JPS5942323A - Conjugated protein killing selectively cell and its preparation - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain the titled conjugated protein having improved efficiency as a carcinostatic agent, by bonding an immunoglobulin capable of being selectively linked to a specific antigen of the target cell or its fragment to neocarcinostatin through a specified bifunctional organic group. CONSTITUTION:A thiol group is produced in an immunoglobulin which is capable of being selectively linked to a specific antigen possessed by a cell to be killed (the target cell for short) or its fragment, or the thiol group is introduced to the immunoglobulin or its fragment, while a maleimide group is introduced to neocarcinostatin, a carcinostatic agent. Both of them are reacted to give the desired conjugated protein wherein they are bonded through a bifunctional organic group shown by the formula [X1 and X2 are bifunctional organic group; m is 0, or 1; with the proviso that the immunoglobulin or its fragment is bonded in the (X1)m side, and neocarcinostatin is bonded in the X2 side]. Since the toxic part of the cell and a carrier part are bonded by a safe chemical bond, the toxicity of the cell on the target cell can be manifested selectively with improved efficiency.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な選択的殺細胞性蛋白複合体とその製造方
法に関する。更に詳しくは、殺すべき細胞（以下標的細
胞という）のもつ特定の抗原と選択的に結合しうる免疫
グロブリン、あるいはその抗原結合部位を含むフラグメ
ントからなる構成部分と、抗癌剤ネオカルチノスタチ／
からなる構成部分を有する、新規な選択的殺細胞性蛋白
複合体とその製造方法に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a novel selective cell-killing protein complex and a method for producing the same. More specifically, a component consisting of an immunoglobulin that can selectively bind to a specific antigen of cells to be killed (hereinafter referred to as target cells) or a fragment containing its antigen-binding site, and an anticancer drug neocarcinostasis/
The present invention relates to a novel selective cell-killing protein complex having a component consisting of the following, and a method for producing the same.

ある種の細胞だけを選択的に殺すことを目的として、そ
の標的細胞と選択的に結合しうる免疫グロブリンを種々
の抗癌剤と結合させる試みがなされてきた（例えば、テ
ィ　ゴース（Ｔ。For the purpose of selectively killing only certain types of cells, attempts have been made to combine various anticancer drugs with immunoglobulins that can selectively bind to the target cells (for example, T.

Ｇｈｏｓｅ）ら、ジャーナル　オプ　ザ　ナショナルキ
ャンサー　インステイテコート（Ｊ、　Ｎａｔｌ。Ghose et al., Journal of the National Cancer Institute (J, Natl.

Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ　、　）＋第６１巻、第６５７
〜６７６頁。Cancer In5t, ) + Volume 61, No. 657
~676 pages.

１９７８年参照）。ネオカルチノスタチンは、その細胞
毒性が強いが故に、かかる目的に使用する抗癌剤として
適していることが考えられ、免疫グロブリンとの覆合体
が検討された。例えば木材らは１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（以下ｗｓｃ
ｒという）を脱水縮合剤として用いて、免疫グロブリン
とネオカルチノスタンを結合せしめ、得られた複合体は
ネオカルチノスタチン活性とともに抗体活性を保有して
いること、及びネオカルチノスタチン単独より有効に標
的細胞のＤＮＡ合成を阻害したと報告している（癌と化
学療法、第６巻端時増刊ｉ、７５〜８１頁１９７９年参
照）。また、ジ　ユング（Ｇ、　Ｊｕｎｇ　）らは、免
疫グロブリンとネオカルチノスタチンに架橋剤を用いて
導入した硫黄原子間にジスルフィド結合を形成せしめる
ことにより複合体を作製し、その複合体はネオカルチノ
スタチン活性を保持していたと報告している（バイオケ
ミカル　アンド　バイオフィジカル　リサーチ　コミュ
ニイケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　
Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　ＲｅｓｅｒｃｈＯｏｍｎｕｎ
ｉｃａｔｉｏｎｓ　）、第１０１巻、５９９〜６０６頁
。(see 1978). Because neocarzinostatin has strong cytotoxicity, it is thought to be suitable as an anticancer agent for such purposes, and a conjugate with immunoglobulin has been investigated. For example, wood is 1-ethyl-3-(3-
dimethylaminopropyl) carbodiimide (hereinafter wsc
r) as a dehydration condensation agent to bind immunoglobulin and neocarzinostane, and that the resulting complex possesses antibody activity as well as neocarzinostatin activity, and that it is more active than neocarzinostatin alone. It has been reported that it effectively inhibited DNA synthesis in target cells (see Cancer and Chemotherapy, Vol. 6, Special Edition I, pp. 75-81, 1979). In addition, Ji Jung et al. created a complex by forming a disulfide bond between the sulfur atoms introduced into immunoglobulin and neocarzinostatin using a crosslinking agent, and the complex was used as neocarzinostatin. It has been reported that nostatin activity was maintained (Biochemical and Biophysical Research Communications).
Biophysical Research
101, pp. 599-606.

１９８１年参照）。しかしながら、複合体作製に当りｗ
ｓａｒを縮合剤として用いる方法は、ｗｓｏｒはアミノ
基とカルボキシル基間で脱水縮合を起こさせ、アミド結
合を形成させる試薬であり、免疫グロブリンとネオカル
チノスタチン−５〜 間の架橋の他に、一つの分子内での架橋や、免疫グロブ
リン同志の架橋あるいはネオカルチノスタチン同志の架
橋も起こり、望ましい生成物は得にくい。また、免疫グ
ロブリン及びネオカルチノスタチンには複数個のアミノ
基及びカルボキシル基があるために、免疫グロブリンと
ネオカルチノスタチンが複数個互に結合した高分子物質
も相当程度生成し、Ｗ８０Ｉを用いる架橋方法によって
は実際に治療に供し得る複合体を得ることは極めて困難
である。また、上記のユングらの複合体では、免疫グロ
ブリンとネオカルチノスタチンがジスルフィド（−８−
８−）　　結合により結合されていて、かかる非天然の
ジスルフィド結合はその相嶋部分は血液中で切断される
ので、かかる複合体は標的細胞に到達する前にその薬効
が低下するという欠点がある。(see 1981). However, when preparing the complex,
In the method using sar as a condensing agent, wsor is a reagent that causes dehydration condensation between an amino group and a carboxyl group to form an amide bond, and in addition to crosslinking between immunoglobulin and neocarzinostatin-5, Cross-linking within one molecule, cross-linking between immunoglobulins, or cross-linking between neocarzinostatins also occurs, making it difficult to obtain desired products. In addition, since immunoglobulin and neocarzinostatin have multiple amino groups and carboxyl groups, a considerable amount of polymeric substances in which multiple immunoglobulins and neocarzinostatin are bonded to each other is produced, and W80I is used as Depending on the crosslinking method, it is extremely difficult to obtain a complex that can actually be used for therapy. In addition, in the above-mentioned complex of Jung et al., immunoglobulin and neocarzinostatin are combined with disulfide (-8-
8-) Since the non-natural disulfide bonds are cleaved in the blood, the efficacy of such complexes is reduced before they reach the target cells.

