JPS59143960A - 酵素標識抗体に含まれる非特異的吸着成分の除去法 - Google Patents
酵素標識抗体に含まれる非特異的吸着成分の除去法Info
- Publication number
- JPS59143960A JPS59143960A JP1905283A JP1905283A JPS59143960A JP S59143960 A JPS59143960 A JP S59143960A JP 1905283 A JP1905283 A JP 1905283A JP 1905283 A JP1905283 A JP 1905283A JP S59143960 A JPS59143960 A JP S59143960A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- enzyme
- immunoglobulin
- carrier
- labeled antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、酵素標識抗体に含まれる非特異的吸着成分の
除去法に関するものであり、更に詳しくは種々の生体成
分の酵素免疫測定法に用いられる酵素標識抗体中の非特
異的吸着成分を除くことにより酵素免疫測定法の測定感
度および測定精度を向上させるここを目的とする酵素標
識抗体に含まれる非特異的吸着成分の除去法に関するも
のである。
除去法に関するものであり、更に詳しくは種々の生体成
分の酵素免疫測定法に用いられる酵素標識抗体中の非特
異的吸着成分を除くことにより酵素免疫測定法の測定感
度および測定精度を向上させるここを目的とする酵素標
識抗体に含まれる非特異的吸着成分の除去法に関するも
のである。
近年、医学の発展に伴ない生体体液に含まれる多くの微
量成分の生理的意義が明らかになってきた。これに伴な
い臨床検査の分野において、これら生体体液中に含まれ
る微量成分の定量法がますます重要なものとなってきた
。
量成分の生理的意義が明らかになってきた。これに伴な
い臨床検査の分野において、これら生体体液中に含まれ
る微量成分の定量法がますます重要なものとなってきた
。
これら微量成分の定量法の一つに、抗体と酵素の結合物
（以下酵素標識抗体という）と、抗体を不溶化した不溶
性担体を用いる固相法酵素免疫測定法（以下固相法ＥＩ
Ａという）がある。
（以下酵素標識抗体という）と、抗体を不溶化した不溶
性担体を用いる固相法酵素免疫測定法（以下固相法ＥＩ
Ａという）がある。
固相法ＥＩＡは、抗原を抗体不溶化担体に結合せしめ、
次に該担体に結合した抗原に酵素標識抗体を結合せしめ
た後該担体に結合した酵素標識抗体量を酵素活性を測定
することによって定量し、この定！値より抗原の量を求
めるものである。固相法ＥＩＡには上記以外に種々の変
法があるが、いずれの方法も標識物質として放射性同位
元素を用いるラジオイムノアッセイなどに比べて特殊な
設備を必要とせず、簡単−な操作で感度良く抗原即ち、
生体体液等に含まれる微量物質を定量することができる
。
次に該担体に結合した抗原に酵素標識抗体を結合せしめ
た後該担体に結合した酵素標識抗体量を酵素活性を測定
することによって定量し、この定！値より抗原の量を求
めるものである。固相法ＥＩＡには上記以外に種々の変
法があるが、いずれの方法も標識物質として放射性同位
元素を用いるラジオイムノアッセイなどに比べて特殊な
設備を必要とせず、簡単−な操作で感度良く抗原即ち、
生体体液等に含まれる微量物質を定量することができる
。
固相法ＥＩＡは上記のように微量物質の定量法として優
れた方法であるが、測定に用いる酵素標識抗体の品質が
悪い場合には測定精度あるいは測定感度が低下するとい
う問題がある。酵素標識抗体の品質を決定する要因とし
ては、勿論抗体と標識用酵素の純度と特異性があるが、
更に高純度でしかも特異性の高い抗体と標識用酵素を用
いても調製した酵素標識抗体の一部が抗体不溶化担体に
非特異的に吸着するという現象も認められる。この非特
異的吸着は固相法ＥＩＡの測定感度あるいは測定精度の
低下をもたらす。
れた方法であるが、測定に用いる酵素標識抗体の品質が
悪い場合には測定精度あるいは測定感度が低下するとい
う問題がある。酵素標識抗体の品質を決定する要因とし
ては、勿論抗体と標識用酵素の純度と特異性があるが、
更に高純度でしかも特異性の高い抗体と標識用酵素を用
いても調製した酵素標識抗体の一部が抗体不溶化担体に
