JPS59210897A - Production of beta-lactam compound - Google Patents

Abstract

NEW MATERIAL:A beta-lactam antibiotic TAN-458 represented by formula I and its salt. USE:It shows antibacterial activity against gram-positive and -negative bacteria and is used as a synthetic intermediate of medicines and as a reagent. PREPARATION:A microorganism in Spirillum, capable of producing antibiotic TAN-458 such as Spirillum sp-UK-1521 strain (FERM-7075) is cultured aerobically at about 10-35 deg.C and a pH of about 4-8 and the objective antibiotic TAN- 458 is obtained mainly from the filtrate of the culture mixture.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規抗生物質Ｔ　Ａ、　ｐｒ　−４５８および
その塩の製造法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for producing a novel antibiotic TA, pr-458, and its salts.

木究明者らは、新規な抗生物質の探索を目的として多数
の微生物を土壌より分ｂｉｂ　Ｌ、その産生ずる抗生物
質全分離探索したところ、ある種の微生物がβ−ラクク
ダム化合物である抗生物質’Ｉ’ＡＮ−４５８を産生ず
ること、該微生物がスピリルム属に属すること、該微生
物を適宜の培地に培養することによってグラム陽性細菌
およびダラム陰性細菌に対して抗菌力を示す抗生物質を
培地中に蓄積しうろことなどを知り、この抗生物質を単
離し、その物理化学的および生物学的諸性質から、当該
抗生物質が下式で表わされるβ−ラクタム抗生物質であ
ることを確めた。In order to search for new antibiotics, researchers isolated a large number of microorganisms from the soil and searched for all the antibiotics they produced. The microorganism belongs to the genus Spirillum, and by culturing the microorganism in an appropriate medium, an antibiotic that exhibits antibacterial activity against Gram-positive bacteria and Durum-negative bacteria is added to the medium. After learning about the accumulation of scales, we isolated this antibiotic and confirmed from its physicochemical and biological properties that it was a β-lactam antibiotic represented by the following formula.

該（１合物は既にり、Ｄ、　Ｃａｍａ　　らによって合
成されているが（Ｊ、Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ
、　１００　＋　８００６（＋９７８））、該化合物（
ナトリウム塩）が不安定なため物理化学的諸性質が明確
に記載されていない。また、Ｗ、Ｌ、　Ｐａｒｋｅｒら
は該化合物（遊呼カルボン酸）を５Ｑ２７８６０と称し
、ｐ−ニトロベンジルエステルに誘導化後、セラシア（
Ｓｅｒｒａｔｉａ　）Ｍおよび工μヴイニャ（Ｅｒｗｉ
ｎｉａ　）ＦＡ菌の代鞠産物として培養ｇＩから単離し
ている（　Ｊ、　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　、　３５．
　６５３　　（１９８２））。The first compound has already been synthesized by D. Cama et al. (J. Amer. Chem. Soc.
, 100 + 8006 (+978)), the compound (
Because the sodium salt) is unstable, its physicochemical properties are not clearly described. In addition, W, L, Parker et al. named this compound (free carboxylic acid) as 5Q27860, and after derivatizing it to p-nitrobenzyl ester, it was converted to Serasia (
Serratia) M and Erwi
nia) has been isolated from cultured gI as a substitute product of FA bacteria (J, Antibiotics, 35.
653 (1982)).

この場合も化合物（Ｉ）を培養欣中から単離することは
不可能で従って物理化学的諸性質の記載はされていない
。In this case as well, it is impossible to isolate compound (I) from the culture medium, and therefore its physicochemical properties are not described.

本発明者らは、これらの知見を認識したうえでさらに研
究を重ねた結果本発明を完成した。The present inventors recognized these findings and completed the present invention as a result of further research.

すなわち、本発明はスピリルム広すに属する式（ で示される化合物の生産菌を培地に培養し、培養物中に
上式の化合物全生成蓄積せしめ、これを採取することを
特徴とする上式の化合物またはその塩の製造法て゛める
。That is, the present invention provides a method for producing a compound of the above formula, which is characterized by culturing in a medium a bacterium that produces a compound of the formula ( Learn about methods for producing compounds or their salts.

なお、本願では抗生物質Ｔ　Ａ　ｘｑ　−４５８全単に
Ｔ　Ａ　Ｎ　−４５８と称することもある。In addition, in this application, the antibiotic T A xq -458 may be simply referred to as T A N -458.

本発明で使用される抗生物γ′ｆ　Ｔ　ＡＮ　−４５８
生並酌としては、スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｌｕｍ）
属に属し、抗生物質Ｔ　Ａ　Ｎ　−４５８を産生ずる能
力を何するものであれば如何なる１）孜生物でもよい。Antibiotic γ′f T AN-458 used in the present invention
Spirillum (Spirillum) is used as a raw sake.
1) Any species may be used as long as it belongs to the genus and has the ability to produce the antibiotic TAN-458.

抗生物質ＴＡＮ−４５８生産菌の例としては、たとえば
本発明者らによって兵庫県の土壌より採取したスピリル
ム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ’）属のＵＫ　　１５２１株（
以下、ｒＵＫ−１５２１株」と略称することもある。）
があげられる。ヌビリμム属のＵＫ−１５２１株の菌学
的性状は下記のとおシである。As an example of antibiotic TAN-458-producing bacteria, UK 1521 strain of the genus Spirillum (Spirillum') collected from soil in Hyogo Prefecture by the present inventors is used.
Hereinafter, it may be abbreviated as "rUK-1521 strain". )
can be given. The mycological properties of UK-1521 strain of the genus Nubilium are as follows.

（ａ）形　態 肉汁寒天斜面上で２Ｅｌ、２日間培養後の観察では、剖
胞は幅０．６〜０．９μ、長さ２．５〜１２μのカーブ
ないしラセン状で、多形性を示さない。(a) Morphology Observation after culturing for 2 days on a broth agar slant at 2El showed that the necrocysts were curved or spiral-shaped with a width of 0.6-0.9μ and a length of 2.5-12μ, with pleomorphism. Not shown.

ｊＩル動性があシ、極鞭毛を有する。胞子を形成せず、
またグフム染色は陰性で、抗酸性を示さない。It is mobile and has a polar flagellum. does not form spores;
In addition, Guhum staining was negative and showed no acid-fast properties.