本発明者らは、先行技術の有するかかる欠点を解消し、
例えば、癌細胞の如き殺すべき細胞に選択的に強力な毒
性を発揮する選択的殺細胞性蛋白複合体を開発すべく鋭
意研究の結果、本　６− 発明に到達した。The present inventors have overcome such drawbacks of the prior art,
For example, as a result of intensive research to develop a selective cell-killing protein complex that selectively exerts strong toxicity on cells to be killed, such as cancer cells, the present invention was arrived at.

即ち、本発明は、殺すべき細胞のもっている抗原と選択
的に結合し得る免疫グロブリンまたはそのフラグメント
とネオカルチノスタチンを、下記式〔１〕 で表わされる２価の有機基を介して結合させてなる選択
的殺細胞性蛋白複合体である。かかる蛋白複合体の中で
は、その生物活性上、下記式％式％［１１１３ で表わされる蛋白複合体が特に好ましい。That is, the present invention combines an immunoglobulin or a fragment thereof capable of selectively binding to an antigen possessed by cells to be killed and neocarzinostatin via a divalent organic group represented by the following formula [1]. It is a selective cell-killing protein complex consisting of Among such protein complexes, a protein complex represented by the following formula %[1113] is particularly preferred in view of its biological activity.

本発明において免疫グロブリンとは、破壊すべき標的細
胞を認識する抗体またはかかる抗体を含むグロブリンを
言う。かかる免疫グロブリンは、標的細胞が癌細胞の場
合には抗腫瘍免疫グロブリンと呼ばれる。抗腫瘍免疫グ
ロブリンには、例えば癌患者の血清から、または腫瘍細
胞又は腫瘍特異抗原或いは腫瘍関連抗原をサル。In the present invention, immunoglobulin refers to an antibody that recognizes a target cell to be destroyed or a globulin containing such an antibody. Such immunoglobulins are called anti-tumor immunoglobulins when the target cells are cancer cells. Anti-tumor immunoglobulins can be obtained, for example, from the serum of cancer patients or from monkey tumor cells or tumor-specific or tumor-associated antigens.

ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ等の動物に過免疫し
た血清から、コーンのエタノール分画法、硫安分画法、
イオン交換クロマトグラフィー法等の公知の手段によっ
て調製され、さらに必要によっては各種細胞を用いて吸
収、吸着操作をほどこして得ることができるところの抗
体活性を有する蛋白ｌＸ（免疫グロブリン）、あるいは
、癌細胞や癌抗原を動物に免疫して得た抗体産生性リン
パ球を、例えば骨髄腫瘍細胞と融合させて、培養可能で
抗体を産生ずる融合細胞（ハイプリドーマ）を得、とれ
をｉｎ　ｖｉｔｖｏ　　（生体外）で培養するか、或い
は動物に移植してｉｎ　ｖｉｖｏ　（生体内）で培殖せ
しめて、　その培養液または血清や腹腔液からｖＩ４製
される極めて特異性の高い抗体活性を有する免疫グロブ
リンが含まれる。また、腫瘍組織から界面活性剤等の変
性剤で抗腫瘍抗体を遊離させ、これから前述と同様々手
段で調製される抗体活性を有する免−９＝ 疫グロブリンも本発明の免疫グロブリンに含まれる。Cohn's ethanol fractionation method, ammonium sulfate fractionation method,
Protein IX (immunoglobulin) having antibody activity, which can be prepared by known means such as ion-exchange chromatography and further subjected to absorption and adsorption operations using various cells, if necessary, or cancer Antibody-producing lymphocytes obtained by immunizing an animal with cells or cancer antigens are fused with, for example, bone marrow tumor cells to obtain culturable antibody-producing fused cells (hybridomas), which are then incubated in vitro. Immunoglobulin with highly specific antibody activity is produced from the culture fluid, serum, or peritoneal fluid by culturing it in vitro) or transplanting it into animals and culturing it in vivo. included. The immunoglobulin of the present invention also includes immunoglobulin having antibody activity, which is prepared by releasing anti-tumor antibodies from tumor tissue using a denaturing agent such as a surfactant, and then preparing the anti-tumor antibodies by the same means as described above.

免疫グロブリンにはＩりＱ、　ＩｙＡ、　ＩｙＭ、　Ｉ
りり。Immunoglobulins include IriQ, IyA, IyM, and I
Riri.

ＩｆＥの５つのクラスがあることが知られているが、そ
の基本構造は、第１図に模式的に示した如く、図中りで
示されたＬ鎖２本とＨで示されたＨ鎖２本が少なくとも
３つのジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）で結ばれた
ものである点、また、第一図に示した如く、抗原結合活
性をもつＦａｂ部分とエフェクター活性をもつＦｃ部分
から成る点において一致している。ただしＩＢＭは５量
体、　　ＩＰＡは一部２量体で存在するが、殺細胞性蛋
白複合体の組織浸透性という面から考えると、これらを
メルカプタンで還元し、１量体としてから、複合体の誘
導部分に用いるほうが望ましい。It is known that there are five classes of IfE, and its basic structure, as schematically shown in Figure 1, consists of two L chains shown in the figure and an H chain shown in the figure. The two chains are connected by at least three disulfide bonds (-S-S- bonds), and as shown in Figure 1, the Fab part has antigen-binding activity and the Fc part has effector activity. They are in agreement in that they are the same. However, IBM exists as a pentamer and IPA exists as a partial dimer, but from the perspective of tissue permeability of the cell-killing protein complex, these should be reduced with mercaptan to form a monomer and then the complex. It is preferable to use it for the guiding part.

本発明の選択的殺細胞性蛋白複合体の一方の構成部分と
して免疫グロブリンまたはそのフラグメントが用いられ
るが、免疫グロブリンの７２グメントとしては、前述の
ごとき免疫グロブ−１〇− リンの抗体活性を有する部位を含むフラグメントが用い
られる。かかるフラグメントとしては、特にＦａｂ、　
Ｐａｂ’　（Ｆａｂ部といわゆるヒンジ部（第１図に斜
線で示した部分）とからなる部分）及びＦａｂ’の２量
体であるＰ（ａｂ）４が望ましい。これらの免疫グロブ
リン由来の７ラグメントは、原料としての免疫グロブリ
ンがいかなるクラスであれ、いずれも本発明の蛋白複合
体の誘導部として用いることができる。An immunoglobulin or a fragment thereof is used as one component of the selective cell-killing protein complex of the present invention. A fragment containing the site is used. Such fragments include in particular Fab,
P(ab)4, which is a dimer of Pab' (a portion consisting of a Fab portion and a so-called hinge portion (the shaded portion in FIG. 1)) and Fab′, is desirable. Any of these 7 immunoglobulin-derived fragments can be used as the derivative of the protein complex of the present invention, regardless of the class of immunoglobulin used as the raw material.

本発明において用いられるネオカルチノスタチンは、Ｓ
ｌｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　０ａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｃ
ｕｓの培養ヂ液より得られる分子量約１１，０００の急
性白血病。Neocarzinostatin used in the present invention is S
lreptomyces 0arzinostatic
Acute leukemia with a molecular weight of approximately 11,000 obtained from culture fluid of US.

