JPS5971688A - β−１，３−Ｄ−グルカナ−ゼの真菌溶解活性の活性化法 - Google Patents

β−１，３−Ｄ−グルカナ−ゼの真菌溶解活性の活性化法

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JPS5971688A
JPS5971688A JP57183421A JP18342182A JPS5971688A JP S5971688 A JPS5971688 A JP S5971688A JP 57183421 A JP57183421 A JP 57183421A JP 18342182 A JP18342182 A JP 18342182A JP S5971688 A JPS5971688 A JP S5971688A
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吉田　昭義
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亀高　茂
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は真菌溶解酵素であるβ−１，３−Ｄ−グルカナ
ーゼの勇菌溶解活性（以下溶菌活性という）の活性仕法
に関する。
β−１，３−Ｄ−グルカナーゼは、ｐ菌の細胞壁を溶解
したり、低浸透圧下では真菌自体を溶解（溶菌）する微
生物由来の酵素であって、広い分野で多釉多様の用途に
使用されている。例えば、ビール工業や酒造業において
は培養タンクやか材の洗浄に、良品工業やｌ牙薬品工業
では、酵母などの真菌類から物卯イ［学的に不安定な栄
養物、ビタミン、酵素などを抽出する際に障害となる細
胞壁を最も緩和に除去する手段として、そして微生物工
学の分野では細胞鋸Ｉ合や核外遺伝子を導入する際に必
要なプロトプラストの調製に、様々な微生物由来の、そ
して様々な精製段階のβ−１，３−Ｄ　−グルカナーゼ
が使用されている。さらに、この真菌溶解酵素を義歯洗
浄斉１あるいは真菌感染症の治療剤として使用しようと
する試みもある。
上記した〃１］く、β−１，３−］）−グルカナーゼは
杯々の微生物１から単離されているが（後記文献１〜６
参照）、市販されているものとしては、Ｚｙｍｏ１ｙａ
ｓｅ■５０００およびＺｙｍｏｌｙａｓｅ■６００００
（製造、靜麟麦酒；販介、生仕学工業、ＡｒＬｈｒｏ−
ｂａｃｔｅｒ　１ｕｔｅｕｓ由来）　、Ｋｉｔａｌａｓ
ｅ■（製造、クミアイ仕学工業、Ｒｈ１ｚｏｃｔｏｎｉ
ａ　５ｏｌａｎｉ由来１ｕｎａｔｕｓ　　由来）　、Ｃ
ｅ１ｅｆｌｏ■（製造、Ｎ’ｏｖｏ　Ｉｎ−ｄｕｓｔｒ
ｉａ、　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ由来）、
Ｎｏｖｏｚｙｍ■２６４（製造、Ｎｏｖｏ　Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｉａ、　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈｏｒｚｉａｎｕ
ｍ由来）　、Ｆｉｎｉｚｙｍ■（製造、Ｎｏｖ。
Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ、　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉ
ｇｅｒ由来）などが挙げられる。これらの市販のβ−１
，３−Ｄ−グルカナーゼは、いずれも上記の種々の用途
に使用し揚るものであるが、一般的にいって工業用のも
のけ力価が低く、試薬用のものは力価は高いが非常に高
価である。従って従来から、β−１，３−Ｉ）　−グル
カナーゼの溶菌活性を活性（１する方法が多くの研突者
によって検討されて来た。例えは、１゜ＫａｎｅｋＯら
は、２−メルカプトエタノール、チオクリコール酸ナト
リウム、システィンおよび亜硫酸ナトリウムなどの還元
剤によってＣａｎｄｉｄａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの生菌
の溶菌活性が１０〜２［１％上昇すること、およびある
