JPS59169489A - ヒト培養株化細胞 - Google Patents
ヒト培養株化細胞Info
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- JPS59169489A JPS59169489A JP58043992A JP4399283A JPS59169489A JP S59169489 A JPS59169489 A JP S59169489A JP 58043992 A JP58043992 A JP 58043992A JP 4399283 A JP4399283 A JP 4399283A JP S59169489 A JPS59169489 A JP S59169489A
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- Japan
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- cells
- human
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規なヒト培養株化細胞に関する。
更に詳細には、コロニー形成刺激因子( C olon
y−stimulating factor : C
S F )を産生じ、且つ永代培養可能な、ヒト白血病
T細胞由来の培養株化到胞に関する。
y−stimulating factor : C
S F )を産生じ、且つ永代培養可能な、ヒト白血病
T細胞由来の培養株化到胞に関する。
骨髄系幹細胞に由来する顆粒球、マクロファージ系幹細
胞に作用し、これを成熟血球、すなわち顆粒球及び/又
はマクロファージに分化させる体液性因子としてCSF
が知られている( J ournalof I mI
nunoloaiCal M ethods, 4
2 、 2 5 3 −284 (1981)及び「血
液の病態生化学」第1〜3頁、1979年6月25日株
式会社朝倉書店発行参照〕。
胞に作用し、これを成熟血球、すなわち顆粒球及び/又
はマクロファージに分化させる体液性因子としてCSF
が知られている( J ournalof I mI
nunoloaiCal M ethods, 4
2 、 2 5 3 −284 (1981)及び「血
液の病態生化学」第1〜3頁、1979年6月25日株
式会社朝倉書店発行参照〕。
該CSFは、その活性に基づき、例えば癌治療中の患者
等における顆粒球、マクロファージの減少症、あるいは
種々の感染症の予防及び治療薬として、並びに骨髄移植
治療用薬剤として有用な物質である。
等における顆粒球、マクロファージの減少症、あるいは
種々の感染症の予防及び治療薬として、並びに骨髄移植
治療用薬剤として有用な物質である。
本発明者等は、ヒトC8Fの持続産生前を有する細胞株
の検索につき種々研究を重ねる過程において、本発明者
の山村及び原本によりすでに確立されたヒトT細胞株C
E N −A G R(P roe。
の検索につき種々研究を重ねる過程において、本発明者
の山村及び原本によりすでに確立されたヒトT細胞株C
E N −A G R(P roe。
N atl、A cad、s ci、、U SΔ Vo
l、 78 No。
l、 78 No。
12、+1117717〜7721 (1981))の
培養土消中にはC8F活性が認められる場合があること
を見出し、このC8F活性を指標にして更に選別培養(
クローニング)を繰返した結果、C8F産生能を有する
細胞を新たに単離することに成功し、これを培養株化細
胞として確立した。
培養土消中にはC8F活性が認められる場合があること
を見出し、このC8F活性を指標にして更に選別培養(
クローニング)を繰返した結果、C8F産生能を有する
細胞を新たに単離することに成功し、これを培養株化細
胞として確立した。
また上記細胞株は、生体外で長期安定に継代培養でき、
よって該S胞株を培養することにより、C8Fを均質な
状態で多量生産することが可能となることを見出した。
よって該S胞株を培養することにより、C8Fを均質な
状態で多量生産することが可能となることを見出した。
本発明は、これら新知見に基き完成されたものである。
すなわち本発明はヒト白血病T細胞由来の下記特性を有
するヒト培養株化細胞「AGR−ON」に係る。
するヒト培養株化細胞「AGR−ON」に係る。
a) 形態:リンパ様III胞
b) 増殖性=100μM8−アザグアニン(8−AG
)、10%牛脂児血清 (Fe2) 、5xl O−5M2−メルカプトエタノ
ール、100μo/mQストレプトマイシン、100単
位/鵬ペニシリンG150μG/IIIQゲンタマイシ
ン及び1mMグルタミンを含むRPML−1640培地
において良好に財殖する c) 11代培養;限界なく継代培養が可能である d) 凍結保存;液体窒素中で容易に長期保存できる e) 酵素欠損: HGPRT酵素欠損株であり、1X
10”Mヒボキサンチン、4× 10−7Mアミノプテリン及び1.6×10−5Mチミ
ジンを含むRPMI− 1640培地で死滅する f) 染色体数;43〜54本 g) 物質産生能;コロニー形成刺激因子(C8F)の
持続産生能を有する。
)、10%牛脂児血清 (Fe2) 、5xl O−5M2−メルカプトエタノ
ール、100μo/mQストレプトマイシン、100単
位/鵬ペニシリンG150μG/IIIQゲンタマイシ
ン及び1mMグルタミンを含むRPML−1640培地
において良好に財殖する c) 11代培養;限界なく継代培養が可能である d) 凍結保存;液体窒素中で容易に長期保存できる e) 酵素欠損: HGPRT酵素欠損株であり、1X