前癌、膀胱癌、肝臓癌等に抗ｍ瘍活性を示す蛋白性抗生
物質であり、分子中に２個の遊離アミン基を有している
。また、ネオカルチノスタチンには非蛋白部分、即ちク
ロモフォアが存在し、このクロモフォアがネオカルチノ
スタチンの生物活性を担い、蛋白部分はクロモ７オアの
安定化、運搬、活性化等に関与していることが明らかに
されており（江戸２石田、医学のあゆみ。It is a protein antibiotic that exhibits anti-malignant activity against pre-cancer, bladder cancer, liver cancer, etc., and has two free amine groups in its molecule. In addition, neocarzinostatin has a non-protein part, that is, a chromophore, and this chromophore is responsible for the biological activity of neocarzinostatin, and the protein part is involved in the stabilization, transport, activation, etc. of chromo7oa. (Edo 2 Ishida, History of Medicine.

第１２０巻、７９〜８０頁、１９８２年参照）、かかる
分子構造的特徴が本発明においては有利に用いられる。120, pp. 79-80, 1982), such molecular structural features are advantageously used in the present invention.

上記式［：Ｉ）、　（ＩＩ：］及び〔■〕においてｍ＝
０の場合には、Ｓは免疫グロブリンまたはそのフラグメ
ントに由来する硫黄原子であｔ）、ｍ＝１の場合には架
橋剤により導入された硫黄原子である。In the above formulas [:I), (II:] and [■], m=
In the case of 0, S is a sulfur atom derived from the immunoglobulin or a fragment thereof (t), and in the case of m=1, it is a sulfur atom introduced by a crosslinking agent.

Ｘ、は例えば下記式［１１１） ％式％） で表わされる架橋剤、下記式（Ｖ） Ｑ−０−ｘ３−ｓ−ｙ　　　　　−・・・・・−・（Ｖ
）１ Ｈ−ＨＲ で表わされる架橋剤、下記式〔■〕 で表わされる架橋剤、下記式〔■〕 で表わされる架橋剤（２−イミノチオラクトン）、下記
式〔■〕 で表わされる架橋剤（Ｎ−アセチルホモシスティン）Ｋ
由来する２価の有機基である。X is, for example, a crosslinking agent represented by the following formula [111) % formula %), the following formula (V) Q-0-x3-s-y -...
)1 H-HR, a crosslinking agent represented by the following formula [■], a crosslinking agent (2-iminothiolactone) represented by the following formula [■], a crosslinking agent represented by the following formula [■] (N-acetylhomocystine) K
It is a divalent organic group derived from

Ｙで表わされる、結合している硫黄原子と共に活性ジス
ルフィド基を形成し得る１価の有機基の具体例としては
、２−ピリジルチオ基（Ｑ−ｓ−）、４−ビ’）　シ＃
　？　オ基（１’Ｊ３−８−）。Specific examples of the monovalent organic group represented by Y that can form an active disulfide group together with the bonded sulfur atom include 2-pyridylthio group (Q-s-), 4-bi')
? O group (1'J3-8-).

ｌ３− Ｘ３で表わされる２価の有機基は、化学的に不活性であ
れば特に限定されないが、一般的には分岐を有するか有
しないアルキレン基、フェニレン基等から適宜選ばれる
。２で表わされる活性１４− エノキシ基、２，４−ジニトロフェノキシ基、２８４．
５−トＩＪクロロフェノキシ基、ぺ／タクロロフェノキ
シ基等を挙げることができる。Ｑで表わされるイミドエ
ステルのアルコール残基の具体例としてはメトキシ、エ
トキシ基等を挙げることができる。几で表わされるハロ
ゲン原子の具体例としては、塩素、臭素、ヨウ素等を挙
げることができる。Ｘ２は下記式〔■〕 で表わされる架橋剤に由来する２価の有機基である。Ｘ
４で表わされる２価の有機基は化学的に不活性であれば
特に限定されないが、一般的に社分　を有するか有しな
いアルキレン基、フェニレン基等から適宜選ばれる。２
で表わされる活性エステルのアルコール残基の具体例と
しては、上記の式（’Ｗ　）及びＣＶＩ’Ｊの場合と同
じである。The divalent organic group represented by 13-X3 is not particularly limited as long as it is chemically inert, but is generally appropriately selected from alkylene groups with or without branches, phenylene groups, etc. Active 14-enoxy group, 2,4-dinitrophenoxy group represented by 2, 284.
Examples include a 5-toIJ chlorophenoxy group and a pe/tachlorophenoxy group. Specific examples of the alcohol residue of the imidoester represented by Q include methoxy and ethoxy groups. Specific examples of the halogen atom represented by chlorine include chlorine, bromine, and iodine. X2 is a divalent organic group derived from a crosslinking agent represented by the following formula [■]. X
The divalent organic group represented by 4 is not particularly limited as long as it is chemically inert, but is generally appropriately selected from alkylene groups, phenylene groups, etc. with or without a monomer. 2
Specific examples of the alcohol residue of the active ester represented by are the same as those of the above formula ('W) and CVI'J.

架橋剤の具体例としては、式ＣＭ）で表わされる架橋剤
として、Ｎ−サクシンイミジル　３−（２−ピリジルジ
チオ）グロピオネート、　Ｎ　−サクシンイミジル　ａ
−（２，４−ジニトロフェノキシ）ブチレートを、式〔
ｖ〕で表わされる架橋剤として、メチル３−（２−ピリ
ジルジチオ）プロピオンイミデート塩酸塩を、式〔■〕
で表わされる架橋剤として、Ｎ−ザクシンイミジル３−
ブロモプロピオネートを、式〔■〕で表わされる架橋剤
として、メタマレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシサクシ
ンイミドエステル、オルト−ｒＶイミド安安息香酸−ヒ
ドロキシサクシンイミドエステル、バラマレイミド安息
香酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル、マレイミ
ド酢酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル。Specific examples of the crosslinking agent include N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)gropionate, N-succinimidyl a as a crosslinking agent represented by the formula CM)
-(2,4-dinitrophenoxy)butyrate with the formula [
methyl 3-(2-pyridyldithio)propionimidate hydrochloride as a crosslinking agent represented by the formula [■]
As a crosslinking agent represented by N-succinimidyl 3-
Bromopropionate is used as a crosslinking agent represented by the formula [■], metamaleimidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester, ortho-rV imidobenzoic acid-hydroxysuccinimide ester, bramaleimidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester, maleimidoacetic acid N-hydroxysuccinimide ester.

マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボル
ネン−２，３−ジオルポジイミドエステル。マレイミド
酪酸２，４−ジニトロフェノールエステル、マレイミド
吉草酸ペンタクロロフェノールエステルを挙げることが
できる。Maleimidopropionic acid N-hydroxy-5-norbornene-2,3-diorposiimide ester. Maleimidobutyric acid 2,4-dinitrophenol ester and maleimidovaleric acid pentachlorophenol ester can be mentioned.

本発明の選択的殺細胞性蛋白複合体は、免疫グロブリン
またはそのフラグメントにチオール基を発生させるか導
入しておき、他方、ネオカルチノスタチンにマレイミド
基を導入し、両者を反応させることにより製造すること
ができる。The selective cell-killing protein complex of the present invention is produced by generating or introducing a thiol group into an immunoglobulin or a fragment thereof, introducing a maleimide group into neocarzinostatin, and reacting the two. can do.