種の界面活性剤の前処理によって酵母の溶菌感受性が上
昇することを報告している（文献７）。また、Ｋ、Ｋｉ
　ｔａｍｕｒａ　らによれば、亜硫酸ナトリウムと塩化
カリウムを併用するとパン酵母の溶菌活性が約５０％上
昇するという（文献８）。
上記の方法は、β−１，３−Ｄ−グルカナーゼの溶菌活
性を活性イヒするという点ではいずれも有用なものであ
るが、それぞれ欠点を有し、即想的な方法とは言い鄭い
。即ち、還元剤は一般に高価であり、かつあらゆる目的
に使用し得るものではなく、捷だ、上記文部７に記載さ
れた界面活性剤、即チ、ナトリウムドデンルサルフエー
ト、ナトリウムドデシルベンゼンヌルホネート、セチル
トリメチルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウム
プロミド、ツウイーン２０および８０はさほど顕著な活
性化作用を有するものではない。
本発明者らは、β−１，３−Ｄ−グルカナーゼが種々の
異なった目的に使用されることから、使用目的に応じて
適当な活性化物質を選択し得ることが必要であると感じ
、広範囲の物質群について検討した結果、■ラウロイル
サルコシン酸ナトリウムに代表されるＮ−アシルサルコ
シン糸陰イオン界面活性剤、■ポリオキシエチレンアル
キルフエニルエーテ／Ｌ／（以下ＰＡＰＥと略す）、ポ
リオキシエチレンアルキルエーテル（以下ＰＡＥ　ト略
ｆ　）およびホリオキシエチレンポリオキシプロピレン
アルギルエーテルからなる群からｆばれる非イオンＷ面
活性ａｌｌ、■堪イヒヘンサルコニウム、アンモニウム
クロリドおよびグルクロン酸クロルヘキシジンからなる
群から選ばれる陽イオン殺菌剤、■メチルパラベンおよ
びプロピルパラベンからなる群から選ばれるパラオキシ
安息香酸ゴスチル系防腐剤、および■動物■起珈の蛋白
質分解酵素（例メけＩ・リプシン）および微生物起源の
蛋白質分解酵素（ケンはプロナーゼ■Ｅ（科研イヒ学社
製）およびアルカラーセ■（Ｎｏｖｏ　Ｉｎｄｕｓｔｒ
ｉａ（デンマーク）社製）など）からなる群から選ばれ
る蛋白質分解酵素の少なくとも１種″ｉ！たはそれらの
混合物がβ−１，３−Ｄ−グルカナーゼの溶菌活性の活
性化作用を有することを見出した。更に本発明者らは、
起源の異なるβ−１，３−Ｄ−グルカナーゼ、例えばＺ
ｙｍｏｌｙａｓｅ■５０００とＫｉ　ｔａ　ｌａ　ｓｅ
■を併用することによっても、その溶菌活性が著しく上
昇すること、即ち相乗効果が得られることを見出し本発
明を完成するに芋った。
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。尚
、以下の実施例において、溶菌活性の基質として、対数
増殖期のＣ１ｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ（酵母）　
ＩＦＯ１３８５、Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌ、
ｉｓ　ＩＦＯ８ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ　Ａ２２４Ａ　　を用いた。これらの菌株は
広島大学歯学部口腔細菌学教室から入手した。
実施例１　β−１，３−Ｄ−グルカナーセ活性化物質 サブローブドウ糖培地（Ｄｉｆｃｏ）での前培養を経て
培養した対数増殖期のＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎ
ｓＩＦＯ１３８５株を遠心分離し、蒸留水で洗浄した後
、６６０ｎｍにおける濁度が約１になる様に蒸留水に懸
濁させる。この酵母の生菌懸澗液６−に、それぞれ５Ｑ
ｍＭ燐酸ａ衝液に溶解したβ−１，６−Ｄ−グルカナー
ゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ■５０００　）溶液１−および
下記の表１に示す扱験物冑溶液１ｒｎｌを加え、６７°
Ｃで振盪し、１０分、６０分、および６０分後の６６０
ｎｍにおける濁度を測定し、次式により被験物質の溶菌
活性を計算した。
ここでＯＤｉ　　は反応開始時の、ＯＤｔはｔ分後の６
６０ｎｍにおける濁度を表わす。
