JPS59169489A - ヒト培養株化細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なヒト培養株化細胞に関する。

更に詳細には、コロニー形成刺激因子（　Ｃ　ｏｌｏｎ
ｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　：　Ｃ　
Ｓ　Ｆ　）を産生じ、且つ永代培養可能な、ヒト白血病
Ｔ細胞由来の培養株化到胞に関する。

骨髄系幹細胞に由来する顆粒球、マクロファージ系幹細
胞に作用し、これを成熟血球、すなわち顆粒球及び／又
はマクロファージに分化させる体液性因子としてＣＳＦ
が知られている（　Ｊ　ｏｕｒｎａｌｏｆ　　Ｉ　ｍＩ
ｎｕｎｏｌｏａｉＣａｌ　　Ｍ　ｅｔｈｏｄｓ，　４　
２　、　２　５　３　−２８４　（１９８１）及び「血
液の病態生化学」第１〜３頁、１９７９年６月２５日株
式会社朝倉書店発行参照〕。

該ＣＳＦは、その活性に基づき、例えば癌治療中の患者
等における顆粒球、マクロファージの減少症、あるいは
種々の感染症の予防及び治療薬として、並びに骨髄移植
治療用薬剤として有用な物質である。

本発明者等は、ヒトＣ８Ｆの持続産生前を有する細胞株
の検索につき種々研究を重ねる過程において、本発明者
の山村及び原本によりすでに確立されたヒトＴ細胞株Ｃ
Ｅ　Ｎ　−Ａ　Ｇ　Ｒ（Ｐ　ｒｏｅ。

Ｎ　ａｔｌ、Ａ　ｃａｄ、ｓ　ｃｉ、、Ｕ　ＳΔ　Ｖｏ
ｌ、　７８　　Ｎｏ。

１２、＋１１１７７１７〜７７２１　（１９８１））の
培養土消中にはＣ８Ｆ活性が認められる場合があること
を見出し、このＣ８Ｆ活性を指標にして更に選別培養（
クローニング）を繰返した結果、Ｃ８Ｆ産生能を有する
細胞を新たに単離することに成功し、これを培養株化細
胞として確立した。

また上記細胞株は、生体外で長期安定に継代培養でき、
よって該Ｓ胞株を培養することにより、Ｃ８Ｆを均質な
状態で多量生産することが可能となることを見出した。

本発明は、これら新知見に基き完成されたものである。

すなわち本発明はヒト白血病Ｔ細胞由来の下記特性を有
するヒト培養株化細胞「ＡＧＲ−ＯＮ」に係る。

ａ）　形態：リンパ様ＩＩＩ胞 ｂ）　増殖性＝１００μＭ８−アザグアニン（８−ＡＧ
）、１０％牛脂児血清 （Ｆｅ２）　、５ｘｌ　Ｏ−５Ｍ２−メルカプトエタノ
ール、１００μｏ／ｍＱストレプトマイシン、１００単
位／鵬ペニシリンＧ１５０μＧ／ＩＩＩＱゲンタマイシ
ン及び１ｍＭグルタミンを含むＲＰＭＬ−１６４０培地
において良好に財殖する ｃ）　　１１代培養；限界なく継代培養が可能である ｄ）　凍結保存；液体窒素中で容易に長期保存できる ｅ）　酵素欠損：　ＨＧＰＲＴ酵素欠損株であり、１Ｘ
１０”Ｍヒボキサンチン、４× １０−７Ｍアミノプテリン及び１．６×１０−５Ｍチミ
ジンを含むＲＰＭＩ− １６４０培地で死滅する ｆ）　染色体数；４３〜５４本 ｇ）　物質産生能；コロニー形成刺激因子（Ｃ８Ｆ）の
持続産生能を有する。

上記本発明の細胞株は、ヒトＣ８Ｆの製造に有用であり
、これを純度よく人員に製造することができる。更に本
発明の細胞株のＣ８Ｆ産生能は長期にわたり安定であり
、低下が認められていない。

また本発明細胞株はＨＧＰＲＴ欠損株であり、ヒトＴ細
胞の細胞融合の親細胞としても有用であり、殊にその細
胞表面表現型が明確であることより、該細胞より誘導さ
れた融合細胞の選別時に該表現型を利用することができ
、好適なものである。

