JPS611622A - Cytotoxic complex and preparation thereof - Google Patents

Abstract

PURPOSE:The titled complex having a constituent component consisting of immunoglobulin or fragment capable of bonding specifically to a specific antigen of cells to be killed and a constituent component consisting of blood serum albumin bonded to a cytotoxin. CONSTITUTION:A cytotoxic complex obtained from immunoglobulin capable of bonding specifically to a specific antigen of cells to be killed, e.g. prepared from antiserum separated from an animal immunized by tumorous cells or target cells, e.g. specific lymphocytes or tissue containing the same, or a fragment and a cytotoxic part having bonded 31-60 cytotoxins based on one blood serum albumin molecule bonded to blood serum albumin through S atoms of the blood serum, e.g. the formula (Ab is immunoglobulin fragment; Al is blood serum albumin; Cy is cytotoxin; B1 is bifunctional organic group; m is an integer 31- 60; n is an integer 1-10).

Description

【発明の詳細な説明】 （ａ）　　産業上の利用分野 本発明は新規な細胞毒性複合体とその製造法に関する。[Detailed description of the invention] (a) Industrial application field The present invention relates to a novel cytotoxic conjugate and a method for producing the same.

更に詳しくは、殺すべき細胞（以下標的細胞という）の
もつ特定の抗原と特異的に結合しうる免疫グロブリン、
あるいはその抗原結合部位を含むフラグメントからなる
構成部分と、細胞毒性物質を結合せしめた血清アルブミ
ンからなる構成部分を有する、新規な細胞毒性複合体と
その製造法に関するものである。本発明で得られる細胞
毒性複合体は、例えば、ガン細胞に選択的に作用を発現
する抗腫瘍剤として有用である。More specifically, immunoglobulins that can specifically bind to specific antigens of cells to be killed (hereinafter referred to as target cells);
Alternatively, the present invention relates to a novel cytotoxic complex having a component consisting of a fragment containing the antigen-binding site and a component consisting of serum albumin bound to a cytotoxic substance, and a method for producing the same. The cytotoxic complex obtained by the present invention is useful, for example, as an antitumor agent that selectively acts on cancer cells.

（ｂ）　　従来技術 ある種の細胞だけを選択的に殺すことを目的として、そ
の標的細胞と特異的に結合しうる免疫グロブリンを種々
の細胞毒性物質と結合させる試みがなされてきた。例え
ば、免疫グープリン１ｌＣｐ−ジ（２−りｐロエチル）
アミ７−Ｌ−フェニルアラニン認を結合した複合体（特
開昭５ｌ−６１６４０）ｌ免疫グロブリンにメトトレキ
セート等を結合した複合体（４ｉ開昭５６−６５８２９
）ｌ免疫グロブリンにクロラムプシル等を結合した複合
体（特開昭５６　６５８２８）＋免疫グロブリンにマイ
トマイシン−Ｃ等を結合した複合体（特開昭−５５−９
２３２５）ｌ免疫グロブリンにダウノマイシンを結合し
た複合体（特開＠５ｌ−１４４７２３）等が知られてい
る。(b) Prior Art For the purpose of selectively killing only certain types of cells, attempts have been made to combine various cytotoxic substances with immunoglobulins that can specifically bind to the target cells. For example, immunoguprin 1lCp-di(2-poethyl)
A complex containing amino-7-L-phenylalanine (JP-A-51-61640) A complex containing methotrexate, etc., bound to immunoglobulin (4i JP-A-56-65829)
) complex of immunoglobulin bound to chlorampsil, etc. (JP-A-56-65828) + complex of immunoglobulin bound to mitomycin-C, etc. (JP-A-55-9)
2325) A complex in which daunomycin is bound to immunoglobulin (Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-144723) is known.

（ｃ）　　発明が解決しようとする問題１粍これらの方
法で得られた細胞毒性複合体は、ガン細胞と選択的に結
合しガン細胞に毒性を発揮することが期待されるもので
あり、非常に興味のある複合体である。しかしながら細
胞毒性物質を直接抗体に結合する場合は、免疫グープリ
ンに多数の細胞毒性物質を結合すると、抗体の抗原ｇ識
活性が低下してしまうので、かかる困難を回避するため
には、少数の細胞毒性物質を結合するにととめざるをえ
ない。(c) Problem 1 to be solved by the invention The cytotoxic complexes obtained by these methods are expected to selectively bind to cancer cells and exhibit toxicity to cancer cells, and are extremely is a complex of interest. However, when directly binding a cytotoxic substance to an antibody, binding a large number of cytotoxic substances to immunoguplin reduces the antigen recognition activity of the antibody. It has no choice but to bind toxic substances.

（ｄ）　　問題点を解決するための手段本発明者等は、
かかる先行技術の欠点を解決すべく鋭意研究を行なった
結果、先ず血清アルブミンに多数の細胞毒性物質を結合
せしめ、然る後かかる細胞ｌＩ性物質を結合せしめた血
清アルブミン（細胞毒性部）を免疫グロブリンまたはそ
のフラグメントと結合せしめれば、抗体活性を損うこと
なく多数の細胞毒性物質を結合した免疫グープリン−細
胞毒性物質複合体を製造し得ることを見い出して本発明
に到達した。(d) Means for solving the problem The inventors,
As a result of intensive research to solve the drawbacks of the prior art, we first bound a large number of cytotoxic substances to serum albumin, and then used the serum albumin (cytotoxic part) to which the cytotoxic substances were bound for immunization. The present invention has been achieved based on the discovery that an immunogupulin-cytotoxic substance complex can be produced which binds a large number of cytotoxic substances without impairing antibody activity by binding it to globulin or a fragment thereof.

すなわち、本発“明は殺すべき細胞のもっている特定の
抗原と特異的に結合し得る免疫グロブリンまたはそのフ
ラグメントと、血清アルブミンの分子１個当り細胞毒性
物質が３１〜６０個結合してなる細胞毒性部とが、血清
アルブミン中の硫黄原子を介して結合せしめられてなる
細胞毒性複合体に関するものである。That is, the present invention is directed to a cell comprising an immunoglobulin or a fragment thereof capable of specifically binding to a specific antigen of the cell to be killed, and 31 to 60 cytotoxic substances per molecule of serum albumin. The cytotoxic complex relates to a cytotoxic complex in which the toxic portion is bound via a sulfur atom in serum albumin.

本発明において、殺すべき細胞のもっている特定の抗原
と特異的に結合しうる免疫グープリン（細胞毒性蛋白複
合体の誘導部）とは次のようなものである。腫瘍細胞あ
るいは特定のリンパ球等の標的細胞あるいはそれらを含
む組絨で免疫されたヒト、サル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒ
ツジ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラット、マウ
ス等の動物がら分離された抗血清より、エタノール分画
、硫安分画、イオン交換あるいは分子篩カラムクルマド
グラフィー等の公知の手段によって１１１Ｍされる免疫
グロブリン、あるいは標的細胞で免疫した動物より採取
された抗体産生細胞を発癌性のある物質で癌化させたり
、ミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマ処したり
することＫよって得られるモノクルーナルな抗体をいう
。また標的細胞に結合した免疫グロブリンを界面活性剤
等で分離して得られる、標的細胞に特異的な免疫グロブ
リンも本発明の免疫グロブリンに含まれる。In the present invention, the immunogupulin (inducer of cytotoxic protein complex) that can specifically bind to a specific antigen possessed by cells to be killed is as follows. Antibiotics isolated from animals such as humans, monkeys, horses, cows, goats, sheep, rabbits, guinea pigs, hamsters, rats, and mice that have been immunized with target cells such as tumor cells or specific lymphocytes, or tissue containing them. Antibody-producing cells collected from animals immunized with immunoglobulin or target cells, which are 111M purified from serum by known means such as ethanol fractionation, ammonium sulfate fractionation, ion exchange, or molecular sieve column chromatography, are carcinogenic. A monoclonal antibody obtained by causing cancer with a substance or by fusion with myeloma cells to produce a hybridoma. The immunoglobulins of the present invention also include target cell-specific immunoglobulins obtained by separating immunoglobulins bound to target cells using a surfactant or the like.

免疫グロブリンにはＩｇＧ　＋　ＩｇＡ　＋　ＩｇＭ　
＋ＩｇＤ　＋　ＩｇＥの５つのクラスが知られており、
さらに各クラスはい（つかのサブクラスから成っている
ことが知られている。しかし、その基本構造は、２本の
重鎮と２本の軽鎖とから成る点、また抗原結合活性をも
つＦａｂ部分とエフェクター活性をもつＦｃ部分から成
る点において一致している。ただし、ＩｇＭは５量体＊
　ＩｇＡは一部２量体で存在する。Immunoglobulins include IgG + IgA + IgM
Five classes are known: +IgD + IgE.
Furthermore, each class is known to consist of several subclasses.However, its basic structure consists of two heavy chains and two light chains, and a Fab portion with antigen-binding activity. They are identical in that they consist of an Fc portion with effector activity.However, IgM is a pentamer*
Some IgA exists in the form of a dimer.

細胞毒性蛋白複合体の誘導部としては、免疫グロブリン
分子全体を用いてもよいが、その抗原結合部位を含むが
、Ｆｃ部分をもたないフラグメントを用いてもよい。Ｆ
ｃ部分を含む複合体にあっては、Ｆｃ部分による標的細
胞以外の細胞に対する非特異的吸着及び細胞膜上のＦＣ
Ｃリブターとの結合が起こり、細胞毒性蛋白複合体の殺
すべき細胞に対する選択性が減じることがあり、また免
疫グロブリンがヒトにとって異種蛋白である場合、その
抗原性は、Ｆｃ部分において特に強いので、蛋白複合体
の抗原性を低下させるために、Ｆｃ部分のない免疫グロ
ブリンのフラグメントが、細胞毒性蛋白複合体の誘導部
として望ましいことがある。一般に、免疫グロブリンを
パパイン（ｐａｐａｉｎ）　＋　）リブシン（ｔｒｙｐ
ｓｉｎ）　＋キモトリプシン（ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓ　
ｉｎ）　＋プラスミン（ｐｌａｓｍｉｎ）等の蛋白分解
酵素で分解すると、抗原結合部分を１つもつ、いわゆる
Ｆａｂフラグメントが得られる。またペプシン（ｐｅｐ
ｓｉｎ）分解９条件によってはトリプシン分解によって
も抗原結合部分を２つもつ、いわゆるＦ　（ａ　ｂ’）
２フラグメントが得られる。このフラグメントはさらに
メルカプタンで処理すると、−価のＦａｂ’フラｌメン
トになる。さらに免蛋グｐプリンを変性させつつ分解さ
せると抗原結合部分（バリ７プル・リージョン　ｖａｒ
ｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ　）のみが得られる。免疫グ
ロブリン及び免疫グロブリン由来の例えば上記のフラグ
メントは、免疫グロブリンがいかなるクラス、サブクラ
スであれ、いずれも本発明の蛋白複合体の誘導部として
用いることもできる。As the derivative of the cytotoxic protein complex, the entire immunoglobulin molecule may be used, or a fragment containing its antigen-binding site but without the Fc portion may also be used. F
In a complex containing the c portion, non-specific adsorption to cells other than target cells by the Fc portion and FC on the cell membrane
Binding with C libtar may occur, reducing the selectivity of the cytotoxic protein complex for the cells to be killed, and if the immunoglobulin is a protein foreign to humans, its antigenicity is particularly strong in the Fc portion. To reduce the antigenicity of the protein complex, a fragment of an immunoglobulin without an Fc portion may be desirable as the derivative of the cytotoxic protein complex. Generally, immunoglobulins are combined with papain (papain +) ribsin (tryp).
sin) + chymotrypsin
In) + When digested with a protease such as plasmin, a so-called Fab fragment having one antigen-binding portion is obtained. Also, pepsin (pep
sin) Degradation 9 Depending on the conditions, tryptic digestion can also result in so-called F (a b') having two antigen-binding parts.
Two fragments are obtained. This fragment is further treated with a mercaptan to become a -valent Fab' fragment. Furthermore, when the immunoguprine is denatured and degraded, the antigen-binding region (vari7 pull region var
region ) is obtained. Immunoglobulins and immunoglobulin-derived fragments, such as those described above, can be used as derivatives of the protein complexes of the present invention, regardless of the class or subclass of the immunoglobulin.

本発明の細胞毒性複合体の他方の成分は、細胞毒性部、
即ち、細胞毒性物質を結合せしめた血清アルブミンであ
るが、かかる細胞毒性物質の押体となる血清アルブミン
としては人及び各種の動物の崩清アルズミンが用いられ
るが、特に好ましくは人及び牛の血清アルブミンである
。また血清アルブミンに結合される細胞毒性物質として
は、例えば各種の抗癌剤が適しているが、特に好ましく
は血清アルブミンの７ミノ基と反応して結合する基を有
する抗癌剤または抗癌剤誘導体であり、その具体例とし
ては、以下の化学式で表わされる化合物を挙げることが
できるが、これらに限られるものではない。The other component of the cytotoxic complex of the present invention is a cytotoxic moiety,
In other words, it is serum albumin to which a cytotoxic substance is bound.As the serum albumin that acts as a carrier for such cytotoxic substance, human and various animal disintegrated albumins are used, but human and bovine serum is particularly preferable. It is albumin. Further, as the cytotoxic substance that binds to serum albumin, for example, various anticancer drugs are suitable, but particularly preferred are anticancer drugs or anticancer drug derivatives having a group that reacts with and binds to the 7-mino group of serum albumin. Examples include, but are not limited to, compounds represented by the following chemical formulas.