非特異的に吸着するという現象も認められる。この非特
異的吸着は固相法ＥＩＡの測定感度あるいは測定精度の
低下をもたらす。
本発明者等は上記の酵素標識抗体の非特異的吸着を防止
する方法について鋭意核的した結果、酵素標識抗体含有
液をイムノグロブリン又はイムノグロブリンの分解物を
不溶化せしめた不溶化担体に接触せしめ、酵素標識抗体
に含まれる非特異的吸着成分のみを該担体に吸着除去せ
しめるという方法を開発した。ここで述べる非特異的吸
着成分としては、抗原抗体反応に関係なく抗体不溶化担
体に吸着し、しかも酵素活性を有するものである。
する方法について鋭意核的した結果、酵素標識抗体含有
液をイムノグロブリン又はイムノグロブリンの分解物を
不溶化せしめた不溶化担体に接触せしめ、酵素標識抗体
に含まれる非特異的吸着成分のみを該担体に吸着除去せ
しめるという方法を開発した。ここで述べる非特異的吸
着成分としては、抗原抗体反応に関係なく抗体不溶化担
体に吸着し、しかも酵素活性を有するものである。
具体的には、抗体と結合していない標識用酵素、変性し
た抗体と結合した標識用酵素、酵素標識抗体を調製する
のに用いる抗体中に微量に存在する抗体以外の成分と結
合した標識用酵素、正常な酵素標識抗体の抗体と標識用
酵素の結合様式と異なるような結合をしている酵素標識
抗体などが含まれる。
た抗体と結合した標識用酵素、酵素標識抗体を調製する
のに用いる抗体中に微量に存在する抗体以外の成分と結
合した標識用酵素、正常な酵素標識抗体の抗体と標識用
酵素の結合様式と異なるような結合をしている酵素標識
抗体などが含まれる。
本発明が適用される固相法ＥＩＡにおいて抗体を不溶化
する担体としては、ポリスチレン試験管、ポリスチレン
球、ガラス球、シリコン樹脂片、多糖ゲル、濾紙片など
を用いるものが含まれる。また、標識用酵素としては、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、パーオキシダーゼ、アルカ
リボスファターセ、リンゴ酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵
素、アセチルコリンエステラーゼなどが用いられる。
する担体としては、ポリスチレン試験管、ポリスチレン
球、ガラス球、シリコン樹脂片、多糖ゲル、濾紙片など
を用いるものが含まれる。また、標識用酵素としては、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、パーオキシダーゼ、アルカ
リボスファターセ、リンゴ酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵
素、アセチルコリンエステラーゼなどが用いられる。
一方、酵素標識抗体と抗体不溶化担体に用いる抗体とし
てはイムノグロブリンそのものでもよいが、更にイムノ
グロブリンをペプシン、パパインなどで限定分解したＦ
（ａｂ’）２部分、Ｆａｂ’部分でもよい。
てはイムノグロブリンそのものでもよいが、更にイムノ
グロブリンをペプシン、パパインなどで限定分解したＦ
（ａｂ’）２部分、Ｆａｂ’部分でもよい。
標識用酵素と抗体との結合には通常用いられる二官能性
試薬などが用いられる。例えばグルタルアルデヒド、Ｎ
、Ｎ’−０−フェニレンジマレイミド、４−（マレイミ
ドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸号りシニミ
ドエステル、カルボジイミド誘導体などがある。
試薬などが用いられる。例えばグルタルアルデヒド、Ｎ
、Ｎ’−０−フェニレンジマレイミド、４−（マレイミ
ドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸号りシニミ
ドエステル、カルボジイミド誘導体などがある。
不溶性担体と抗体との結合は、物理的吸着を利用するか
不溶性担体に抗体を共有結合させる方法で行なわれる。
不溶性担体に抗体を共有結合させる方法で行なわれる。
共有結合の場合には、例えば不溶性担体が多糖ゲルの場
合には多糖ゲルを臭化シアン、エピクロルヒドリン、過
ヨウ素酸ソーダなどで活性化する。また、例えばシリコ
ン樹脂の場合には、牛血清アルブミンなどの蛋白質をシ
リコン樹脂に物理的に吸着させておき、次にグルタルア
ルデヒド等を用いて牛血清アルブミン等の蛋白質に抗体
を結合させることもできる。
合には多糖ゲルを臭化シアン、エピクロルヒドリン、過
ヨウ素酸ソーダなどで活性化する。また、例えばシリコ