本発明の細胞株は、上記により特徴づけられるが、その
細胞学的及びその他の諸性質について詳述すれば次の通
りである。

（１）　形態学的特徴 リンパ様細胞；径は正常ヒト末梢血Ｔ細胞の約２〜３倍
であり、はぼ球形をなす。細胞内における核の占める割
合は大で、原形質が僅かに認められる。原形質内には僅
かの顆粒が認められる。時として変形した細胞が存在す
る。

（２）　染色体数 本発明ｒ　Ａ　Ｇ　Ｒ−ＯＮ　Ｊの染色体数を以下の方
法により計算した。即ち対数増殖期にある細胞の培地に
コルセミド（シグマ社製）を０．１μｇ／帥となるよう
に添加した。２時間後、細胞浮遊液を遠心管に移し、１
０００　ｒ、ｌ）、ＩＯで５分間遠心し、沈査細胞上に
１％のクエン酸ナトリウム溶液約１鵬を加え、ゆるやか
に混ぜ合せた後、室温で約１５分間放置した。固定液（
メタノール：氷酢酸＝３：１）を静かに上底していき、
約１０ｍ１２となったとき、静かに撹拌した。そのまま
で５分間放置後、遠心し、新しい固定液に細胞を懸濁し
た。

同様な操作を３回繰り返し、最後に固定液１〜２舗に細
胞を懸濁し、その細胞浮遊液をスライドグラス上に２〜
３滴づつ落とし、空気乾燥させた。

１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）で約２％に希釈
したギムザ（Ｇ　Ｉｅｍｓａ　）液（メルク社製）で１
５〜２０分間染色し、水洗後乾燥した。顕微鏡上で６０
倍のノーカバー用レンズを用いて、良く拡がった中期分
裂像５０個を観察し、染色体数を計数した。

その結果は、下記第１表に示す通りであり、本細胞の染
色体数は４３〜５４本の間にあり、平均４５木である。

第１表 （３〉　Ｔ細胞特異抗原発現性 本発明ｒＡＧＲ−ＯＮＪの細胞表面表現型を、公知のヒ
ト白血病Ｔ細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（Ａ　Ｔ　Ｃ，Ｃ寄
託Ｎｏ、ＣＣＬｌ　１９）　、ＯＥＭ−ＡＧＲ（ＡＴＣ
Ｃ寄託Ｎｏ、ＣＲＬ−８０８１：Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、ｓｃｉ、、ＵｓＡ、、Ｖｏｌ、　７８゜ＮＯ
，１２，Ｆｌｌ）、７７１７−７７２１　（１９８１）
）及びヒト末梢血Ｔ細胞と対比して検討した。

即ち、各細胞を５Ｘ１０５個／ヒ淵度に調整し、１０’
ＯμＱの適当なモノクローナル抗体〔オーソミュー二Ｏ
Ｋシリーズモノクローナル抗体（Ｏｒｔｈｏ　　Ｐ　ｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　　Ｃｏ、：　Ｒａｒｉｔａ
ｎ。

Ｎｅｗｊａｒｓｅｙ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　）及びベクトン　
デイツキンソン　ｌｅｕシリーズモノクローナル抗体（
Ｂ　ｅｃｔｏｎ　　　　＆　　　Ｄ　　１ｃｋｉｎｓｏ
ｎ　：　　Ｓ　ｕｎｎｙｖａｌｅ。

Ｃａ１Ｈｏｒｎｉａ　、　ＵＳＡ　＞　）と４℃で３０
分間反応させた後、細胞を５％ＦＣ８を含むＭＥＭ培地
で２回洗浄し、Ｆ　Ｉ　Ｔ　Ｃ（ｆｌｕｏｒｅｓｓｅｉ
ｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｒ＋ａｔｅ）結合−ウサギ抗マ
ウス免疫グロブリン（マイルスーイエーダー社（イスラ
エル）袈）と反応させ、Ｔ細胞表面の特異抗原発現性を
間接免疫螢光抗体法により測定した。１００個の細胞に
ついて調べた結果を下記第２表に示す。第２表より、本
発明のｒＡＧＲ−ＯＮＪはＴ４、Ｌｅｕｌ及び１−ｅｕ
３ａ抗体に対して１００％陽性であり、Ｔ３、Ｔ８及び
１ｅｕ２ａ抗体に対して陰性であった。