（ｂ）各種培地上での生育状態 ２８℃で培養し、１ないし１４日間にわたって１硯祭し
た。(b) Growth status on various media The cells were cultured at 28° C. and cultured in one inkstone for 1 to 14 days.

■肉′ｔｆ基大平板培養＝３日間培養で直径０．１ない
し０．５絹の円形１頭状、全光艮の集落を形成する。■ Meat'tf basic plate culture = After 3 days of culture, a colony of round, single-headed, full-light lilies with a diameter of 0.1 to 0.5 silk is formed.

表面は平滑、不透明、うすい黄土色を呈する。拡散性色
素は生成しない。The surface is smooth, opaque, and has a pale ocher color. No diffusible dye is produced.

■肉汁寒天斜面培養：中程度の糸状の生育を示し、不透
明、うすい黄土色を呈する。■Juice agar slant culture: Shows medium filamentous growth, is opaque, and has a pale ocher color.

■肉汁液体培、ｉｊ、　、混湧状に生青し、小爪の沈Ｖ
笈を生じ、菌１簡全形成しない。■ Meat juice liquid culture, ij, , raw green in a mixed well, small nail sink V
No bacteria are formed at all.

■肉ｔトセフチン響ジ・・ｊ培グ３・ゼラヅーンを液化
しない。■ Meat t Tosefchin Hibikiji...j Cultivation 3. Do not liquefy Zeladun.

■リトマヌ・ミルり：ベプＩ・ンイｈしない。■ Ritmanu Miruri: Bepu I Nyih not.

（ｃ）生理的性質 ■硝酸塩の迭尤；　ｂｔ’８ｊ計 （り脱窒反応：：一志注 ■ＭＲ（メチルレッド）テスト・［食性■ｖＰ（フオー
ゲ７験〕゛ロヌカウエルンテヌト二薗性 ■インドールの生成：酩注 （′０硫化水素の生成冒陰性 ■デンプンのカニ］水分ｊ’ｆ：’　：　’ｊ’；、’
ｊ　ｊ生（、紳クエン酸の利用：陽性 （のｆ！４１泥窒累源の利用 Ｉ）硝酸カリウム；陽性 ■）硫酸アンモニウム：υ−一 ［相］色素の生成：うすいピンク色の拡散性色素を生成
する。(c) Physiological properties ■ Nitrate loss; bt'8j meter (denitrification reaction: Kazushi's note ■ MR (methyl red) test, [feedability ■ vP (Vouge 7 experiment) ■ Formation of indole: Intoxication ('0 Generation of hydrogen sulfide - starch crab) Moisture j'f:' : 'j';,'
j j Raw (, Utilization of citric acid: Positive (f! 41 Utilization of mud nitrogen sources I) Potassium nitrate; Positive ■) Ammonium sulfate: υ-1 [phase] Formation of pigment: Pale pink diffusible pigment generate.

ｑリウレアーゼ：陽性 ０オキシダーゼ：陽性 ［相］カタラーゼ：陽性（弱い） ■生育の範囲 Ｔ）　ｐＨ：ｐＨ４，０〜７．０で生育するが、最適ｐ
Ｈは４．６〜５．５゜ １１）２詰度：１４〜３４℃で生育するが最適温度は２
８〜３４℃。q Liurease: Positive 0 Oxidase: Positive [Phase] Catalase: Positive (weak) ■Growth range T) pH: Grows at pH 4.0 to 7.0, but optimum pH
H is 4.6-5.5° 11) 2 degree of clogging: grows at 14-34°C, but the optimum temperature is 2
8-34℃.

（０酸緊に刻する態度：好気的 （１Ω０−Ｆ（オキシダティブーファーメンタテイブ）
テスト〔ヒユー・レイフソン　（Ｈｕｇｈ・Ｌｅｉｆｓ
ｏｎ）法〕：酸化的 ＠潰からの酸およびガスの生成： 酸　　ガス Ｌ−アラビノース　　　　　　−　　−Ｄ−キシロース
　　　　　−　　− Ｄ−グルコース　　　　　　士　　− Ｄ−マンノース　　　　　±　　− Ｄ−フラクトース　　　　　　−− Ｄ−ガラクトース　　　　　　　＋　　　−α々　　ガ
ス 麦　　　　芽　　　才ｊ＋ｊ　　　　　　　　　　−一
シ　　　　　　ョ　　　　　　゛和、４　　　　　　　
　　　　　　　十　　　　　　−乳　　　　　　　　　
　　］唐　　　　　　　　　　−−トレハロース　　　
　　−− Ｄ　−ソ　ル　ビ　ッ　　１・　　　　　　　　　　　
　　　−−Ｄ−マンニット　　　　　　−− イ　　ノ　　シ　　ッ　　　ト　　　　　　　　　　　
　　　−−グ　　リ　セ　　　リ　　ン　　　　　　　
　　　　　−−デ　　ン　　　　ブ　　　ン　　　　　
　　　　　　　　−　　　　　−以」−の菌学的性質を
４］するｕＫ−＋５２１株をバーシーズ・マニュアル・
オブ・デクーミナテイブ・バクテリオロジ−（Ｂｅｒｇ
ｅｙ’ｓ　　Ｍａｎｕａ工ＯｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｖｅ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）第８版の記求注
がないことから、スピリルムｊ萬和１菌と同定し、ＵＫ
−１５２１ｍをヌピリルム・エヌピー　ＵＫ−１５２１
株（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｓｐ、　ＵＫ−１５２１）と
命名した。(Attitude to be carved into 0 acid tension: aerobic (1Ω0-F (oxidative bufermentative)
Test (Hugh Leifs)
on) method]: Production of acids and gases from oxidative crushing: Acid Gas L-arabinose − −D-xylose − − D-glucose − D-mannose ± − D-fructose − − D-galactose + −α Gas malt sai j + j - one shot ゛wa, 4
10 - Breasts
] Tang ---Trehalose
--D-sol bit 1・
--D-Mannit --- Inosit
−−Glycerin
--Den Bun
- The uK-+521 strain, which has the following mycological properties, was obtained using the Bersey's Manual
Of Decuminative Bacteriology (Berg)
ey's Manua EngineeringOfDeterminati
ve Bacteriology) Since there is no annotation in the 8th edition, it was identified as Spirillum jmanwa 1 bacterium.
-1521m by Nupirilum NP UK-1521
The strain was named Spirillum sp, UK-1521.