ニドｐンウレ７誘導体 りｐラムブシル誘導体 マイトマイシン−〇誘導体 ダウノマイシン誘導体 Ｉ ５−フルオロ−２′−デオキシウリジン誘導体デスアセ
チルビンブラスチン酸アジド誘導体むＯＮ。Nidopunure7 derivatives Lambucyl derivatives Mitomycin-〇 derivatives Daunomycin derivatives I 5-Fluoro-2'-deoxyuridine derivatives Desacetyl vinblastic acid azide derivatives ON.

メ））レキセード活性エステル誘導体 アクチノマイシンーＤオキサジノン誘導体本発明の免疫
グルプリンまたはそのフラグメントと、血清アルブミン
の分子１個当り細胞毒性物質が３１〜６０個結合してな
る細胞毒性部とが、血清アルブミン中の硫黄原子を介し
て結合せしめられてなる細胞毒性複合体の中では、その
製造、精製及び活性上、下記式ＣＩ） で表わされる複合体が好ましく、その中でも下記式（Ｉ
Ｉ）または〔■〕 で表わされる複合体が特に好ましい。m)) Rexade active ester derivative actinomycin-D oxazinone derivative The immunoglupurin of the present invention or its fragment and the cytotoxic moiety formed by binding 31 to 60 cytotoxic substances per molecule of serum albumin, Among the cytotoxic complexes bonded via the sulfur atom in the compound, the complex represented by the following formula (CI) is preferable from the viewpoint of production, purification, and activity.
Particularly preferred are complexes represented by I) or [■].

上記式ＣＩ）　、、　（［］及び（ｍ）　において、Ｓ
、は）血清アルブミン中の硫＊原子を表わし、シス□ ナインまたはシスチンいずれに由来する硫黄原子であっ
てもよい。In the above formula CI),, ([] and (m), S
, represents a sulfur* atom in serum albumin, and may be a sulfur atom derived from either cis□ nine or cystine.

上記式（Ｕ）　Ｋお゛いてｔ、＝０の場合には、Ｓ。If the above formula (U) K and t, = 0, then S.

は免疫グルプリンまたはそのフラグメントに由来する硫
黄原子であり、ｔ、＝１の場合には架橋剤により導入さ
れた硫黄原子である。式（Ｉｆ）において１．＝０の場
合には、硫黄原子Ｓ１とＳ、は直接結合しジスルフィド
基を形成する。is a sulfur atom derived from immunoglobulin or a fragment thereof, and when t, = 1, it is a sulfur atom introduced by a crosslinking agent. In formula (If), 1. When =0, sulfur atoms S1 and S directly bond to form a disulfide group.

一方ｔｓ＝１の場合には、硫黄原子Ｓ１とＳ、は２価の
有機基Ｂ、を介して結合するが、Ｂ、はチオール基と反
応する２個の官能基を有、する架橋剤、例えば下記式（
ＩＸ） （ｎｉは２価の有機基である。〕 で表わされる架橋剤あるいはベンゾキノンに由来する２
価の有機基である。式（ＩＩ）におけるＢ、は、例えば
下記式（Ｘ） Ｘ−８−Ｂ、−Ｃ−Ｙ　　　　　・・・・・・・・・・
・・ＣＸ）ｊ で表わされる架橋剤、下記式（ＸＩ） ＮＨ・ＨＱ で表わされる架橋剤、下記式し■〕 で表わされる架橋剤（２−イミノチオラクトン）下記式
〔■〕 で表わされろ架橋剤（Ｎ−７セチルホモシステイン）、
で表わされる架橋剤に由来する２価の有機基である。On the other hand, when ts = 1, the sulfur atoms S1 and S are bonded via a divalent organic group B, and B is a crosslinking agent having two functional groups that react with a thiol group; For example, the following formula (
IX) (ni is a divalent organic group.) or 2 derived from benzoquinone.
It is a valent organic group. B in formula (II) is, for example, the following formula (X) X-8-B, -C-Y...
・・CX)j A crosslinking agent represented by the following formula (XI) NH・HQ A crosslinking agent represented by the following formula (■) A crosslinking agent (2-iminothiolactone) represented by the following formula [■] crosslinking agent (N-7 cetylhomocysteine),
It is a divalent organic group derived from a crosslinking agent represented by

Ｘで表わされる、結合している硫黄原子と共に活性ジス
ルフィド基を形成し得る１価の有機基の具体例としては
、例えば２−ビリジ２−ベンゾイミダゾイルチオ基 一フェニルイミノメチルチオ基 Ｂ、またはＢ、で表わされる２価の有機基は、化学的に
不活性であれば特に限定されないが、一般的には分岐を
有するか有しないアルキレン基、フェニレン基等から適
宜選ばれる。Ｙで表わされる活性エステルのアルコール
残基の具体例としては２．４−７ジニトロフエノキシ表
わされるイミドエステルのアルコール残基の具体例とし
てはメトキシ、エトキシ基等を皐げることがでさｒる。Specific examples of the monovalent organic group represented by X that can form an active disulfide group together with the bonded sulfur atom include 2-pyridi-2-benzimidazoylthio group, monophenyliminomethylthio group B, or B The divalent organic group represented by is not particularly limited as long as it is chemically inert, but is generally appropriately selected from branched or unbranched alkylene groups, phenylene groups, and the like. Specific examples of alcohol residues in the active ester represented by Y include 2.4-7 dinitrophenoxy. Specific examples of alcohol residues in the imide ester represented by Y include methoxy and ethoxy groups. ru.

Ｑで表わされるハロゲン原子の具体例としては塩素、臭
素等を挙げることができる。Specific examples of the halogen atom represented by Q include chlorine and bromine.

架橋剤の具体例としては、式ＣＩＸ）で表わされる架橋
剤として、Ｎ、Ｎ’−（１，２−フェニン（１，４−フ
ェニレン）シマレイミド イルアミノ）アゾベンゼン マレイミ　トメチル）エーテル される架橋剤として、Ｎ−サ、クシンイミジル３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオネート。As a specific example of the crosslinking agent, as a crosslinking agent represented by the formula CIX), N,N'-(1,2-phenylene(1,4-phenylene)simaleimidoylamino)azobenzenemaleimitomethyl)ether crosslinking As an agent, N-sa, succinimidyl 3-(2
-pyridyldithio)propionate.

Ｎ−サクシンイミジル３−　（２１４−ジニトロフェノ
キシ）ズチレートを、式（ＸＩ）で表わされる架橋剤と
して、メチル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンイ
ミデート塩酸塩を挙げることができる。Methyl 3-(2-pyridyldithio)propionimidate hydrochloride can be used as a crosslinking agent for N-succinimidyl 3-(214-dinitrophenoxy)dutyrate represented by formula (XI).

上記式Ｃ１１ｌ）においてＢ４は、例えば下記式〔■〕
。In the above formula C11l), B4 is, for example, the following formula [■]
.

で表わされる、マレイミド基を有する架橋剤に由来する
２価の有機基である。Ｂ、で表わされる２価の有機基は
、化学的に不活性であれば４ｉＰＶｃ限定されないが、
一般的には分校を有するか有しない４ルキレン基、フェ
ニレン基等から適宜−ばれる。It is a divalent organic group derived from a crosslinking agent having a maleimide group, represented by The divalent organic group represented by B is not limited to 4iPVc as long as it is chemically inert, but
Generally, it is appropriately divided from a 4-rukylene group, a phenylene group, etc., having or not having a branch group.

〔豆〕□で表わされる架橋剤の具体例としては例えばメ
タ−（Ｎ−マンイミド）安息香酸Ｎ−ヒＦｓ＝キシサク
シンイミドエステル１’　）　安Ｊｉ香酸２，４−ジニ
）ｐフェニルエステル、β−（Ｎ−マレイミド）プｐピ
オンｌｌＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル等を挙
げることができる。[Beans] Specific examples of the crosslinking agent represented by □ include meta-(N-manimido)benzoic acid N-hyperoxysuccinimide ester 1') benzoic acid 2,4-dini) p-phenyl ester, Examples include β-(N-maleimide)pion 11N-hydroxysuccinimide ester.

本発明の細胞毒性複合体は、免疫グロブリンまたはその
フラグメントと、細胞毒性物質を結合せしめた血清アル
ブミンを、血清アルブミン中の硫黄原子を介して結合さ
せること罠より製造することができる。例えば、本発明
の細胞毒性複合体の内式（ｎ−ｉ）で表わされる複何体
は、例えば、発生または導入したチオール基を有する下
記式（ｍＶ） で表わされる免疫グロブリンまたはそのフラグメントと
、下記式（Ｖ） ＸＳｒ　　Ａ’　＋ＮＨＣｙ　）ｍ　　　　　・・・・
・・・・・・・・・・・・・・　（Ｖ）で表わされる細
胞毒性物質を結合した活性ジスルフィド基を有する血清
アルブミンを反応せしめるか、または、誘導または導入
した活性ジスルフィド基を有する下記式（Ｖｌ）で表わ
される免疫グロブリンまたはそのフラグメントと、下記
式〔■〕 Ｈ８＋　　ＡＩ　＋ＮＨＣｙ　）　　　　　・・・・・
・・・・・・・・・・・・・　〔■〕で表わされる細胞
毒性物質を結合した血清アルブミンを反応せしめること
により製造することかできる。　１ 前記式（ｍＶ）　において、ｔ、＝００場合疋は、式Ｃ
ＩＶ）で表わされる免疫グロブリンまたはそのアラ２メ
ントは、　Ｆａｂ′、ＩｇＭより得られる一量体１　ｇ
Ｍｓによって代表される如くそれ自体チオール基を有す
るか、またはジスルフィド基より発生せしめた千オール
基を有する免疫グロブリン□またはそのフラグメントで
ある。The cytotoxic complex of the present invention can be produced by binding an immunoglobulin or a fragment thereof to serum albumin bound to a cytotoxic substance via a sulfur atom in the serum albumin. For example, the complex represented by the internal formula (n-i) of the cytotoxic complex of the present invention may be, for example, an immunoglobulin represented by the following formula (mV) having a generated or introduced thiol group or a fragment thereof, The following formula (V) XSr A' +NHCy)m...
・・・・・・・・・・・・・・・ Serum albumin having an active disulfide group bound to a cytotoxic substance represented by (V) is reacted with, or the following having an active disulfide group induced or introduced. An immunoglobulin represented by formula (Vl) or a fragment thereof and the following formula [■] H8+ AI +NHCy)...
It can be produced by reacting serum albumin bound with a cytotoxic substance represented by [■]. 1 In the above formula (mV), if t = 00, the formula C
The immunoglobulin represented by IV) or its alignment is 1 g of a monomer obtained from Fab', IgM.
It is an immunoglobulin □ or a fragment thereof, which itself has a thiol group, as typified by Ms, or has a thiol group generated from a disulfide group.

ｔ！＝１である式（ｍＶ）で表わされる導°入されたチ
オール基を有する免疫グープリンまたはそのフラグメン
トは、例えば免疫グ＝＝プリンまたはそのフラグメント
に前記式（Ｘ）またはＬＸ［）で表わされる架橋剤を反
応させた後、導入された活性ジスルフィド基より還元操
作によりチオール基を発生せしめるか、または、免疫グ
ロブリンまたはそのフラグメン）Ｋ前記式（ｍ）または
〔思〕で表わされる架橋剤を反応させることにより製造
することができる。T! For example, an immunoguprine or a fragment thereof having an introduced thiol group represented by the formula (mV) where =1 can be used by crosslinking the immunoguprin or a fragment thereof with the above formula (X) or LX[). After reacting the agent, a thiol group is generated by a reduction operation from the introduced active disulfide group, or a crosslinking agent represented by the above formula (m) or [I] is reacted. It can be manufactured by

上記式（Ｖｌ）において、１．＝０の場合には、かかる
活性ジスルフィド基を有する免疫グロブリンまたはその
フラグメントは、例えば、それ自体のまたは発生せしめ
たチオール基を梅する免疫グロブリンまたはそのフラグ
メントに活性ジスルフィド基導入剤を作用させることに
より製造することができる。In the above formula (Vl), 1. = 0, the immunoglobulin or fragment thereof having such an active disulfide group can be prepared by, for example, treating the immunoglobulin or fragment thereof that has its own or generated thiol group with an active disulfide group-introducing agent. can be manufactured.

上記の目的に用いることができる活性ジスルフィド化合
物としては、例えば、２−ビリリジルジスルフィド（Ｑ
−ｓ−ｓ乃）。Examples of active disulfide compounds that can be used for the above purpose include 2-pyridyl disulfide (Q
-ssno).