10”Mヒボキサンチン、4× 10−7Mアミノプテリン及び1.6×10−5Mチミ
ジンを含むRPMI− 1640培地で死滅する f) 染色体数;43〜54本 g) 物質産生能;コロニー形成刺激因子(C8F)の
持続産生能を有する。
上記本発明の細胞株は、ヒトC8Fの製造に有用であり
、これを純度よく人員に製造することができる。更に本
発明の細胞株のC8F産生能は長期にわたり安定であり
、低下が認められていない。
、これを純度よく人員に製造することができる。更に本
発明の細胞株のC8F産生能は長期にわたり安定であり
、低下が認められていない。
また本発明細胞株はHGPRT欠損株であり、ヒトT細
胞の細胞融合の親細胞としても有用であり、殊にその細
胞表面表現型が明確であることより、該細胞より誘導さ
れた融合細胞の選別時に該表現型を利用することができ
、好適なものである。
胞の細胞融合の親細胞としても有用であり、殊にその細
胞表面表現型が明確であることより、該細胞より誘導さ
れた融合細胞の選別時に該表現型を利用することができ
、好適なものである。
本発明の細胞株は、上記により特徴づけられるが、その
細胞学的及びその他の諸性質について詳述すれば次の通
りである。
細胞学的及びその他の諸性質について詳述すれば次の通
りである。
(1) 形態学的特徴
リンパ様細胞;径は正常ヒト末梢血T細胞の約2〜3倍
であり、はぼ球形をなす。細胞内における核の占める割
合は大で、原形質が僅かに認められる。原形質内には僅
かの顆粒が認められる。時として変形した細胞が存在す
る。
であり、はぼ球形をなす。細胞内における核の占める割
合は大で、原形質が僅かに認められる。原形質内には僅
かの顆粒が認められる。時として変形した細胞が存在す
る。
(2) 染色体数
本発明r A G R−ON Jの染色体数を以下の方
法により計算した。即ち対数増殖期にある細胞の培地に
コルセミド(シグマ社製)を0.1μg/帥となるよう
に添加した。2時間後、細胞浮遊液を遠心管に移し、1
000 r、l)、IOで5分間遠心し、沈査細胞上に
1%のクエン酸ナトリウム溶液約1鵬を加え、ゆるやか
に混ぜ合せた後、室温で約15分間放置した。固定液(
メタノール:氷酢酸=3:1)を静かに上底していき、
約10m12となったとき、静かに撹拌した。そのまま
で5分間放置後、遠心し、新しい固定液に細胞を懸濁し
た。
法により計算した。即ち対数増殖期にある細胞の培地に
コルセミド(シグマ社製)を0.1μg/帥となるよう
に添加した。2時間後、細胞浮遊液を遠心管に移し、1
000 r、l)、IOで5分間遠心し、沈査細胞上に
1%のクエン酸ナトリウム溶液約1鵬を加え、ゆるやか
に混ぜ合せた後、室温で約15分間放置した。固定液(
メタノール:氷酢酸=3:1)を静かに上底していき、
約10m12となったとき、静かに撹拌した。そのまま
で5分間放置後、遠心し、新しい固定液に細胞を懸濁し
た。
同様な操作を3回繰り返し、最後に固定液1〜2舗に細
胞を懸濁し、その細胞浮遊液をスライドグラス上に2〜
3滴づつ落とし、空気乾燥させた。
胞を懸濁し、その細胞浮遊液をスライドグラス上に2〜
3滴づつ落とし、空気乾燥させた。
1/15Mリン酸緩衝液(pH6,8)で約2%に希釈
したギムザ(G Iemsa )液(メルク社製)で1
5〜20分間染色し、水洗後乾燥した。顕微鏡上で60
倍のノーカバー用レンズを用いて、良く拡がった中期分
裂像50個を観察し、染色体数を計数した。
したギムザ(G Iemsa )液(メルク社製)で1
5〜20分間染色し、水洗後乾燥した。顕微鏡上で60
倍のノーカバー用レンズを用いて、良く拡がった中期分
裂像50個を観察し、染色体数を計数した。
その結果は、下記第1表に示す通りであり、本細胞の染
色体数は43〜54本の間にあり、平均45木である。
色体数は43〜54本の間にあり、平均45木である。
第1表
(3〉 T細胞特異抗原発現性
本発明rAGR−ONJの細胞表面表現型を、公知のヒ
ト白血病T細胞株CCRF−CEM(A T C,C寄
託No、CCLl 19) 、OEM−AGR(ATC
C寄託No、CRL−8081:Proc、Natl、
Acad、sci、、UsA、、Vol、 78゜NO
,12,Fll)、7717−7721 (1981)
)及びヒト末梢血T細胞と対比して検討した。
ト白血病T細胞株CCRF−CEM(A T C,C寄
託No、CCLl 19) 、OEM−AGR(ATC
C寄託No、CRL−8081:Proc、Natl、
Acad、sci、、UsA、、Vol、 78゜NO
,12,Fll)、7717−7721 (1981)
)及びヒト末梢血T細胞と対比して検討した。
即ち、各細胞を5X105個/ヒ淵度に調整し、10’
OμQの適当なモノクローナル抗体〔オーソミュー二O
Kシリーズモノクローナル抗体(Ortho P h
armaceutical Co、: Rarita
n。
OμQの適当なモノクローナル抗体〔オーソミュー二O
Kシリーズモノクローナル抗体(Ortho P h
armaceutical Co、: Rarita
n。
Newjarsey、 U S A )及びベクトン
デイツキンソン leuシリーズモノクローナル抗体(
B ecton & D 1ckinso
n : S unnyvale。
デイツキンソン leuシリーズモノクローナル抗体(
B ecton & D 1ckinso
n : S unnyvale。
Ca1Hornia 、 USA > )と4℃で30
分間反応させた後、細胞を5%FC8を含むMEM培地
で2回洗浄し、F I T C(fluoressei
nisothiocyar+ate)結合−ウサギ抗マ