なお、本菌株ＵＫ−１５２１株は、昭和５８年５月６日
から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＢ
Ｉ）Ｋ受託番号ＦＥＢ、Ｍ　　Ｐ−７０７５として、ま
た昭和５８年２月９日から財団法人発酵研究所にＩＦＯ
１４２２７としてそれぞれ寄託されている。In addition, this strain UK-1521 has been used since May 6, 1981 by the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (FB).
I) K accession number FEB, MP-7075, and IFO to Fermentation Research Institute from February 9, 1988.
14227, respectively.

本発明に用いられるスピリルム属細菌は一般にその性状
が変化しやすく、たとえば紫外線、Ｘ線。The properties of the Spirillum bacteria used in the present invention are generally susceptible to changes, such as exposure to ultraviolet rays and X-rays.

化学５ＪｉｊＨ品（例、ニトロソグアニジン、エチルメ
タンスルホン酸）などを用いる人工父異手段で容易に変
異しうるものであり、どの様な変異株であっても本発明
の対象とするＴＡＮ−４５８の生産能全有するものはす
べて本発明に使用することができる。It can be easily mutated by artificial alienation methods using chemical products (e.g., nitrosoguanidine, ethyl methanesulfonic acid), etc., and any mutant strain of TAN-458, which is the subject of the present invention, is Anything with full production capacity can be used in the present invention.

ＴＡ　Ｎ　−４５８生産菌の培養に際しては、炭素源と
しては、たとえばグルコース、シュークロース、マルト
ース、屍糖蜜、グリセローμ、油脂類（例、大豆油、オ
リーブ油など）、有機酸類（例、クエン酸、コハク酸、
グルコン酸など）など菌が資化しうるものが適宜用いら
れる。窒素源とじてしては、たとえば大豆粉２幅火粉、
コーン・ヌティープ・リカー、乾）桑酵母、酵母エキス
、肉エキス・ペプトン・尿メモ、　ｒｉｌ、を酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム　ｊｐ化アンモニウム、リン
酸アンモニウムなどの有４に屋素化合物や無機硫黄化合
物が利用できる。また、勲椴塩としては、たとえば塩化
ナトリウム、塩化カリウム、炭酸力μシウム、硫酸マグ
ネシウム、リン酸−カリウム、リン酸二ナトリウムなど
の通常細菌の培う慎で必要な無機塩類が単独もしくは適
宜、組合せて使用される。When culturing TA N-458 producing bacteria, examples of carbon sources include glucose, sucrose, maltose, corpse molasses, glycerol μ, oils and fats (e.g. soybean oil, olive oil, etc.), organic acids (e.g. citric acid, succinic acid,
Gluconic acid, etc.) that can be assimilated by bacteria are used as appropriate. As a nitrogen source, for example, soybean powder,
Corn Nuteep Liquor, Dry) Mulberry yeast, yeast extract, meat extract, peptone, urine memo, ril, ammonium acid, ammonium nitrate, ammonium chloride, ammonium phosphate, etc. Compounds and inorganic sulfur compounds are used. can. In addition, Hunchu salt includes inorganic salts normally cultivated by bacteria, such as sodium chloride, potassium chloride, μsium carbonate, magnesium sulfate, potassium phosphate, and disodium phosphate, either singly or in appropriate combinations. used.

また、スビリ々ム属に、）％する抗生物質Ｔ　Ａ　Ｎ　
−４５８生産蘭の資化しうる硫黄化合吻、たとえば（克
酸塩（例、硫酸アンモニウムなど）、チオ伝６々塩（例
、チオ硫［俊アンモニウムなど）、亜（ゾ：Ｃ１俊塩（
例、亜硫酸アンモニウム）などの無機硫黄化合物＋　含
硫アミノ酸（例、シヌチン、システィン。In addition, antibiotics T A N
Assimilated sulfur compound proboscis of -458 production orchids, such as (kate salts (e.g., ammonium sulfate, etc.), thiodentagen salts (e.g., thiosulfate [ammonium, etc.),
Inorganic sulfur compounds such as ammonium sulfite) + sulfur-containing amino acids (e.g. synutin, cysteine).

Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン１．ＩＱ　）　＋ヒポ
タウリン、含の１ｆペプチド（例、グルタチオン）など
の有機硫黄化合物または、これらの混合物を培地に添加
すると目的物の生成量が増大する場合がある。L-thiazolidine-4-carvone 1. When organic sulfur compounds such as IQ)+hypotaurine, 1f peptides (eg, glutathione), or mixtures thereof are added to the medium, the amount of the target product produced may be increased.

また、硫酸第１鉄、硫ｅ銅などの道金属類、ビタミンＢ
ｌ　　、ビオチンなどのビタミン類なども必要に応じて
添加される。さらにシリコーンオイルやポリアルキレン
グリコールエーテμなどの消泡剤や界面活性剤を培地に
添加してもよい。その細菌の発育を助け、ＴＡＮ−４５
８の生産を促進するような有根物や無機物を適宜に添加
してもよい。In addition, metals such as ferrous sulfate and copper sulfate, and vitamin B
Vitamins such as l, biotin, etc. are also added as necessary. Furthermore, antifoaming agents and surfactants such as silicone oil and polyalkylene glycol ether μ may be added to the medium. Helps the growth of bacteria, TAN-45
Rooted substances or inorganic substances that promote the production of No. 8 may be added as appropriate.

培養方法としては、一般の抗生物質の生産方法と同様に
行なえばよく、固体培養でも面体培養でもよい。液体培
養の場合は静置培養、撹拌培養。The culturing method may be the same as a general antibiotic production method, and solid culture or hedron culture may be used. For liquid culture, static culture and agitation culture are used.

振盈垢養９通気培養などいずれを実施してもよいがとく
に通気攪拌培養が好ましい。又培養温度はおよそ１０し
〜３５ｔＥの範囲が好ましく、培地のｐＨは約４〜８の
範囲でおよそ８時間〜１６８時間、好ましくは２４時間
〜１４４時間培養する。Although any method such as shaking and culturing may be carried out, aerated agitation culture is particularly preferred. The culture temperature is preferably in the range of about 10 to 35 tE, the pH of the medium is in the range of about 4 to 8, and the culture is carried out for about 8 to 168 hours, preferably 24 to 144 hours.