Ｌ　ｅｕ　ｉ陽性であることより、本細胞はＴ細胞株で
あり、またＴ４及び１−ｅｕ３ａ陽性であることより、
本細胞はヒトインデューサー／ヘルパー下リンパ球サブ
クラスに屈することが証明された。

第２表 （４）　ロゼツト形成 抗体補体感作ヒツジ赤血球（ＥΔＣ）におけるロゼツト
形成を、２００個の細胞につき、４００倍の顕微鏡下で
測定した結果、１％以下が陽性である。

（５）　Ｂ細胞、マクロファージマーカー発現性（ａ）
　　ＦＩＴＣ−結合マウス抗ヒト−免疫グロブリン（Ｂ
ｅｈｒｉｎａ　　ｗｅｒｋｅ　　ＡＧ、Ｍａｒｂｕｒｏ
）を用いた直接免疫螢光抗体法により解析した表面免疫
グロブリン（Ｉ（＋）は、１％以下陽性である。

（ｂ　）　　モノクローナル−抗−ＤＲ抗体（Ｂ　ｅｃ
ｔｏｎ　−Ｄ　１ｃｋｉｎｓｏｎ　　Ｃｏ、　）を用い
た間接免疫螢光抗体法により解析したヒトＨＬＡ−ＤＲ
抗原（ＤＲ）は、１％以下陽性である。

（Ｃ’）　　またビールス（Ｅ　ｐＳｔ１３ｉｎ−Ｂ　
ａｒｒ　Ｖｉｒｕｓ　）でトランスフオームしたヒトＢ
Ｉ！８胞株（ＣＥＳＳ、スローン、ケタリング癌研究所
のビーターラルフ博士より入手）により免疫されたマウ
ス稗細胞とミエローマＰ３ＬＩ＋（Ｅ　Ｉｂｅｒｔ　Ｅ
　１ｎｓｔｅｉｎ　ＣｏＣｏ１１ｅ　　ｏｆＭｅｄｉａ
ｉｎｓより入手）との細胞融合株から得た（Ｍｉｋｔ　
、　Ｙ、　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆＴ
　ｍｍｕｎｏｌｏａｙ　、　１２９　、１９２１　（１
９８２）参照〕モノクローナル抗ヒトＢ細胞抗体を用い
、間接免疫螢光抗体法により解析した、ヒトＢ細胞特異
抗体（Ｂ抗原）の表現性は、１％以下が陽性である。尚
上記抗体はＢ細胞乃至そのラインとは反応するが、■細
胞乃至そのラインとは反応しない。

（ｄ　）　　ヒ１−マクロファージ朕瘍刺胞株Ｕ９３７
細胞をＢＡＩＢ／ｃマウスに免疫し、このＢＡＬＢ／ｃ
マウスより得た＋ｓ　Ｂ　細胞とミエローマ細胞Ｐａｔ
Ｊ＋とをポリエチレングリコールを用いて細胞融合させ
、ヒトマクロファージに対するモノクロナル抗体を産生
ずるマウスＢハイブリドーマを得た（Ｍａｒｕｙａｍａ
　Ｓ、　ｅｔ　　ａｌ−。

Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　　’　
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、β工。

５７（１９８，３＞参照〕。この抗体はＵ９３７や正常
ヒトマクロファージには特異的に結合するが、正常ヒＩ
−Ｔ細胞やＢ細胞或いはヒ１〜Ｔ日胞ラインやヒｌ−Ｂ
細胞ラインとは反応しないものである。この抗体を用い
、同様に間接螢光抗体法により解析したヒ１へマクロフ
ァージ抗原の表現性は、１％以下が陽性である。

（６）　増殖性 ８−７Ｖ’ｊ７’ニン（８−ＡＧ、１００μＭ）、ｉｏ
ｏμ（＋／ｍ２ストレプトマイシン、１００単位／＆！
ペニシリンＧ、５０／ｉｏ／鶴ゲンタマイシン、１０％
牛脂児血清（Ｆｅ２）　、５Ｘ１０−　”　Ｍ２−メル
カプトエタノール及び１ｍＭグルタミンを含むＲＰＭＩ
−１６４０培地（フロー　ラボラトリ−社製）において
良好に増殖する。