結果をｕ下の表１に示す。
表１．Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　ＩＦＯ１３
８５茅に対するＺｙｍｏｌｙａｓｅ■５０００の溶菌活
性に及はす各挿物Ｉ質の活性化効果 表１（つづき） ・１）Ｂｌ、−９ＢＸ■（日光ケミカル社製）使用＊２
）　Ｎ　Ｐ　−１０■（日光ケミカル社製）使用上記の
表１から明らかな様に、表１に挙げた被験物質は、全て
顕著なβ−１，３−Ｄ−グルカナーゼの溶菌活性の活性
化作用を示した。尚、塩イヒベンザルコニウムおよびグ
ルクロン酸クロルヘキシジンは、低濃度で強力な活性什
作用を示したが、高濃度ではむしろ酵素の溶菌活性を阻
害した。
実施例２　活性什剤の併用効果 実施例１の実験の結果、ＰＡＰＥおよびグルクロン酸ク
ロルヘキシジンは、いずれも著しい活性什作用を有する
ことがわかったが、反応液を検鏡した結果、溶菌してい
ない酵母細胞が若干残存していることがわかった。そこ
でこれらの化合物を併用した場合、完全な溶菌が起るか
どうかを実施例１と同様に操作して調べた。結果を第１
図に示す。
第１図において、Ａ、Ｂ、Ｃ，ＤおよびＥは以下の意義
を有する。
Ａ・・・ＰＡＰＥ（ＮＰ−１０■使用）＋グルクロン酸
クロルヘキシジン（コントロール）Ｂ−−・Ｚｙｍｏｌ
ｙａｓｅ■５０００（コントロール）Ｃ−−−Ｚｙｍｏ
　１ｙａｓｅ■５０００　＋ＰＡＰＥＤ　・−Ｚ　ｙｍ
ｏ　１ｙａｓｅ■５０ｑＯ＋グルクロン酸クロルヘキシ
ジン Ｅ　−・Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ■　５０００　　＋　Ｐ　
　Ａ　　Ｐ　　Ｅ　＋　り゛）Ｖクロン酸クロルヘキシ
ジン 尚、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ■５０００、ＰＡＰＥおよびり
゛）ｖクロン酸クロルヘキシジンの終濃度は、それツレ
０．５１Ｗ／記、０．０５％および０．００１％とした
。
図から明らかな様に、ＰＡＰＥとクルジクりン酸クロル
ヘギシジンを併用した場合、単独使用の場合と比べて初
期の溶菌活性が非常に弾ノフであり、６０分後には９５
％以上のＯＤ減少率を示した。
尚、この時点で検鏡したところ、はぼ全ての菌７５；溶
菌していることがわかった。
上記の如き併用効果は、グルクロン酸クロルへギンジン
とＰＡＥとの間、及び環化ベンザルコニウムとＰＡＰＥ
およびＰＡＥとの…１にもみられ−た。
実施例６　各種菌株の生菌に対する、起源の異なる各種
β−１，３−Ｄ−グルカナー ゼの溶菌活性に及ぼす活性（ヒ剤の併 用効果 実施例１と同様の方法で、６種の菌株の生菌に対するＺ
ｙｍｏｌ　ｙａｓｅ■５０００、Ｎｏｖｏｚｙｍ■２６
４およびＫｉｔａｌａｓｅ■の溶菌活性に及ぼすＰＡＰ
Ｅ（Ｎ’Ｐ−１０■使用）ト壌什ベンザルコニウムの併
用効果を調べた。結果を以下の表２に示す。
表２から明らかな様に、ＰＡＰＥと塩什ベンザルコニウ
ムを併用すると、いずれの菌株に於いても、部署な活性
化作用を示した。特に、Ｚｙｎｏｌｙａｓｅ■５００Ｄ
　Ｋ対しテｆｆｉ受性の低いＣ，ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ
　ＩＦＯ１４００とＴ、　１ｎｃｏｎｓｐｉｃｕａ　Ｉ
ＦＯ０６２１では、それぞれ７８％および９５％の活性
の上昇がみられた。
この様なβ−１，３−Ｄ−グルカナーゼの溶菌活性の活
性化作用はＫｉ　Ｌａ１ａｓｅ■およびＮ。ｖｏｚｙｍ
■２６４　にも見られ、このことから、本発明に係る活
性化剤はあらゆる起源のβ−１，３−Ｄ−グルカナーゼ
の溶菌活性の活性化に有効であり、かつ表２に示した全
ての菌株に適用し得ることがわかる。
実施例４２種の起源の異なるβ−１，３−Ｄ−グルカナ
ーゼの相乗効果 実施例６で使用した２γｍｏｌｙａｓｅ■５０００およ
びＫｉｔａｌａｓｅ■は、等しくβづ、６−Ｄ−グルカ
ナーゼではあるが、その起源を異にし、表２に見られる
様に活性スペクトルも若干異なっている。また、そ（７
）ｆｆｉｉｃｉｉｌＰＨは前者７５：　ｐＨ７，０、後
者力ｐＨ６，０であって互いに相違している。従って両