ン樹脂の場合には、牛血清アルブミンなどの蛋白質をシ
リコン樹脂に物理的に吸着させておき、次にグルタルア
ルデヒド等を用いて牛血清アルブミン等の蛋白質に抗体
を結合させることもできる。
本発明においては、上記のような固相法ＥＩＡに用いる
酵素標識抗体をイムノグロブリンネ溶化担体に接触せし
めて酵素標識抗体に含まれる非特異的吸着成分を吸着除
去するものである。ここで用いるイムノグロブリンネ溶
化担体としては特に限定はしないが、固相法ＥＩＡにお
いて抗体不溶化担体に用いられる不溶性担体を用いるこ
とができる。イムノグロブリンと不溶性担体の結合は、
上記の抗体と不溶性担体の結合と同じ方法で達成される
。イムノグロブリンとしてはどのような動物種から得ら
れたものでもよいが、抗体不溶化担体に用いられる抗体
と同種の動物のイムノグロブリンが好ましい。また、イ
ムノグロブリンとしてイムノグロブリンの分解物、例え
ばプロテアーゼ処理して得られるＦ （ａｂ’）２、Ｆ
ａｂ’、Ｆｃなどの部分を単独あるいは組み合わせて用
いてもよい。
酵素標識抗体をイムノグロブリンネ溶化担体に接触せし
めて酵素標識抗体に含まれる非特異的吸着成分を吸着除
去するものである。ここで用いるイムノグロブリンネ溶
化担体としては特に限定はしないが、固相法ＥＩＡにお
いて抗体不溶化担体に用いられる不溶性担体を用いるこ
とができる。イムノグロブリンと不溶性担体の結合は、
上記の抗体と不溶性担体の結合と同じ方法で達成される
。イムノグロブリンとしてはどのような動物種から得ら
れたものでもよいが、抗体不溶化担体に用いられる抗体
と同種の動物のイムノグロブリンが好ましい。また、イ
ムノグロブリンとしてイムノグロブリンの分解物、例え
ばプロテアーゼ処理して得られるＦ （ａｂ’）２、Ｆ
ａｂ’、Ｆｃなどの部分を単独あるいは組み合わせて用
いてもよい。
酵素標識抗体とイムノグロブリンネ溶化担体を接触させ
る方法はどのような方法でもよいが、イムノグロブリン
ネ溶化担体を充填したカラムに酵素標識抗体含有液を流
すか、あるいは酵素標識抗体含有液にイムノグロブリン
ネ溶化担体を加え攪拌あるいは振盪する方法などが操作
的に優れている。
る方法はどのような方法でもよいが、イムノグロブリン
ネ溶化担体を充填したカラムに酵素標識抗体含有液を流
すか、あるいは酵素標識抗体含有液にイムノグロブリン
ネ溶化担体を加え攪拌あるいは振盪する方法などが操作
的に優れている。
以上のように、本発明法によって非特異的吸着成分を除
いた酵素標識抗体を用いることで、面相法ＥＩＡの測定
感度と精度を向上させることができるが、以下にこのこ
とを実施例によって具体的に示す。
いた酵素標識抗体を用いることで、面相法ＥＩＡの測定
感度と精度を向上させることができるが、以下にこのこ
とを実施例によって具体的に示す。
実施例１ セクレタリー・コンポーネントとセクレタリ
ー・イムノグロブリンＡの定量 セクレタリー・コンポーネント（ＳＣ）は外分泌液に含
まれる蛋白質でイムノグロブリンＡと結合してセクレタ
リー・イムノグロブリンＡ （ＳＩｇＡ）を形成する。
ー・イムノグロブリンＡの定量 セクレタリー・コンポーネント（ＳＣ）は外分泌液に含
まれる蛋白質でイムノグロブリンＡと結合してセクレタ
リー・イムノグロブリンＡ （ＳＩｇＡ）を形成する。
ＳＣとＳ ｒｇＡはいずれも微量ではあるが血中にも存
在する。
在する。
（１，ｓ Ｃ，Ｓ ＩｇＡ、 Ｓ Ｃ抗体および Ｉｇ
Ａ抗体の調製ヒト初乳よりイオン交換クロマトグラフィ
、ゲル濾過などの方法でＳＣ及びＳ ＩｇＡを精製した
。
Ａ抗体の調製ヒト初乳よりイオン交換クロマトグラフィ
、ゲル濾過などの方法でＳＣ及びＳ ＩｇＡを精製した
。
このＳＣをウサギに注射することにより抗ｓｃ血清を得
た。抗１ｇＡ血清（ウサギ）は市販のもの（医学生物学
研究所部）を用いた。各々の抗血清ヲ塩析し、更にＤＥ
ＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィを行ないＳＣ
抗体およびＩｇＡ抗体を得た。
た。抗１ｇＡ血清（ウサギ）は市販のもの（医学生物学
研究所部）を用いた。各々の抗血清ヲ塩析し、更にＤＥ
ＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィを行ないＳＣ
抗体およびＩｇＡ抗体を得た。
（２）酵素標識ＳＣ抗体の調製
（１）で得られたＳＣ抗体をペプシンで限定分解後セフ
ァデックスｃ−４ｓｏのカラムに流し、Ｆ （ａｂ’）