即ち、免疫グロブリンまたはその７ラグメ／トに、例え
ば、式［Ｆ／］あるいは〔ｖ〕で表わされる架橋剤を反
応せしめ、生成物を、例えば、２−メルカプトエタノー
ルまたはジテオスレイトールで還元する〔反応（す、　
（２）　）か、〔ｘ〕 １７− 免疫グロブリンまたはそのフラグメントを、式（Ｗ）、
　　（■〕または〔■〕で表わされる架橋剤と反応せし
め〔反応（３）、　（４）、　（５）　）、（ＸＩ） （ＸＩ−ｔ） Ｃｘ−１） 式Ｃｘ）、　ＣＭ）、　（ＸＩ−１）及び〔Ｘ−１：ｌ
で表わサレるチオール基が導入された免疫グロブリンま
たはその７ラグメントを得る（上記式（１）〜（５）中
、ｐはＡｂがインタクトのｒｆＭである場合には１〜２
０の整数を、インタクトのＩｐＭでない場合には１〜５
の整数を表わす）。他方、ネオカルチノスタチンを、例
えば、式〔■〕で表わされる架橋剤と反応せしめ、下記
式〔罵〕 １８− で表わされるマレイミド基が導入されたネオカルチノス
タチンを得る。そして、かくして得られたチオール基が
導入された免疫グロブリンまたはそのフラグメントと、
マレイミド基が導入されたネオカルチノスタチンを反応
させることにより、本発明の選択的殺細胞性蛋白複合体
を製造することができる。That is, an immunoglobulin or its 7 lagmate is reacted with a crosslinking agent represented by the formula [F/] or [v], and the product is reduced with, for example, 2-mercaptoethanol or diteothreitol. [Reaction (su,
(2) ) or [x] 17- An immunoglobulin or a fragment thereof of the formula (W),
React with a crosslinking agent represented by (■] or [■] [Reaction (3), (4), (5)), (XI) (XI-t) Cx-1) Formula Cx), CM), ( XI-1) and [X-1:l
Obtain an immunoglobulin into which a thiol group represented by the formula (1) to (5) above (in the above formulas (1) to (5), p is 1 to 2 when Ab is an intact rfM).
An integer of 0, or 1 to 5 if not an intact IpM.
). On the other hand, neocarzinostatin is reacted, for example, with a crosslinking agent represented by the formula [■] to obtain neocarzinostatin into which a maleimide group represented by the following formula [expletive] 18- has been introduced. and the thus obtained immunoglobulin or fragment thereof into which a thiol group has been introduced,
The selective cell-killing protein complex of the present invention can be produced by reacting neocarzinostatin into which a maleimide group has been introduced.

本発明の選択的殺細胞性蛋白複合体の一つの前駆物質は
チオール基を有する免疫グロブリンまたはそのフラグメ
ントであるが、かかるチオール基は化学式で具体的に記
した如く、外部から導入されたチオール基の他、免疫グ
ロブリンまたはそのフラグメント自体がもともとチオー
ル基を有している場合にはそのチオール基、あるいはシ
スチンに基づくジスルフィド結合をもっている場合には
、そのジスルフィド基を、例えば、還元して生成させる
ことができるチオール基であってもよい。One precursor of the selective cell-killing protein complex of the present invention is an immunoglobulin or a fragment thereof having a thiol group; In addition, if the immunoglobulin or its fragment itself originally has a thiol group, or if it has a cystine-based disulfide bond, the disulfide group can be produced by, for example, reduction. It may also be a thiol group that can.

本発明の選択的殺細胞性蛋白複合体の製造において、免
疫グロブリンまたはそのフラグメントに架橋剤を反応さ
せる場合は、免疫グロブリンまたはそのフラグメント１
モルに対し、架橋剤を１〜１００モル用いるのが好まし
い。反応は免疫グロブリンまたはそのフラグメントのｐ
Ｈ５〜８の緩衝液中蛋白濃度が０．５〜ｔ　ｏ　Ｏｗ／
ｌｄ（より好ましくは１〜２０　ｑ／−）になるように
調製された溶液に、０〜４０℃で攪拌しながら架橋剤の
水溶液または架橋剤が水に溶けない場合には、架橋剤を
少量の有機溶媒、例えば、Ｎ。In the production of the selective cell-killing protein complex of the present invention, when reacting immunoglobulin or its fragment with a crosslinking agent, immunoglobulin or its fragment 1
It is preferable to use 1 to 100 moles of the crosslinking agent per mole. The reaction is an immunoglobulin or its fragment p
The protein concentration in the buffer of H5-8 is 0.5-to Ow/
ld (more preferably 1 to 20 q/-), add a small amount of the crosslinking agent to an aqueous solution of the crosslinking agent while stirring at 0 to 40°C, or if the crosslinking agent is not soluble in water. An organic solvent such as N.

Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、１
，２−ジメトキシエタン、メタノール。N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, 1
, 2-dimethoxyethane, methanol.

エタノール、アセトン等に溶かした溶液を添加して行な
われる。反応時間は、反応スケール。This is done by adding a solution dissolved in ethanol, acetone, etc. Reaction time is the reaction scale.

反応条件によるが、一般に２日間以内である。Depending on the reaction conditions, it is generally within 2 days.

反応終了後、透析または分子ふるいの力２ムクロマトグ
ラフイーにより、未反応の架橋剤及び低分子反応生成物
を除く。架橋剤によりジスルフィド基が導入された場合
には、ジスルフィド基はチオール基に還元されるが、か
かる反応はチオール試薬（例えば、２−メルカプトエタ
ール、ジテオスレイトール）を過剰に用い、上記の反応
温度２反応時間を適用して行い、同じく上記の方法にて
反応物の精製を行うことができる。また、ネオカルチノ
スタチンに架橋剤を用いてマレイミド基を導入する反応
条件も上記の免疫グロブリンまたはそのフラグメントに
架橋剤を反応させる場合の反応条件と同様である。After the reaction is completed, unreacted crosslinking agents and low-molecular reaction products are removed by dialysis or molecular sieve force chromatography. When a disulfide group is introduced by a crosslinking agent, the disulfide group is reduced to a thiol group, but such a reaction uses an excess of a thiol reagent (e.g., 2-mercaptoethal, diteothreitol), and the above reaction is performed. The reaction can be carried out by applying a temperature and two reaction times, and the reaction product can be purified by the same method as described above. Furthermore, the reaction conditions for introducing a maleimide group into neocarzinostatin using a crosslinking agent are the same as those for reacting the crosslinking agent with the above-mentioned immunoglobulin or its fragment.

チオール基を発生または導入されたチオール基を有する
免疫グロブリンまたはそのフラグメントとマレイミド基
が導入されたネオカルチノスタチンとの反応は、両者を
混合して（反応液の好ましいｐＨは５〜８で、好ましい
蛋白濃度は１〜２０岬／−である）、０〜４０℃で２〜
２４時間行われる。上記方法によって得られる免疫グロ
ブリン又はそのフラグメントとネオカルテ＝２１− ノスタチンの複合体の、反応混合物からの分離。The reaction between an immunoglobulin having a thiol group or a fragment thereof having a thiol group generated or introduced therein and neocarzinostatin having a maleimide group introduced can be carried out by mixing the two (the preferred pH of the reaction solution is 5 to 8, The preferred protein concentration is 1-20 cap/-), 2-20 at 0-40°C.
It will be held for 24 hours. Separation of the complex of immunoglobulin or its fragment obtained by the above method and Neocalte=21-nostatin from the reaction mixture.

精製は通常用いられる操作、例えば、分子ふるいのカラ
ムクロマトグラフィーによって行なうことができる。Purification can be carried out by commonly used operations, such as molecular sieve column chromatography.