者を併用した場合、何らかの併用効果が期待された。
実施例１の方法に従い、基質としてＣ１ａｌｂｉｃａｎ
ｓＩＦＯ１６８５と感受性の低いＣ，ｃｒｏｐｉｃａｌ
ｉｓ　ＩＦＯ１４００を用いて、上＝ｅの真菌溶解酵素
の併用効果を調べた。その結果、表６に示す様に、これ
らの酵素を併用すると、単独の場合の活性の和に比べて
著しく活性が上昇することがわかった（相乗効果）。
表６．起源の異なるβ−１，３−Ｄ−グルカナーゼの相
乗効果（６０分後の０ＤｖＪ少率、傘１）終濃度　０．
１岬／ｍｌ ＊２）終濃度　０．５ｑ／ｉ ・３）終濃度　Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ■５０（１０（（：
１．１　ｒｒｔｑｉｒｎｉ　）−１−Ｋｉｔａｌａｓｅ
■（０，５Ｆ！／献）文献 １）Ａ、Ｅ、ＭＯｏｒｅ　ａｎｄ　Ｂ、　Ａ、　５ｔｏ
ｎｅ、　１９７’ｌ。
Ａβ−１，３−ｇｌｕｃａｎ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ｆ
ｒｏｍ　Ｎｉｃｏｔｉａｎａｇｌｕｔｉｎｏｓａ　ｊ、
Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ、　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａ
ｎｄ　ｐｈｙｓｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ　、Ａｃ　ｔａ、　２５Ｂ　：　２′り
８−’１４７゜２）Ｊ、　Ｐ、　Ｇ、Ｂａ１ｌｅｓｔａ
　ａｎｄ　Ｍ、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ。
１９７２、５ｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｓｅ
ｖｅｒａｌｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｃｔｅｓ　ｔｏ　ｍ１
ｃｒｏｂｉａｌ　Ｌｙｓｉｓ、。
Ｔｒａｎｓ＋Ｂｒ、＋ｎｙｃｏｌ　、Ｓｏｃ、、　５８
：４８ｉ−４８Ｚ３）Ｋ、）ｌｏｒｉｋｏｓｈｉ　ａｎ
ｄ　Ｙ、Ａｔｓｕｋａｗａ、　ｊ９７３゜β−１，３−
Ｇｌｕｃａｎａｓｅ　ｐｒｏｄｖｔｃｅｄ　ｂｙ　ａｌ
ｋａｌｏｐｈｉｌｉｃｂａｃｔｅｒｉａ　Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　Ａ、に−１２，−５，、Ａｇｒ。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍｌ、　３７　：　１４４９−１４５
６゜４）Ｇ＋）（、Ｆｌｅｅｔ　ａｎｄ　Ｈ，Ｊ、　Ｐ
ｈａｆｆ、　ｊ９７４゜Ｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｙｅａｓｔ
、　ｃｅｌｌ　ｗａｌｌｓ　：Ｇｌｕｃａｎａｓｅｓ　
ｆｒｏｍ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓＷＬ
−１２，、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　ｊ１９　：
２０７−２　ｊ９゜５）Ｔ、０ｂａｔａ、に、Ｆｕｊｉ
ｏｋａ、Ｓ、Ｈａｒａ　　ａｎｄＹ、Ｎａｍｂａ、ｊ９
７７、Ｔｈｅ　　ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃｅｆｆｅｃｔ
　　ａｍｏｎｇ　β−１，３−ｇｌｕｃａｎａｓｅｓ　
　ｆｒｏｍＯｅｒｓｋｏｖｉａ　　ｓｐ、ＣＫ　ｏｎ　
　１ｙｓｉｓ　　ｏｆ　　ｖｉａｂｌｅｙｅａｓｔ　　
ｃｅｌｌｓ、、Ａｇｒ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、４１：
６７１−６７７゜ ６）デビット・アレン・ルイス・デービエス、アンソニ
ー・マイクル・サムウェル・ホープ。
ＩＪ１和５４年、＃Ｉ胞溶解性酵素含有医薬却成品なら
びにその製造法９日本公開特許公報。
昭５４．−２３１０゜ ７）Ｔ、　Ｋａｎｅｋｏ、　Ｋ、　Ｋｉｔａｍｕｒａ　