（７）　増殖条件 一般に３６〜３８℃の温度条件下及びＩ）Ｈ゛１．２〜
７．３の条件下で良好に増殖する。また５％炭酸ガス及
び９５％空気のインキュベーター内での培養が好適であ
る。

く８）　縫代培養 限界なく継代培養が可能である。

（９）　凍結保存 ２０％ＦＣ３を含むＲＰＭＩ−１６４０培地９０％、ジ
メチルスルフオキシド（ＤＭＳＯ）１０％の条件で凍結
し、液体窒素中で容易に長期保存できる。

（１０）　　８−アザグアニン（８−ＡＧ）耐性１００
μＭの８−ＡＧに耐性があり、ヒポキサンチン（１ｘ１
０−’Ｍ）、アミノプテリン（４ＸＩＯ−７Ｍ）及びチ
ミジン（１，６Ｘ１０−５Ｍ）を含む培地（ＨＡＴ培地
）で死滅する。この結果よりｒ　Ａ　Ｇ　ＲＯＮ　Ｊは
、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株であることが明白である
。

（１１）　マイトジェン反応性 ］ンカナバリンΔ（ＣｏｎＡ）　１０〜１００μ０／Ｉ
ｉＱの添加及び植物性赤血球凝集水、フイトヘモアグル
チニン（Ｐ　ＨＡ　）の１〜１０％添加により、***増
殖は部分的に抑制される。ポラクライードマイトジェン
（Ｐ　Ｗ　Ｍ　）及びプロティンＡ（Ｐｒ。

Δ）は、いかなる潤度においても本細胞株の***１！！
殖に影響を与えない。

本発明細胞株ｒＡＧＲ−ＯＮＪは、８−ΔＧ耐性ヒト白
血病Ｔ細胞より、常法に従って、前記した特性を有する
［ΔＧＲ−ＯＮＪをクローニングすることにより収得で
きる。上記８−ＡＧ耐性ヒト白血病Ｔ細胞は、常法、例
えば特開昭５７−２０６３８３号に記載の方法に従って
製造され、これは公知のヒ１〜白血病Ｔ　Ｉｌｉ　Ｒ１
例えばＣＣＲＦ−ＯＥＭ　（Ｊ、　Ｋａｐｌａｎ　ｅｔ
　　ａｈ、Ｅｘａ、　Ｍｅｄ、。

１３９．１０７０〜１０７６　（１９７４））を起源と
し、これを１０％ＦＯ３含有ＲＰＭＩ−１６４０培地に
８−ＡＧを添加した培地で培養し、８−ＡＧ添加量を順
次増加させていくことにより取得するものである。より
具体的には例えばまず２μＭの８−ＡＧを添加した培地
で１週間培養し、生存細胞を次に１６μＭの８−ＡＧを
含む培地で１週間培養し、その後同様に８−ＡＧ濃度を
２倍づつ増加させた培地で順次培養し、最終的に８−Ａ
Ｇ濃度を１００μＭとした培地に生存する８−ＡＧ耐性
細胞株を使用すればよく、該細胞株の代表例としては、
例えば前述のＣＥＭ　　ＡＧ”（ＡＴＣＣ寄託Ｎｏ、Ｃ
ＲＬ−８０８１）を挙げることができる。

上記ｒＡＧＲ−ＯＮＪのクローニングは、常法に従って
行なえばよく、より詳細には、例えばソフトアガー法（
Ｍ　ｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌｏａｙ
　。

Ｖｏｌ、７３．Ｄ　１〜４５（１’９８１））に従い実
施できる。即ち２００〜２０００／ｒｒＱに希釈した８
胞浮遊液を、２倍口度の培養液（８ＡＧ添加ＲＰＭＩ　
　１６４０等）で作製し、直ちに、３７℃に加温した０
、３％ソフトアガー（Ｄｉｒｃ。

Ｌａｂ、、Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍ　Ｔ　、　）液を等優
に混ぜ合せ、プラストツクディツシュにブレーティング
する。