本発明の選択的殺細胞性蛋白複合体は、癌細胞等の標的
細胞に対し毒性を発揮するネオカルチノスタチンから成
る構成部分と、標的細胞を選択的に認識し、ネオカルチ
ノスタチンを標的細胞に選択的に到達せしめるキャリア
ーである免疫グロブリンまたはそのフラグメントから成
る構成部分を有し、しかも画構成部分が化学的に安全な
結合によって結合されているので、標的細胞に対する細
胞毒性を選択的にしかも効率よく発揮できるという特徴
を有している。またかかる複合体は、本発明の方法によ
って純度高くｉ造することができる。The selective cell-killing protein complex of the present invention has a component consisting of neocarzinostatin that is toxic to target cells such as cancer cells, and a component that selectively recognizes target cells and targets neocarzinostatin. It has a constituent part made of immunoglobulin or its fragment, which is a carrier that selectively reaches cells, and the constituent parts are linked by chemically safe bonds, so it selectively suppresses cytotoxicity to target cells. Moreover, it has the characteristic of being able to perform effectively. Further, such a complex can be produced with high purity by the method of the present invention.

以下、実施例により本発明を詳述する。Hereinafter, the present invention will be explained in detail with reference to Examples.

２２− 実施例１ （イ）　抗マウス乳癌ＭＭ４６モノクローン抗体の調製 細胞融合法により得られた抗ＭＭ４６ＩＳＩＧ２ｂ抗体
産生性ハイプリドーマ（瀬戸加太ら、ジャーナル　オプ
　イムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　）、第１２８
巻、２０１〜２０５頁、１９８２年参照）を、ヌードマ
ウス１５匹の腹腔に、−匹当り２Ｘ１０’個接種し、１
０日後に腹水液を採取し、得られた腹水液５０−を５ｔ
の０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨｓ、ｏ　）に十分透析し
た。透析内液を同じ緩衝液で十分に平衡化されたプロテ
ィンＡ・セファロースカラム（カラムサイズ１，５　Ｘ
　１２．５　ｏｎ　）にかけて、十分に素通り蛋白を流
し出した後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，０）で
不純蛋白を溶出し、　その後０．１Ｍクエン酸緩衝液（
ｐＨ３，０）で吸着していたＩｆＧ２ｂを溶出し、溶出
液のｐＨを２ＭＴ「目−Ｈｏｔ緩衝液（ｐＨ８，２）で
中性にもどじ、その後５ｔの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｉ−ｔ７．５）に十分透析し、１ｏｓｑ（ｔ７．７−）
の抗ＭＭ４６モノクローン抗体（ＩｆＧ２ｂ　）を得た
。22- Example 1 (a) Preparation of anti-mouse mammary cancer MM46 monoclonal antibody Anti-MM46 ISIG2b antibody-producing hybridoma obtained by cell fusion method (Kata Seto et al., Journal Op Immunology (J, Immunol), No. 128
Vol., pp. 201-205, 1982) was inoculated into the peritoneal cavity of 15 nude mice at 2×10' mice per mouse.
Ascites fluid was collected after 0 days, and 5 tons of the obtained ascites fluid 50-
The mixture was thoroughly dialyzed against 0.1 M phosphate buffer (PHs, o ). The dialysis solution was thoroughly equilibrated with the same buffer using a Protein A/Sepharose column (column size 1.5
12.5 on) to sufficiently wash out the protein that passed through, elute the impure protein with 0.1M citrate buffer (pH 5,0), and then add 0.1M citrate buffer (pH 5.0) to elute the impure protein.
The adsorbed IfG2b was eluted with 2MT Hot buffer (pH 8, 2), and the pH of the eluate was returned to neutral with 2MT Hot buffer (pH 8, 2), and then 5 tons of 20mM phosphate buffer (pH 8, 2) was added to the eluate.
It was thoroughly dialyzed to I-t7.5) and 1 osq (t7.7-)
An anti-MM46 monoclonal antibody (IfG2b) was obtained.

また、正常マウス血清５０−より、上記と同様にして非
免疫ｒｙｏ２ｂ　２５　Ｗ　（７，０ｍ１）を得た。In addition, non-immune ryo2b 25 W (7.0 ml) was obtained from normal mouse serum 50-ml in the same manner as above.

（ロ）　チオール基をもつｒｐｏ２ｂ抗体の調製上記（
イ）で得られた抗ＭＭ４６モノク四−ン抗体１ｆＧ２ｂ
　２７．３岬（４，６、ｔ、０．１８２μｍｏｌｅ）に
Ｎ−サクシンイミジル　３−（２−ピリジルジチオ）グ
ロピオネート（以下５ＰＤＰと略す）の２０ｍＭエタノ
ール溶液３６．４μｔ　（ＩｐＧ２ｂの４倍当量）を加
え、室温で３０分間反応させた後、反応液に、２ＭＴｒ
ｉｓ　−ＨＯ４緩衝液（ｐＨ７，５）を１／１ｏ容量、
２Ｍ２−ＭＥを１０．ｌＪｌ、（ＳＰＤＰに対して３０
倍当量）加えて３７℃で１時間インキュベートした。(b) Preparation of rpo2b antibody having a thiol group (
Anti-MM46 monoquine antibody 1fG2b obtained in b)
Add 36.4 μt (4 times equivalent of IpG2b) of a 20 mM ethanol solution of N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) gropionate (hereinafter abbreviated as 5PDP) to 27.3 cape (4,6, t, 0.182 μmole). After reacting at room temperature for 30 minutes, 2MTr was added to the reaction solution.
1/1 volume of is-HO4 buffer (pH 7,5),
2M2-ME 10. lJl, (30 for SPDP
double equivalent amount) and incubated at 37°C for 1 hour.

次いで反応液を２０ｍＭＩＪン酸緩価液（ｐＨ７，５）
で平衡化されているセファデックスＧ−２５カラムにか
け、低分子物質を取り除き、約２０Ｍ９（４，７６ｍｊ
）のチオール基が導入された抗Ｍ　Ｍ　４６１９Ｇ２ｂ
抗体を得た。非免疫Ｉｙ２ｂについても同様にして、２
５ｍ９のＩｐＧ２ｂより約２０岬（７Ｊ＋ｄ）のチオー
ル基が導入されたＩｆＧ２ｂを得た。Then, the reaction solution was diluted with 20mM J acidic acid solution (pH 7.5).
Approximately 20M9 (4,76 mj
) anti-M M 4619G2b into which a thiol group was introduced
Obtained antibodies. Similarly, for non-immune Iy2b, 2
IfG2b into which about 20 capes (7J+d) of thiol groups were introduced was obtained from 5m9 of IpG2b.