ウス免疫グロブリン(マイルスーイエーダー社(イスラ
エル)袈)と反応させ、T細胞表面の特異抗原発現性を
間接免疫螢光抗体法により測定した。100個の細胞に
ついて調べた結果を下記第2表に示す。第2表より、本
発明のrAGR−ONJはT4、Leul及び1−eu
3a抗体に対して100%陽性であり、T3、T8及び
1eu2a抗体に対して陰性であった。
分間反応させた後、細胞を5%FC8を含むMEM培地
で2回洗浄し、F I T C(fluoressei
nisothiocyar+ate)結合−ウサギ抗マ
ウス免疫グロブリン(マイルスーイエーダー社(イスラ
エル)袈)と反応させ、T細胞表面の特異抗原発現性を
間接免疫螢光抗体法により測定した。100個の細胞に
ついて調べた結果を下記第2表に示す。第2表より、本
発明のrAGR−ONJはT4、Leul及び1−eu
3a抗体に対して100%陽性であり、T3、T8及び
1eu2a抗体に対して陰性であった。
L eu i陽性であることより、本細胞はT細胞株で
あり、またT4及び1−eu3a陽性であることより、
本細胞はヒトインデューサー/ヘルパー下リンパ球サブ
クラスに屈することが証明された。
あり、またT4及び1−eu3a陽性であることより、
本細胞はヒトインデューサー/ヘルパー下リンパ球サブ
クラスに屈することが証明された。
第2表
(4) ロゼツト形成
抗体補体感作ヒツジ赤血球(EΔC)におけるロゼツト
形成を、200個の細胞につき、400倍の顕微鏡下で
測定した結果、1%以下が陽性である。
形成を、200個の細胞につき、400倍の顕微鏡下で
測定した結果、1%以下が陽性である。
(5) B細胞、マクロファージマーカー発現性(a)
FITC−結合マウス抗ヒト−免疫グロブリン(B
ehrina werke AG、Marburo
)を用いた直接免疫螢光抗体法により解析した表面免疫
グロブリン(I(+)は、1%以下陽性である。
FITC−結合マウス抗ヒト−免疫グロブリン(B
ehrina werke AG、Marburo
)を用いた直接免疫螢光抗体法により解析した表面免疫
グロブリン(I(+)は、1%以下陽性である。
(b ) モノクローナル−抗−DR抗体(B ec
ton −D 1ckinson Co、 )を用い
た間接免疫螢光抗体法により解析したヒトHLA−DR
抗原(DR)は、1%以下陽性である。
ton −D 1ckinson Co、 )を用い
た間接免疫螢光抗体法により解析したヒトHLA−DR
抗原(DR)は、1%以下陽性である。
(C’) またビールス(E pSt13in−B
arr Virus )でトランスフオームしたヒトB
I!8胞株(CESS、スローン、ケタリング癌研究所
のビーターラルフ博士より入手)により免疫されたマウ
ス稗細胞とミエローマP3LI+(E Ibert E
1nstein CoCo11e ofMedia
insより入手)との細胞融合株から得た(Mikt
、 Y、 et al、、Journal ofT
mmunoloay 、 129 、1921 (1
982)参照〕モノクローナル抗ヒトB細胞抗体を用い
、間接免疫螢光抗体法により解析した、ヒトB細胞特異
抗体(B抗原)の表現性は、1%以下が陽性である。尚
上記抗体はB細胞乃至そのラインとは反応するが、■細
胞乃至そのラインとは反応しない。
arr Virus )でトランスフオームしたヒトB
I!8胞株(CESS、スローン、ケタリング癌研究所
のビーターラルフ博士より入手)により免疫されたマウ
ス稗細胞とミエローマP3LI+(E Ibert E
1nstein CoCo11e ofMedia
insより入手)との細胞融合株から得た(Mikt
、 Y、 et al、、Journal ofT
mmunoloay 、 129 、1921 (1
982)参照〕モノクローナル抗ヒトB細胞抗体を用い
、間接免疫螢光抗体法により解析した、ヒトB細胞特異
抗体(B抗原)の表現性は、1%以下が陽性である。尚
上記抗体はB細胞乃至そのラインとは反応するが、■細
胞乃至そのラインとは反応しない。
(d ) ヒ1−マクロファージ朕瘍刺胞株U937
細胞をBAIB/cマウスに免疫し、このBALB/c
マウスより得た+s B 細胞とミエローマ細胞Pat
J+とをポリエチレングリコールを用いて細胞融合させ
、ヒトマクロファージに対するモノクロナル抗体を産生
ずるマウスBハイブリドーマを得た(Maruyama
S、 et al−。
細胞をBAIB/cマウスに免疫し、このBALB/c
マウスより得た+s B 細胞とミエローマ細胞Pat
J+とをポリエチレングリコールを用いて細胞融合させ
、ヒトマクロファージに対するモノクロナル抗体を産生
ずるマウスBハイブリドーマを得た(Maruyama
S、 et al−。
Journal of Cl1nical ’
Immunology、β工。
Immunology、β工。
57(198,3>参照〕。この抗体はU937や正常
ヒトマクロファージには特異的に結合するが、正常ヒI
−T細胞やB細胞或いはヒ1〜T日胞ラインやヒl−B
細胞ラインとは反応しないものである。この抗体を用い
、同様に間接螢光抗体法により解析したヒ1へマクロフ
ァージ抗原の表現性は、1%以下が陽性である。
ヒトマクロファージには特異的に結合するが、正常ヒI
−T細胞やB細胞或いはヒ1〜T日胞ラインやヒl−B
細胞ラインとは反応しないものである。この抗体を用い
、同様に間接螢光抗体法により解析したヒ1へマクロフ
ァージ抗原の表現性は、1%以下が陽性である。
(6) 増殖性
8−7V’j7’ニン(8−AG、100μM)、io
oμ(+/m2ストレプトマイシン、100単位/&!