そのきはディツシュの大きさによりまちまちであるが、
直径３ｃｍのディツシュに対しては１〜１．５鵬、５〜
６囲のものには２〜２．５Ｉｒ：Ｑ加えるのがよい。培
養開始後１０〜１４日位で肉眼でも分るコロニーを形成
してくる。この時点で、先を細くシたパスツールピペッ
トを用いて、俄立顕微鏡上で１個のコロニーだｊすを吸
引でひろいあげ、予め用意しておいた°９６穴平底培養
プレー１〜内の培養液に移して培養づる。

得られた各コロニーは、そのＣ３Ｆ産生能を通常の方法
〔例えばＪ　ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｉ　ｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｉｃａｌｖｅｔｈｏｄｓ、　４２　　ｐｐ２５３
〜２８４　（１９８１）　）に従い検索して本発明のｒ
ＡＧＲ−ＯＮＪを単一の細胞株として分離する。

かくして得られる本発明の細胞株［△ＧＲ−ＯＮＪは、
前述の諸性性を有し、これは、出願人によって、１９８
３年１月２４日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（ＡＴＣＣ）にｒＡＴＣＣ寄託Ｎｏ、ＣＲ
Ｉ　−８１９９Ｊとして受託されている。

上記本発明の細胞株ｒＡＧＲ−ＯＮＪがらのＣ８Ｆの製
造は、これを常法に従って、組織培養し、培養上清から
分離する方法により実施される。

上記組織培養は、通常の栄養培地中で行なわれる。栄養
培地としては、特に限定なく、この種の細胞培益に頻用
される、例えばＲＰＭＩ−１６４０、ＭＥＭ等をＦｅ２
で改質した培地等を挙げることができる。培養条件とし
ても特に限定されず、例えば細胞濃度１〜１ｏ×１０５
個／鶴程度で、前記した増殖条件に従って通常３日程度
１８養すればよい。か（してｔ８養液中に、Ｃ３Ｆが生
産される。該Ｃ８Ｆは常法に従い例えば、塩析、クロマ
トグラフィー、電気泳動法、透析等の物理化学的手段に
より更に精製することができる。

かくして本発明細胞［ΔＧＲ−０陪Ｊの利用によれば、
非常に容易に高収率、高純度で所望のＣ８Ｆを収得でき
、該Ｃ３Ｆの大ば生産が工業的規模で実施できる。しか
もかくして得られるＣ　Ｓ　Ｆは活性が強く、毒性が低
く、更にその製造工程での活性低下もなく、従来公知の
Ｃ８Ｆと同様の用途に、より有利に利用できるものであ
る。

以下、本発明の詳細な説明するため、実施例及び試験例
を掲げる。

実施例１　　ｒＡＧＲ−ＯＮＪの製造 ＣＥＭ−ＡＧＲ（ΔＴＣＣ寄託ＮＯ，ＣＲＬ−８０８１
〕を、１００μＭ８−ΔＧを含む同一培地にてｉ　ｏｏ
ｏ個の／岐に希釈して用胞浮遊液を作成し、直ちに、３
７℃に加温した０、３％ソ７１へアガー（ディフコ社製
）液に混合し、プラスチックディツシュ（φ３Ｃ１ｌＩ
）に約１ｉ＋ｌ！ｌ！ずつブレーティングする。培養１
４日後に形成してくるコロニーをパスツールピペットを
用いて、倒立顕微鏡下にひろいあげ、９６穴平底培養プ
レー１〜内の上記培養液に移して培養した。得られた各
クローンは、後記試験例に基づき、その培養上清のＣ８
Ｆ活性を測定して、本発明の細胞株「ΔＧＲ−ＯＮＪを
得た。この株はその後同潟度（１００μＭ）の８−　Ａ
　Ｇ　ヲ含むＲＰＭ　Ｔ−１６４Ｑ＋１０％ＦＣ８培地
にて強いｉ？５￥４を示し、この培地で継代培養により
推持されている。またその細胞学的及びその他の特性は
前述した通りであった。

