JPS5923790B2

JPS5923790B2 - 固定化酵素の製造方法

Info

Publication number: JPS5923790B2
Application number: JP2923877A
Authority: JP
Inventors: 典雄小野寺; 靖彦児島; 弘中野
Original assignee: Dainippon Ink and Chemicals Co Ltd
Current assignee: DIC Corp
Priority date: 1977-03-18
Filing date: 1977-03-18
Publication date: 1984-06-05
Also published as: JPS53115887A

Description

【発明の詳細な説明】近年、生化学の発達に伴って酵素の作用機構の解明が進
み、酵素作用を応用した技術の開発が急速に高まってき
た。

酵素が広い分野の触媒として使用され、工業的な一人飛
躍をなすことは遠い将来ではない。

酵素を触媒として用いるために開発された固定化技術は
、連続化反応を可能にするため酵素の触媒作用を効率よ
く工業化工程で利用するものとして注目されている。

従来、酵素の固定化法として（１）酵素をイオン交換性
セルロースやイオン交換樹脂に結合させる方法。

（２）微生物菌体内含有酵素を失活しない程度に加熱し
て該酵素を菌体内に固定する方法。

（３）酵素をアクリル系樹脂内に包括固定する方法。

（４）酵素を無機物質微細穴内に共有結合させるか又は
吸着させて固定化する方法などが知られている。

（１）の方法は、酵素とイオン交換性セルロースもしく
はイオン交換樹脂との結合が弱く、基質のイオン強度に
よる影響を受けやすく、酵素が離脱し易い欠点がある。

（２）の方法は加熱により酵素が失活し易いので実際上
の固定化条件の選定が困難であると同時に酵素に対する
汎用性に乏しい。

（３）の方法では固定化条件、即ち重合条件が難かしく
、また重合中の酵素失活の問題がある。

特に担体重合物の毒性のために実際の使用に際して問題
を残す。

（４）の方法では、担体となる無機物質が微細穴構造を
有していることが必要であるため担体製造に比較的経費
がかかつて高価と々す、また基質中への酵素の流出が懸
念される。

本発明者等は、上述の様な公知の固定化法にみられる諸
欠点を排除し、有利に固定化酵素を製造する方法につい
て鋭意研究を進めた結果、本発明に到達した。

本発明は、水中に於いて酵素の存在下で可溶性蛋白質と
ジアルデヒド澱粉を反応させることによシ、酵素を固定
化した水不溶性物質を生成させることを特徴とする固定
化酵素の製造方法に関するものである。

ジアルデヒド澱粉は、次式で示されるくり返し単位をも
った高分子化合物である。

ジアルデヒド澱粉は、比較的反応性の強いアルデヒド基
を有していることによって蛋白質とも容易に反応し、例
えば次式で示されるような三次元構造をとる。

本発明に従って、水中に於いて酵素の存在下で可溶性蛋
白質とジアルデヒド澱粉を反応させると、酵素を構造中
に包括するとともに酵素が前記三次元構造のアルデヒド
基と一部結合してゲル状物、沈澱物の如き形態で酵素を
固定化した水不溶性物質が生成する。

依って、本発明によって得られる酵素を固定化した水不
溶性物質、即ち固定化酵素に於いては、酵素が担体に包
括されているだけではなく酵素が担体と一部結合してい
るため、酵素の歩留が良好である上に酵素が担体から離
脱し難い長所を有している。

また、可溶性蛋白質とジアルデヒド澱粉との反応はＰＨ
を選択することにより室温で容易に進行するため、本発
明に従って固定化酵素を製造する場合には製造中に酵素
が失活することがない。

さらに、ジアルデヒド澱粉は、２６００■／に９／日の
割合、即ち７０ｋ１９の体重の人間に対して１日あたり
１８２ｇを投与することに相当するような割合で継続的
にネズミに投与しても何らの悪影響を与えないことが報
告されているように無毒であるし、また可溶性蛋白質も
各種食料品に使用されているように無毒であるから、本
発明によって得られる固定化酵素は基質に毒害を及ぼす
ことがない。

本発明に於いて使用される酵素は、微生物菌体内含有酵
素のように細胞内に存在する酵素でもよいし、また細胞
から分離抽出した酵素でもよく、例えば次のようなもの
を挙げることができる。

酸化還元酵素；例えばグルコースオキシダーゼ、グルタ
ミン酸ジヒドロゲナーゼ、リンゴ酸ジヒドロゲナーゼ、
乳酸ジヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ
。