ペニシリンG、50/io/鶴ゲンタマイシン、10%
牛脂児血清(Fe2) 、5X10− ” M2−メル
カプトエタノール及び1mMグルタミンを含むRPMI
−1640培地(フロー ラボラトリ−社製)において
良好に増殖する。
oμ(+/m2ストレプトマイシン、100単位/&!
ペニシリンG、50/io/鶴ゲンタマイシン、10%
牛脂児血清(Fe2) 、5X10− ” M2−メル
カプトエタノール及び1mMグルタミンを含むRPMI
−1640培地(フロー ラボラトリ−社製)において
良好に増殖する。
(7) 増殖条件
一般に36〜38℃の温度条件下及びI)H゛1.2〜
7.3の条件下で良好に増殖する。また5%炭酸ガス及
び95%空気のインキュベーター内での培養が好適であ
る。
7.3の条件下で良好に増殖する。また5%炭酸ガス及
び95%空気のインキュベーター内での培養が好適であ
る。
く8) 縫代培養
限界なく継代培養が可能である。
(9) 凍結保存
20%FC3を含むRPMI−1640培地90%、ジ
メチルスルフオキシド(DMSO)10%の条件で凍結
し、液体窒素中で容易に長期保存できる。
メチルスルフオキシド(DMSO)10%の条件で凍結
し、液体窒素中で容易に長期保存できる。
(10) 8−アザグアニン(8−AG)耐性100
μMの8−AGに耐性があり、ヒポキサンチン(1x1
0−’M)、アミノプテリン(4XIO−7M)及びチ
ミジン(1,6X10−5M)を含む培地(HAT培地
)で死滅する。この結果よりr A G RON Jは
、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ(HGPRT)欠損株であることが明白である
。
μMの8−AGに耐性があり、ヒポキサンチン(1x1
0−’M)、アミノプテリン(4XIO−7M)及びチ
ミジン(1,6X10−5M)を含む培地(HAT培地
)で死滅する。この結果よりr A G RON Jは
、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ(HGPRT)欠損株であることが明白である
。
(11) マイトジェン反応性
]ンカナバリンΔ(ConA) 10〜100μ0/I
iQの添加及び植物性赤血球凝集水、フイトヘモアグル
チニン(P HA )の1〜10%添加により、***増
殖は部分的に抑制される。ポラクライードマイトジェン
(P W M )及びプロティンA(Pr。
iQの添加及び植物性赤血球凝集水、フイトヘモアグル
チニン(P HA )の1〜10%添加により、***増
殖は部分的に抑制される。ポラクライードマイトジェン
(P W M )及びプロティンA(Pr。
Δ)は、いかなる潤度においても本細胞株の***1!!
殖に影響を与えない。
殖に影響を与えない。
本発明細胞株rAGR−ONJは、8−ΔG耐性ヒト白
血病T細胞より、常法に従って、前記した特性を有する
[ΔGR−ONJをクローニングすることにより収得で
きる。上記8−AG耐性ヒト白血病T細胞は、常法、例
えば特開昭57−206383号に記載の方法に従って
製造され、これは公知のヒ1〜白血病T Ili R1
例えばCCRF−OEM (J、 Kaplan et
ah、Exa、 Med、。
血病T細胞より、常法に従って、前記した特性を有する
[ΔGR−ONJをクローニングすることにより収得で
きる。上記8−AG耐性ヒト白血病T細胞は、常法、例
えば特開昭57−206383号に記載の方法に従って
製造され、これは公知のヒ1〜白血病T Ili R1
例えばCCRF−OEM (J、 Kaplan et
ah、Exa、 Med、。
139.1070〜1076 (1974))を起源と
し、これを10%FO3含有RPMI−1640培地に
8−AGを添加した培地で培養し、8−AG添加量を順
次増加させていくことにより取得するものである。より
具体的には例えばまず2μMの8−AGを添加した培地
で1週間培養し、生存細胞を次に16μMの8−AGを
含む培地で1週間培養し、その後同様に8−AG濃度を
2倍づつ増加させた培地で順次培養し、最終的に8−A
G濃度を100μMとした培地に生存する8−AG耐性
細胞株を使用すればよく、該細胞株の代表例としては、
例えば前述のCEM AG”(ATCC寄託No、C
RL−8081)を挙げることができる。
し、これを10%FO3含有RPMI−1640培地に
8−AGを添加した培地で培養し、8−AG添加量を順
次増加させていくことにより取得するものである。より
具体的には例えばまず2μMの8−AGを添加した培地
で1週間培養し、生存細胞を次に16μMの8−AGを
含む培地で1週間培養し、その後同様に8−AG濃度を
2倍づつ増加させた培地で順次培養し、最終的に8−A
G濃度を100μMとした培地に生存する8−AG耐性
細胞株を使用すればよく、該細胞株の代表例としては、
例えば前述のCEM AG”(ATCC寄託No、C
RL−8081)を挙げることができる。
上記rAGR−ONJのクローニングは、常法に従って
行なえばよく、より詳細には、例えばソフトアガー法(
M ethods in E nzymoloay
。
行なえばよく、より詳細には、例えばソフトアガー法(
M ethods in E nzymoloay
。
Vol、73.D 1〜45(1’981))に従い実
施できる。即ち200〜2000/rrQに希釈した8
胞浮遊液を、2倍口度の培養液(8AG添加RPMI
1640等)で作製し、直ちに、37℃に加温した0
、3%ソフトアガー(Dirc。
施できる。即ち200〜2000/rrQに希釈した8
胞浮遊液を、2倍口度の培養液(8AG添加RPMI