５Ｉ５′−ジチオビス（２−二トロ安息香酸）シー２−
ピリジルジスルフィド ２−ペンゾチ７ゾイルジスルフイド ミタゾイルンスルフイド ７ミノーＮ′−フェニルイミノメチルジスルフことがで
きる。5I5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)cy2-
Pyridyl disulfide 2-penzothi7zoyl disulfide mitazoyl sulfide 7 minor N'-phenyliminomethyl disulfide.

また、前述のＦ（ａｂ’）、のヒンジ部分のジスルフィ
ド結合を、例えば亜硫酸イオンによりスルホ化分解して
分子中ＫＳ−スルホ基 （−８−８ｏ、’）を有するＦａ　ｂ’を得ることがで
きるが、この物も、式〔■〕で表わされる細胞毒性物質
を結合した血清アルブミンと好適に反応して、式（ｎ−
１’）で表わされる細胞毒性複合体を生成する。Furthermore, it is possible to obtain Fab' having a KS-sulfo group (-8-8o,') in the molecule by sulfonating and decomposing the disulfide bond at the hinge portion of F(ab'), for example, with sulfite ion. However, this substance also reacts suitably with serum albumin bound to the cytotoxic substance represented by the formula [■], resulting in the formation of the formula (n-
1').

式〔Ｖ〕または〔■〕で表わされる細胞毒性物質を結合
した血清アルブミンの製造方法については後述する。A method for producing serum albumin bound to a cytotoxic substance represented by formula [V] or [■] will be described later.

また、本発明の細胞毒性複合体の内式 ｃｍ−２）で表わされる複合体は、例えば、前記式［）
で表わされる発生または導入しまたチオール基を有する
免疫りμノリンまたはそのフラグメントと、前記式〔■
〕で表わされる細胞毒性物質を結合した血清アルブミン
を、チオール基と反応し得る官能基を２個有する架橋剤
を用いて結合することにより製造することができる。本
反応を行なう場合は、２段階の反応として行なうのが好
ましい。即ち、最初罠、式（ｒＶ）で表わされる発生ま
たは導入したチオール基を有する免疫グロブリンまたは
そのフラグメントか、或いは式〔■〕で表わされる細胞
毒性物質を結合した血清アルブミンに、過剰の、例えば
式（ＩＸ）で表わされる架橋剤を反応させ、精製処理を
ほどこした後、得られた中間体に他方の蛋白を作用せし
める。Further, the cytotoxic complex of the present invention, which is represented by the internal formula cm-2), is, for example, the complex represented by the formula [)
Immunorinrin or a fragment thereof which is generated or introduced and has a thiol group represented by the formula [■
] can be produced by binding serum albumin bound to a cytotoxic substance represented by the following formula using a crosslinking agent having two functional groups capable of reacting with a thiol group. When carrying out this reaction, it is preferably carried out as a two-step reaction. That is, first, an excess of e.g. After reacting with a crosslinking agent represented by (IX) and performing a purification treatment, the other protein is allowed to act on the resulting intermediate.

以上の反応手順により、目的とする式（ＩＴ−２）で表
わされる細胞毒性複合体を得ることかできる。By the above reaction procedure, the desired cytotoxic complex represented by formula (IT-2) can be obtained.

さらに、本発明の細胞毒性複合体の内式（ｍ）で表わさ
れる複合体は、例えば、上記式〔■〕で表わされる細胞
毒性物質を結合した血清アルブミンと、下記式〔■〕 で表わされる導入されたマレイミド基をもつ免疫グロブ
リンまたはそのフラグメントな反応せしめることＫより
製造することができる。Further, the cytotoxic complex of the present invention represented by the inner formula (m) may be, for example, serum albumin bound to the cytotoxic substance represented by the above formula [■], and the complex represented by the following formula [■]. It can be produced by reacting an immunoglobulin or a fragment thereof having an introduced maleimide group.

上記式〔■〕で表わされる導入されたマレイミド基をも
つ免疫グロブリンまたはそのフラグメントは、例えば、
免疫グロブリンまたはそのフラグメントに前記式〔正〕
で表わされるマレイミド基を有する架橋剤を反応せしめ
ることにより製造することができる。The immunoglobulin or fragment thereof having an introduced maleimide group represented by the above formula [■] is, for example,
Immunoglobulin or its fragment with the above formula [correct]
It can be produced by reacting a crosslinking agent having a maleimide group represented by:

次に、前記式（Ｖ）または〔■〕で表わされる細胞毒性
物質を結合した血清アルブミンの製造方法につい【述べ
る。かかる細胞毒性物質を結合した血清アルブミンは各
種の方法により製造できるが、例示すれば以下の通りで
ある。Next, a method for producing serum albumin bound to a cytotoxic substance represented by the formula (V) or [■] will be described. Serum albumin bound to such a cytotoxic substance can be produced by various methods, examples of which are as follows.

先ず血清アルブミンが有するチオール基に、前記式（Ｖ
ｌ）で表わされる活性ジスルフィド基を有する免疫グー
プリンまたはそのフラグメントの製造法の項で例示した
２−ピリジルジスルフィド、４−ピリジルジスルフィド
等の活性ジスルフィド化合物を反応させて、下記式〔立
〕 ＸＳ、　−Ａ／　　　　　・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・（ＸＶ）（ＡＡ’、Ｓ、及びＸの定義
は式ＣＩ）に同じ。〕で表わされる活性ジスルフィド基
を有する血清アルブミンを得る。次いでこれを適当な細
胞毒性物質と反応させて、アルブミンの７ミノ基に細胞
毒性物質を結合せしめることＫより、前記式（Ｖ）で表
わされる細胞毒性物質を結合した活性ジスルフィド基を
有する血清アルブミンを得る。前記式〔■〕で表わされ
る血清フルグミン鰐導体は、例えば、上記の如（して得
た式（Ｖ）で表わされる活性ジスルフィド基を有するア
ルブミン銹導体を還元剤、例えば２−メルカプトエタノ
ールまたはジチオスレイトールで処理することＫより樽
ることができる。First, the formula (V
The active disulfide compounds such as 2-pyridyl disulfide and 4-pyridyl disulfide exemplified in the section of the method for producing immunoguprin or its fragment having an active disulfide group represented by l) are reacted to form the following formula [vertical] XS, - A/ ・・・・・・・・・・・・・・・
......(XV) (Definitions of AA', S, and X are the same as in formula CI). ] to obtain serum albumin having an active disulfide group. Next, this is reacted with an appropriate cytotoxic substance to bind the cytotoxic substance to the 7-mino group of albumin, thereby producing serum albumin having an active disulfide group bound to the cytotoxic substance represented by the formula (V). get. The serum fulgumin crocodile conductor represented by the above formula [■] can be prepared by, for example, converting the albumin fulgamine conductor having an active disulfide group represented by the formula (V) obtained as described above into a reducing agent such as 2-mercaptoethanol or dithiophyl It can be barreled by treating it with threitol.

また、下記の方法によっても前記式（Ｖ）または〔■〕
で表わされる細胞毒性物質を結合した血清アルブミンは
製造することができる。In addition, the formula (V) or [■] can also be obtained by the following method.
Serum albumin bound to a cytotoxic substance represented by can be produced.

血清アルブミンをそのチオール基を活性ジスルフィド基
に変換することなく、直ちに適当な細胞毒性物質と反応
させて、アルブミンの７ミノ基に細胞毒性物質を結合せ
しめ、次いで、２−メルカプトエタノールまたはジチオ
スレイトール等のチオール試薬で処理し、アルブミンの
ジスルフィド基またはフルフミンのチオール基にシステ
ィンやグルタチオンが結合して生じたジスルフィド基な
切断することＫより前記式〔■〕で表わされる血？１１
フルプ、１１１ ミン誘導体を得る。前記式（Ｖ）で表わされる細胞毒性
物質を結合した活性ジスルフィド基を有する血清アルブ
ミンは、例えば、上記の如くして得た式〔■〕で表わさ
れる血清アルブミン鰐導体のチオール基に、２−ピリジ
ルジスルフィド、４−ピリジルジスルフィド。Serum albumin is immediately reacted with a suitable cytotoxic agent without converting its thiol group to an active disulfide group to bind the cytotoxic agent to the 7-mino group of albumin, followed by 2-mercaptoethanol or dithiothreitol. Blood ? 11
Fulp, 111mine derivatives are obtained. Serum albumin having an active disulfide group bound to a cytotoxic substance represented by the formula (V) can be prepared by, for example, adding 2- Pyridyl disulfide, 4-pyridyl disulfide.

５．５′−ジチオビス（２−ニドｐ安息香酸）等の活性
ジスルフィド化合物を反応させて製造することができる
。It can be produced by reacting an active disulfide compound such as 5.5'-dithiobis(2-nido p-benzoic acid).

本発明の細胞毒性複合体の製造法を例示すれば次の通り
である。An example of the method for producing the cytotoxic complex of the present invention is as follows.

（１１式（ＩＶ）で表わされる発生または導入したチオ
ール基を有する免疫グロブリンまたはそのフラグメント
と式（Ｖ）で表わされる細胞毒性物質を結合した活性ジ
スルフィド基を有する血清アルブミンを反応させるか、
式（Ｖｌ）で表わされる活性ジスルフィド基を有する免
疫グロブリンまたはそのフラグメントと式〔■〕で表わ
される細胞毒性物質を結合した血清アルブミンを反応さ
せる方法。(11 Reacting an immunoglobulin having a generated or introduced thiol group represented by formula (IV) or a fragment thereof with serum albumin having an active disulfide group bound to a cytotoxic substance represented by formula (V), or
A method of reacting an immunoglobulin having an active disulfide group represented by formula (Vl) or a fragment thereof with serum albumin bound to a cytotoxic substance represented by formula [■].

これらの方法においては、式（ｒＶ）で表わされるチオ
ール基を有する免疫グープリンまたはそのフラグメント
１モルに対し、式〔Ｖ〕で表わされる細胞毒性物質を結
合した活性ジスルフィド基を有する血清アルブミンを０
．３〜２０モルの割合で使用するのが好ましい。反応は
、両蛋白をＰＨ、ｓ〜１０の緩衝液に合計の蛋白濃度が
０．５〜１００Ｍｇ／―（より好ましくは１〜２０ダ／
ｍｌ　）　Ｋなるように混じ、０〜６０℃で静置、もし
くは反応混液と同じ−の緩衝、液に対し透析することＫ
より行なうことができる。反応時間は反応スケール、反
応条件によるが、−膜圧は４時間〜３日間である。得ら
れた細胞宿性複合体の、反応混合物からの分離。In these methods, 0 serum albumin having an active disulfide group bound to a cytotoxic substance represented by formula [V] is added to 1 mole of immunogupulin having a thiol group represented by formula (rV) or a fragment thereof.
．． It is preferable to use it in a proportion of 3 to 20 moles. In the reaction, both proteins are mixed in a buffer solution with a pH of s~10 at a total protein concentration of 0.5~100 Mg/- (more preferably 1~20 da/-).
ml) K, leave it at 0-60℃, or dialyze against the same buffer solution as the reaction mixture.
You can do more. The reaction time depends on the reaction scale and reaction conditions, but - membrane pressure is 4 hours to 3 days. Separation of the resulting cell-hosted complex from the reaction mixture.

精製は通常用いられる操作、例えば透析。Purification is carried out by commonly used operations, such as dialysis.

分子ふるいのカラムクロマトグラフィーによって行なう
ことができる。This can be done by molecular sieve column chromatography.

（２）式（ＩＶ）で表わされるチオール基を有する免疫
グロブリンまたはそのフラグメントと式〔■〕で表わさ
れる細胞毒性物質を結合した血清アルブミンを、両者の
チオール基と反応しうる前述した式（ＸＤの架橋剤を用
いて結合する方法。(2) Serum albumin bound to an immunoglobulin having a thiol group represented by the formula (IV) or a fragment thereof and a cytotoxic substance represented by the formula [■] is treated with the aforementioned formula (XD) which can react with the thiol groups of both. A method of bonding using a crosslinking agent.

この方法において、反応はチオール基を有する免疫グロ
ブリンまたはそのフラグメント、架橋剤、ＭｆＩ胞毒性
物質を結合した血清アルブミン王者を同時に接触させて
行なうこともできるが、好ましくはどちらか一方の蛋白
に架橋剤を反応させた後、次いで、その生成物に他方の
蛋白を反応せしめることにより製造される。まず架橋剤
を反応させる蛋白１モルに対し、好ましくは、架橋剤及
び他方の蛋白がそれぞれ０．８〜５０モル、０．８〜１
０モル用いられる。反応はまず、チオール基を肩する免
疫グｒａソリンまたはそのノラグメント或いは細胞毒性
物質を結合した血清アルブミンのｐＨ５〜１０　の緩衝
液の浴液（蛋白濃度は好ましくは０．５〜１００〜／威
、より好ましくは１〜２０■／妃に！１ｌｉｌ製する）
に、０〜６０℃で攪拌しながら、少量の溶媒、例えば、
Ｎ、Ｎ’−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシ
ド、　１．２−ジメトキシエタン、メタノール。In this method, the reaction can be carried out by simultaneously contacting an immunoglobulin having a thiol group or a fragment thereof, a cross-linking agent, and a serum albumin champion bound to an MfI cytotoxic substance, but preferably one of the proteins is contacted with the cross-linking agent. It is produced by reacting the product with the other protein. First, for 1 mole of protein to be reacted with the crosslinking agent, preferably 0.8 to 50 moles and 0.8 to 1 mole of the crosslinking agent and the other protein, respectively.
0 mol is used. The reaction is first carried out in a bath solution of a buffer solution of pH 5-10 (the protein concentration is preferably 0.5-100-100%) containing immunograsolin having thiol groups or its noragment or serum albumin bound to a cytotoxic substance. (More preferably 1 to 20 cm/feet! 1 lil)
Then, while stirring at 0-60°C, add a small amount of solvent, e.g.
N,N'-dimethylformamide, dimethylsulfoxide, 1,2-dimethoxyethane, methanol.