（ハ）　ｍ−マレイミドベンゾイルネオカルチノスタチ
ンの調製 遮光下にネオカルチノスタチン（以下ＮＯ８と略す）　
ｓ　４．３ｓｙ　（ｓ、２−）を含む５０ｍＭリン酸緩
衝液（＋）Ｈ７，０）に、Ｎ−サクシンイミシル　ｍ−
マレイミドヘン／−１−−ト（以下８ＭＢと略す）のＮ
、Ｎ’−ジメチルホルムアミド溶液（１７３ｍＭ）０．
１５−を加え、２３℃で３０分間反応させた。反応液を
遠心し上清を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，２）で平
衡化されているセファデックスＧ−２５カラム（１ｃｒ
Ｒ×３６ｃｒｎ）にかけ、未反応のＳＭＢ等の低分子物
質を除き、ｍ−マレイミドベンゾイルネオカルチノスタ
テ／（以下ＮＯ８−ＭＢと略す）９．９岬（４，ｓ−）
を得た。(c) Preparation of m-maleimidobenzoyl neocarzinostatin Neocarzinostatin (hereinafter abbreviated as NO8) in the dark
N-succinimisyl m-
Maleimidehen/-1--to (hereinafter abbreviated as 8MB) N
, N'-dimethylformamide solution (173mM) 0.
15- was added and reacted at 23°C for 30 minutes. The reaction solution was centrifuged and the supernatant was transferred to a Sephadex G-25 column (1cr) equilibrated with 50mM phosphate buffer (pH 6.2).
R x 36 crn) to remove unreacted low molecular weight substances such as SMB, m-maleimidobenzoyl neocarcinostate/(hereinafter abbreviated as NO8-MB) 9.9 capes (4, s-)
I got it.

２５− なお、生成物の一部１００μｔに１０倍当量のジニトロ
フェニル−システィン（以下ＤＮＰＮシーティンと略す
）を加え２３℃で１時間インキュベーションし、生理食
塩水で平衡化しであるセファデックスＧ−２５に通し、
未反応のＤＮＰ−システィンを除き、得られた試料の２
７８　ｎｍと３６１　ｎｍの吸光度を測定したところ（
ＮＯ８８％ １ｃＰｎ＋２７８ｎｍ′１５ｔＤＮ Ｐ　−Ｖ　、ｒ、テ／（７Ｂ％ｌ、、Ｉ、　３６１　ｎ
ｍ　＝　１７”ｏ）、平均してＮＣ！８１個あたり０．
３２個のｍ−マレイミドベンゾイル基が導入されている
ことがわかった〇 に）抗Ｍ　Ｍ　４６　ＩｆＧ２ｂ抗体とＮＯ８の複合体
の作製 上記（Ｉ：Ｉ）の如くして得られたチオール基が導入さ
れた抗Ｍ　Ｍ　４６　ＩｐＧ２ｂ抗体２０ｖ（４，ｙ６
−）に上記（ハ）の如くして得られたＮＯ８−ＭＢを４
．７３岬（２，１５−）加え、水酸化ナトリウムでｐＨ
７，０に合わせて４℃で一晩反応させた。反応終了後反
応液を生理食塩水で平衡２６− 化されているセファデックスＧ−１５０スーパーフアイ
ンカラム（１，５Ｘ　ｓ　９　ｃｍ　）にかけ、第２図
の斜線部分の両分を集め濃縮し、本発明の複合体を含む
生成物２０．８　ｍｇ　（ｓ、ｘｗＩｔ）を得た。得ら
れた生成物をラウリル硫酸ナトリウム・ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（以下５ＤＳ−ＰＡＧＥと略す）によ
シ解析したところ、第３図のディスク２に示した如きバ
ンドのパターンが得られ、この生成物社未反応の抗Ｍ　
Ｍ　４６１ｆＧ２ｂ抗体（分子量約１５，５万）と、Ｉ
ｆＧ２ｂ抗体にＮＯ８が１個結合したもの（分子量約１
７万）とＩｙＧ２ｂ抗体にＮＯ８が２個結合したもの（
分子量約１８万）とからなることがわかった。25- In addition, 10 times the equivalent of dinitrophenyl-cysteine (hereinafter abbreviated as DNPN sheetin) was added to 100 μt of a portion of the product, incubated at 23°C for 1 hour, equilibrated with physiological saline, and transferred to Sephadex G-25. Through,
After removing unreacted DNP-cysteine, 2 of the obtained sample
When absorbance was measured at 78 nm and 361 nm (
NO88% 1cPn+278nm'15tDN P -V , r, Te/(7B%l, , I, 361 n
m = 17”o), on average NC! 0.0 per 81 pieces.
It was found that 32 m-maleimidobenzoyl groups were introduced. ○) Preparation of a complex of anti-M M 46 IfG2b antibody and NO8 The thiol group obtained as above (I:I) was introduced. Anti-M M 46 IpG2b antibody 20v (4,y6
-), add NO8-MB obtained as in (c) above to 4
．． Add 73 Misaki (2,15-) and adjust the pH with sodium hydroxide.
7.0 and allowed to react overnight at 4°C. After the completion of the reaction, the reaction solution was applied to a Sephadex G-150 Super Fine column (1,5X s 9 cm) that had been equilibrated with physiological saline, and both the diagonally shaded portions in Figure 2 were collected and concentrated. 20.8 mg (s, xwIt) of product containing the conjugate of the invention was obtained. When the obtained product was analyzed by sodium lauryl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (hereinafter abbreviated as 5DS-PAGE), a band pattern as shown in disk 2 of Fig. 3 was obtained, and this product unreacted anti-M
M 461fG2b antibody (molecular weight approximately 15,5000) and I
fG2b antibody bound to one NO8 (molecular weight approximately 1
70,000) and an IyG2b antibody bound to two NO8s (
The molecular weight was approximately 180,000).

非免疫Ｉｆ！Ｇ２ｂ抗体を用い、前記と同様にしてＮＯ
８との反応を行なったところ、その生成物の１９ＤＳ−
ＰＡＧＥによる解析結果は第３図のディスク３の如くで
あり、抗ＭＭ４６ＩｐＧ２ｂ抗体の場合と類似していた
。Non-immune If! Using G2b antibody, NO
When the reaction with 8 was carried out, the product 19DS-
The PAGE analysis results were as shown in Disc 3 of FIG. 3, and were similar to those for the anti-MM46IpG2b antibody.

なお、第１図のディスクｌは抗ＭＭ４６ＩｆＧ２ｂ抗体
のバンドのパターンである。Note that disk 1 in FIG. 1 is a band pattern of anti-MM46IfG2b antibody.

（ハ）　マウスにおける治療実験 上記に）の如くして作製した抗ＭＭ４６■りＧ２ｂ抗体
とＮＯ８の複合体を含む生成物（以下単に抗Ｍ　Ｍ　４
６　ＩｆＧ２ｂ抗体とＮＯ８の複合体という）の、ＭＭ
４６腫瘍を移植したマウスに対する治療効果を検討した
。(c) Therapeutic experiment in mice A product containing a complex of anti-MM46 G2b antibody and NO8 prepared as described above (hereinafter simply referred to as anti-MM4
6 IfG2b antibody and NO8 complex), MM
The therapeutic effect on mice transplanted with 46 tumors was investigated.

即ち、一群５匹の０３Ｈマウスに３Ｘ１Ｇ５個のＭＭ４
６細胞を腹腔内に移植し、移植２４時間後に静脈注射に
より検体（抗ＭＭ４６ＩｐＧ２ｂ抗体とＮＯ８の複合体
、非免疫ＩｆＧ２ｂ抗体とＮＯ８の複合体、抗ＭＭ４６
ＩｐＧ２ｂ抗体とＮＯ８の１＝１混合物の５０μｔまた
は５００μ２）を投与し、各群のマウスの寿命を比較し
、抗ＭＭ　４６　ＩｐＧ２ｂ抗体とＮＯ８の複合体の抗
腫瘍活性を検討した。That is, 3×1G5 MM4 were administered to each group of 5 03H mice.
6 cells were transplanted intraperitoneally, and 24 hours after transplantation, the samples (complex of anti-MM46IpG2b antibody and NO8, complex of non-immune IfG2b antibody and NO8, anti-MM46
A 1=1 mixture of IpG2b antibody and NO8 (50 μt or 500 μ2) was administered, and the lifespan of mice in each group was compared to examine the antitumor activity of the complex of anti-MM 46 IpG2b antibody and NO8.