1640等)で作製し、直ちに、37℃に加温した0
、3%ソフトアガー(Dirc。
Lab、、Detroit、 M T 、 )液を等優
に混ぜ合せ、プラストツクディツシュにブレーティング
する。
に混ぜ合せ、プラストツクディツシュにブレーティング
する。
そのきはディツシュの大きさによりまちまちであるが、
直径3cmのディツシュに対しては1〜1.5鵬、5〜
6囲のものには2〜2.5Ir:Q加えるのがよい。培
養開始後10〜14日位で肉眼でも分るコロニーを形成
してくる。この時点で、先を細くシたパスツールピペッ
トを用いて、俄立顕微鏡上で1個のコロニーだjすを吸
引でひろいあげ、予め用意しておいた°96穴平底培養
プレー1〜内の培養液に移して培養づる。
直径3cmのディツシュに対しては1〜1.5鵬、5〜
6囲のものには2〜2.5Ir:Q加えるのがよい。培
養開始後10〜14日位で肉眼でも分るコロニーを形成
してくる。この時点で、先を細くシたパスツールピペッ
トを用いて、俄立顕微鏡上で1個のコロニーだjすを吸
引でひろいあげ、予め用意しておいた°96穴平底培養
プレー1〜内の培養液に移して培養づる。
得られた各コロニーは、そのC3F産生能を通常の方法
〔例えばJ ournal of I mmuno
logicalvethods、 42 pp253
〜284 (1981) )に従い検索して本発明のr
AGR−ONJを単一の細胞株として分離する。
〔例えばJ ournal of I mmuno
logicalvethods、 42 pp253
〜284 (1981) )に従い検索して本発明のr
AGR−ONJを単一の細胞株として分離する。
かくして得られる本発明の細胞株[△GR−ONJは、
前述の諸性性を有し、これは、出願人によって、198
3年1月24日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション(ATCC)にrATCC寄託No、CR
I −8199Jとして受託されている。
前述の諸性性を有し、これは、出願人によって、198
3年1月24日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション(ATCC)にrATCC寄託No、CR
I −8199Jとして受託されている。
上記本発明の細胞株rAGR−ONJがらのC8Fの製
造は、これを常法に従って、組織培養し、培養上清から
分離する方法により実施される。
造は、これを常法に従って、組織培養し、培養上清から
分離する方法により実施される。
上記組織培養は、通常の栄養培地中で行なわれる。栄養
培地としては、特に限定なく、この種の細胞培益に頻用
される、例えばRPMI−1640、MEM等をFe2
で改質した培地等を挙げることができる。培養条件とし
ても特に限定されず、例えば細胞濃度1〜1o×105
個/鶴程度で、前記した増殖条件に従って通常3日程度
18養すればよい。か(してt8養液中に、C3Fが生
産される。該C8Fは常法に従い例えば、塩析、クロマ
トグラフィー、電気泳動法、透析等の物理化学的手段に
より更に精製することができる。
培地としては、特に限定なく、この種の細胞培益に頻用
される、例えばRPMI−1640、MEM等をFe2
で改質した培地等を挙げることができる。培養条件とし
ても特に限定されず、例えば細胞濃度1〜1o×105
個/鶴程度で、前記した増殖条件に従って通常3日程度
18養すればよい。か(してt8養液中に、C3Fが生
産される。該C8Fは常法に従い例えば、塩析、クロマ
トグラフィー、電気泳動法、透析等の物理化学的手段に
より更に精製することができる。
かくして本発明細胞[ΔGR−0陪Jの利用によれば、
非常に容易に高収率、高純度で所望のC8Fを収得でき
、該C3Fの大ば生産が工業的規模で実施できる。しか
もかくして得られるC S Fは活性が強く、毒性が低
く、更にその製造工程での活性低下もなく、従来公知の
C8Fと同様の用途に、より有利に利用できるものであ
る。
非常に容易に高収率、高純度で所望のC8Fを収得でき
、該C3Fの大ば生産が工業的規模で実施できる。しか
もかくして得られるC S Fは活性が強く、毒性が低
く、更にその製造工程での活性低下もなく、従来公知の
C8Fと同様の用途に、より有利に利用できるものであ
る。
以下、本発明の詳細な説明するため、実施例及び試験例
を掲げる。
を掲げる。
実施例1 rAGR−ONJの製造
CEM−AGR(ΔTCC寄託NO,CRL−8081
〕を、100μM8−ΔGを含む同一培地にてi oo
o個の/岐に希釈して用胞浮遊液を作成し、直ちに、3
7℃に加温した0、3%ソ71へアガー(ディフコ社製
)液に混合し、プラスチックディツシュ(φ3C1lI
)に約1i+l!l!ずつブレーティングする。培養1
4日後に形成してくるコロニーをパスツールピペットを
用いて、倒立顕微鏡下にひろいあげ、96穴平底培養プ
レー1〜内の上記培養液に移して培養した。得られた各
クローンは、後記試験例に基づき、その培養上清のC8
F活性を測定して、本発明の細胞株「ΔGR−ONJを
得た。この株はその後同潟度(100μM)の8− A
G ヲ含むRPM T−164Q+10%FC8培地
にて強いi?5¥4を示し、この培地で継代培養により
推持されている。またその細胞学的及びその他の特性は
前述した通りであった。
〕を、100μM8−ΔGを含む同一培地にてi oo
o個の/岐に希釈して用胞浮遊液を作成し、直ちに、3
7℃に加温した0、3%ソ71へアガー(ディフコ社製
)液に混合し、プラスチックディツシュ(φ3C1lI
)に約1i+l!l!ずつブレーティングする。培養1