エタノール、アセトン等に溶かした架橋剤を添加し、て
行なわれる。次いで、透析または分子ふるいのカラムク
ロマトグラフィーにより、未反応の架橋剤を除いた後、
もう一方の蛋白のｐＨ５〜ｌＯの緩衝液の溶液（好まし
い蛋白濃度の範囲は上に記載したのと同じである）を添
加して、０〜６０℃で反応せしめる。上記方法によって
得られる細胞毒性複合体の、反応混合物からの分離、精
製は通常用いられる操作、例えば分子ふるいのカラムク
ロマトクラフィーによって行なうことができる。This is done by adding a crosslinking agent dissolved in ethanol, acetone, etc. Next, after removing unreacted crosslinking agent by dialysis or molecular sieve column chromatography,
A solution of the other protein in a pH 5-10 buffer (the preferred protein concentration range is the same as described above) is added and allowed to react at 0-60°C. The cytotoxic complex obtained by the above method can be separated from the reaction mixture and purified by commonly used operations, such as molecular sieve column chromatography.

（３）式〔■〕で表わされる細胞毒性物質を結合した血
清アルブミンと式〔■〕で表わされる導入されたマレイ
ミド基をもつ免疫グロブリンまたはそのフラグメントな
反応させる方法３゜ この方法においては、式〔■〕で表わされろ導入された
マレイミド基をもつ免疫グロブリンまたはそのフラグメ
ント１モルに対し式〔■〕で表わされる細胞毒性物質を
結合した血清アルブミンを０．３〜１０モルの割合で使
用するのが好ましい。反応は、両蛋白をＰＨ５〜１０の
緩衝液に合計の蛋白濃度が０．５〜１００！！９／氾（
より好ましくは１〜２０■／１）になるように混じ、０
〜６０°Ｃで静置して行なうことができも反応時間は反
応スケール、反応条件によるが、一般には４時間〜３日
間である。得られた細胞毒性複合体の、反応混合物から
の分離。(3) Method of reacting serum albumin bound with a cytotoxic substance represented by the formula [■] with an immunoglobulin or a fragment thereof having an introduced maleimide group represented by the formula [■] 3゜In this method, Serum albumin bound to a cytotoxic substance represented by the formula [■] is used at a ratio of 0.3 to 10 moles per mole of the immunoglobulin or its fragment having a maleimide group introduced therein, represented by [■]. is preferred. For the reaction, both proteins are mixed in a pH 5-10 buffer solution with a total protein concentration of 0.5-100! ! 9/Flood (
More preferably, the ratio is 1 to 20/1), and 0
Although the reaction can be carried out by standing still at ~60°C, the reaction time depends on the reaction scale and reaction conditions, but is generally 4 hours to 3 days. Separation of the resulting cytotoxic conjugate from the reaction mixture.

精製は通常用いられる操作、例えば透析。Purification is carried out by commonly used operations, such as dialysis.

分子ふるいのカラムクロマトクラフィーによって行なう
ことができる。This can be done by molecular sieve column chromatography.

以下実施例により本発明を詳述する。The present invention will be explained in detail with reference to Examples below.

参考例１ ピ）　抗マウス白血病Ｌ１２１０１ｇＧの精シマウス白
血病Ｌ１２１０細胞Ｉ　Ｘ　１０’個をフロイント完全
７ジユバンドとのエマルジョンとし、家兎に静脈注射し
た。その後更に、１週間間隔で３回、それぞれ約ｉ　ｘ
　ｉ　ｏ’個のＬ１２１０細胞をアジュバントと共に皮
下注射し、最終投与口から８日後に採血した。Reference Example 1) IX 10' anti-mouse leukemia L12101gG cells were made into an emulsion with Freund's complete 7-diuband and intravenously injected into rabbits. Thereafter, three more times at one week intervals, each time approximately i x
io' L1210 cells were injected subcutaneously with an adjuvant, and blood was collected 8 days after the final injection.

得られた血液をプールし、血清を分離し、その血清を５
６℃、３０分間加熱、非動化した。こうして得られた抗
Ｌ１２１０血清２００航に、硫安の飽和水溶液２００　
ａｔを加えて、生じた沈澱を遠心分離によって分取した
。The obtained blood was pooled, the serum was separated, and the serum was
The mixture was heated at 6° C. for 30 minutes to immobilize it. To 200 mg of the anti-L1210 serum thus obtained, 200 mg of a saturated aqueous solution of ammonium sulfate was added.
At was added, and the resulting precipitate was separated by centrifugation.

この沈澱を０．０１　Ｍリン酸緩衡液（ＰＨ７，６）５
０’ｍに溶解し、更に同緩衝液に対して十分に透析した
。この透析内液を同じ緩衝液で平衡化したジエチルアミ
ノエチルセルジー入カラムクロマトグラフィー（カラム
サイズ３　ａｎ　Ｘ　９４　ｍ　）　Ｋかけて、未吸着
分画として抗Ｌ１２１０　ＩｇＧを含む溶液を得た。This precipitate was dissolved in 0.01 M phosphoric acid buffer (PH7,6) 5
It was dissolved in 0'm and further thoroughly dialyzed against the same buffer. This dialyzed solution was subjected to column chromatography (column size: 3 an x 94 m) using diethylaminoethyl cergye equilibrated with the same buffer solution to obtain a solution containing anti-L1210 IgG as an unadsorbed fraction.

（→免疫グロブリンよりＦ（ａｂ’、）、フラグメント
の分離 上記（へ）の如くして得られた抗Ｌ１２１０　ＩｇＧの
１．２ｇを０．１　Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ４，５）４０１
に溶解し、２４〜のペプシンを添加して、３７℃で約１
８時間分解した後、分解生成物を生理食塩水中でセファ
デックス０２００カラムクロマトグラフイー（カラムサ
イズ３．５αＸ　１４０　＞　）　Ｋかけて、分子量約
１０万のところに流出する蛋白として純粋なＦ　（ａ　
ｂ’）ｚフラグメントを得た。(→Separation of F(ab',), fragment from immunoglobulin 1.2 g of anti-L1210 IgG obtained as described above was added to 0.1 M acetate buffer (PH4,5) 401
Add 24 to 24 pepsin and incubate at 37°C for about 1
After decomposition for 8 hours, the decomposition products were subjected to Sephadex 0200 column chromatography (column size 3.5α x 140 > ) K in physiological saline to obtain pure F (a
b') z fragment was obtained.

（ハ）　Ｆａｂ’フラグンントの調製 上記（ロ）の如くして得られたＦ（ａｂ’）＊フラグメ
ント１８．４〜を含む９．０１　Ｍ　）リス・塩酸−０
，１４Ｍ塩化ナトリウム（以後Ｎ＆αと省略する）−２
ｍＭエチレンジ７ミン四酢酸（以後ＥＤＴＡと省略する
）溶液（ＰＨ８，３）２、ＯＩＩｔに、１５０ｍＭの２
−メルカプトエタ／−ル水溶液を０．０２１１／加えて
、３７℃で１時間還元した。反応後、その溶液を５ｍＭ
酢酸緩衝液−０，１４，Ｍ塩化ナトリウム−１ｍ　Ｍ　
ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ５，５）　（以下、ＡＮＥ緩衡液と
略す）で平衡化したセファデックスＧ２５カラムクｐマ
ドグラフイー（１，０αＸ　２０　ｏｎ　）　Ｋかけて
２−メルカプトエタノールを除去し、チオール基１個を
有するＦａｂ’フラグメントを得た。(c) Preparation of Fab' fragment 9.01 M containing F(ab')* fragments 18.4 to 18.4 obtained as in (b) above Lis.HCl-0
, 14M sodium chloride (hereinafter abbreviated as N&α)-2
Add 150 mM of 2 to OIIt in mM ethylenedi7minetetraacetic acid (hereinafter abbreviated as EDTA) solution (PH 8,3).
-Mercaptoethanol/-mer aqueous solution was added at 0.0211/ml, and the mixture was reduced at 37°C for 1 hour. After the reaction, the solution was diluted to 5mM
Acetate buffer - 0,14,M Sodium chloride - 1mM
A Sephadex G25 column equilibrated with an EDTA solution (pH 5,5) (hereinafter referred to as ANE buffer) was applied to a Sephadex G25 column (1,0αX 20 on) to remove 2-mercaptoethanol and remove one thiol group. A Fab′ fragment with the following properties was obtained.

に）　ＩｇＭの精製 （イ）の如くして、得られた抗Ｌ１２１０抗血清１００
威に飽和硫安溶液１００ｖを添加し、生じた沈澱を遠心
分離した。沈澱を、少量の０．９％塩化カリウム溶液に
溶解し、遠心分離して生じた不溶物を除いたのち、０．
９％塩化ナトリウム溶液に平衡化したセファデツクＧ・
２００カラムクロマトグラフイー（２，２ｃｍＸ　１０
２３　）　Ｋかけ、第１ピークにｘｇｍ画分をえた。100% of the anti-L1210 antiserum obtained as in IgM purification (a)
100 vol of saturated ammonium sulfate solution was added to the solution, and the resulting precipitate was centrifuged. The precipitate was dissolved in a small amount of 0.9% potassium chloride solution and centrifuged to remove the resulting insoluble matter.
Sephadec G. equilibrated in 9% sodium chloride solution.
200 column chromatography (2.2cm x 10
23) K was applied to obtain the xgm fraction in the first peak.

こうして得たＩｇＭ画分は、同容積の飽和硫安溶液を加
えて生じた沈澱を遠心分離した後、少量の０．９％塩化
ナトリウム溶液に溶かし、０．９％塩化ナトリウム溶液
に充分透析した。The IgM fraction thus obtained was added with the same volume of saturated ammonium sulfate solution, the resulting precipitate was centrifuged, dissolved in a small amount of 0.9% sodium chloride solution, and thoroughly dialyzed against 0.9% sodium chloride solution.

６１’）　　ＩｇＭ、　１７）　ＭＡ　Ｒｏ、９％塩化
ナトリウム溶液に溶解したウサギＩｇＭ　（１０〜／ｍ
）２ｍに、ＩＭ）リス塩酸緩衝液、（ＰＨ８，０）　Ｋ
溶解した０、２Ｍシスティン９．２ｍｌを混合し、室温
４時間還べした後、過剰のヨード７セトアミド ＣＩＣＨ，Ｃ０ＮＨ，）を反応せしめ、次いでセファデ
ックスＧ−２５（０，８Ｘ４３α）を用いるゲルろ過（
５ｍＭＩｌ−酸緩衝溶液−０，１４Ｍ　Ｎａα−１ｍ　
　Ｍ　ＥＤＴＡ　　（ｐＨ５，５）　　）　　　Ｋ　よ
　リ、過剰の試薬を除いた。61') IgM, 17) MA Ro, rabbit IgM dissolved in 9% sodium chloride solution (10~/m
) 2m, IM) Lis-HCl buffer, (PH8,0) K
After mixing 9.2 ml of dissolved 0.2M cysteine and cooling at room temperature for 4 hours, excess iodo-7cetamide CICH, CONH,) was reacted, and then gel filtration using Sephadex G-25 (0.8X43α) was performed. (
5mM Il-acid buffer solution-0,14M Naα-1m
Excess reagent was removed from MEDTA (pH 5,5).