試楡例 （１）　上記実施例１で得たｒＡＧＲ−ＯＮＪをＲＰＭ
　Ｉ−１６４０＋１０％ＦＣ３培地ヲ用イ１”５Ｘ１０
５個／四濃度に調整し、これをプラスチック日胞培芸液
用フラスコ（コーニング社製、２５０岳２／７０譜）に
て３日間、３７℃下、５％炭酸ガスインキュベーター内
で培養した。遠心分路して得た培養上清１０鶴を、８０
％の飽和硫安処理後、沈澱物を遠心分離して採取し、こ
れを１回の生理食塩水に溶解した。これを以下の試験に
供した（ＡＧＲ−ＯＮサンプル）。

（２）　　Ｃ８Ｆ活性 上記ＡＧＲＯＮサンプルのＣ８Ｆ活性を、イアン（Ｉａ
ｎ）等の方法に準じて試躊した〔、）。

Ｔｍｍｕｎｏｌ、　１２８．ｐｌ　６８　（１，９８２
）　）。

下記培地を使用した。

０培地１（２倍濃度λ４　Ｅ　Ｍ培地）；Ｍ　Ｅ　ｆｖ
ｌ粉末（フロー社製）　　　　２．６８ｑメイロン　（
大塚製桑社製）１０−６ｍ２ペニシリンＧ　　　　　　
２００００単位ストレプトマイシン　　　　　２０ｍ。

ゲンタマイシン　　　　　　　１０ｍｇ２−メルカプト
エタノール　５Ｘ１０−５Ｍ蒸溜水　　　　　全体を１
００館とする９０培地ＩＩ（ＭＥＭ培地）；・ Ｍ　Ｅ　Ｍ扮末　　　　　　　１３．＝ｉ。

メイロン　　　　　　　　５２．９四 ペニシリン０　　１０００００単位 ス１〜レプトマイシン　　１００ｍｇ ゲンタマイシン　　　　　５０ｍＧ ２−メルカプトエタノール　５Ｘ１０−５Ｍ蒸溜水　　
　　全体を１０００謡とするＲＯ培地■： 培地■３０Ｉ＋１２ 培地ＩＩ　　　　　　　　　　２０購 ＦＣ８（イルビン　サイエンティフィック社、（〕ＳΔ
製）、２０　■Ｑ １％アガー（ディフコ社製）をオー１〜クレープ中溶解
し、４３℃に保温する。この１０ＩＩＩＩ２を３７℃に
保温した上記培地Ｉ［［２３，３ｍに加え混和した後３
７℃に保温する。

ＢＡＬＢ／ｃ系マウス大腿骨より採取した骨髄細胞（Ｂ
ＭＣ）を、ハンクス液で２回洗浄後、これを前記培地■
を用いて１０７個／鵬に調整し、その１戒を上記寒天培
地に加え、混和した後３７℃に保つ（２，９Ｘ１０５個
／鶴）。この１却を段階希釈したＡＧＲ−ＯＮサンプル
の０．１脱を入れたシャーレ（φ＝３．５ｃｍ；　Ｆａ
ｌｃｏｍ３００１）に加え手早く混和し、室温で培地が
固まるまで放置後、３７℃で炭酸ガスインキュベーター
内で培養を開始する。培養１０日後に形成されたコロニ
ー数を計測した。結果を第１図に示す。

図中、＠軸は、す゛ンプルの最終希釈を、縦軸はブレー
１〜当りのコロニー数を示す。尚図中の各折れ線は、夫
々以下のことを示す。

ｅ−＠；ＡＧＲ−ＯＮサンプル ローロ：ヒ１〜牌細胞より調製されたサンプル（牌臥摘
出手術を受けた愚者より供与されたヒト牌藩より浮遊細
胞を作？Ｊ　Ｌ、、これを１×１０θ個／戒培地（１％
ＦＣ８加 Ｒ’ＰＭＩ−１６４０培地）の細胞口度に調製し、０．
１％ＰＨ△−Ｐ（ディフコ社）にて２日間刺激し、以後
前記（１）と同様にして得た］ントロールリンプル。

ムーＡ：ヒト末梢血単核球より調製されたサンプル（健
常人末梢血より、比重密度遠心分画法により；単核球に
分離蹟閂し、これを１％ＦＣ８を加えたＲＰＭＩ− １６４０培地に１×１０ε個／閥の紹胞溌度に調製し、
０．１％Ｐ　ＨＡ−Ｐにて２日間刺激し、以後前記（１
）と同様にして得たコン１−ロールサンプル）。