培養物から目的とする抗生物１ＴＡＮ−４５８を採取す
るＯては微生物の生産する代謝物をその微生物の培養物
から採取するのに通常使用される分は手段が適宜利用さ
れる。たとえばＴ　Ａ　Ｎ−４５８は水溶性酸性物質で
、主としてＰ液中に含まれるので、−過または遠心分離
によって菌体を除去した後、その沖ａから一般に有効物
質を分離、精製。To collect the target antibiotic 1TAN-458 from the culture, any means normally used to collect metabolites produced by microorganisms from the culture of the microorganisms may be used as appropriate. For example, TAN-458 is a water-soluble acidic substance and is mainly contained in the P solution, so after removing the bacterial cells by filtration or centrifugation, the effective substance is generally separated and purified from the aqueous solution.

採取する方法を用いる。すなわち適当な溶媒にＡオン交
換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー
あるいは減圧泪Ａ６などの手段が単独あるいは任意の１
１旧序に組合わせて、または反復して用いられる。吸着
ハ：１としては活性炭、吸后性樹脂、陰イオン交倹１ｄ
昭（アニオ：）型）、粉末セルロース、シリカゲルなど
が用いられ、あるいは分子ふるいなどの１生質全待った
担体も用いられる。Use the method of collecting. That is, A6-exchange chromatography, molecular sieve chromatography, vacuum chromatography, etc. may be used alone or in combination with an appropriate solvent.
Used in combination or repeatedly. Adsorption c: 1 is activated carbon, absorbent resin, anion exchanger 1d
Anio type), powdered cellulose, silica gel, etc. are used, or a single-organic carrier such as a molecular sieve is also used.

浴用溶媒は担体の［・≦−ｆ１によって異なるがたとえ
ば水溶性＃仕り溶媒、アセトン、メタノール、エタノー
ル、プロパツール、ブタノール、イソプロパノ−／し、
イソブクノールなどの含ゐくｌ各面Ｉあるいはアルカ！
Ｊ　＋　７，５５　荊敲もしくは葡ｔ；あるいは有機塩
の水溶ｒ夜などが用いられる。The bathing solvent varies depending on the carrier [・≦−f1, but for example, water-soluble solvent, acetone, methanol, ethanol, propatool, butanol, isopropanol,
Contains such as isobuknol or alkaline!
J + 7,55 荊敲 or 葡 t; or aqueous organic salts are used.

さらに詳しく述べるならば、培養終了後培養液を遠心分
離し、灯体を除去する。当該物質が酸性物質であるため
、アニオン交換樹脂〔アンバーライト、工ＲＡ−４００
，４，０２，４１０（米国、ローム・アンド・ハース社
製）、ダウエックス−１（米国、ダウ・アンド・ケミカ
ル社製）、ダイヤイオン５Ａ−２１ＡおよびＣ（三菱化
成社製）〕などの０１−またはＡＣＯ−型が有利に利用
出来る。More specifically, after completion of the culture, the culture solution is centrifuged to remove the light body. Since the substance is an acidic substance, anion exchange resin [Amberlite, Engineering RA-400
, 4,02,410 (manufactured by Rohm and Haas, USA), DOWEX-1 (manufactured by Dow & Chemical, USA), Diaion 5A-21A and C (manufactured by Mitsubishi Kasei), etc. The 01- or ACO-type can be advantageously used.

吸着した当該物質の溶出液には食塩水または緩衝（４１
を用い有効物質を溶出する。溶出液の脱塩には活性炭を
用いるクロマトグラフィーを行い、含水アルコ−／ｌ／
等で溶出する。また希アンモニア水などを加えて中性な
いし微塩基性で溶出するとさらに良い結果が得られる。The eluate of the adsorbed substance is saline or buffer (41
The active substance is eluted using Chromatography using activated carbon was performed to desalt the eluate, and water-containing alcohol/l/
Elutes with etc. Further, even better results can be obtained by adding dilute ammonia water or the like to elute in neutral or slightly basic conditions.

有効物質の溶出液を減圧下泊緬し、濃縮液をアニオン交
換性分子ふるい樹脂、ＱＡＥ−セファデックスＡ　−２
５（ｃｌ型、ファルマシャ社製、スウェーデン）に吸着
させ、食塩水で溶出１分画する。活性区分を活性炭のク
ロマトグラフィーに付し、脱塩すると、化合物■のすｔ
ｌｌラムを含む溶液が得られる。また上記セファデック
スの代りに通常イオン・ペアード抽出法と称される方法
で濃縮液中の抗生物質を抽出することかできる。すなわ
ち、ｎ個を夜中の有効成分を４級アｐキ／Ｌ／（または
ベンジ／１／　）アンモニウムハライドを含むハロゲン
化炭化水素の溶液で抽出する。４殺アμキルアンモニウ
ムハフイドについてはたとえばトリーｎ−オクチル・メ
チル・アンモニウム・クロライド、ｎ−ヘキサデシール
ベンジルジメチルアンモニウム・クロライド、テトラ−
ｎ−ペンチルアンモニウム・ブロマイドなどが挙げられ
る。これらのアンモニウム塩は通常０．５〜６％の濃度
で用いられ、特に好ましくは１〜２％の濃度で用いられ
る。ハロゲン化炭化水素についてはたとえばメチレン・
ジクロライド、クロロフォアレムなどが溶剤として用い
られる。抽出液はアルカリ金属ハライド（例、ヨウ化ナ
トリウム、ヨウ化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリ
ウム）またはアルカリ土類金属ハライド（例、ヨウ化マ
グネシウム、ヨウ化亜鉛、ヨウ化カルシウム、臭化マグ
ネシウム、臭化カルシウム）を含む水溶液で処理される
と抗生物質は水溶液中にアルカリ金属塩またはアルカリ
土類金属塩として回収される。The eluate of the active substance was concentrated under reduced pressure, and the concentrated solution was treated with an anion exchange molecular sieve resin, QAE-Sephadex A-2.
5 (Cl type, manufactured by Pharmasha, Sweden), and eluted with saline and fractionated into one fraction. When the active fraction is subjected to activated carbon chromatography and desalted, the compound ■
A solution containing 11 rum is obtained. Furthermore, instead of using Sephadex, the antibiotic in the concentrate can be extracted by a method commonly called ion-paired extraction. That is, the active ingredients of the n active ingredients are extracted with a solution of halogenated hydrocarbon containing quaternary Apki/L/(or Bendi/1/) ammonium halide. For example, tri-n-octyl methyl ammonium chloride, n-hexadecylbenzyldimethyl ammonium chloride, tetra-
Examples include n-pentylammonium bromide. These ammonium salts are generally used in a concentration of 0.5 to 6%, particularly preferably 1 to 2%. Regarding halogenated hydrocarbons, for example, methylene
Dichloride, chlorophorem, etc. are used as solvents. The extract contains alkali metal halides (e.g., sodium iodide, potassium iodide, sodium bromide, potassium bromide) or alkaline earth metal halides (e.g., magnesium iodide, zinc iodide, calcium iodide, magnesium bromide, When treated with an aqueous solution containing calcium bromide), the antibiotic is recovered as an alkali metal salt or an alkaline earth metal salt in the aqueous solution.