（へ）　抗マウス乳癌ＭＭ４６モノクローン抗体の調製 細胞融合法により得られた抗ＭＭ４６　ＩｇＧ’２ｂ抗
体産生性ハイプリドーマ（瀬戸友人ら、ジャーナル　オ
プ　イムノルジ−（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ）、＄１２８巻
、２０１〜２０５）（，１９８２年参照）を、ヌードマ
ウス１５匹の腹腔に、−匹当り２　Ｘ　１０’個接種し
、１０日＊に腹水液を採取し、得られた腹水液５０−を
５ノの０．１Ｍリン酸緩衡液＜　ＰＨｓ、ｏ　）　Ｋ十
分透析した。透析内液を同じ緩衝液で十分に平衡化され
たプロティン人＠セファ０−スカラム（カラムサイズ１
．５　Ｘ　１２．５ｃｍ　）　Ｋかけて、十分に素通り
蛋白を流し出した後、０．１　Ｍり＝ン酸緩衡液（ｐＨ
５，０，）で不純蛋白を溶出し、その後０．１Ｍクエン
酸緩衝液（ＰＨ３・０）で吸着してゝ゛たＩｇＧ　２ｂ
　　を溶出し、溶出後の−を２ＭＴｒｉｓ、−Ｈα緩衡
液（ＰＨ８，２）で中性にもどじ、その後５１の２０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に十分透析し、１０５Ｍ
９（１７，７ｍ１４）の抗ＭＭ４６　　モ／クローン抗
体（ＩｇＧ２ｂ　）を得た。また、正常マウス血清５０
紅より、上記と同様にして非免疫ＩｇＧ２ｂ　２５〜（
７，ＯＮ　）を得た。(f) Preparation of anti-mouse breast cancer MM46 monoclonal antibody Anti-MM46 IgG'2b antibody-producing hybridoma obtained by cell fusion method (Tomo Seto et al., Journal Op Immunol, $128, 201~ 205) (see 1982) was inoculated into the peritoneal cavity of 15 nude mice at a dose of 2 x 10' per mouse, and ascites fluid was collected on day 10*. Dialyzed thoroughly in 0.1M phosphate buffer <PHs, o) K. The dialysis solution was thoroughly equilibrated with the same buffer using a protein column @ Sepha 0-Scolumn (column size 1).
．． 5 x 12.5 cm) K to thoroughly wash out the protein that passed through, and then add 0.1 M acid buffer solution (pH
5,0,) to elute impure proteins, and then adsorbed with 0.1M citrate buffer (PH3.0).
After elution, - was returned to neutrality with 2M Tris, -Hα buffer (PH8, 2), and then 20M of 51
Thoroughly dialyzed against 105M phosphate buffer (pH 7,5).
9 (17.7m14) of anti-MM46 mo/clonal antibodies (IgG2b) were obtained. In addition, normal mouse serum 50
From red, non-immune IgG2b 25~(
7,ON) was obtained.

実施例１ （１−１）＋（１−２）　　　　　→ １−（イ）　２−ピリジルジチオ基を有する人血清アル
ブミンのｐ４製 人血清アルブミン（以下Ｈ８Ａと省略する）の凍結乾燥
品２００〜を、０．１ＭＩＪン駿緩衡液−０．１　Ｍ　
Ｍａｉｌ　−１ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，０）５．
０　ｄ　Ｋ溶解し、２−ピリジルジスルフィド６．０〜
をＤＭＦ　０．１　ｍに溶解した溶液を添加し、４℃で
１夜反応した。反応液をセファデックスＧ−２５（０，
１Ｍリン酸緩衝液−１ｍＭＥＤＴＡ、　ｐＨ７，０）　
（１ｃｍＸ　４０ｃｍ　）のカラムに通し、蛋白質溶出
部９．２１を得た。回収Ｈ８Ａ量、１８５　Ｎ　（２８
０ｎｍ　の吸光度測定による）。Example 1 (1-1) + (1-2) → 1-(a) Freeze-dried products of p4 human serum albumin (hereinafter abbreviated as H8A) of human serum albumin having 2-pyridyldithio group 200~ , 0.1 MIJ-Shun buffer solution - 0.1 M
Mail -1mM EDTA (pH 7,0)5.
0 d K dissolved, 2-pyridyl disulfide 6.0 ~
A solution prepared by dissolving 0.1 m of DMF was added thereto, and the mixture was reacted overnight at 4°C. The reaction solution was mixed with Sephadex G-25 (0,
1M phosphate buffer - 1mM EDTA, pH 7.0)
(1 cm x 40 cm) column to obtain protein elution portion 9.21. Amount of recovered H8A, 185 N (28
(by absorbance measurement at 0 nm).

得られた２−チオピリモル化Ｈ８Ａ上の活性ジスルフィ
ド残基の数は、その平均値を以下の方法により決定した
結果、０．６５であった。即ち１ｓのサンプルに過剰の
ジチオスレイトールを作用させ、遊離したチオヒリドン
の吸収極大値（３４３ｎｍ　）　　における吸光度を測
定して該サンプル中に含有される活性ジスルフィドのｌ
を定量した。The average number of active disulfide residues on the obtained 2-thiopyrimolized H8A was determined by the following method, and was found to be 0.65. That is, an excess of dithiothreitol is applied to a sample for 1 s, and the absorbance at the absorption maximum value (343 nm) of liberated thiohyridone is measured to determine the amount of active disulfide contained in the sample.
was quantified.

１方、該サンプル中のＨ８Ａの量は、２８０ｎｍにおけ
る吸光度を測定して求めた。Ｂ５Ａ１分子に存生する活
性ジスルフィド残基の数は、これらの測定値の比で表わ
される。On the other hand, the amount of H8A in the sample was determined by measuring the absorbance at 280 nm. The number of active disulfide residues present in the B5A1 molecule is expressed as the ratio of these measured values.

１−（ロ）マイトマイシン−１ｅｃ（以後ＭＭＣと省略
）を結合Ｌ　ｆ、ニー　Ｈ８Ａ（１−２）　ノｖ４Ｉ！
１−（イ）で得られた２−ピリジルジチオ基な有するＨ
８Ａ　２０．１■を溶解した。、ｉＭ−リン酸緩衝液１
　ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，０）　１　、０１Ｌｔ
に、１ａ−（４−サクシンイミジルオキシカルポニルブ
チリル）−７−７ミノー９ａ−メトキシマイトサン５６
４５〜′をＤＭＦ１００μｌに溶解して加え、４°で５
時間攪拌した後、同シハツファーに溶かした１Ｍジチオ
スレイトール１．５ｄを加えて、１．５時間４℃に保っ
た。反応液を０．Ｏ］、Ｍ酢酸緩衝液−０，１４Ｍ　Ｎ
ａ（Ｊ−−０，０１ｒｎ　Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ５，２
５）に対して４℃で１７時間透析した。回収液１．８ｄ
Ｋ含有されるＭＭＣ結合）ＩＳＡの定量は、Ｌａｖ、＋
　ｒｙ法による蛋白定量により１５■であった。1-(b) mitomycin-1ec (hereinafter abbreviated as MMC) conjugated L f, knee H8A (1-2) Nov4I!
The 2-pyridyldithio group obtained in 1-(a) has H
8A 20.1■ was dissolved. , iM-phosphate buffer 1
mM EDTA (pH7,0) 1,01Lt
1a-(4-succinimidyloxycarponylbutyryl)-7-7 minnow 9a-methoxymitosan 56
Dissolve 45-' in 100 μl of DMF, add and incubate at 4° for 5 minutes.
After stirring for an hour, 1.5 d of 1M dithiothreitol dissolved in the same buffer was added and kept at 4° C. for 1.5 hours. The reaction solution was reduced to 0. O], M acetate buffer - 0,14M N
a(J--0,01rnM EDTA (pH5,2
5) at 4° C. for 17 hours. Recovery liquid 1.8d
Quantification of K-containing MMC binding) ISA is performed using Lav, +
It was determined to be 15 ■ by protein determination using the RY method.

さらＫ、回収液に含有されるＭＭＣ結合結合Ａ（１−２
）について、回収液の一部を使ってＨ８Ａ分子に結合し
たＭＭＣの数（ＭＭＣ／Ｉ（ＳＡ　）を求めたところ５
２であった。即ち、ＭＭＣの吸収極大３６０　ｎｍにお
ける吸光度よりＭＭＣ＊；基量をＬａｗｒｙ法によりＨ
８Ａ量を求めた。Furthermore, K, MMC bond A (1-2
), the number of MMC bound to H8A molecules (MMC/I (SA)) was calculated using a part of the recovered solution, and it was 5.
It was 2. That is, from the absorbance at the absorption maximum of MMC at 360 nm, the amount of MMC*;
The amount of 8A was determined.

又、ｆ（ＳＡ分子に再生したチオールの数（Ｈ８−／Ｈ
８Ａ）は、次のように定量した。Also, f (number of thiols regenerated into SA molecules (H8-/H
8A) was quantified as follows.

反応生成物の１部Ｋ　Ｏ，Ｉ　Ｍ　！Ｊン酸緩衡液０　
、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ９，１ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，
５）の浴液中、過剰の５，５′−ジチオビ・スー（２−
二トμ安息香酸）　（ＤＴＮＢ）　　を加え、４℃で一
夜反応した。反応液をセファデックスＧ　−２５（０，
０１Ｍ−リン酸ナトリウム緩衝液−−０，１４ＭＮａα
　１　ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ　、　ｐ）（＝　７．６）Ｋ通
し、蛋白部をプールする。このものについて、Ｌｏｗｒ
ｙ法によりＨ８Ａの濃度を求め、さらに、過剰のジチオ
スレイトールを加えることにより遊離した５−メルカプ
ト−２−二）　ｔｙ安息査酸に由来す゛る４１２ｎｒｎ
Ｋおける吸収を測定することによって、　ＭＭＣ結合結
合Ａに含有されるチオール基の浸度を定量できた。これ
らの比を求めると、 （チオール鮎）／　（）（ＳＡ）　＝・０．５５以上の
定量値より、得られたＭＭＣＭＣ結合フルフミン１−２
式で表わされる。Part of the reaction product K O, I M ! J acid buffer solution 0
, IM NaC9, 1 m M EDTA (pH 7,
In the bath solution of 5), excess 5,5'-dithiobis(2-
Dito-μ benzoic acid (DTNB) was added, and the mixture was reacted overnight at 4°C. The reaction solution was mixed with Sephadex G-25 (0,
01M-sodium phosphate buffer--0,14M Naα
1 mM EDTA, p) (= 7.6) K, and pool the protein portion. About this thing, Lowr
The concentration of H8A was determined by the Y method, and by adding an excess of dithiothreitol, 412nrn derived from 5-mercapto-2-2)ty benzoic acid was released.
By measuring the absorption at K, the degree of immersion of the thiol group contained in the MMC bond A could be quantified. When determining these ratios, (thiol sweetfish)/()(SA) = ・From the quantitative value of 0.55 or more, the obtained MMCMC-bound flufmin 1-2
It is expressed by the formula.

ｌ−（ハ）　ＩｇＧへ活性ジスルフィド基の導入（ｌ−
１の調製） 上記参考例１−０）で得られた、ラビットＩｇＧ抗体２
．ＯＮ９を０．１　Ｍ　！ｊ　７酸緩衡液−０，１ＭＮ
ａα（ｐｌＨ７，５’）　１．Ｏｍに溶解し、Ｎ−サク
シンイミジル−３−（２−ピリジルチ。l-(c) Introduction of active disulfide group into IgG (l-
Preparation of 1) Rabbit IgG antibody 2 obtained in Reference Example 1-0) above
．． ON9 0.1M! j 7 acid buffer - 0.1 MN
aα(plH7,5') 1. Dissolved in Om, N-succinimidyl-3-(2-pyridylthi.

オ）プロピオネート（以下５ＰＤＰと１瑞する）の１０
０ｍＭＤＭＦ溶液８．０ｔｔｌを室温下に加え、３０分
間ゆっくり攪拌したのち、セフ７デツｌスＧ−２５のカ
ラＡＣ１，ＯＸ３０ｍ＋０．１Ｍリン酸緩衝液−０，１
ＭＮａα。e) 10 of propionate (hereinafter referred to as 5PDP and 1)
Add 8.0 ttl of 0mM DMF solution at room temperature, stir slowly for 30 minutes, and add Cef7Dets G-25 color AC1, OX30m + 0.1M phosphate buffer -0.1
MNaα.

ｐＨ６，５）Ｋ通し、低分子を除くと、活性ンスルフイ
ド基が導入されたマウ＝　Ｉｇｃ　（１〜走）の溶液６
．０−が得られた。pH 6,5) After passing through K to remove low molecules, a solution of Mau=Igc (1 to 6) with active sulfide groups introduced
．． 0- was obtained.

かくして得られた溶液中のＩｇＧの量は、２８０　ａｍ
の吸光度よ−り求めたところ１７ＩＩ９であった。Ｉｇ
ＧＫ導入された活性ジスルフィド基の数は以下の手順で
定量した。The amount of IgG in the solution thus obtained was 280 am
The absorbance was determined to be 17II9. Ig
The number of active disulfide groups introduced into GK was determined by the following procedure.

溶液の１部を同一緩衝液で希釈した２８０ｎｍの吸光度
より、先づＩｇＧのモル濃度を求めた。次いで、溶液に
過剰の２−メルカプトエタノールを加え、１分間放置の
後遊離した２−メルカプトピリジンに由来する３４３ｎ
ｍの吸光度を測定する′ことＫより、活性ジスルフィド
基の濃度を求めた。これらの比より式１−１で表わされ
る生成物においつよ、４部分千に平均３．５個、）２−
ピリジルジチオ基が導入されていることを決定した。First, the molar concentration of IgG was determined from the absorbance at 280 nm of a portion of the solution diluted with the same buffer. Next, excess 2-mercaptoethanol was added to the solution, and after standing for 1 minute, 343n derived from liberated 2-mercaptopyridine
The concentration of active disulfide groups was determined by measuring the absorbance of m. From these ratios, the product represented by formula 1-1 has an average of 3.5 pieces per 1,000 parts, )2-
It was determined that a pyridyldithio group was introduced.