転移酵素；例えばアスパラギン酸塩アミノトランスファ
ラーゼ、ヒスタミントランスファラーゼ、グリシンアミ
ノトランスファラーゼ、アスパラギン酸塩アセチルトラ
ンスファラーゼ、Ｅ−リジンアセチルトランスファラー
ゼ、ヘキソキナーゼ、フルクトキナーゼ。

加水分解酵素；例えばリパーゼ、ホスホリパーゼ、アセ
チルコリンエステラーゼ、ペクチナーゼ、ホフファター
ゼ、αおよびβ−アミラーゼ、マルターゼ、セルラーゼ
、インベルターゼ、アシラーゼ、ペプシン、パパイン、
レンニン、トリプシン、キモトリプシン、アスパラギナ
ーゼ、ウレアーゼ、アルギナーゼ、リボヌクレアーゼ。

リアーゼ；例工ばアスパラギン酸デカルボキシラーゼ、
グルタミン酸塩デカルボキシラーゼ、リンゴ酸塩シター
ゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸塩ヒドラターゼ。

異性化酵素；例えばグルコースイソメラーゼ、アラニン
ラセマーゼ、メチオニ／ラセマーゼ、グルタミン酸塩ラ
セマーゼ、乳酸塩ラセマーゼ。

リガーゼ；例えばアスパラギンシンセターゼ、グルタミ
ンシンセターゼ、グルタチオンシンセターゼ、ピルビン
酸塩シンセターゼ。

可溶性蛋白質とは、水に溶解または微細に分散するもの
を言い、例えば礼装カゼイン、礼装アルブミン、礼装グ
ロブリン、即製アルブミンの如き動物性蛋白質並びに大
豆可溶性タンパク、グリチニン、グルテリン、ウレアー
ゼ、カナバリンの如き植物性蛋白質などを挙げることが
でき、これらの蛋白質は単独或は二種以上混合して使用
される。

ジアルデヒド澱粉は、通常澱粉を過沃素酸で酸化して得
られる白色微粉末状の物質であり、日本カーリット株式
会社からカルゲス５号の商標により販売されている。

本発明に従って、水中に於いて酵素の存在下で可溶性蛋
白質とジアルデヒド澱粉を反応させるには、例えば次の
様にすればよい。

先ず、可溶性蛋白質を室温、攪拌下に水に分散させる。

その濃度は、可溶性蛋白質の種類により一定ではないが
、通常３〜５０重量％、攪拌が容易に行なわれ得る好ま
しい濃度は５〜２０重量％である。

この分散液に対して酵素を添加し、室温下で攪拌して分
散溶解させる。

酵素の添加量は、その活性により一定ではないが、固定
化酵素を錠剤化した場合の錠剤の物理的強度の観点から
微生物菌体内含有酵素のように細胞内に存在する酵素の
場合には細胞の重量をも含めて通常可溶性蛋白質１０重
量部に対して０．１〉５０重量部、好ましくは０．１〜
１０重量部であり、細胞から分離抽出した酵素の場合に
は通常可溶性蛋白質１０重量部に対して０．１〜２０重
量部、好ましくは０．１〜５重量部である。

微生物菌体内含有酵素のように細胞内に存在する酵素の
場合には使用する前によくすりつぶし、酵素を出来るだ
け細胞外に出すことが望ましい。

細胞は、不溶性蛋白質と考え得るので微生物菌体内含有
酵素のようにこれを含んだ酵素を用いた場合には、水中
に可溶性蛋白質と不溶性蛋白質および酵素が混在し、酵
素は蛋白質への吸着と不溶解の２つの状態にあることに
なる。

この分散液は通常ＰＨ７，０以上の弱アルカリ性を示し
ている。

一方、ジアルデヒド澱粉を水に添加し、攪拌下に８０°
Ｃ程度まで加熱して透明な水溶液を調製する。

ジアルデヒド澱粉の濃度は、通常５〜３０重量％、よシ
好ましくは１０〜２０重量％とすればよい。

尚、ジアルデヒド澱粉を水に溶解させる際に、四ホウ酸
ナトリウム、酢酸と酢酸ソーダとの等当量混合物の如き
緩衝剤を一緒に添加すると、緩衝剤として役立つだけで
はなく、ジアルデヒド澱粉の溶解を促進するため好まし
く、四ホウ酸ナトリウム・ｌＯ水塩の場合には通常濃度
を１〜２重量％とすればよい。