4日後に形成してくるコロニーをパスツールピペットを
用いて、倒立顕微鏡下にひろいあげ、96穴平底培養プ
レー1〜内の上記培養液に移して培養した。得られた各
クローンは、後記試験例に基づき、その培養上清のC8
F活性を測定して、本発明の細胞株「ΔGR−ONJを
得た。この株はその後同潟度(100μM)の8− A
G ヲ含むRPM T−164Q+10%FC8培地
にて強いi?5¥4を示し、この培地で継代培養により
推持されている。またその細胞学的及びその他の特性は
前述した通りであった。
試楡例
(1) 上記実施例1で得たrAGR−ONJをRPM
I−1640+10%FC3培地ヲ用イ1”5X10
5個/四濃度に調整し、これをプラスチック日胞培芸液
用フラスコ(コーニング社製、250岳2/70譜)に
て3日間、37℃下、5%炭酸ガスインキュベーター内
で培養した。遠心分路して得た培養上清10鶴を、80
%の飽和硫安処理後、沈澱物を遠心分離して採取し、こ
れを1回の生理食塩水に溶解した。これを以下の試験に
供した(AGR−ONサンプル)。
I−1640+10%FC3培地ヲ用イ1”5X10
5個/四濃度に調整し、これをプラスチック日胞培芸液
用フラスコ(コーニング社製、250岳2/70譜)に
て3日間、37℃下、5%炭酸ガスインキュベーター内
で培養した。遠心分路して得た培養上清10鶴を、80
%の飽和硫安処理後、沈澱物を遠心分離して採取し、こ
れを1回の生理食塩水に溶解した。これを以下の試験に
供した(AGR−ONサンプル)。
(2) C8F活性
上記AGRONサンプルのC8F活性を、イアン(Ia
n)等の方法に準じて試躊した〔、)。
n)等の方法に準じて試躊した〔、)。
Tmmunol、 128.pl 68 (1,982
) )。
) )。
下記培地を使用した。
0培地1(2倍濃度λ4 E M培地);M E fv
l粉末(フロー社製) 2.68qメイロン (
大塚製桑社製)10−6m2ペニシリンG
20000単位ストレプトマイシン 20m。
l粉末(フロー社製) 2.68qメイロン (
大塚製桑社製)10−6m2ペニシリンG
20000単位ストレプトマイシン 20m。
ゲンタマイシン 10mg2−メルカプト
エタノール 5X10−5M蒸溜水 全体を1
00館とする90培地II(MEM培地);・ M E M扮末 13.=i。
エタノール 5X10−5M蒸溜水 全体を1
00館とする90培地II(MEM培地);・ M E M扮末 13.=i。
メイロン 52.9四
ペニシリン0 100000単位
ス1〜レプトマイシン 100mg
ゲンタマイシン 50mG
2−メルカプトエタノール 5X10−5M蒸溜水
全体を1000謡とするRO培地■: 培地■30I+12 培地II 20購 FC8(イルビン サイエンティフィック社、(〕SΔ
製)、20 ■Q 1%アガー(ディフコ社製)をオー1〜クレープ中溶解
し、43℃に保温する。この10IIII2を37℃に
保温した上記培地I[[23,3mに加え混和した後3
7℃に保温する。
全体を1000謡とするRO培地■: 培地■30I+12 培地II 20購 FC8(イルビン サイエンティフィック社、(〕SΔ
製)、20 ■Q 1%アガー(ディフコ社製)をオー1〜クレープ中溶解
し、43℃に保温する。この10IIII2を37℃に
保温した上記培地I[[23,3mに加え混和した後3
7℃に保温する。
BALB/c系マウス大腿骨より採取した骨髄細胞(B
MC)を、ハンクス液で2回洗浄後、これを前記培地■
を用いて107個/鵬に調整し、その1戒を上記寒天培
地に加え、混和した後37℃に保つ(2,9X105個
/鶴)。この1却を段階希釈したAGR−ONサンプル
の0.1脱を入れたシャーレ(φ=3.5cm; Fa
lcom3001)に加え手早く混和し、室温で培地が
固まるまで放置後、37℃で炭酸ガスインキュベーター
内で培養を開始する。培養10日後に形成されたコロニ
ー数を計測した。結果を第1図に示す。
MC)を、ハンクス液で2回洗浄後、これを前記培地■
を用いて107個/鵬に調整し、その1戒を上記寒天培
地に加え、混和した後37℃に保つ(2,9X105個
/鶴)。この1却を段階希釈したAGR−ONサンプル
の0.1脱を入れたシャーレ(φ=3.5cm; Fa
lcom3001)に加え手早く混和し、室温で培地が
固まるまで放置後、37℃で炭酸ガスインキュベーター
内で培養を開始する。培養10日後に形成されたコロニ
ー数を計測した。結果を第1図に示す。
図中、@軸は、す゛ンプルの最終希釈を、縦軸はブレー
1〜当りのコロニー数を示す。尚図中の各折れ線は、夫
々以下のことを示す。
1〜当りのコロニー数を示す。尚図中の各折れ線は、夫
々以下のことを示す。
e−@;AGR−ONサンプル
ローロ:ヒ1〜牌細胞より調製されたサンプル(牌臥摘
出手術を受けた愚者より供与されたヒト牌藩より浮遊細
胞を作?J L、、これを1×10θ個/戒培地(1%
FC8加 R’PMI−1640培地)の細胞口度に調製し、0.
1%PH△−P(ディフコ社)にて2日間刺激し、以後
前記(1)と同様にして得た]ントロールリンプル。
出手術を受けた愚者より供与されたヒト牌藩より浮遊細
胞を作?J L、、これを1×10θ個/戒培地(1%
FC8加 R’PMI−1640培地)の細胞口度に調製し、0.
1%PH△−P(ディフコ社)にて2日間刺激し、以後
前記(1)と同様にして得た]ントロールリンプル。
ムーA:ヒト末梢血単核球より調製されたサンプル(健
常人末梢血より、比重密度遠心分画法により;単核球に
分離蹟閂し、これを1%FC8を加えたRPMI− 1640培地に1×10ε個/閥の紹胞溌度に調製し、