アルカリ金属ハライドまたはアルカリ土類金属ハライド
の足は使用された四級アンモニウムハライドの１．１〜
２．０モル当量を用いれば良い。The alkali metal halide or alkaline earth metal halide foot is between 1.1 and 1.1 of the quaternary ammonium halide used.
2.0 molar equivalent may be used.

得られた水溶液を活性炭あるいは吸着性樹脂たとえばダ
イヤイオンＨＰ−２０（三菱化成社製）のクロマトグラ
フィに付し、脱塩すると、化合物■のアルカリ金属塩ま
たはアルカリ土類金属塩を含む溶液が得られる。以上述
べた方法などで抗生物質が未だ不純物を含む場合、いか
に述べろ方法が用いられる。すなわち、化合物Ｉを含む
水溶液はＦＡ　Ｗ（ｊされ、濃縮物は分取用高速液体ク
ロマトグラフィーに付され、さらに精製される。液体ク
ロマトグラフィーに用いられる担体としては逆層系の担
体たとえばＴＳＫゲμ〔東洋曹達社製〕、ＹＭＣゲル〔
京都クロマト社製〕などが用いられる。The resulting aqueous solution is subjected to chromatography using activated carbon or an adsorbent resin such as Diaion HP-20 (manufactured by Mitsubishi Kasei Corporation) and desalted to obtain a solution containing the alkali metal salt or alkaline earth metal salt of compound (1). . If the antibiotic still contains impurities using the methods described above, the methods described above are used. That is, an aqueous solution containing Compound I is subjected to FAW (j), and the concentrate is subjected to preparative high-performance liquid chromatography for further purification. μ [manufactured by Toyo Soda Co., Ltd.], YMC gel [
[manufactured by Kyoto Chromato Co., Ltd.] etc. are used.

移動層としては通常イオン・ペアード法で用いられる試
薬たとえば水酸化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム、リ
ン酸デトフーｎ−グチμアンモニウムなどを含む水溶液
が用いられる。分取画分は分析用高速液体クロマトグラ
フィーによって単一性カｋＮ　Ｂされ、シングルピーク
を示す両分が集められる。As the mobile phase, an aqueous solution containing reagents used in the ion-paired method, such as tetra-n-butylammonium hydroxide, detofu n-gutiammonium phosphate, etc., is used. The fractions are analyzed for uniformity by analytical high performance liquid chromatography, and both fractions showing a single peak are collected.

この画分中にヨウ化ナトリウムあるいは臭化ナトリウム
全加えると、化合物Ｉはナトリウム塩となる。得られた
溶液？活性炭のクロマトグラフィーに付し、脱塩後、溶
出液全滅圧下低温で製糊し、濃縮物にジエチルエーテル
などを加えると、粉末状の化合物■のナトリウム塩が得
られる。ただし、溶出液を濃縮し、７う糊液を厘ｒｌＪ
乾燥すると化合物工のナトリウム塩は直ちに仕打ｔする
。When all sodium iodide or sodium bromide is added to this fraction, Compound I becomes the sodium salt. The resulting solution? After subjecting to activated carbon chromatography and desalting, the eluate is made into a paste at low temperature under completely evaporated pressure, and diethyl ether or the like is added to the concentrate to obtain the powdered sodium salt of compound (1). However, the eluate should be concentrated and the glue solution should be
When dried, the sodium salt of the compound is immediately treated.

ＴＡＮ−４５８の（−Ｃ遁式はＴ　Ａ　１ｑ　−４５８
ナトリウム２ａと５Ｑ２７８６ｏ　　ｐ−ニトロ・ベン
ジルエステル（ＳＱ２７８６０ｐＩｑｎとν；各）の核
磁気共鳴スペクトル（）ｉ−Ｎ　Ｍ　Ｂ　）を比較する
ことによって容易に確認される（表１）。TAN-458's (-C ton style is T A 1q -458
This is easily confirmed by comparing the nuclear magnetic resonance spectra ()i-NMB) of sodium 2a and 5Q2786o p-nitrobenzyl ester (SQ27860pIqn and ν; each) (Table 1).

（以下余白） 表１　　　　δｐｐｍ　Ｊ（Ｈｚ） ※　Ｗ、Ｌ、　Ｐａｒｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ａ
ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　　３５＋６５３　　（１９８２
） また、ＴＡＮ−４５８の不斉次素は１個であるが、絶対
配位については下式で表わされる既知カルバペネム系抗
生物質Ｃ−１９３９３ｕ２Ｍ２！と円二色性（ＣＤ）ス
ペクトｌしを比較することによって容易に類推すること
が出来る。(Left below) Table 1 δppm J (Hz) * W, L, Parker et al, J, A
ntibiotics 35+653 (1982
) Also, TAN-458 has one asymmetric element, but the absolute coordination is expressed by the following formula, which is the known carbapenem antibiotic C-19393u2M2! It can be easily inferred by comparing the circular dichroism (CD) spectrum.