このようにして得られたジアルデヒド澱粉の１０重量％
水溶液は、ＰＨが通常６．０〜６．５である。

次いで、室温で可溶性蛋白質および酵素の分散液にジア
ルデヒド澱粉の水溶液を添カ目する。

使用するジアルデヒド澱粉の割合は、全蛋白質量１０重
量部に対して通常１〜１０重量部、より好１しくは１〜
５重量部とすればよい。

可溶性蛋白質とジアルデヒド澱粉との反応は、ＰＨに大
きく影響され、ＰＨが酸性の場合には反応が遅く、ＰＨ
がアルカ’Ｊｆ’ｌＥの場合には反応が急速に進行す
る。

但し、ＰＨが８．５以上ではジアルデヒド澱粉の劣化が
おこり好ましくないため、反応時のＰＨは通常６．８〜
８．５、好ましくは７．５〜８．０とすればよい。

一般に、ジアルデヒド澱粉の水溶液を添加することによ
りＰＨが低下するので、カセイソーダ、カセイカリ等の
アルカリによりＰＨを上記の範囲に調整すると反応が進
行し、酵素を構造中に包括するとともに酵素と一部結合
した三次元構造が形成される。

蛋白質及び酵素の種類により反応速度が異るが通常３０
〜６０分間でゲル状物、沈澱物の如き形態で酵素を固定
化した水不溶性物質が生成する。

次いで、反応を完結させるために０〜１００°Ｃ１好ま
しくは１０〜５０°Ｃで数時間放置すればよい。

本発明に従って製造した酵素を固定化した水不溶性物質
、即ち固定化酵素を使用する場合には、固定化酵素を脱
水、乾燥させて所望の形状に成形して錠剤化すればよい
が、連続反応に使用するための強度を得るには補強剤を
併用して成形することが好ましい。

補強剤は、永年心性の粉末粒子であればいずれをも使用
することができるが、その粒度は細かい程良い。

本発明に於いて使用される補強剤の代表例は、珪藻±（
ゼオライト）、セリサイト、カオリン、ベントナイト、
アルミナ等の水不溶性物質並びにエチルセルロース、ア
セチルセルロースの如キ繊維状および粉末状セルロース
誘導体、ポリアミド、ポリエステル、ポリウレタン、ポ
リエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等の永年ｍ
性有機物質を挙げることができ、補強剤は一種のみを使
用してもよいが、二種以上を併用してもよい。

また、補強剤の使用割合はゲル状物、沈澱物の如き水不
溶性物質中の固形分に対して１〜８０重量％、好ましく
は１０〜５０重量％とすればよい。

固定化酵素または固定化酵素と補強剤との混線物を脱水
、乾燥させて所望の形状に成形して錠剤化するには、例
えば直径が１〜２ｍｍで深さが１−２ｍｍの穴を多数設
けた成型板の穴の内にこれらの物質を充填し、−１０〜
−２０℃に冷却して凍結させた陵に冷凍真空乾燥させて
もよいし、また押し出し成型機によってこれらの物質を
直径が０．５〜２ｍｒｎの棒状に押し出した後に１〜２
ｍｍの長さに切断し、次いで−１０〜−２０°Ｃに冷却
して凍結させた後に冷凍真空乾燥させてもよく、この方
法により円筒形の錠剤を得ることができるが、錠剤の形
状は円筒形だけではなく、球形、立方形等であってもか
まわない。

次に、実施例によって本発明を具体的に説明する。

実施例１礼装カゼイン２８ｇ、四ホウ酸ナトリウム・１０水塩５
ｇを蒸留水２５２ｇに添加し７、室温で攪拌分散させる
。

この分散液に微生物菌体内含有グルコースイソメラーゼ
（合同酒精株式会社製）から常法により抽出した粉末グ
ルコースイソメラーゼ（単位／、９１０１００）５ｇを
添加し、室温で攪拌溶解させた。