第１図より、ΔＧＲ−ＯＮの培養上清はＣ３Ｆ活性を有
することが判る。尚、計測した］ロニーは、形態学的観
察の結果、顆粒球及びマクロファージであった。

（３）　親細胞との比較 前記（１）ど同様にして得たサンプルの０．２鶴及びＣ
ＣＲＦ−ＣＥＭ　（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ１１９）を用いて
同様にして得た対照サンプルの０．２譜の夫々を用いて
、上記（２）と同様にしてＣ８Ｆ活性を測定した。

結果を下記第３表に示す。

第　　３　　表 セルライン　　　コロニー数／プレートＡＧＲ−ＯＮ　
　　　　　　３０７ ＣＣＲＦ−ＣＥＭ　　　　　　　０ （４）　ゲルン濾過 前記（２）の各シンプルをウルトロゲルＡＣ△５４　（
２，２ｘ９０ｃｎ＋、ＬＫＢ社、ストックフィルム、ス
ウェーデン）カラムにて分画した。カラムは０．５Ｍ　
　Ｎａ　（１，０，０１Ｍリン酸ｖ：：衝液、０．０５
％ポリエチレングリ］−ルー６０００であらかじめ平衡
化した。１９ｐＪ２／ｈｒの流速で２綬づ５つの分画を
行ない、蛋白の分■状況を２８０ｍμでの吸光度を測定
することによりモニターした。各分画のＣ８Ｆ活性は前
述の方法で測定した。

結果を第２〜４図に示す。

各図中、縦軸は、Ｃ８Ｆ活性（コロニー′！Ａ’１　／
プレート）を、横＠はフラクションＮｏ、を示ず。また
第２図はＡＧＲ−ＯＮＮシンブル、釘３図はヒ１〜末梢
血単核球より調製したサンプルを、及び第４図はヒ１〜
后Ｂ厨胞より調製した４ノ゛ンプルを夫々示す。

標準分子亡キツ（〜（ファルマシア社薯）より１１Ｆ定
したΔＧＲ−ＯＮ由来のＣ８Ｆの分子量は、約８４００
０であり、これは、正常ヒ１へ末梢血１１５核球及びヒ
トＲＩｆｆｉ細胞由来のＣ３Ｆの分子量とほぼ一致した
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明ｒＡＧＲ−ＯＮＪ細胞から得られるサン
プルのＣ８Ｆ活性を示すグラフ及び第２〜４図は、上記
サンプル及びフン１〜ロールサンプルのゲル濾過による
溶出パターンを示す。 （以　上） 代理人　弁理士　三　枝　英　二 第１図 最琳双借 第　２　図 フラクションＮ。 第３図 フラツジｇ　＞Ｎ　Ｏ。 第４図 フラツジｑ、＞Ｎ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■　下記の特性を有するヒト白血病ＴＩ胞由来のヒト培
   養株化細胞ｒＡＧＲ−ＯＮＪ。 ａ）　形態；リンパ様細胞 ｂ）　増殖性；　１０ＣＩＭ８−７ザグアニン、１０％
   牛脂児血清、５Ｘ１０−５Ｍ２−メルカプトエタノール レプトマイシン、１００単位／凶ペニシリンＧ１５０μ
   （１／ｍＩ２ゲンタマイシン及び１ｍ　Ｍグルタミンを
   含むＲＰＭＩ−１６４０培地において良好に増殖する Ｏ）　縫代培養；限界なく継代培養が可能である ｄ）　凍結保存；液体窒素中で容易に長期保存できる ｅ）　酵素欠損；　ＨＧＰＲＴ酵素欠損株であり、ＩＸ
   ｌｏ−’Ｍヒボキザンチン、４× １０−７Ｍアミノプテリン及び１．６×１０−５Ｍチミ
   ジンを含むＲＰＭＩ− １６４０培地で死滅する ｆ）　染色体数；４３〜５４本 ｇ）　物質産生能：コロニー形成刺激因子の持続産生能
   を有する。