring method according to claim 11, wherein the coupler is an aromatic compound that undergoes oxidative condensation with the aniline derivative to form a color-forming compound. (18) The measuring method according to claim 12, wherein the aromatic compound is a phenol compound, an aminophenol compound, an aniline compound, or a naphthol compound. (14) The measuring method according to claim 6, wherein the chemical coloring means is a method of coloring using a pentacyanoiron complex salt.