その結果を第４図に示した。非免疫ｒｆＧＲｂ抗体とＮ
Ｏ８の複合体はＳＯＯμＶ投与しても抗腫瘍性を示さず
、マウスの寿命は食塩水投与の対照群とほぼ同じであシ
、全゛マウスが腫瘍移植後１５日までに死亡しｆｃ（第
４図（ｂ））。The results are shown in Figure 4. Non-immune rfGRb antibody and N
The O8 complex did not show antitumor activity even when administered with SOOμV, and the lifespan of the mice was almost the same as that of the saline-administered control group, with all mice dying by 15 days after tumor implantation and fc (fc). Figure 4(b)).

抗Ｍ　Ｍ　４６　ＩｙＧ　２　ｂ抗体とＮＯ８の１対１
混合物では、５００及び５０μ２投与した場合、若干の
抗腫瘍効果がみられたが、−匹のマウスが長期間生存し
たに止まった（第４図（Ｃ））。Anti-M M 46 IyG 2 b antibody and NO8 1:1
Although some antitumor effects were seen in the mixture when administered at 500 and 50μ2, only -1 mice survived for a long period of time (Figure 4(C)).

これに対し、抗Ｍ　Ｍ　４６　ＩｆＧ２ｂ抗体とＮＯ８
の複合体投与群では、５００μ２投与した場合３匹のマ
ウスが長期間生存し、本発明の複合体に強い抗腫瘍性が
あることがわかった（第４図（ａ））。In contrast, anti-MM46 IfG2b antibody and NO8
In the complex administration group, 3 mice survived for a long period of time when 500μ2 was administered, indicating that the complex of the present invention has strong antitumor properties (Figure 4(a)).

実施例２ （イ）　抗マウス白血病Ｌ１２１０Ｉ、Ｇの調製マウス
白血病Ｌ１２１０細胞ｌＸｌ０’個をフロイント完全ア
ジュバントとのエマルジョンとし、家兎に静脈注射した
。その後頁に、　１週間間隔で３回、それぞれ約Ｉ　Ｘ
　１０’個のＬ１２１０細胞をアジュバントと共に皮下
注射し、最終投与口から８日後に採血した。得られた血
液をプールし、血清を分離し、その２９− 血清を５６℃、３０分間加熱、非動化した。Example 2 (a) Preparation of anti-mouse leukemia L1210I, G 1X10' mouse leukemia L1210 cells were made into an emulsion with Freund's complete adjuvant and intravenously injected into rabbits. On subsequent pages, three times at one-week intervals, each about I
10' L1210 cells were injected subcutaneously with an adjuvant, and blood was collected 8 days after the final injection. The obtained blood was pooled, the serum was separated, and the 29-serum was inactivated by heating at 56°C for 30 minutes.

こうして得られた抗Ｌ１２１０血清２００＋ｄに、硫安
の飽和水溶液２００−を加えて、生じた沈澱を遠心分離
によって分散した。この沈澱を０．０１　Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，６）　５０−に溶解し、更に同緩衝液に対
して十分に透析した。この透析内液を同じ緩衝液で平衡
化したＤＥＡＥ　セルロースカラムクロマトグラフィー
（カラムサイズ３ｔｙＲＸ９４ｍ）にかけて、未吸着分
画として抗Ｌ１２１０ＩｆＧを含む溶液を得た。To 200+d of the anti-L1210 serum thus obtained, 200-d of a saturated aqueous solution of ammonium sulfate was added, and the resulting precipitate was dispersed by centrifugation. This precipitate was dissolved in 0.01 M phosphate buffer (pH 7,6) 50- and then thoroughly dialyzed against the same buffer. This dialyzed solution was subjected to DEAE cellulose column chromatography (column size 3tyRX94m) equilibrated with the same buffer solution to obtain a solution containing anti-L1210IfG as an unadsorbed fraction.

（ロ）　免疫グロブリンよ！ｌ）　Ｆ’　（ａｂ’）ｚ
フラグメントの分離 上記０）の如くして得られた抗Ｌ１２１０　ｒｔＧの１
．２ｆを０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，ｓ）４゜−に溶
解し、２４岬のペプシンを添加して、３７℃で約１８時
間分解した後、分解生成物を生理食塩水中でセファデッ
クス０２００カラムクロマトグラフイー（カラムサイズ
３．５２　Ｘ　１４０　ａｍ　）にかけて、分子量約１
０万の３０− ところに流出する蛋白として純粋なＦ　（ａ　ｂ’）２
７ラグメントを得た。(b) Immunoglobulin! l) F'(ab')z
Isolation of fragments 1 of anti-L1210 rtG obtained as in 0) above.
．． 2f was dissolved in 0.1M acetate buffer (pH 4, s) at 4°, and 24 pepsin was added to decompose it at 37°C for about 18 hours. By column chromatography (column size 3.52 x 140 am), the molecular weight was approximately 1.
Pure F (a b')2 as a protein flowing out at 30-00000
7 fragments were obtained.

（ハ）　Ｆａｂ’フラグメントの調製 上記（ロ）の如くして得られたＦ　（ａｂ’　）２フラ
グメン）　１８．４岬を含む０．０１　Ｍ　）リス・塩
酸−０，１４Ｍ塩化ナトリウム−２ｍＭＢＤＴＡ溶液（
ｐＨ８，３）　２．０−に、１５０ｍＭの２−メルカプ
トエタノール水溶液を０．０２ｗｔ加えて、３７℃で１
時間還元した。反応後、その溶液を５ｍＭ酢酸緩衝液−
０，１４Ｍ塩化ナトリウム−１ｍＭＥＤＴＡｌｌｌ液（
ｐＨ５，５）　（以下、ＡＮＥ緩衝液と略す）で平衡化
したセファデックス０２５カラムクロマトグラフイー（
１，０３Ｘ　２０　ｃａｒ　）にかけて２−メルカプト
エタノールを除去し、チオール基１個を有するＦａｂ’
７ラグメントを得た。(c) Preparation of Fab' fragment F(ab')2 fragment obtained as in (b) above) 0.01 M lithium hydrochloric acid-0.14 M sodium chloride-2mM BDTA solution containing 18.4 capes (
pH 8,3) 0.02 wt of 150 mM 2-mercaptoethanol aqueous solution was added to 2.0-, and the mixture was heated to 1 at 37°C.
Time was saved. After the reaction, the solution was diluted with 5mM acetate buffer.
0,14M sodium chloride-1mM EDTAll solution (
Sephadex 025 column chromatography (pH 5.5) (hereinafter abbreviated as ANE buffer) equilibrated with
1,03 x 20 car) to remove 2-mercaptoethanol and prepare Fab' having one thiol group.
7 fragments were obtained.