２部分を得た。このＦ （ａｂ’）２部分をメルカプト
エチルアミンで還元後、大腸菌のβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーセ（分子表面にＳＨ基を持つ）とＮ、 Ｎ’ −０−
フェニレンジマレイミドを用いて結合させることにより
酵素標識ＳＣ抗体を調製した。
ァデックスｃ−４ｓｏのカラムに流し、Ｆ （ａｂ’）
２部分を得た。このＦ （ａｂ’）２部分をメルカプト
エチルアミンで還元後、大腸菌のβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーセ（分子表面にＳＨ基を持つ）とＮ、 Ｎ’ −０−
フェニレンジマレイミドを用いて結合させることにより
酵素標識ＳＣ抗体を調製した。
＋３１３ Ｃ抗体不溶化シリコンとＩｇＡ抗体不溶化セ
ファロースの調製 （２）と同じ方法で調製したＳＣ抗体のＦ （ａｂ’）
２の溶液にシリコン樹脂片（径３ ｍｍ、長さ４ｍｍ）
を入れ、４°Ｃで１晩置いた後シリコン樹脂片を洗浄し
た。このシリコン樹脂片をＳＣ抗体不溶化シリコンとし
て用いた。
ファロースの調製 （２）と同じ方法で調製したＳＣ抗体のＦ （ａｂ’）
２の溶液にシリコン樹脂片（径３ ｍｍ、長さ４ｍｍ）
を入れ、４°Ｃで１晩置いた後シリコン樹脂片を洗浄し
た。このシリコン樹脂片をＳＣ抗体不溶化シリコンとし
て用いた。
一方、ＣＮ Ｂｒ活性化セファロース（ファルマシア・
ファインケミカル社製）とＩｇＡ抗体を反応させＩｇＡ
抗体不溶化セファロースを調製した（抗体５■／ １
ｍｅセファロース）。ＩｇＡ不溶化セファロースは容量
０Ａｒｎｌのミニカラムに充填して用いた。
ファインケミカル社製）とＩｇＡ抗体を反応させＩｇＡ
抗体不溶化セファロースを調製した（抗体５■／ １
ｍｅセファロース）。ＩｇＡ不溶化セファロースは容量
０Ａｒｎｌのミニカラムに充填して用いた。
（４）イムノグロブリンネ溶化セファロースの調製正常
ウサギ血清を塩析し、ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロ
マトグラフィを行ないウサギのイムノグロブリンＧ （
ＩｇＧ）を分離した。このＩｇＧを（３）と同じくセフ
ァロースに不溶化した（ ＩｇＧ １０■／ １ ｍＲ
セファロース）。
ウサギ血清を塩析し、ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロ
マトグラフィを行ないウサギのイムノグロブリンＧ （
ＩｇＧ）を分離した。このＩｇＧを（３）と同じくセフ
ァロースに不溶化した（ ＩｇＧ １０■／ １ ｍＲ
セファロース）。
（５）不溶性担体としてシリコンを用いるＳＣの定量Ｓ
Ｃ標準液（０〜５０ｎｇ／ｍｆｆ） ０．２＋＋＋ｆ
！に（３）で得られたＳＣ抗体不溶化シリコン（以下固
相という）を入れ３０°Ｃで３時間反応させた。反応後
固相を洗浄し、この固相を（２）で得られた酵素標識Ｓ
Ｃ抗体含有液に入れ４０℃で１晩反応後洗浄した。この
固相に結合した酵素活性を螢光基質（４−メチルウンベ
リフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を用いて測定し、
第１図におけるＡの検量線を得た。次にヒト血清の２０
〜１００倍希釈液を用いて同様に測定したところ第１表
Ａｍの結果が得られた。
Ｃ標準液（０〜５０ｎｇ／ｍｆｆ） ０．２＋＋＋ｆ
！に（３）で得られたＳＣ抗体不溶化シリコン（以下固
相という）を入れ３０°Ｃで３時間反応させた。反応後
固相を洗浄し、この固相を（２）で得られた酵素標識Ｓ
Ｃ抗体含有液に入れ４０℃で１晩反応後洗浄した。この
固相に結合した酵素活性を螢光基質（４−メチルウンベ
リフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を用いて測定し、
第１図におけるＡの検量線を得た。次にヒト血清の２０
〜１００倍希釈液を用いて同様に測定したところ第１表
Ａｍの結果が得られた。
一方、酵素標識ＳＣ抗体を（４）で得られたイムノグロ
ブリンネ溶化セファロースのカラムに流し、カラム流出
液、即ち非特異的吸着成分を除去した酵素標識抗体を用
いて上と同様にＳＣを測定したところ第１図におけるＢ
の検量線と第１表Ｂ欄の定量値が得られた。
ブリンネ溶化セファロースのカラムに流し、カラム流出
液、即ち非特異的吸着成分を除去した酵素標識抗体を用
いて上と同様にＳＣを測定したところ第１図におけるＢ