0.1%P HA−Pにて2日間刺激し、以後前記(1
)と同様にして得たコン1−ロールサンプル)。
常人末梢血より、比重密度遠心分画法により;単核球に
分離蹟閂し、これを1%FC8を加えたRPMI− 1640培地に1×10ε個/閥の紹胞溌度に調製し、
0.1%P HA−Pにて2日間刺激し、以後前記(1
)と同様にして得たコン1−ロールサンプル)。
第1図より、ΔGR−ONの培養上清はC3F活性を有
することが判る。尚、計測した]ロニーは、形態学的観
察の結果、顆粒球及びマクロファージであった。
することが判る。尚、計測した]ロニーは、形態学的観
察の結果、顆粒球及びマクロファージであった。
(3) 親細胞との比較
前記(1)ど同様にして得たサンプルの0.2鶴及びC
CRF−CEM (ATCC,CCL119)を用いて
同様にして得た対照サンプルの0.2譜の夫々を用いて
、上記(2)と同様にしてC8F活性を測定した。
CRF−CEM (ATCC,CCL119)を用いて
同様にして得た対照サンプルの0.2譜の夫々を用いて
、上記(2)と同様にしてC8F活性を測定した。
結果を下記第3表に示す。
第 3 表
セルライン コロニー数/プレートAGR−ON
307 CCRF−CEM 0 (4) ゲルン濾過 前記(2)の各シンプルをウルトロゲルAC△54 (
2,2x90cn+、LKB社、ストックフィルム、ス
ウェーデン)カラムにて分画した。カラムは0.5M
Na (1,0,01Mリン酸v::衝液、0.05
%ポリエチレングリ]−ルー6000であらかじめ平衡
化した。19pJ2/hrの流速で2綬づ5つの分画を
行ない、蛋白の分■状況を280mμでの吸光度を測定
することによりモニターした。各分画のC8F活性は前
述の方法で測定した。
307 CCRF−CEM 0 (4) ゲルン濾過 前記(2)の各シンプルをウルトロゲルAC△54 (
2,2x90cn+、LKB社、ストックフィルム、ス
ウェーデン)カラムにて分画した。カラムは0.5M
Na (1,0,01Mリン酸v::衝液、0.05
%ポリエチレングリ]−ルー6000であらかじめ平衡
化した。19pJ2/hrの流速で2綬づ5つの分画を
行ない、蛋白の分■状況を280mμでの吸光度を測定
することによりモニターした。各分画のC8F活性は前
述の方法で測定した。
結果を第2〜4図に示す。
各図中、縦軸は、C8F活性(コロニー′!A’1 /
プレート)を、横@はフラクションNo、を示ず。また
第2図はAGR−ONNシンブル、釘3図はヒ1〜末梢
血単核球より調製したサンプルを、及び第4図はヒ1〜
后B厨胞より調製した4ノ゛ンプルを夫々示す。
プレート)を、横@はフラクションNo、を示ず。また
第2図はAGR−ONNシンブル、釘3図はヒ1〜末梢
血単核球より調製したサンプルを、及び第4図はヒ1〜
后B厨胞より調製した4ノ゛ンプルを夫々示す。
標準分子亡キツ(〜(ファルマシア社薯)より11F定
したΔGR−ON由来のC8Fの分子量は、約8400
0であり、これは、正常ヒ1へ末梢血115核球及びヒ
トRIffi細胞由来のC3Fの分子量とほぼ一致した
。
したΔGR−ON由来のC8Fの分子量は、約8400
0であり、これは、正常ヒ1へ末梢血115核球及びヒ
トRIffi細胞由来のC3Fの分子量とほぼ一致した
。
第1図は本発明rAGR−ONJ細胞から得られるサン
プルのC8F活性を示すグラフ及び第2〜4図は、上記
サンプル及びフン1〜ロールサンプルのゲル濾過による
溶出パターンを示す。 (以 上) 代理人 弁理士 三 枝 英 二 第1図 最琳双借 第 2 図 フラクションN。 第3図 フラツジg >N O。 第4図 フラツジq、>N。
プルのC8F活性を示すグラフ及び第2〜4図は、上記
サンプル及びフン1〜ロールサンプルのゲル濾過による
溶出パターンを示す。 (以 上) 代理人 弁理士 三 枝 英 二 第1図 最琳双借 第 2 図 フラクションN。 第3図 フラツジg >N O。 第4図 フラツジq、>N。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ■ 下記の特性を有するヒト白血病TI胞由来のヒト培
養株化細胞rAGR−ONJ。 a) 形態;リンパ様細胞 b) 増殖性; 10CIM8−7ザグアニン、10%
牛脂児血清、5X10−5M2−メルカプトエタノール レプトマイシン、100単位/凶ペニシリンG150μ
(1/mI2ゲンタマイシン及び1m Mグルタミンを
含むRPMI−1640培地において良好に増殖する O) 縫代培養;限界なく継代培養が可能である d) 凍結保存;液体窒素中で容易に長期保存できる e) 酵素欠損; HGPRT酵素欠損株であり、IX
lo−’Mヒボキザンチン、4× 10−7Mアミノプテリン及び1.6×10−5Mチミ
ジンを含むRPMI− 1640培地で死滅する f) 染色体数;43〜54本 g) 物質産生能:コロニー形成刺激因子の持続産生能
を有する。
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58043992A JPS59169489A (ja) | 1983-03-15 | 1983-03-15 | ヒト培養株化細胞 |
US06/586,558 US4675291A (en) | 1983-03-15 | 1984-03-06 | Human cultured cell line |
EP84102681A EP0118915B1 (en) | 1983-03-15 | 1984-03-12 | Human cultured cell line |