ＴＩ州−４５８Ｃ−１９３９３Ｈ２１４２すなわち化合
物工のナトリウム塩のＣＤスペクトルにおいては〔θ〕
１２°２１８　（−１２，１００）およ１ｎ び２５５（＋７，５１０）に特徴的なコツトン効果全示
し、一方、Ｃ−＋９３９３Ｈ２Ｍ２のそれにおいては〔
θ〕′１２°２３０　（−２７３００）および２５３ｎ
口 （＋　２３１００）ＬＳ、Ｈａｒａｄａら＋Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ　　＋３９、　γ５　　（＋９８３））に
コツトン効果を示す。In the CD spectrum of TI state-458C-19393H2142, that is, the sodium salt of compound engineering, [θ]
12°218 (-12,100), 1n and 255 (+7,510) all exhibit the characteristic Kotton effect, while that of C-+9393H2M2 [
θ〕'12°230 (-27300) and 253n
Mouth (+23100) LS, Harada et al.+Tetra
hedron +39, γ5 (+983)) shows a trickling effect.

これらはｅｔとんと同じＣＤスペクトル・パターンと、
（スわれるので、ＴＡＮ−４５８の５位の絶対配位はＩ
？５であると推足される。These have the same CD spectrum pattern as eton,
(The absolute configuration of the 5th position of TAN-458 is I
? It is estimated that it is 5.

後述の実施例２で得られたＴＡ　ｘｑ　−４５８ナトリ
ウム塩の物理化学的性状は以下の通りである。The physicochemical properties of TA xq-458 sodium salt obtained in Example 2 described below are as follows.

（１）形状；白色粉末状物質 （２）分子式（分子量）　ｉ　Ｃ７Ｈ６Ｎ０３Ｎａ（１
７５，１２）（３）紫外線吸収スペクト）ｖ（水中）を
入　　　　　　２５３±２ｎｍ（Ｆｉ１％　＝１５６　
ンｍａＸ　　　　　　　　　　　　　　　　ｌ！（４）
赤外部吸収スペクトｙｖ＜食塩板上）、主要ピー　り　
（ｌ：１７！−１）　二　３４５０．　　２９６０．　
　１７５０゜＋５８０．１４１０．１３４０．１２９０
．１２６０゜１１９０．１１３０．１０５０，１０２０
，９５０゜８９５、　８４０．　８００．　７８０．　
７５０゜７１０、　　６６０ （５）１Ｈ−１１７ＭＩ’ｌスペクトＮ　（４００’　
Ｈｚ　、Ｄ　２０中）（δｐｐｍＪ（Ｈ，）　　６．２
９（ＩＨ，ｔ、Ｊ＝２．６．Ｈ２）。(1) Shape: White powdery substance (2) Molecular formula (molecular weight) i C7H6N03Na (1
75,12) (3) Ultraviolet absorption spectrum) Enter v (in water) 253 ± 2 nm (Fi1% = 156
NmaX l! (4)
Infrared absorption spectrum yv<on salt plate), main peak
(l:17!-1) Two 3450. 2960.
1750°+580.1410.1340.1290
．． 1260°1190.1130.1050,1020
,950°895, 840. 800. 780.
750°710, 660 (5) 1H-117MI'l Spect N (400'
Hz, D20) (δppmJ(H,) 6.2
9 (IH, t, J=2.6.H2).

４．３０（ｌＨ５ｍ、　Ｈ５）、３．４６（ＩＨ，ｄｄ
、Ｊ−５，４゜１６．８．　Ｈ６ａ）、　３．０４（Ｉ
Ｈ，ｄｄ、　Ｊ＝２−９．１６．８゜Ｈ６ｂ）、２−９
０（ＩＨ，ｄｄａ、　Ｊ＝１８．８．２．６，９．６゜
Ｊａ）　、２．７７（ＩＬ　ａｄｄ、Ｊ＝１８．８．２
．６．８．４゜Ｈｌｂ） （６）　ＣＤスペクトル（水中）； 〔θ〕ｎｍ　　２１８（−１２，１００）および〔θ）
　　　２５５（＋　　７，５１０）ｍ （７）　ｉ６　Ｍクロマトグラフィー〔セルロースｆ　
２ｆ４１　。4.30 (IH5m, H5), 3.46 (IH, dd
, J-5,4゜16.8. H6a), 3.04(I
H, dd, J=2-9.16.8°H6b), 2-9
0 (IH, dda, J = 18.8.2.6, 9.6°Ja), 2.77 (IL add, J = 18.8.2
．． 6.8.4°Hlb) (6) CD spectrum (in water); [θ] nm 218 (-12,100) and [θ)
255 (+ 7,510) m (7) i6 M chromatography [cellulose f
2f41.

（来光化成社製）］ 溶媒系　　　　　　　　　　　　　　　Ｅｆｎ−プロパ
ツール：水（４：１）　　　　　　　　　　０．４６（
８）高速液体クロマトグラフィー（ウォーターヌ社製、
米国）１．ｌ！、ｉｉ体、マイクロボンダパックＣ，，
、移動層、０．００５７Ａテトラ−ｎ−１チルアンモニ
ウムハイＩ゛ロキザイド１０．０２）Δリンｔ’ｊ？　
Ｍ衝Ｍ　（ｐＨ７，８）　　、　２　ｑｉ　／　ｍｉｎ
Ｒｔ（ｍｉｎ）＝８．５ （９）溶解性：水、ジメチルヌμフォキサイドなどに易
溶。(manufactured by Raiko Kasei Co., Ltd.)] Solvent system Efn-propertool: water (4:1) 0.46 (
8) High performance liquid chromatography (manufactured by Waterne,
USA) 1. l! , ii body, Micro Bonder Pack C,,
, mobile phase, 0.0057A tetra-n-1 tylammonium high I゛loxide 10.02) Δphosphorus t'j?
M concentration (pH 7,8), 2 qi/min
Rt (min) = 8.5 (9) Solubility: Easily soluble in water, dimethyl nufoxide, etc.

００安定性：溶（包中では、ｐＨ５以−［の水浴顛およ
びメタノール中で直ちに分解、賑アルカリ注水溶液（ｐ
Ｈ７，５〜９）中ではかなシ安定。00 Stability: Decomposes immediately in a water bath with a pH of 5 or higher and in methanol in a solution (in a package)
H7, 5-9) It is stable in the middle.