の検量線と第１表Ｂ欄の定量値が得られた。
第１図より明らかなように非特異的吸着成分を除いた標
識抗体を用いることによりＳＣＯｎｇ／検体の酵素活性
が低くなり、もとの標識抗体を用いた場合検出できなか
った０、１ｎｇのＳＣが検出できるようになった。また
、第１表より測定精度（ＣＶ）も向上していることが分
かる。
識抗体を用いることによりＳＣＯｎｇ／検体の酵素活性
が低くなり、もとの標識抗体を用いた場合検出できなか
った０、１ｎｇのＳＣが検出できるようになった。また
、第１表より測定精度（ＣＶ）も向上していることが分
かる。
第１表
（６）不溶性担体としてセファロースを几いるＳ Ｉｇ
Ａの定量 Ｓ ＩｇＡ標準液（０〜１２００ｎｇ／ ｍ、ｅ ）
Ｏ，ＬｍＰと酵素標識ｓｃ抗体含有液０．５ｍｅを混
合し、３７°Ｃで２時間反応させた。この反応液を（３
）で得られたＩｇＡ抗体不溶化セファロースのミニカラ
ムに流し、カラムを洗浄後Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ
−ガラクトシド溶液をカラムに流し室ＩＪＬ（２５℃）
で１晩反応させた。反応後、０．’１ＭＮａ２ ＣＯ３
溶液２．５ｍｆでカラムを洗浄し、洗浄液のＡ４２０ｎ
ｍを測定した。
Ａの定量 Ｓ ＩｇＡ標準液（０〜１２００ｎｇ／ ｍ、ｅ ）
Ｏ，ＬｍＰと酵素標識ｓｃ抗体含有液０．５ｍｅを混
合し、３７°Ｃで２時間反応させた。この反応液を（３
）で得られたＩｇＡ抗体不溶化セファロースのミニカラ
ムに流し、カラムを洗浄後Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ
−ガラクトシド溶液をカラムに流し室ＩＪＬ（２５℃）
で１晩反応させた。反応後、０．’１ＭＮａ２ ＣＯ３
溶液２．５ｍｆでカラムを洗浄し、洗浄液のＡ４２０ｎ
ｍを測定した。
得られた検量線を第２図に示す。第２図におけるＡは処
理をしていない酵素標識ＳＣ抗体、Ｂは非特異的吸着成
分を除いた酵素標識ＳＣ抗体を用いた場合である。明ら
かにＢの検量線の方がＳ ＩｇＡＯｎｇ／検体のＡ ４
２０ｎｍが低く、しかもＳ ＩｇＡＯｎｇ／検体と １
２０ｎｇ／検体のＡ ４２０ｎｍの差が大きいことが分
かる。また血清の１００倍希釈液について上の方法で測
定の精度（ＣＶ）を求めたところ、無処理の酵素標識Ｓ
Ｃ抗体ではＣＶ １０〜２５％であるのに対し、非特異
的吸着成分を除去したものではＣＶ ’７〜１３％とな
り精度の向上が認められた。
理をしていない酵素標識ＳＣ抗体、Ｂは非特異的吸着成
分を除いた酵素標識ＳＣ抗体を用いた場合である。明ら
かにＢの検量線の方がＳ ＩｇＡＯｎｇ／検体のＡ ４
２０ｎｍが低く、しかもＳ ＩｇＡＯｎｇ／検体と １
２０ｎｇ／検体のＡ ４２０ｎｍの差が大きいことが分
かる。また血清の１００倍希釈液について上の方法で測
定の精度（ＣＶ）を求めたところ、無処理の酵素標識Ｓ
Ｃ抗体ではＣＶ １０〜２５％であるのに対し、非特異
的吸着成分を除去したものではＣＶ ’７〜１３％とな
り精度の向上が認められた。
実施例２ サイログロブリンの定量
（１）サイログロブリン（Ｔ Ｇ）とサイログロブリン
抗体の調製 ヒトのＴＧは市販品を用いた。このＴＧをマウスに注射
することにより抗ＴＧ血清を得、実施例１（１）に準じ
てＴＧ抗体を分離した。
抗体の調製 ヒトのＴＧは市販品を用いた。このＴＧをマウスに注射
することにより抗ＴＧ血清を得、実施例１（１）に準じ
てＴＧ抗体を分離した。
（２）酵素標識抗体の調製
西洋ワサビのパーオキシダーゼを過ヨウ素酸ソーダで処
理し、パーオキシダーゼの糖鎖部分を過ヨウ素酸酸化し
た後、（１１で得られたＴＧ抗体と反応させて酵素標識
抗体を調製した。
理し、パーオキシダーゼの糖鎖部分を過ヨウ素酸酸化し
た後、（１１で得られたＴＧ抗体と反応させて酵素標識
抗体を調製した。
調製した酵素標識抗体の一部は実施例１（４）に準じて
調製したマウスのＩｇＧを不溶化したセファロースのカ
ラムに流し、非特異的吸着成分を除去した。
調製したマウスのＩｇＧを不溶化したセファロースのカ
ラムに流し、非特異的吸着成分を除去した。
＋３１７ Ｇ抗体不溶化ポリスチレンピーズの開裂（１
）で調製したＴＧ抗体の溶液にポリスチレンビーズ（径
４．４ｍｍ）を入れ、４°Ｃで１晩置いた後、ポリスチ
レンビーズを洗浄した（ＴＧ抗抗体不化化ポリスチレン
ビーズ以下固相という）。
）で調製したＴＧ抗体の溶液にポリスチレンビーズ（径
４．４ｍｍ）を入れ、４°Ｃで１晩置いた後、ポリスチ