１−に）　活性ジスルフィド含有ＩｇＧとＭＭＣ結合結
合Ａ（１−２）の反応による複、合体（１−３’）の調
製 上記１−（ハ）で得られた、２−ピリジルジチオ基を平
均３．５個含有するＩｇＧの溶液１．０ｍＫ、１−（ロ
）で調製した式１−芝で表わされるＭＭＣを結合した人
血清アルブミンの溶液１．０−を混合し、４℃で１夜反
応した。反応液をＳＤＳ電気泳動で調べると、生成物は
、ＭＭＣ結合結合Ａが１〜３個結合した式１−３で表わ
される複合体を生成物とすることが判明した。セファデ
ックスＧ　−１５０スーパーフアインのカラム（１，５
Ｘ８０　ａｍ　）を用いることＫより、複合体を精製し
た。1-) Preparation of complex (1-3') by reaction of active disulfide-containing IgG and MMC bond bond A (1-2) A solution of 1.0 mK of IgG containing 3.5 molecules was mixed with a solution of human serum albumin (1.0 mK) bound to MMC represented by the formula 1-shiba prepared in 1-(b), and the mixture was incubated at 4°C overnight. I reacted. When the reaction solution was examined by SDS electrophoresis, it was found that the product was a complex represented by formula 1-3 in which 1 to 3 MMC bonds A were bound. Sephadex G-150 superfine column (1,5
The complex was purified using K.

（ｅ）　　発明の作用及び効果（その１）Ｌ１２１０細
胞に対する複合体（１−３）の細胞毒性 上記１−に）の如くして得られた複合体（１−３）の標
的細胞Ｌ１２１Ｇに対する細胞毒性を検討した。(e) Actions and effects of the invention (Part 1) Cytotoxicity of complex (1-3) against L1210 cells Complex (1-3) obtained as in 1- above) against target cells L121G cells Toxicity was investigated.

２４穴の培養プレートに、５Ｘ１０’個のＬ１２１０　
ｆｉ胞を含むｐズウエルバー、クメモリアルインステチ
ュート１６４０（以、下ＲＰＭＩ　１６４０と省略する
）培地（１０％牛脂児血清、２０βＭの２−メルカプト
エタノールと０．１４／１１７のカナマイシンを含む）
０．９１１７を分注し、更に種々の濃度の被検サンプル
０．１−を加え、５％Ｃ０２雰囲気下で３７℃で４８時
間培養後、トリバンプルー染色法により生細胞数を測定
した。5 x 10' pieces of L1210 in a 24-well culture plate
P Zoowelver, Memorial Institute 1640 (hereinafter abbreviated as RPMI 1640) medium containing fi cells (containing 10% tallow serum, 20βM 2-mercaptoethanol and 0.14/117 kanamycin)
0.9117 was dispensed, and various concentrations of the test sample 0.1- were further added, and after culturing at 37°C for 48 hours in a 5% CO2 atmosphere, the number of viable cells was measured by Trivan Blue staining.

その結果、第１表に示す如（、複合体（１−３）は、標
的細胞Ｌ１２１０　Ｋ対し濃度依存的に著しい＃Ｉ胞増
殖抑制効果を示した。尚、培養は２系列行ない、値はそ
の平均で示した。As a result, as shown in Table 1, the complex (1-3) exhibited a remarkable concentration-dependent inhibitory effect on the proliferation of #I cells on the target cell L1210K. It is shown as the average.

第１表 実施例２ 上記参考例１−に）で得られたラビッ）ＩｇＭ抗体と、
実施例１−（ロ）で調製したＭＭＣを結合したＢＳＡ（
１−２）を、架剤５ＰＤＰを用い実施例１と同じ手順に
より結合せしめ、ＩｇＭ　−ＵＳＡ　−ｈｌＪＭｃ複合
体を得た。Table 1 Example 2 Rabbit) IgM antibody obtained in Reference Example 1-) above,
BSA (
1-2) was combined using the cross-agent 5PDP in the same manner as in Example 1 to obtain an IgM-USA-hlJMc complex.

実施例３ （３−ｉ　　）＋　　（３−２）　　→３−（イ）　２
−ピリジルジチオ基を含有する牛血清アルブミンの調製 牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと省略する）の結晶（市
販品）１３２′Ｍ９を０．１Ｍリン醗ナナトリウム緩衝
液−０，１Ｍ　ＮａＣ１−１ｍ　ＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ
７，ｏ　）　ｓ、ｏ配に溶縮し、２−ピリジンジスルフ
ィド４．４■をＤ■゛０．１１に溶解した溶液を添加し
、４°で１夜反応した。反応液をセロファンチューブに
入れ、４℃にて２日間、　０．０１　Ｍリン酸緩衝液−
０，４ＭＮａＣｌ−１ｒｎ　ＭＥＤＴＡ　（ＰＨ７，０
）　Ｋ対して透析した。透析回収液をセファデックスＧ
−２５（０，１Ｍリン酸ｌｌｉ衡液−０，１４ＭＮａＣ
１，ｐＨ７，０）　（１ｍ、Ｘ　４０ｃｍ　）のカラム
に通し、蛋白質溶出部１２凝を得た。回収ＢＳＡｆｔ　
＋　１０４”＆　（２８０ｎｍ０′）吸光度による）。Example 3 (3-i)+ (3-2) →3-(a) 2
- Preparation of bovine serum albumin containing pyridyldithio groups Crystals of bovine serum albumin (hereinafter abbreviated as BSA) (commercial product) 132'M9 in 0.1M sodium phosphate buffer - 0.1M NaCl in 1m MEDTA solution (pH
A solution of 4.4 2-pyridine disulfide dissolved in D 0.11 was added, and the mixture was reacted at 4° overnight. The reaction solution was placed in a cellophane tube and incubated at 4°C for 2 days with 0.01 M phosphate buffer.
0,4M NaCl-1rn MEDTA (PH7,0
) Dialyzed against K. Sephadex G for the dialysis recovery solution
-25 (0,1M phosphoric acid lli equilibration -0,14M NaC
1, pH 7,0) (1 m, x 40 cm) to obtain 12 protein eluted portions. Collection BSAft
+ 104” & (280 nm 0′) absorbance).

得られた２−ピリジルジチオ基を有す ＢＳＡ上の活性ジスルフィド残基の数は、実施例１−（
イ）と同じ方法で決定した結果、０．６７であった。The number of active disulfide residues on the obtained 2-pyridyldithio group-bearing BSA was determined from Example 1-(
The result of determination using the same method as a) was 0.67.

３−（→　ノトトンキセート（以後ＭＴＸと省略する）
を結合したＢＳＡ（３−２’）の調製 実施例３−（イ）で得られた、２−ピリジルジチオ基を
平均０．６７個含有するＢ’５Ａ１７．３■を溶解した
０、１Ｍリン酸ナトリウム−０，１４Ｍ　Ｎａα（ｐＨ
７，０）の緩衝液２．０１に、すでに公知の方法（ビー
　エヌ　クルカルニら（Ｐ、Ｎ、Ｋｕｌｋａｒｎｉ　）
　＋キャンサーリサーチ（’Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　）　＋第４１巻！第２７００〜２７０６頁参照
）に従って調製したＭＴＸのＮ−ヒドロキシサクシンイ
ミドエステル１４．４”Ｐを溶解しｆ、：　ＤＭＦ溶液
３００μｌを４℃にて加え、１０時間反応せしめた。3-(→ Nototonxate (hereinafter abbreviated as MTX)
Preparation of BSA (3-2') bound to 0.1M phosphorus in which 17.3■ of B'5A containing an average of 0.67 2-pyridyldithio groups obtained in Example 3-(a) was dissolved. Sodium acid - 0,14M Naα (pH
7.0) in buffer 2.01 using a known method (P, N. Kulkarni et al.).
+Cancer Research ('Cancer Re5ea)
rch ) + Volume 41! N-hydroxysuccinimide ester 14.4''P of MTX prepared according to the method (see pages 2700 to 2706) was dissolved, and 300 μl of a DMF solution was added at 4° C. and reacted for 10 hours.

次いで同じ緩衝液に溶かした１Ｍ２−メルカプトエタノ
ール５．０μｌを加え、４℃で１．５時間反応した。反
応液を、セロファンチューブに入れ０．９％食塩水１　
ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡＫ対して４℃で充分透析して、低分子
物質を除くと、ＭＴＸを結合したＢＳＡ（３−２）を含
有する溶液３．２−が得られた。Next, 5.0 μl of 1M 2-mercaptoethanol dissolved in the same buffer was added, and the mixture was reacted at 4° C. for 1.5 hours. Put the reaction solution into a cellophane tube and add 0.9% saline 1
After thorough dialysis against m M EDTAK at 4° C. to remove low-molecular substances, a solution 3.2- containing MTX-bound BSA (3-2) was obtained.

回収液中に有られたタンパク質量は、 Ｌｏｗ’ｒｙ法にて、又ＭＴＸの量は３’０７ｎｍＫお
ゆる吸収を測定して決定した。The amount of protein present in the collected solution was determined by the Low'ry method, and the amount of MTX was determined by measuring the 3'07 nmK low absorption.

次に、ＢＳＡ分子に再生したチ穿−ル基の数は、実施例
１−（弓の手順に従ってＤＴＮＢ法で決定した。以上の
結果、回収液中忙得られた蛋白質量はＩ　Ｃ１，７Ｗ　
＋　ＢＳＡ分子に結合したＭＴＸは４１分子、Ｔ４生じ
たＢＳＡのチオール基は平均０．６１個と決門され、従
って、得られたＭＴＸ残基な結合したＢＳＡは３−２の
ごとくに表わされる。Next, the number of thiole groups regenerated into the BSA molecule was determined by the DTNB method according to the procedure of Example 1.
+ MTX bound to BSA molecules is determined to be 41 molecules, and the number of thiol groups in T4 generated BSA is determined to be 0.61 on average. Therefore, the resulting BSA bound to MTX residues is expressed as shown in 3-2. .

３−（ハ）参考例１−（ハ）で得られたウサギＩｇＧの
フラグメントＦａｂ’　１３．０　＃を含む溶液（５ｍ
　Ｍ　Ａｃ０Ｎａ　−０，１４Ｍ　ＮａＣ１ｒｐＨ５，
５，１，５１１７Ｋ％Ｎ、Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレ
イミド（以下ＰＤＡと省略する）の同じ緩衝液中に飽和
溶液１．５１を加えて室温中で３０分間反応させ、 過剰試薬をセファデックスＧ−２５ （１，０Ｘ４０ｃ＋ａ＋同−緩衝液）Ｋより除去して、
弐３−１で表わされるマレ イミド基を含有するＦａｂ’を含む溶液９．２ｊ１ｊを
得た。3-(c) A solution containing rabbit IgG fragment Fab' 13.0 # obtained in Reference Example 1-(c) (5 m
M Ac0Na -0, 14M NaC1rpH5,
Add 1.51 of a saturated solution of 5,1,5117K%N,N'-o-phenylene dimaleimide (hereinafter abbreviated as PDA) to the same buffer solution, react for 30 minutes at room temperature, and remove excess reagent with Sephadex. G-25 (1,0X40c+a+same-buffer) removed from K,
A solution 9.2j1j containing Fab' containing a maleimide group represented by 23-1 was obtained.

３−に）　マレイミド基含有Ｆａ　ｂ’とＭＴＸ結合結
合Ａ（３−２）との反応による複合体（３−３）のｐ４
製、 上記３−←）で得られたＭＴＮ結合結合Ａを６．７９！
有する溶液（−０，９％ＮａＣｌ−１，０ｍ　Ｍ　ＥＤ
ＴＡ　２．Ｏｗｔｔを上記−３−ｆ−）テ得うレタマレ
イミド基を含有するＦａｂ’（１０−１）〜 の溶液２．０１Ｌｔｋ混合し、４℃で一夜反応せしめた
。反応液をＳＯ８電気泳、動により詞、さると、生成物
は、Ｆａｂ’にＢＳＡが結合した式３−３で表わされる
複合体を含有することが判明した。セファデックスＧ−
”１５０スーパーフアインのカラム（１，５Ｘ　１００
ｃｍ）を用いることにより一合体なｎ＋！ｉ、−た。3-) p4 of complex (3-3) by reaction of maleimide group-containing Fab' and MTX binding bond A (3-2)
The MTN bond bond A obtained in 3-←) above is 6.79!
solution with (-0,9% NaCl-1,0 m M ED
TA 2. 2.01 Ltk of the solution of Fab'(10-1) containing a retamaleimide group obtained in -3-f-) above was mixed with Owtt and reacted overnight at 4°C. When the reaction solution was subjected to SO8 electrophoresis, it was found that the product contained a complex represented by formula 3-3 in which BSA was bound to Fab'. Sephadex G-
”150 Super Fine Column (1,5X 100
cm), the unified n+! i, -ta.