次にＴＡＮ−４５８の生物学的性状について述べる。Ｔ
　Ａ　Ｎ−４５８すｔｌヮム塩の各種饋生物に対する抗
助スペクトルは！：Ｆｆｊ２表に示すとおシである。こ
の表から明らかなようにＴＡＮ−４５８はダラム陽性閉
、ダラム陰性しゴに有効でちる。Next, the biological properties of TAN-458 will be described. T
What is the anti-inflammatory spectrum of A N-458 STLM salt against various feeding organisms? : It is recommended to show it in the Ffj2 table. As is clear from this table, TAN-458 is effective against Durham-positive and Durham-negative cases.

ト　　■　　０　　Φ　　自　　へ　　■　　０　　ヘ
　　トー　　■　　の　　Ｏ■　　の　　−　　　　　
さ１　　ω（’ｌ’）　　　ＣＯＣｏ　　　Ｃ）　　　
０　　　へ　　　Ｎ　　　　　　　■　　　Ｏ■へへω
へ■　　Ｎ寸 本発明によって得られるＴＡＮ−４５８は上記のデータ
から明らかなようにダラム陽性菌、ダラム陰性菌などの
轍生物に対して強い生育阻止作用を示す。それ故に、Ｔ
ＡＮ−４５８はヒトおよび家畜（例、ウシ、ゲタ、ニワ
トリ）などのＮＩ菌感染症において殺菌剤として用いる
ことが出来る。■ 0 Φ self to ■ 0 he to ■ of O■ of -
Sa1 ω('l') COCo C)
0 to N ■ O■ to ω
As is clear from the above data, TAN-458 obtained by the present invention exhibits a strong growth-inhibiting effect on rutting organisms such as Durum-positive bacteria and Durum-negative bacteria. Therefore, T
AN-458 can be used as a fungicide in the treatment of NI bacterial infections in humans and livestock (eg, cows, geese, chickens), etc.

ＴＡＮ−４５８をたとえば大腸菌感染症の治療薬として
用いるには、たとえばＴＡＮ−４５８ナトリウム塩全生
理的食塩水に溶解して注射剤として非経口的に皮下また
は筋内内に１〜ｌ　ＯＯｌｎｇ／　ｋｑ／日、好１しく
は５〜５０１１９７にり７日投与する。To use TAN-458 as a therapeutic agent for E. coli infection, for example, TAN-458 sodium salt can be dissolved in total physiological saline and administered parenterally subcutaneously or intramuscularly as an injection at 1 to 1 OOlng/kq. /day, preferably 5 to 501197 days for 7 days.

また経口剤として、ｒＡｙ−４５８を乳糖と混合してカ
プセル剤とし、ＴＡＮ−４５８として１〜１００１′！
ｇ／　ｋｑ　／日、好ましくは５〜５０■／　ｋｇ／日
投与する。In addition, as an oral preparation, rAy-458 is mixed with lactose to form a capsule, and TAN-458 is prepared from 1 to 1001'!
g/kq/day, preferably 5-50 kg/kg/day.

また、ＴＡＮ−４５８は新しい医薬の合成中間体あるい
は試夢としても極めて有望な化合物である。Furthermore, TAN-458 is an extremely promising compound as a synthetic intermediate for new medicines or as a dream come true.

次に突施例をもってさらに詳細に本発明の詳細な説明す
るか、これによって本発明が限定されるものではない。Next, the present invention will be explained in more detail with reference to specific examples, but the present invention is not limited thereto.

バーセン１−は、特にことわ９のないかぎシ爪Ｊ資／容
Ｉｉｔ％を示す。Basen 1- indicates claw J capital/volume Iit% without particular mention.

実施例１ 栄養寒天斜ｍｉ上に生育させたスピリルム・エスピーＵ
　Ｋ　−１５２１（、ＦＥＲＭ　　Ｐ−７Ｑ７５　、　
　工ＦＯ１４２２７）株全、グルコース２％、可溶性ζ
５隻粉３％、ソイビーン・フラワー１％、コーン・ヌテ
ィープ・リカー１％、ポリペプトン（大玉栄養化学社製
）０，５％、食トム０．３％、沈ｔｆｉ性炭酸カルシウ
ム０．３％（ｐＨ６，５）からなる培地４０ｒｎｔを含
む２００＊を容エルレン・マイヤー・フラスコ７本に接
種して、２４℃で４８時間培養しその培養物をね（菌と
した。次にグルコース３％、可溶性鍼粉３％、プロフロ
（ブロククー・アンド・ギャンブル社製）１．５％、ソ
イ・ビーン・ミーｔｖ　ｌ、　５％、塩化コバルト２ｐ
ｐｍ　（ｐＨ６，５）からなる培地４Ｏｔｚｌを含む２
００ｖｌ容工μレン・マイヤー・フラスコ２５０本Ｋ、
ｎｊ＋　ｇ種ｒＨヲｌ　ｃｔ　ツツ接１１　Ｌ、１７℃
で３日間４フ・又酋坑養を行なった。この培養物を抵温
で遠心分離し、上清蔽約７．５ｅをえた。Example 1 Spirillum sp. U grown on nutrient agar slant mi
K-1521 (, FERM P-7Q75,
FO14227) strain, glucose 2%, soluble ζ
5 star flour 3%, soybean flour 1%, corn nutip liquor 1%, polypeptone (manufactured by Otama Nutritional Chemical Co., Ltd.) 0.5%, dietary tom 0.3%, precipitated TFI calcium carbonate 0.3% ( Seven Erlen-Meyer flasks were inoculated with 200 * containing 40 rnt of a medium consisting of 3% glucose (pH 6.5) and cultured at 24°C for 48 hours. Acupuncture powder 3%, Proflo (manufactured by Brokku & Gamble) 1.5%, Soy Bean Meat TV 1, 5%, cobalt chloride 2p
pm (pH 6,5) containing 2 Otzl
00vl Mulen Meyer flask 250 bottles K,
nj+ g type rHol ct Tutu connection 11 L, 17℃
We carried out 4-f/mata-mine cultivation for 3 days. The culture was centrifuged at low temperature to yield a supernatant of approximately 7.5e.