レンビーズを洗浄した（ＴＧ抗抗体不化化ポリスチレン
ビーズ以下固相という）。
（４１Ｔ Ｇの測定
ＴＧＧ準液（０〜２５ｎｇ／＋＋＋ｊり ０．２ｍｆ
ｆに固相を入れ３０℃で１時間反応後、固相を洗浄し酵
素標識抗体含有液に固相を入れ３０℃で１時間反応させ
た。
ｆに固相を入れ３０℃で１時間反応後、固相を洗浄し酵
素標識抗体含有液に固相を入れ３０℃で１時間反応させ
た。
この固相に結合した酵素活性をオルトフェニレンジアミ
ンと過酸化水素を基質として測定した（反応液の液量は
最終１ｒＲｅ）。無処理の酵素標識抗体を用いた場合の
検量線を第３図におけるＡに、非特異的吸着成分を除い
た酵素標識抗体を用いた場合を第３図のＢに示す。第３
図において検量線Ｂは検量線Ａに比べて明らかにＴ Ｇ
Ｏｎｇ／検体の酵素活性（Ａ ４９０ｎｍ 、）が低
く、しがもＴ ＧＯｎｇ／検体と５ ｎｇ／検体のＡ
４９０ｎｍの差が大きいことが分かる。測定のばらつき
（ＣＶの平均）も、検量線Ａが１２．５に対して検量線
Ｂは８．１％と低い値を示した。
ンと過酸化水素を基質として測定した（反応液の液量は
最終１ｒＲｅ）。無処理の酵素標識抗体を用いた場合の
検量線を第３図におけるＡに、非特異的吸着成分を除い
た酵素標識抗体を用いた場合を第３図のＢに示す。第３
図において検量線Ｂは検量線Ａに比べて明らかにＴ Ｇ
Ｏｎｇ／検体の酵素活性（Ａ ４９０ｎｍ 、）が低
く、しがもＴ ＧＯｎｇ／検体と５ ｎｇ／検体のＡ
４９０ｎｍの差が大きいことが分かる。測定のばらつき
（ＣＶの平均）も、検量線Ａが１２．５に対して検量線
Ｂは８．１％と低い値を示した。
実施例３ エノラーゼの定量
（１）エノラーゼ（ＮＳＥ）とエノラーゼ抗体の９１ウ
シの脳油出液よりイオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾
過等の方法で神経組織特異型エノラーゼ（ＮＳＥ）を精
製し、更にこのＮＳＥを用いてウサギの抗ＮＳＥ血清を
調製した。この抗ＮＳＥ血清より実施例１（１）に準じ
てＮＳＥ抗体を調製した。
シの脳油出液よりイオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾
過等の方法で神経組織特異型エノラーゼ（ＮＳＥ）を精
製し、更にこのＮＳＥを用いてウサギの抗ＮＳＥ血清を
調製した。この抗ＮＳＥ血清より実施例１（１）に準じ
てＮＳＥ抗体を調製した。
（２）酵素標識抗体とＮＳＥ抗体不熔化セファロースの
調製 上記ＮＳＥ抗体より実施例１（２）に準じてＦ （ａｂ
’）２部分を得た後、これとβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
と結合させて酵素標識抗体を得た。この酵素標識抗体の
一部をウサギのＩｇＧを不溶化したセファロースのカラ
ムに流し非特異的吸着成分を除いた。
調製 上記ＮＳＥ抗体より実施例１（２）に準じてＦ （ａｂ
’）２部分を得た後、これとβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
と結合させて酵素標識抗体を得た。この酵素標識抗体の
一部をウサギのＩｇＧを不溶化したセファロースのカラ
ムに流し非特異的吸着成分を除いた。
一方、ＮＳＥ抗体を実施例１（３）に準じて処理しＮＳ
Ｅ抗体不溶化セファロースを調製した。
Ｅ抗体不溶化セファロースを調製した。
（３１Ｎ Ｓ Ｂの測定
ＮＳＥ標準液（０〜１１０００ｎ／ ｍｆ！ ） ０
．１ｍｅと酵素標識抗体含有液０．５ｍＪ！を混合し、
３７°Ｃで２時間反応させた。この反応液をＮＳＥ抗体
不溶化セファロースのミニカラムに流し、更にミニカラ
ムを洗浄後Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド
溶液をミニカラムに流し＼室温（２５℃）で１晩置いた
。次にカラムを０．１ＭＮａ２ＣＯ３熔液１ｉで洗浄し
、この洗浄液のＡ ４２０ｎｍを測定した。無処理の酵
素標識抗体を用いた場合の検量線を第４図のＡに、非特
異的吸着成分を除いた酵素標識抗体を用いた場合を第４
図のＢに示す。検量線Ａでは０、１ｎｇのＮＳＥは測定
できないが、Ｂでは０．１ｎｇのＮＳＥが測定できるこ
とが分かる。また検量線Ｂの方がＡ ４２０ｎｍの変化
が大きく、測定精度も良かった。
．１ｍｅと酵素標識抗体含有液０．５ｍＪ！を混合し、
３７°Ｃで２時間反応させた。この反応液をＮＳＥ抗体
不溶化セファロースのミニカラムに流し、更にミニカラ