（ｆ）　　発明の作用及び効果（その２）Ｌ１２１０細
胞に対する複合体（３−３）の細〜 胞毒性 上記３−０の如くして得られた複合体（３−３）の標的
細胞Ｌ１２１０に対する細胞毒性を検討した。　。(f) Actions and effects of the invention (Part 2) Cytotoxicity of complex (3-3) on L1210 cells Complex (3-3) obtained as in 3-0 above on target cells L1210 Cytotoxicity was investigated. .

２４大の培養プレートに、５　Ｘ　１０’個のＬ１２１
０細胞を含むＲＰＭＩ　１６４０培地（１０％牛脂児血
清、　２０４Ｍの２−メルカプトエタノールとＯ，１Ｍ
９／−のカナマイシンを含む）０．９１を分注し、更に
種々の濃度の被検サンプル０．１−を加え、５％ＣＯ１
雰囲気下で３７℃で４８時間培養後、トリバンプルー染
色法により生細胞数を測定した。5 x 10' pieces of L121 in 24 large culture plates
RPMI 1640 medium containing 0 cells (10% tallow serum, 204M 2-mercaptoethanol and O, 1M
Dispense 0.91 (containing 9/- of kanamycin), add 0.1- of the test sample at various concentrations, and add 0.1- of the test sample at 5% CO1.
After culturing at 37° C. for 48 hours in an atmosphere, the number of viable cells was measured by Trivan blue staining.

その結果、第２表に示す如く複合体（３−３）は、標的
細胞Ｌ１２１０に対し濃度依存的に著しい細胞増殖抑制
効果を示した。尚、培養は２系列行ない、値はその平均
で示した。As a result, as shown in Table 2, the complex (3-3) exhibited a remarkable cell proliferation inhibitory effect on the target cell L1210 in a concentration-dependent manner. The culture was carried out in two series, and the values are shown as the average.

＃Ｉ２表 実施例４ 実施例３−（ロ）で得られた、ＭＴＸを結合したＢＳＡ
　（３−２）の溶液（０，９％Ｎａ（’ｌ−１ｍ　ＭＥ
ＤＴＡ溶液）１．０就Ｋ　Ｎ、Ｎ’−ビス（マンイミド
メチル）エーテル（以下ＢＭＥと省略する）の５　ｍ　
ＭＡｃＯＮａ　−０，１４ＭＮａＣｌ　（ｐ）ｆ５．ｓ
　）　Ｍ漬液中飽和溶液１．０紅を加え、３０分間反応
させた。過剰の試薬をセファデックスＧ　−２５（１，
Ｏｘ４０ｃｍ　＋同一緩衝液）Ｋて除去して、式４−２
で示されるマレイミド基を含有するＭＴＸを結合したＢ
ＳＡの溶液４．７縦を得た。この溶液に参考例１−Ｐ−
３で得られたウサギＩｇＧのＦａｂ’　１２．５　Ｍｇ
を含む同一緩衝液１．５威を加え、−夜反応せしめた。#I2 Table Example 4 MTX-bound BSA obtained in Example 3-(b)
(3-2) solution (0.9% Na('l-1m ME
DTA solution) 5 m of 1.0 K N,N'-bis(manimidomethyl) ether (hereinafter abbreviated as BME)
MAcONa -0,14MNaCl (p)f5. s
) A saturated solution of 1.0 ml of M solution was added and reacted for 30 minutes. Excess reagent was removed by Sephadex G-25 (1,
(Ox40cm + same buffer) K and removed, formula 4-2
B bound to MTX containing a maleimide group represented by
A solution of 4.7 mL of SA was obtained. Reference Example 1-P-
Fab' 12.5 Mg of rabbit IgG obtained in 3.
1.5 volumes of the same buffer was added to the mixture, and the mixture was allowed to react overnight.

反応液をＳＤＳ電気泳動により調べると、生成物は、Ｆ
ａｂ’にＢＳＡが結合した式４−２で表わされる複合体
を含有することが判明した。When the reaction solution was examined by SDS electrophoresis, the product was F
It was found that it contained a complex represented by formula 4-2 in which BSA was bound to ab'.

セフ７デンクスＧ−１５０スーパーフアインのカラム（
１，５Ｘ１００ＣＩ＋）を用いることＫより複合体を精
製した。Cef7 Denks G-150 Super Fine Column (
The conjugate was purified using 1,5×100 CI+).

実施例５ 上記実施例３の反応を、架橋剤としてＮ、Ｎ’−ヘキサ
メチレンビスマレイミド ３と同様の条件下に施行し、Ｆａｂ’　−ＢＳＡ　−Ｍ
ＴＸ複合体を得た。Example 5 The reaction of Example 3 above was carried out under the same conditions as N,N'-hexamethylene bismaleimide 3 as a crosslinking agent, and Fab' -BSA -M
A TX complex was obtained.

実施例６ ＴＪ −子 ６〜　４ １−〇） 参考例１−に）で得られた１ｇＭ８１０．０〜を溶解し
た緩衝液（１０ｍＭ！Ｊン酸緩衝液−０．１４Ｍ塩化ナ
トリウム、　’ｐＨ７，０、２，０威に同一の緩衝液に
溶解した、架橋剤Ｎ−サクシンイミジルマレイミドプチ
レート（以下ＳＭＢＥと省略する）の１０ｍＭエタノー
ル溶液０．１１を混合し、１温で３０分反応させた後、
過剰のＢＭＥを、セフ７デツクスＧ−２５（１，ＯＸ４
０傷、溶媒は反応溶媒に同じ）を用いるグルろ一過によ
り除いた。Example 6 TJ-6~4 1-0) Buffer solution (10mM!J acid buffer-0.14M sodium chloride, pH 7, 0.11 of a 10 mM ethanol solution of the cross-linking agent N-succinimidyl maleimidobutyrate (hereinafter abbreviated as SMBE) dissolved in the same buffer was mixed with 0.0, 2.0, and reacted at 1 temperature for 30 minutes. After
Excess BME is removed by Cef7dex G-25 (1,OX4
It was removed by filtration using glue (the solvent was the same as the reaction solvent).

相当する両分を集め修飾ＩｇＭｓ　１８．９　Ｍｌｌｌ
を含有する溶液４．６−が得られた（６−１）。Collect the corresponding amounts of modified IgMs 18.9 Mlll
A solution 4.6- containing (6-1) was obtained.

この溶媒は、直ちに、６−ｔ→における反応に使用した
。This solvent was immediately used for the reaction in 6-t→.

６−（ロ）　ビンデシンを結合したＨ８Ａ　（６−３）
の調製 一方、公知の方法（シーシェイパ−ネットら（Ｃ，Ｊ、
Ｂａｒｎｅｔｔ　）　＋ジャーナル　オプメデイシナル
　ケミストーリーｒ　（Ｊｕｒｎａｌｏｆ　Ｍｅｄｉｃ
ｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）第２１巻、第８８〜
９６頁、１９７８弗参照）Ｋより、式１−２で示される
デス７セチルビングラスチン酸７ジド中間体を得た。即
ち、デス７セチルビンプラスチン酸ヒドラジド１０〜を
、ＩＮ塩酸１．０１１６に溶解し　０１１にて０、ＩＮ
亜硝酸ソーダ溶液なｏ、１ｓＩＩｔ加えた。6-(b) H8A bound to vindesine (6-3)
On the other hand, a known method (See Shapernet et al. (C, J,
Barnett) + Journal Op Medicinal Chemistry r (Jurnalof Medic
inal Chemistry) Volume 21, No. 88~
96, p. 1978)), a des7 cetyl vingrastic acid 7dide intermediate represented by formula 1-2 was obtained from K. That is, des7 cetylvin plastinic acid hydrazide 10 ~ was dissolved in 1.0116 IN hydrochloric acid, 0 at 011, IN
A solution of sodium nitrite was added.

５分間反応後θ°にてテトラヒドロフラン０．５−を加
え、ＩＮＮ水化化ナトリウム０５−で中和すると、式１
〜２で示される反応性のデスアセチルビ／プラスチン９
フジド中間体を含む溶液が得られた。上記溶液を上記実
施例１−（１′）で得られた２−チオピリジル化した人
血清アルブミン９．７Ｍｇの０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ９，０）　１．５−に加え、室温にで２ｇ＃間攪拌し
た。次いでＩＮのアンモニア　０．１−を加えてさらに
２時間反応せしめた。反応液をセファデックスＧ　−５
（）のカラム（１ａｍ　Ｘ　４０　ｍ　＋溶媒は０．１
Ｍリン酸−０，１Ｍ塩化ナトリウム緩衝液ＰＨ７，５）
に通して溶媒を交換し、相当する両分を集めた（７．９
ｍ）。　　。After reacting for 5 minutes, 0.5- of tetrahydrofuran was added at θ° and neutralized with INN sodium hydride 05-, resulting in formula 1.
Reactive desacetyl bi/plastin 9 indicated by ~2
A solution containing the fujido intermediate was obtained. The above solution was mixed with a 0.2M borate buffer (p
H9,0) 1.5- and stirred at room temperature for 2 g#. Then, 0.1-liter of IN ammonia was added and the reaction was further continued for 2 hours. Sephadex G-5
Column () (1 am x 40 m + solvent is 0.1
M phosphate-0.1M sodium chloride buffer PH7.5)
The solvent was exchanged through 7.9
m). .

次いで４°にでＩＭジチオ仝レイトール（ＤＴＴ）　（
溶媒は、０．１Ｍリン１ｌｌｌ衝液ｐＨ７Ｊ　）４．０
μｊを加え、１．０時間反応せしめたのち（１−３）、
反応液をセーフ７ンチユーブに入れ、１０ｍＭリン酸ナ
トリウム− 〇、１４　Ｍ　Ｎ５ＣＬ　（ＰＨ’７．０　）に対して
４°にで充分透析した。回収液（８，５ｔ）　Ｋ含有さ
れる生成物の蛋白質量はＬｏｗｒｙ法により求めた。又
、薬剤の童は２７０ｎｍＫおける吸光度を測定して求め
、得られた値を蛋白質量で補正した。人血清アルブミン
蛋白質量は、６．６１１Ｐ、デス７セチルビンプラスチ
ン残基量と、蛋白量の比より１人血清７λブミン１分子
には薬剤が平均３４個結合していることが判明した。又
、人血清アルブミンのチオール基は実施例１−ｆ→の方
法で定量した結果、平均０．６０個であった。Then IM dithiothreitol (DTT) (
The solvent is 0.1M phosphorus 1lll buffer pH 7J) 4.0
After adding μj and reacting for 1.0 hour (1-3),
The reaction solution was placed in a safe 7-tube and thoroughly dialyzed against 10 mM sodium phosphate, 14 M N5CL (PH'7.0) at 4°. Recovery liquid (8.5 t) The protein amount of the K-containing product was determined by the Lowry method. In addition, the amount of the drug was determined by measuring the absorbance at 270 nmK, and the obtained value was corrected by the amount of protein. The amount of protein in human serum albumin is 6.611P, and the ratio of the amount of des7 cetylbin plastin residues to the amount of protein reveals that an average of 34 drugs are bound to one molecule of human serum 7λbumin. Further, the number of thiol groups in human serum albumin was determined by the method of Example 1-f→, and the average number was 0.60.

６−Ｇ）で得られた修飾ＩｇＭ、　　の溶液２．０−と
、１−（＋’）で得られたデス７セチルビンプラスチン
を結合した人血清フルズミンの溶液ｓ、ｏＩＬｔを混合
し、４°で一夜反応せしめた。反応液をンデクＡドデシ
ルサルフェート電気泳動により調べると、生成物はＩ　
ｇＭ。6-G) A solution of modified IgM obtained in step 2.0- and a solution of human serum flusmin bound to des7cetylvinplastin obtained in step 1-(+'), oILt, were mixed; The reaction was allowed to occur overnight at 4°. When the reaction solution was examined by NDEKU A dodecyl sulfate electrophoresis, the product was I
gM.

にＨ８Ａが結合した式６−４で表わされる複合体を含有
する事が判明した。セファタックスＧ−１５０スーパー
ファインのカラム（１，５ｘ９０ｃＲ）を用いるゲルろ
過により精製して複合体を得た。It was found that the compound contains a complex represented by formula 6-4 in which H8A is bound to. The complex was purified by gel filtration using a Sephatax G-150 Superfine column (1,5x90cR).

優）　発明の作用及び効果（その３） Ｌ１２１０細胞に対する複合体（６−４）の細胞毒性 上記６−（ハ）の如くして得られた複合体（６−４）の
標的細胞Ｌ１２１０　Ｋ対する細胞毒性を検討した。Excellent) Actions and Effects of the Invention (Part 3) Cytotoxicity of Complex (6-4) to L1210 Cells Complex (6-4) Obtained as in 6-(C) Above to Target Cells L1210 K Cytotoxicity was investigated.