上滑液にアセトン＜３０ｇ）全加え、攪拌、濾過して得
られたアセトン抽出液を濃縮、濃縮岐（７１）をダウエ
ックスＩ　Ｘ　２　（ｃｉ−型）（２００ｒｓｌ　）の
カラムクロマトグツフィーに付した。有効区分を０１２
Ｊ直食塩水で溶出し、ｐｌ、５に補正後、アラかじめ希
アンモニア水で処理した活性炭（４００ｄ　）のカラム
に調製ｇ！を通し、水および２０％メクノール水で溶出
分画した。溶出液を濃＋ｌｉ’４　Ｌ、ｌ１廂１夜（７
５０ｇｌ）を２％トリーｎ−オクチルメチルアンモニウ
ム　クロライド／メチレンクロライド溶液で抽出し、メ
チレンクロライド抽出ＭＴｈ１．５％ヨウ化ナトリウム
水（５０Ｏｒ＋Ｊ）で再抽出した。Add all acetone (<30 g) to the supernatant synovial fluid, stir, and filtrate. Concentrate the obtained acetone extract and transfer the concentrated branch (71) to column chromatography using DOWEX IX2 (ci-type) (200 rsl). Attached. Valid category is 012
Elute with J saline, correct to pl, 5, and prepare on a column of activated carbon (400 d) that has been pretreated with dilute ammonia water. The mixture was eluted and fractionated with water and 20% Meknol water. The eluate was concentrated +li'4 L, 1 night (7
50gl) was extracted with 2% tri-n-octylmethylammonium chloride/methylene chloride solution and re-extracted with methylene chloride extracted MTh1.5% sodium iodide aqueous solution (50Or+J).

抽出八属ＫｐＨ８に調整し、調整液を前記と同様に調整
した活性炭（１５０ｍｌ）のカラムクロマトグラフィー
に何した。水で溶出された両分を分析用ＨＰＬＣに付し
、単一ピークを示す画分を低温下減圧蒸留し、油状の工
のナトリウム塩（３Ｃ１’）を得た。The pH of the extract was adjusted to 8, and the adjusted solution was subjected to column chromatography using activated carbon (150 ml) prepared in the same manner as above. Both fractions eluted with water were subjected to analytical HPLC, and the fraction showing a single peak was distilled under reduced pressure at low temperature to obtain an oily sodium salt (3C1').

実施例２ 大／ｌと例１と同様の朱件で培か、はれた培碧面のが（
心上清液（３，５ｇ）をｉ２Ｌ”、ａ例１と同様の方法
で処理し、１回目の活１・士疾クロマ１−グラフィーの
溶出液全ＱＡＥ−セフ１デックスＡ−２５（ＣＩ　　型
。Example 2 A swollen cultured green surface was cultivated with large / l and the same vermilion as in Example 1 (
Cardiac supernatant fluid (3.5 g) was treated with i2L'' in the same manner as in Example 1, and the eluate of the first active chroma 1-graph total QAE-Sef1Dex A-25 (CI Type.

ファルマンア社鯛、スウェーデン）（５０ｙｔ）のカラ
ムクロマトグラフィーに付した。抗生物質をＱ、　ｌ　
Ｍ食塩水で溶出５分両した。有効ＩＺ分（４５ｙｔ　）
を活性ｍのクロマトグラフィー（５０ｅｌに付し、水で
溶出９分画した。イア効Ｎ分（９６ｙｔのｌ梅歪１！ｊ
　ＪＹりをＴＳＫ−ゲル（厨ｎ仁舒込工莢半」」罎）を
ゼユ体とする分取用高速液１本クロマトグラフィーに−
付し、０．００５Ｍテトラグチルアンモニウムハイドロ
キサイド／　０．０２　ｙｈリンｌｅ’Ｌｊ　ｉ２Ｊ’
ｔｔＩＩＪ液（ｐＨ７，８）で溶出した。有効区分（５
５ゴ）甲にヨウ化ナトリウム（４１’Ｖ）を・加え、水
溶液を活性炭のクロマトグラフィーに付した。１拝出蔽
を低温下減圧蒸留、′ｊし、７ｊ：Ｊ　４’ｌ’ｆ物中
にジエチルエーテルを加えると化合！！２フエのナトリ
ウム塩（２２・・ｙ）が吸湿性のわＪ木として？鰺られ
た。The mixture was subjected to column chromatography using Farmana Co., Ltd. (Tai, Sweden) (50 yt). Antibiotics Q, l
Elution was continued for 5 minutes with M saline. Effective IZ minute (45yt)
was subjected to active m chromatography (50 el, and 9 fractions were eluted with water.
For preparative high-performance liquid single-bottle chromatography using JY-ri as TSK-gel (Chuunrenshugomekogohan') as Zeyu-body.
Attached, 0.005M tetragutylammonium hydroxide / 0.02 yh phosphorus le'Lj i2J'
It was eluted with ttIIJ solution (pH 7, 8). Valid category (5
5) Sodium iodide (41'V) was added to the instep, and the aqueous solution was subjected to activated carbon chromatography. 1) Distill the mixture under reduced pressure at low temperature, and then add diethyl ether to the 7j:J 4'l'f product and it will combine! ! Is the sodium salt of 2Fe (22...y) a hygroscopic tree? I was bitten.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

パｓ　＋　ｉｍはＴ／覧Ｎ−４５８ナトリウム塩の赤外
部吸収スペクトル（食塩板上）を、第２図は　Ｈ−）Ｉ
↑ｌＲスペクトル（４００ＭＨ２，量水中）をそれぞれ
示す。Pass + im is the infrared absorption spectrum (on a salt plate) of T/view N-458 sodium salt, and Figure 2 is H-) I
↑1R spectra (400MH2, volumetric water) are shown.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 スピリルム属に属する式 で示される化合物の生産菌全培地に培養し、培養物中に
上式の化合物を生成蓄積せしめ、これを採取することを
特徴とする上式の化合物またはその塩の製造法。[Scope of Claims] A compound of the above formula, which is characterized by culturing in a whole culture medium a microorganism producing a compound of the formula belonging to the genus Spirillum, producing and accumulating the compound of the above formula in the culture, and collecting the compound. or the method of manufacturing the salt.