ムを洗浄後Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド
溶液をミニカラムに流し＼室温（２５℃）で１晩置いた
。次にカラムを０．１ＭＮａ２ＣＯ３熔液１ｉで洗浄し
、この洗浄液のＡ ４２０ｎｍを測定した。無処理の酵
素標識抗体を用いた場合の検量線を第４図のＡに、非特
異的吸着成分を除いた酵素標識抗体を用いた場合を第４
図のＢに示す。検量線Ａでは０、１ｎｇのＮＳＥは測定
できないが、Ｂでは０．１ｎｇのＮＳＥが測定できるこ
とが分かる。また検量線Ｂの方がＡ ４２０ｎｍの変化
が大きく、測定精度も良かった。
第１図、第２図、第３図及び第４図はそれぞれ本発明に
おけるＳ Ｃ，Ｓ ＩｇＡ、、ＴＧ及びＮＳＥを定量す
るための検量線を示すものであり、各図中、Ａの検量線
は無処理の酵素標識抗体を用いた場合を示し、Ｂの検量
線は非特異的吸着成分を除いた酵素標識抗体を用いた場
合を示す。 特許出願人 天野製薬株式会社 第１図 ＳＣ（ｎｇ／検体） ７５２図 ＋１． ４０ ８０
１’２０Ｓ■ｙ、Ａ （’ｌ）！／
検体） 第３図 ０ １ ２ ３ ４ ５・ｌ
・ｃ（１１ｇ／検体）
おけるＳ Ｃ，Ｓ ＩｇＡ、、ＴＧ及びＮＳＥを定量す
るための検量線を示すものであり、各図中、Ａの検量線
は無処理の酵素標識抗体を用いた場合を示し、Ｂの検量
線は非特異的吸着成分を除いた酵素標識抗体を用いた場
合を示す。 特許出願人 天野製薬株式会社 第１図 ＳＣ（ｎｇ／検体） ７５２図 ＋１． ４０ ８０
１’２０Ｓ■ｙ、Ａ （’ｌ）！／
検体） 第３図 ０ １ ２ ３ ４ ５・ｌ
・ｃ（１１ｇ／検体）
Claims (1)
- 酵素標識抗体含有液をイムノグロブリン又はイムノグロ
ブリンの分解物を不溶化せしめた不溶性担体に接触せし
め、非特異的吸着成分を該不溶性担体に吸着せしめるこ
とを特徴とする酵素標識抗体に含まれる非特異的吸着成
分の除去法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1905283A JPS59143960A (ja) | 1983-02-08 | 1983-02-08 | 酵素標識抗体に含まれる非特異的吸着成分の除去法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1905283A JPS59143960A (ja) | 1983-02-08 | 1983-02-08 | 酵素標識抗体に含まれる非特異的吸着成分の除去法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59143960A true JPS59143960A (ja) | 1984-08-17 |
Family
ID=11988652
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1905283A Pending JPS59143960A (ja) | 1983-02-08 | 1983-02-08 | 酵素標識抗体に含まれる非特異的吸着成分の除去法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59143960A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08114590A (ja) * | 1994-09-23 | 1996-05-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | 測定すべき物質の定性的または／および定量的検出法 |
| JP2018004371A (ja) * | 2016-06-30 | 2018-01-11 | シスメックス株式会社 | 免疫複合体転移法により被検物質を検出するための抗体試薬及びその製造方法、並びにその抗体試薬の利用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5512419A (en) * | 1978-07-13 | 1980-01-29 | Teikoku Hormone Mfg Co Ltd | Immunological measurement and reagent therefor |
-
1983