に）抗マウス白血病Ｌ　１２１０　ＴｐＧフ２グメン）
　Ｆａｂ’とＮＯ８の複合体の作製 上記ｅ９の如くして得られた抗Ｌ　１２１０　Ｉ、Ｇの
Ｆ　ａ　ｂ’　７ラグメントｓｑ＋　（２ｗ　）に、実
施例１の（ハ）の如くして得られたＮＯ８−ＭＢを３，
５岬（１，６＋ｄ）加え、０．５Ｍリン酸緩衝液（＋）
Ｈ７，０）を１７１０容量加え、　４℃で一晩反応させ
た。反応終了後、生理食塩水で平衡化されているセファ
デックスＧ−１５０スーパーフアインカラム（１，５備
ｘｓ９６ｎ）によって複合体を精製し、抗Ｌ１２１０Ｉ
ｐＧのＦａｂ’フラグメントとＮＯ８の複合体ｅｗｑ　
（４＋ｄ　）を得た。得られた複合体には、５ＤＳ−ｐ
ＡＧＦｉにより解析したところ、分子量約５万０Ｆ　ａ
　ｂ’と分子量約６万の蛋白（複合体）が含まれている
ことが判った。) Anti-mouse leukemia L 1210 TpG protein)
Preparation of a complex of Fab' and NO8 To the anti-L 1210 I, G Fab' 7 fragment sq+ (2w) obtained as in e9 above, was added the complex obtained as in Example 1 (c). 3 NO8-MB
5 Misaki (1,6+d) plus 0.5M phosphate buffer (+)
1,710 volumes of H7,0) were added, and the mixture was reacted overnight at 4°C. After the reaction was completed, the complex was purified using a Sephadex G-150 superfine column (1,5 x s96n) equilibrated with physiological saline, and the anti-L1210I
Complex of pG Fab' fragment and NO8 ewq
(4+d) was obtained. The resulting complex contains 5DS-p
When analyzed by AGFi, the molecular weight was approximately 50,000F a
b' and a protein (complex) with a molecular weight of approximately 60,000.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

第１図の（イ）は、免疫グロブリンの基本構造を示す模
式図、←）はヒト免疫グロブリンのＩｐＧ　１の構造を
示す模式図である。第２図は、実施例１に）で得た反応
生成物の、セファデックスＧ−１５０スーパーフアイン
Φカラムクロマトグラフイーにおける蛋白流出パターン
である。第３図は、８Ｄ８−ＰＡＧＥのパターンであシ
、ディスク１は抗Ｍ　Ｍ　４６　ＩｆＧ２ｂ抗体、ディ
スク２は実施例１で得られた抗Ｍ　Ｍ　４６　ＩｆＧ２
ｂ　抗体とＮＯ８の複合体、６デイスク３拡同じ〈実施
例１で得られた非免疫ＩｙＧ２ｂとＮＯ８の複合体を５
ＤＳ−ＰＡＧＥにかけて得られたバンドのパターンであ
る。第４図線、実施例１■で行なった抗ＭＭ４６抗体と
ＮＯ８の複合体の抗腫瘍性を、ＭＭ４６腫瘍を移植した
マウスに対する治療効果で調べた結果であυ、マウスの
生存率を、腫瘍移植後の日数に対して示した図である。 （ａ）　Ｕ抗Ｍ　Ｍ　４６　ＩｐＧ２ｂとＮＯ８との複
合体の場合で、−〇−は生理食塩水を、−〇−は５００
μ２、−△−は５０μＶの複合体を投与した場合の生存
率を示す。（ｂ）は非免疫ＩｐＧ２ｂとＮＯ８との複合
体の場合で、−・−は生理食塩水を、−〇−はＳＯＯμ
Ｖ、−Δ−は５０μｔの複合体を投与した場合の生存率
を示す。（Ｃ）は抗Ｍ　Ｍ　４６　ＩｆＧ２ｂとＮＯ８
が１：１の割合の混合物の場合で、−・−は生理食塩水
を、−〇−は５００μ？、３３− 一△−は５０μりの混合物を投与した場合の生存率を示
す。 特許出願人　帝人株式会社 ３４− 第２図 ０　　　　　　　　　　　　　５０ 今　画 第　３　図FIG. 1(a) is a schematic diagram showing the basic structure of immunoglobulin, and ←) is a schematic diagram showing the structure of human immunoglobulin IpG1. FIG. 2 shows the protein efflux pattern of the reaction product obtained in Example 1) in Sephadex G-150 Superfine Φ column chromatography. FIG. 3 shows the pattern of 8D8-PAGE, disk 1 is anti-MM 46 IfG2b antibody, and disk 2 is anti-MM 46 IfG2 obtained in Example 1.
b Complex of antibody and NO8, 6 disks 3 enlarged <The complex of non-immune IyG2b and NO8 obtained in Example 1 was
This is a band pattern obtained by DS-PAGE. Figure 4 line shows the results of examining the antitumor properties of the complex of anti-MM46 antibody and NO8 in Example 1■ by evaluating the therapeutic effect on mice transplanted with MM46 tumors. It is a diagram shown against the number of days after transplantation. (a) In the case of a complex of U anti-M M 46 IpG2b and NO8, -〇- is physiological saline, -〇- is 500
μ2, -Δ- indicates the survival rate when 50 μV of the complex was administered. (b) is the case of a complex of non-immune IpG2b and NO8, -・- is physiological saline, -〇- is SOOμ
V, -Δ- indicates the survival rate when 50 μt of the complex was administered. (C) Anti-MM46 IfG2b and NO8
In the case of a mixture with a ratio of 1:1, -・- is physiological saline, -〇- is 500 μ? , 33-1Δ- indicates the survival rate when 50μ of the mixture was administered. Patent applicant Teijin Ltd. 34- Figure 2 0 50 Now Figure 3

Claims (1)

【特許請求の範囲】 Ｌ　殺すべ亀細胞のもっている特定の抗原と選択的に結
合し得る免疫グロブリンまたはそのフラグメントとネオ
カルチノスタチンを、下記式〔！〕 で表わされる２価の有機基を介して結合させてなる選択
的殺細胞性蛋白複合体。 ２　下記式〔１〕で表わされる、特許請求の範囲第１項
記載の選択的殺細胞性蛋白複合体。 ＆　下記式〔璽〕で表わされる、特許請求の範囲第１項
記載の選択的殺細胞性蛋白複合体。 ４　発生または導入されたチオール基を有する免疫グロ
ブリンまたはそのフラグメントと、導入されたマレイミ
ド基を有するネオカルチノスタチンを反応させることを
％級とする、免疫グロブリンまたはそのフラグメントと
ネオカルチノスタチンが、下記式〔■〕 で表わされる２価の有機基を介して結合している選択的
殺細胞性蛋白複合体の製造方法。[Claims] L An immunoglobulin or a fragment thereof capable of selectively binding to a specific antigen possessed by turtle cells to be killed and neocarzinostatin are combined with the following formula [! ] A selective cell-killing protein complex bonded via a divalent organic group represented by: 2. The selective cell-killing protein complex according to claim 1, which is represented by the following formula [1]. & The selective cell-killing protein complex according to claim 1, which is represented by the following formula. 4. The immunoglobulin or its fragment having a generated or introduced thiol group or its fragment and neocarzinostatin having an introduced maleimide group are reacted with the immunoglobulin or its fragment and neocarzinostatin, A method for producing a selective cell-killing protein complex bound via a divalent organic group represented by the following formula [■].