この分散液のＰＨは、８．０〜８．５であった。

一方、ジアルデヒド澱粉９ｇ、四ホウ酸ナトリウム・１
０水塩０．４ｇを蒸留水５１ｇに添力口し、７５〜８０
℃で均一に溶解させる。

ジアルデヒド澱粉の水溶液のＰＨは６．０〜６，５であ
った。

礼装カゼイン、酵素の分散液にジアルデヒド澱粉の水溶
液を添加する。

この混合液中にＰＨ主電極挿入し、２分の１規定のカセ
イソーダ水溶液に・よ、！７ＰＨを７．５〜８．０に調
整する。

液は徐々に増粘し反応が進行していることを示し、遂に
は攪拌困難となる。

次いで４０°Ｃの水浴中で２〜３時間熟成反応させると
、堅いゲル状物となる。

このゲル状物に対してゼオライト１８ｇを添加してよく
磨りつぶし混練する。

との混練物を直径がＬ２ｍｍの穴が多数あいた２ｍｍの
厚さの成型板中に塗り込み、−１０℃以下に冷却した後
、冷凍真空乾燥した。

これによって直径が１．１ｍｍで長さが２．Ｏｍｒｎの
円筒形に成形された固定化グルコースイソメラーゼ錠剤
６５ｇが得られた。

この様にして得られた固定化グルコース・イソメラーゼ
錠剤について酵素活性を測定し、活性収率を求めた。

酵素の活性測定は、高崎らの方法〔Ａｇｒ、Ｂｉｏｌ、
ｃｈｅｍ、３３．１５２７゜（１９６９）〕に準じ
０．１モル濃度のグルコース溶液を基質溶液とし、７０
℃で１時間異性化反応を行った後、生成したフラクトー
ス量を測定し、１■のフラクトースを生成する固定化グ
ルコースイソメラーゼ錠剤の活性を１単位とした。

本実施例で得た固定化グルコースイソメラーゼ錠剤の活
性は単位／ｇ６２５であり、活性収率は８０．５％であ
った。

また、本実施例で得た固定化グルコースイソメラーゼ錠
剤をカラムに充填し、５０重量％のグルコース、５ミリ
モル濃度の塩化マグネシウムを含有した基質溶液をＰＨ
７，５，６５℃の湯度でカラムに通し連続異性化反応を
行ない、反応液中のフラクトースへの転換率が４５％に
なる様に基質液の流量を調節したところ、流量を半分に
減じなければならない力価の半減期は、２０日であった
。

実施例２実施例１に於ける粉末グルコースイソメラーゼ（単位／
、９１０１００）ｌのかわりに粉末グルコースイソメラ
ーゼ（単位／ｇ１０１００）２０ｇを使用するほ
かは、実施例１と全く同じ条件で固定化反応を行なった
。

得られたゲル状物にゼオライ）２４！！を添加し、以下
実施例１と全く同様に成形して錠剤化を行々い、直径が
１．１ｍｍで長さが２．０間の円筒形に成形された固定
化グルコースインメラーゼ錠剤８５ｇを得た。

得られた固定化グルコースイソメラーゼ錠剤の活性は単
位／ｇ１９５０であり、活性収率は８２％であった。

実施例３礼装カゼイン２１、四ホウ酸ナトリウム・１０水塩５ｇ
を蒸留水２５２ｇに添加して分散液を作製し、これに微
生物菌体内含有グルコースイソメラーゼ（合同酒精株式
会社製）１０１（１７０，０００単位）をよく磨りつぶ
して添加する。

添加後よく混和するとクリーム状の乳液となる。

−力、ジアルデヒド澱粉１’ｌ、四ホウ酸ナトリウム・
１０水塩ｏ、ｓ、ｐ、蒸留水１０７ｊ！を実施例１に従
って水溶液とする。

礼装カゼイン、酵素のクリーム伏乳液に対してジアルデ
ヒド澱粉の水溶液を添加してよく混練し、２分の１規定
のカセイソーダ水溶液によりＰＨ８，０に調整する。

ＰＨ調整後４０°Ｃで２時間放置すると次第に粘度を増
し終にはゲル状物となる。

ゲル状物に対してゼオライト２２ｇを添加してよく混練
し、実施例１と同様に錠剤化を行々い１１０ｇを得た。

得られた固定化グルコースイソメラーゼ錠剤の酵素活性
は単位／ｇ１４５０であり、活性収率は９３．８％であ
った。

本実施例で得た固定化グルコースイソメラーゼ錠剤をカ
ラムに充填し、５０重量％のグルコース、５ミリモル濃
度の塩化マグネシウムを含有した基質溶液を使用し、Ｐ
Ｈ８，５，６０℃でカラムに通し連続異性化反応を行っ
た。

反応液中のフラクトースへの転換率を４５％になる様に
基質液の流量を調節し連続流入したところ、流量を半分
に減じ々ければならない異性化力価の半減期は２５日で
あった。