DE8484102681T DE3482843D1 (de) | 1983-03-15 | 1984-03-12 | Gezuechtete menschlische zellinie. |
CA000449513A CA1218616A (en) | 1983-03-15 | 1984-03-13 | Human cultured cell line producing colony stimulating factor |
AU25635/84A AU561081B2 (en) | 1983-03-15 | 1984-03-14 | Human cultured cell line and colony-stimulating factor produced therein |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58043992A JPS59169489A (ja) | 1983-03-15 | 1983-03-15 | ヒト培養株化細胞 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS59169489A true JPS59169489A (ja) | 1984-09-25 |
JPH0530437B2 JPH0530437B2 (ja) | 1993-05-10 |
Family
ID=12679210
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58043992A Granted JPS59169489A (ja) | 1983-03-15 | 1983-03-15 | ヒト培養株化細胞 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4675291A (ja) |
EP (1) | EP0118915B1 (ja) |
JP (1) | JPS59169489A (ja) |
AU (1) | AU561081B2 (ja) |
CA (1) | CA1218616A (ja) |
DE (1) | DE3482843D1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0261592A1 (en) | 1986-09-17 | 1988-03-30 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Gene coding for human colony-stimulating factors |
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JPS61227526A (ja) * | 1984-07-25 | 1986-10-09 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 新規なコロニー刺激因子 |
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US5104650A (en) * | 1985-02-05 | 1992-04-14 | Cetus Corporation | Uses of recombinant colony stimulating factor-1 |
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JPH0618781B2 (ja) * | 1986-10-18 | 1994-03-16 | 中外製薬株式会社 | 感染症治療剤 |
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-
1983
- 1983-03-15 JP JP58043992A patent/JPS59169489A/ja active Granted
-
1984
- 1984-03-06 US US06/586,558 patent/US4675291A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-03-12 EP EP84102681A patent/EP0118915B1/en not_active Expired
- 1984-03-12 DE DE8484102681T patent/DE3482843D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1984-03-13 CA CA000449513A patent/CA1218616A/en not_active Expired
- 1984-03-14 AU AU25635/84A patent/AU561081B2/en not_active Ceased
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CA1218616A (en) | 1987-03-03 |
JPH0530437B2 (ja) | 1993-05-10 |
EP0118915A2 (en) | 1984-09-19 |
US4675291A (en) | 1987-06-23 |
DE3482843D1 (de) | 1990-09-06 |
EP0118915A3 (en) | 1987-05-13 |
EP0118915B1 (en) | 1990-08-01 |
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