２４穴の培養プレートに、５Ｘ１０４個のＬ１２１０細
胞を含むＲＰＭ１１６４０培地（１０％牛脂児血清、２
０μＭの２−メルカプトエタノールとｏ、１ｘｖ／−の
カナマイシンを含む）０．９１Ｌ／！を分注し、更に種
々の濃度の被検サンプル０６１−を加え、５　ＸＣＯ，
雰囲気下で３７℃で４８時間培養後、トリバンプルー染
色法により生細胞数を測定した。In a 24-well culture plate, 5x104 L1210 cells were placed in RPM11640 medium (10% tallow serum, 2
Contains 0 μM 2-mercaptoethanol and o, 1xv/- kanamycin) 0.91 L/! and further added various concentrations of test sample 061-, 5XCO,
After culturing at 37° C. for 48 hours in an atmosphere, the number of viable cells was measured by Trivan blue staining.

その結果、第３表に示す如く、複合体（６−４）は、標
的細胞Ｌ１２１０　Ｋ対し濃度依存的に著しい細胞増殖
抑制効果を示した。尚、培養は２系列行ない、値はその
平均で示した。As a result, as shown in Table 3, the complex (6-4) exhibited a remarkable cell proliferation inhibitory effect on the target cell L1210K in a concentration-dependent manner. The culture was carried out in two series, and the values are shown as the average.

第３表 実施例７ 上記参考例１−（へ）で得られた、マウス七ツクローン
ＩｇＧ２ｂ抗体および実施例６−（ロ）で調製したビン
デシンを結合したＨ８Ａ、（６−３）を、架橋剤Ｎ−サ
クシンイミジルマレイミドベンゾエー）　（ＳＭＢＵ　
）を用い、実施例６と同じ手順により結合せしめ、Ｉｇ
Ｇ２ｂ　−Ｈ８Ａ　−ビンクリスチン複合体を得た。Table 3 Example 7 The mouse seven clone IgG2b antibody obtained in Reference Example 1-(f) above and the vindesine-conjugated H8A prepared in Example 6-(b) (6-3) were combined with a cross-linking agent. N-succinimidylmaleimidobenzoate) (SMBU
) using the same procedure as in Example 6 to bind Ig
A G2b-H8A-vincristine complex was obtained.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １、殺すべき細胞のもつている特定の抗原と特異的に結
合し得る免疫グロブリンまたはそのフラグメントと、血
清アルブミンの分子１個当り細胞毒性物質が３１〜６０
個結合してなる細胞毒性部とが、血清アルブミン中の硫
黄原子を介して結合せしめられてなる細胞毒性複合体。 ２、血清アルブミンが人または牛の血清アルブミンであ
る、特許請求の範囲第１項記載の細胞毒性複合体。 ３、下記式〔 I 〕 Ａｂ−〔Ｂ＿１−Ｓ＿１−Ａｌ−（ＮＨ−Ｃｙ）ｍ〕ｎ
・・・・・・〔 I 〕〔Ａｂは免疫グロブリンまたはそ
のフラグメントを、Ａｌは血清アルブミンを、Ｃｙは細
胞毒性物質を表わす。Ｓ＿１及びＮＨはそれぞれ血清ア
ルブミン中の硫黄原子及びイミノ 基を表わす。Ｂ＿１は２価の有機基を表わす。 ｍは３１〜６０の整数を、ｎは１〜１０の 整数を表わす。〕 で表わされる、特許請求の範囲第１項および第２項記載
の細胞毒性複合体。 ４、下記式〔II〕 Ａｂ〔（Ｂ＿２）＿ｔ＿＿２−Ｓ＿２−（Ｂ＿３）＿ｔ
＿＿３−Ｓ＿１−Ａｌ−（ＮＨ−Ｃｙ）＿ｍ〕＿ｎ・・
・・・・・・・〔II〕 〔Ａｂ、Ａｌ、Ｃｙ、Ｓ＿１、ＮＨ、ｍ及びｎの定義は
式〔 I 〕の場合と同じ。Ｓ＿２は硫黄原子を、Ｂ＿２
及びＢ＿３は２価の有機基をｔ＿２及びｔ＿３は同一ま
たは異なつて０または１を表わす。〕 で表わされる、特許請求の範囲第１項、第２項又は第３
項記載の細胞毒性複合体。 ５、下記式〔III〕 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・・・・〔III
〕 Ａｂ、Ａｌ、Ｃｙ、Ｓ＿１、ＮＨ、ｍ及びｎの定義は式
〔 I 〕の場合と同じ。Ｂ＿４は２価の有機基を表わす
。〕 で表わされる、特許請求の範囲第１項、第２項又は第３
項記載の細胞毒性複合体。 ６、発生または導入したチオール基を有する下記式〔I
V〕 Ａｂ−〔（Ｂ＿２）＿ｔ＿＿２−Ｓ＿２Ｈ〕＿ｎ′・・
・・・・・・・・・・〔IV〕〔Ａｂの定義は式〔 I 〕
に同じ。Ｓ＿２、Ｓ＿２及びｔ＿２の定義は式〔II〕に
同じ。ｎ′は１〜１０の整数を表わす。〕 で表わされる免疫グロブリンまたはそのフラグメントと
、下記式〔Ｖ〕 ＸＳ＿１−Ａｌ−（ＮＨ−Ｃｙ）＿ｍ・・・・・・・・
・・・・〔Ｖ〕〔Ａｌ、Ｃｙ、Ｓ＿１、ＮＨ及びｍの定
義は式〔 I 〕に同じ。Ｘは隣接する硫黄原子と共に活
性ジス ルフィド結合を形成し得る基を表わす。〕 で表わされる細胞毒性物質を結合した活性ジスルフィド
基を有する血清アルブミンを反応せしめることを特徴と
する、下記式〔II−１〕Ａｂ−〔（Ｂ＿２）＿ｔ＿＿２
−Ｓ＿２−Ｓ＿１−Ａｌ−（ＮＨ−Ｃｙ）＿ｍ〕＿ｎ・
・・・・・〔II−１〕 〔Ａｂ、Ａｌ、Ｃｙ、Ｓ＿１、ＮＨ、ｍ及びｎの定義は
式〔 I 〕の場合と同じ。Ｓ＿２、Ｂ＿２及びｔ＿２の
定義は式〔II〕の場合と同じ。〕 で表わされる細胞毒性複合体の製造法。 ７、誘導または導入した活性ジスルフィド基を有する下
記式〔VI〕 Ａｂ−〔（Ｂ＿２）＿ｔ＿＿２−Ｓ＿２Ｘ〕＿ｎ′・・
・・・・・・・・・・〔VI〕〔Ａｂの定義は式〔 I 〕
に同じ。Ｓ＿２、Ｂ＿２及びｔ＿２の定義は式〔II〕に
同じ。ｎ′の定義は式〔IV〕に同じ。Ｘの定義は式〔Ｖ
〕に同じ。〕 で表わされる免疫グロブリンまたはフラグメントと、下
記式〔VII〕 ＨＳ＿１−Ａｌ−（ＮＨ−Ｃｙ）＿ｍ・・・・・・・・
・・・・〔VII〕〔Ａｌ、Ｃｙ、Ｓ＿１、ＮＨ及びｍの
定義は式〔 I 〕に同じ。〕 で表わされる細胞毒性物質を結合した血清アルブミンを
反応せしめることを特徴とする、前記式〔II−１〕で表
わされる細胞毒性複合体の製造法。 ８、前記式〔IV〕で表わされる発生または導入したチオ
ール基を有する免疫グロブリンまたはそのフラグメント
と、前記式〔VII〕で表わされる細胞毒性物質を結合し
た血清アルブミンを、チオール基と反応し得る官能基を
２個有する架橋剤を用いて結合することを特徴とする、
下記式〔II−２〕 Ａｂ−〔（Ｂ＿２）＿ｔ＿＿２−Ｓ＿２−Ｂ＿３−Ｓ＿
１−Ａｌ−（ＮＨ−Ｃｙ）＿ｍ〕＿ｎ・・・・・・〔I
I−２〕 〔Ａｂ、Ａｌ、Ｃｙ、Ｓ＿１、ＮＨ、ｍ及びｎの定義は
式〔 I 〕の場合と同じ。Ｓ＿２、Ｂ＿２、Ｂ＿３及び
ｔ＿２の定義は式〔II〕の場合に同じ。〕 で表わされる細胞毒性複合体の製造法。 ９、前記式〔VII〕で表わされる細胞毒性物質を結合し
た血清アルブミンと、下記式〔VIII〕 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・・・・・・・
・・・〔VIII〕 〔Ａｂの定義は式〔 I 〕に同じ。ｎ′の定義は式〔IV
〕に同じ。Ｂ＿４の定義は式〔III〕に同じ。〕で表わ
される導入されたマレイミド基をもつ免疫グロブリンま
たはそのフラグメントを反応せしめることを特徴とする
、前記式〔III〕で表わされる細胞毒性複合体の製造法
。[Scope of Claims] 1. An immunoglobulin or a fragment thereof capable of specifically binding to a specific antigen possessed by cells to be killed, and a serum albumin with a cytotoxic substance content of 31 to 60 per molecule.
A cytotoxic complex in which a cytotoxic moiety formed by individual bonds is bonded via a sulfur atom in serum albumin. 2. The cytotoxic complex according to claim 1, wherein the serum albumin is human or bovine serum albumin. 3. The following formula [I] Ab-[B_1-S_1-Al-(NH-Cy)m]n
...[I] [Ab represents an immunoglobulin or a fragment thereof, Al represents serum albumin, and Cy represents a cytotoxic substance. S_1 and NH represent a sulfur atom and an imino group in serum albumin, respectively. B_1 represents a divalent organic group. m represents an integer of 31 to 60, and n represents an integer of 1 to 10. ] The cytotoxic complex according to claims 1 and 2, which is represented by: 4. The following formula [II] Ab [(B_2)_t__2-S_2-(B_3)_t
___3-S_1-Al-(NH-Cy)_m]_n...
...... [II] [Definitions of Ab, Al, Cy, S_1, NH, m and n are the same as in the case of formula [I]. S_2 is a sulfur atom, B_2
and B_3 represent a divalent organic group, and t_2 and t_3 are the same or different and represent 0 or 1. ] Claims 1, 2, or 3, expressed as
Cytotoxic complexes as described in Section. 5. The following formula [III] ▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼・・・・・・[III
] The definitions of Ab, Al, Cy, S_1, NH, m and n are the same as in the case of formula [I]. B_4 represents a divalent organic group. ] Claims 1, 2, or 3, expressed as
Cytotoxic complexes as described in Section. 6. The following formula [I
V] Ab-[(B_2)_t__2-S_2H]_n'...
・・・・・・・・・・・・ [IV] [Definition of Ab is formula [I]
Same as . The definitions of S_2, S_2 and t_2 are the same as in formula [II]. n' represents an integer from 1 to 10. ] An immunoglobulin or a fragment thereof represented by the following formula [V] XS_1-Al-(NH-Cy)_m...
...[V] [Definitions of Al, Cy, S_1, NH and m are the same as in formula [I]. X represents a group capable of forming an active disulfide bond with an adjacent sulfur atom. ] Ab-[(B_2)_t__2 of the following formula [II-1] characterized by reacting serum albumin having an active disulfide group to which a cytotoxic substance represented by the following is bound.
-S_2-S_1-Al-(NH-Cy)_m]_n・
...[II-1] [Definitions of Ab, Al, Cy, S_1, NH, m and n are the same as in the case of formula [I]. The definitions of S_2, B_2 and t_2 are the same as in the case of formula [II]. ] A method for producing a cytotoxic complex represented by 7. The following formula [VI] Ab-[(B_2)_t__2-S_2X]_n'... having an active disulfide group induced or introduced
・・・・・・・・・・・・ [VI] [Definition of Ab is formula [I]
Same as . The definitions of S_2, B_2 and t_2 are the same as in formula [II]. The definition of n' is the same as in formula [IV]. The definition of X is the formula [V
] Same as. ] Immunoglobulin or fragment represented by the following formula [VII] HS_1-Al-(NH-Cy)_m...
...[VII] [Definitions of Al, Cy, S_1, NH and m are the same as in formula [I]. ] A method for producing a cytotoxic complex represented by the above formula [II-1], which comprises reacting serum albumin bound with a cytotoxic substance represented by the formula [II-1]. 8. Immunoglobulin or a fragment thereof having a generated or introduced thiol group represented by the above formula [IV] and serum albumin bound to a cytotoxic substance represented by the above formula [VII] are treated with a functional compound capable of reacting with the thiol group. characterized by bonding using a crosslinking agent having two groups,
The following formula [II-2] Ab-[(B_2)_t__2-S_2-B_3-S_
1-Al-(NH-Cy)_m]_n・・・・・・[I
I-2] [Definitions of Ab, Al, Cy, S_1, NH, m and n are the same as in the case of formula [I]. The definitions of S_2, B_2, B_3 and t_2 are the same as in the case of formula [II]. ] A method for producing a cytotoxic complex represented by 9. Serum albumin bound to the cytotoxic substance represented by the above formula [VII] and the following formula [VIII] ▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼・・・・・・・・・
... [VIII] [The definition of Ab is the same as in formula [I]. The definition of n′ is the formula [IV
] Same as. The definition of B_4 is the same as in formula [III]. A method for producing a cytotoxic complex represented by the formula [III], which comprises reacting an immunoglobulin or a fragment thereof having an introduced maleimide group represented by the formula [III].