実施例４実施例３によって得られたゲル状物を使用し、ゼオライ
トを添加せずに、以下実施例１と同様に錠剤化を行なっ
た。

得られた固定化グルコースイソメラーゼ錠剤の酵素活性
は単位／ｇ２０１０であり、活性収率は８９．９％であ
った。

実施例５脱脂大豆を原料として得られる高純度粉末状大豆たん白
（味の素株式会社製プロリッチ−Ｒ）５．０ｇを２分の
１規定のカセイソーダ水溶液３０ｍ１中に加え、室温で
２時間かくはん分散させた。

次いで２分の１規定の塩酸でＰＨ８，５に調整するとわ
づかに乳濁した液となる。

この乳濁液に実施例１で使用した粉末グルコースイソメ
ラーゼ１．０ｇ（１０１００単位）を加えて室温でかく
はんし、分散させた。

１５重量％ジアルデヒド澱粉水溶液１６．７ｍｌをタン
パク質、酵素の分散液に攪拌しながら徐々に添加する。

１０分の１規定のカセイソーダ水溶液でＰＨ８，０に調
整して４０°Ｃで３時間放置した。

乳濁液を冷却した後、１０分の１規定の塩酸でｐ）Ｉ
７．０に中和すると沈澱物が生じる。

この沈澱物を含む懸濁液にゼオライ）３．２．？を加え
てよくかくはんして濾過する。

濾過物質を含水のま＼実施例１に示した成型板に充填し
て冷凍真空乾燥を行い固定化グルコースイソメラーゼ錠
剤９．８ｇを得た。

かくして得られた固定化グルコースイソメラーゼ錠剤の
活性測定値は７２０単位／ｇであり、活性収率は６９．
９％であった。

また、該固定化錠剤をカラムに充填し、５０重量％のグ
ルコース、５ミリモル濃度の塩化マグネシウムを含有し
た基質溶液を使用し、ＰＨ８，５゜６０°Ｃでカラムに
通して連続異性化反応を行った結果、力価の半減期は２
０日であった。

実施例６実施例１に於いて得たゲル状物にエチルセルローズ１８
ｇを添加して混練し、以下実施例１と全く同様に錠剤化
を行なった。

得られた固定化錠剤はカラムに充填して連続反応を行な
ってもその形体がくずれることはなかった。

また、その活性は６１０単位／ｇであった。実施例７礼装カゼイン２８ｇ、四ホウ酸ナトリウム・１０水塩５
ｇを蒸留水２５２ｇ中に加え、室温でかくはんして分散
させた。

この分散液に市販グルコアミラーゼ（天野製薬株式会社
製グルクザイム９．０００単位／ｇ）！１（４５，００
０単位）を室温で攪拌溶解させた。

この礼装カゼイン、酵素の分散液に対して、ジアルデヒ
ド澱粉９ｇ、四ホウ酸ナトリウム・１０水塩０．４．９
．蒸留水５１ｇから成る水溶液を加える。

分散液全体のＰＨを２分の１規定カセイソーダ水溶液で
７．５に調整する。

反応が徐々に始まり増粘してくる。

４０°Ｃで３時間熟成反応後、ゲル状物を得た。

かくして得られたゲル状物にゼオライ）１８５’をを添
加しよく混練する。

この混練物質を実施例１に示した様な成型板を用いて成
型、冷凍真空乾燥して固定化錠剤６３ｇを得た。

該固定化錠剤の活性測定は、可溶性澱粉溶液を用い、４
０°Ｃで３０分間糖化を行い、１０■のグルコース生成
時の固定化グルコアミラーゼ量を１単位として行った。

本実施例で得られた固定化グルコアミラーゼ錠剤の活性
は、６４０単位／ｇであり、活性収率は８９．６％であ
った。

本実施例により作製した固定化グルコアミラーゼ錠剤を
使用し澱粉の連続糖化反応を行った。

固定化グルコアミラーゼ錠剤をカラムに充填し、カラム
中にＰＨ５，０の３５重量％の可溶性澱粉を含有した基
質溶液を糖化温度５０℃の条件下に流入した。

ＤＥ（Ｄｅｘｔｒｏｓｅｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）が９
５％以上になる様に流入速度を調節して反応を進めた。

５０日連続反応後でも酵素活性力価の低下はなく、また
ペーパークロマトグラフィーによるオリゴ糖の検出は認
められなかった。

々お、糖化率は、９８％以上（還元糖の定量）であった
。

Claims

【特許請求の範囲】

１水中に於いて酵素の存在下で可溶性蛋白質とジアル
デヒド澱粉を反応させることにより、酵素を固定化した
水子ｌｉｔ物質を生成させることを特徴とする固定化酵
素の製造方法。