ａｎｄ　Ｙ、　Ｙａｍａｍｏｔｏ。
１９７３＋５ｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｉｅｓ　ｏｆ　
ｙｅａｓｔｓ　ｔｏ　ｙｅａｓｔｃｅｌｌ　ｗａｌｌ　
１ｙｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｏｆ　Ａｒｔｈｒｏ−ｂ
ａｃｔｅｒ　１ｕｔｅｕｓ＋Ａｇｒ、Ｂｉｏ１．Ｃｈｅ
ｍ１３７　：２２９５−２３０２゜ ８）Ｋ、　Ｋｉｔａｍｕｒａ　ａｎｄ　Ｙ、Ｙａｍａｍ
ｏｔｏ、　１９８１゜Ｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｙｅａｓｔ　
ｃｅＩｌｓ　ｓｈｏｗｉｎｇ　ｌｏｗｓｕｓｃｅｐｔｉ
ｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ、。
Ａｇｒ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　４５　：　１７６
１　１７６６゜
【図面の簡単な説明】
第１図はβ−１，３−Ｄ−グルカナーゼの溶菌活性に及
ぼすＰＡＰＥとグルクロン酔りロｌレヘキシシンの併用
効果を表わすグラフである。 Ａ・・・ＰＡＰＥ＋クルクロン酸クロルヘキシジン、Ｂ
　−−−Ｚｙｍｏｌ　ｙａｓｅ■５０００、Ｃ・・−Ｚ
ｙｍｏｌｙａｓｅ■５０００＋　Ｐ　Ａ　Ｐ　Ｅ　、　
Ｄ　・−Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ■５０００＋グルクロン酸
クロルヘキシジン、Ｅ−Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ■５０００
＋ＰＡＰＥ＋グルクロン酸クロルヘキシジン。 特許出願人　ロート製薬株式会社 代理人　　　弁理士　青　山　　葆　　　　外１名第１
図 Δ 時間（分）

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １゜　Ｎ−７シルサルコシン糸陰イオン界面活性剤、ホ
    リオギシエチレンアルキルフェニルエーテル、ホリオキ
    シエチレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレン
    ポリオキシプロピレンアルキルエーテルから々る群から
    選ばれる非イオン界面活ｆｌｌ、ｉｌＲ什ベンザルコニ
    ウム、アンモニウムクロリドおよびグルクロン酸クロル
    ヘキシジンかうなる群から遣ばれる陽イオン殺菌剤、メ
    チルパラベンおよびプロピルパラベンからなる群がらｆ
    ばれるパラオキシ安息香酸エステル系防１ρ、剤、およ
    び蛋白質分解酵素から選ばれる少なくとも一神の化合物
    をβ−１，３−Ｄ−グルカナーゼと共に使用することを
    特徴とするβ−１，３−Ｄ−グルカナーゼの真菌溶解活
    性の活性イヒ法。 ２、　β−１，３−Ｄ−グルカナ−セカＺ　ｙｍｏｌｙ
    ａｓｅ■５０００、Ｚ　ｙｍｏ１ｙａｓｅ■６００００
    、Ｋｉｔａｌａｓｅ■、ＹＬ−５■、Ｃｅ１ｅｆｌｏ■
    、Ｎｏｖｏｚｙｍ■２６４　寸たはＦｉｎｉｚｙｍ■　
    である耀１項に記載の方法。 ６、起源の異なるβ−１，３−Ｄ−グルカナーゼを２柾
    捷たけそれり１併用することを特徴とするβ−１，３−
    Ｄ−グルカナーゼの真菌溶解活性の活性化法。 ４、　β−１，３−Ｄ−グルカナーゼがＺｙｍｏｌｙａ
    ｓｅ■５０００、Ｚ　ｙｍ　ｏｌｙａ　ｓ　ｅ■６００
    ０　Ｅｌ、Ｋｉｔａｌａｓｅ■、ＹＬ−５■、Ｃｅ１ｅ
    ｆｌｏ■、Ｎｏｖｏｚｙｍ■２６４オよびＦｉｎｉｚｙ
    ｍ■　からなる群から選ばれるものである第６項に記載
    の方法。 ５、　　Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ■５０００とＫｉｔａｌａ
    ｓ４併用する第４項に記載の方法。
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