- 1983-02-08 JP JP1905283A patent/JPS59143960A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5512419A (en) * | 1978-07-13 | 1980-01-29 | Teikoku Hormone Mfg Co Ltd | Immunological measurement and reagent therefor |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08114590A (ja) * | 1994-09-23 | 1996-05-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | 測定すべき物質の定性的または／および定量的検出法 |
| JP2018004371A (ja) * | 2016-06-30 | 2018-01-11 | シスメックス株式会社 | 免疫複合体転移法により被検物質を検出するための抗体試薬及びその製造方法、並びにその抗体試薬の利用 |
| CN107589249A (zh) * | 2016-06-30 | 2018-01-16 | 希森美康株式会社 | 用于通过免疫复合物转移法检测被检物质的抗体试剂及其制造方法、以及该抗体试剂的用途 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4670383A (en) | Immune-chemical measurement process for haptens and proteins | |
| JPS6035264A (ja) | 保護結合検定法 | |
| JP2642342B2 (ja) | 固相拡散試験法 | |
| EP0840895B1 (en) | Methods of obtaining receptor:release ligand (reland) complexes and test assays | |
| US4729961A (en) | Process for the detection and assay by erythroadsorption | |
| De Alwis et al. | Reversibly immobilized glucose oxidase in the amperometric flow-injection determination of glucose | |
| JPH01209370A (ja) | 免疫活性物質の測定法及び測定試薬 | |
| JP3282129B2 (ja) | 固相非分離酵素分析 | |
| JPS59143960A (ja) | 酵素標識抗体に含まれる非特異的吸着成分の除去法 | |
| JPH02193071A (ja) | ハプトグロビン―ヘモグロビン複合体測定用試薬キット及びそれを用いるハプトグロビン―ヘモグロビン複合体の測定法 | |
| JPH0587809A (ja) | 特定タンパク質の糖化割合の測定方法 | |
| SU1158029A3 (ru) | Способ количественного определени трийодтиронина | |
| JP3898618B2 (ja) | 酵素免疫測定法による抗血液凝固因子抗体の定量方法 | |
| JPH08313530A (ja) | 総ヘモグロビン測定方法及び測定キット | |
| JPS59210365A (ja) | 均一系免疫試験法ならびにそれに用いるための試薬系、試験キツトおよび試験具 | |
| JPS587560A (ja) | 銅，亜鉛−ス−パ−オキシドディスムタ−ゼ測定用試薬 | |
| JPH05249108A (ja) | Ｐｉｖｋａ−ｉｉの測定試薬 | |
| JPS62258399A (ja) | Ｃ−反応性蛋白質の精製方法 | |
| JPH08509064A (ja) | 化学的に架橋したタンパクの固相支持体上の固定化 | |
| JPS58144747A (ja) | Ｓ―１００タンパクの高感度測定法 | |
| JPH04221762A (ja) | 免疫学的測定法 | |
| JPS62238462A (ja) | 高感度抗体測定方法 | |
| JPS63290963A (ja) | 酵素標識抗体感作ラテックス及びそれを用いた酵素免疫測定法 | |
| JPS62238463A (ja) | プラスミン―α２プラスミンインヒビター複合体の測定方法 | |
| JPS63159759A (ja) | 酵素免疫測定法 |