JPS5913753A - 免疫促進作用を有するノナペプチドおよびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、式Ｉ ［１ｕ−Ａｓｐ−８ｅｒ−８ｅｒ−８ｅｒ−Ｔ１１ｒ−
Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−ＯＨ（１）のノナはプチド（
Ｌ−ピログルタミル−スノξルチル−Ｌ−セリル−Ｌ−
セリル−し一セリルーＬースレオニルーＬ　−　りＩＪ
シル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−アスノξラギン）およ
びそれと有機塩基、アルカリ金属ならびにアルカリ土類
属イオンとの塩類、そしてそれの薬学的組成物ならびに
用法に関する。

本発明はまた、式■ ［’Ｇ１ｔｒ−Δｅｐ（ＯＢｕｔ）−Ｓｅｔ　（Ｂｕｊ
’）−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｔｈｒ（Ｂｕ’ｊ；）−Ｇｌ
ｙ−Ｔｒｐ−ＡＦ３ｎ−ＯＢｕｔ（ＩＩ）の保護された
はプチドをはプチド化学におけるトリプトファンを含有
するはプチドに対する常法［　Ｈ，　Ｇｒｏｓｅおよび
Ｊ．　Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ　　両氏編ｒ　Ｔｈｅ　Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ　ｊ　（アカデミツク−プレス社（１９
８１年）刊行）中のＲ．　ＧｅｉｇｅｒおよびＷ。

Ｋｏｎｉｇ両氏の論文を参照〕により第６級ブチルタイ
プの保護基を除去することを特徴とする前記化合物の製
法に関する。

インターフェロンは抗ウィルス作用のほかにまた免疫促
進作用を有する［　Ｗ．　Ｆｉ．　Ｓｔｅｗａｒｄ氏著
「Ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｊ（
　スプリンガー社（１９７９年）刊行）参照〕。

飛くべきことに、ヒトの線維芽細胞インターフェロン［
　［Ｎａｔｕｒｅ　Ｊ第２８５巻第５４２〜５４７頁（
１９８０年）〕の部分配列に該当する式■のノナはプチ
ド Ｑｌｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−６！ｅｒ−日ｅｒ−Ｔｈｒ−
Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−ＯＨ　　　　　（１）は、試
験管内試験において、すでに強力な免疫促進作用を示し
た。

式■のはプチドの合成は、６個の：５はプチドと１個の
トリペプチドのセグメント結合により進められた（合成
方式を参照）。はプチドの縮合［　［ＩＧｌｕ−Ａｓｐ
（ＯＢｕｔ）−０Ｈの合成は例外〕には、ジシクロへキ
シルカルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾ）　ＩＪア
ゾール（　ＤＣａ／ｕｏＢｔ　）法が用いられた。

Ｃｌｕ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−ＯＨは、１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾールにより触媒されるピログルタミンＩ
ｔ　−　２．４．５　−　）　１ｊクロロフエニルエス
テル（　［Ｉ’Ｇ　１　ｕ　−　Ｏ　Ｔ　ｃ　ｐ　）の
Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）による置換によって調製される。側
鎖の機能およびＣ末端カルボキシル基は、第３級ブチル
エーテル（Ｂｕｔ）あるいけ第６級ブチルエステル（　
ＯＢｕｔ）として閉塞される。第３級ブチルエステルあ
るいは第ろ級ブチルエーテルの存在下における接触的水
素化により選択的に除去され得るベンジルオキシカルボ
ニル残基■）は、アミン基の機能に対する中間的保護と
してはたらく。２個のセグメントのカルボキシル基は、
メチルエステル（ＯＭθ）あるいはエチルエステル（ｏ
ｇｔ）を用いて途中の間保護された。これらのエステノ
叫１接触的水素化の際には安定であるが、第ろ級プデル
タイブの保護基の存在下においてはアルカリにより選択
的に除去さノコ、る。

式■のはザチドの保持基は、その物質を９０チのトリフ
ルオロ酢酸に溶解することにより除去される。トリプト
ファンの第３級ブチル化を用型するためには、チオール
化合物を合目的的に加える。１．２−メルカプトエタン
が特に有利であることが示された。

本発明によるノナはプチドは、プラーク形成細胞検定法
（ＰＥＣテスト）およびフイトヘモアグルチニン促進試
験法（ＰＨＡテスト）により淋巴球促進作用について試
験された。

ＰＥＣテストには、新しく調製したマウスの肺臓（牌臓
細胞１０　’　／ｍｌ　）をＲＰＭ工１６４０培地およ
び牛脂児面清（ＦＫＳ）の細胞培養１ｍ７！当り３０μ
λ中で細胞培養を行った。試験管中での免疫処置は羊の
赤血球５Ｘ１０’／ｍｌを用いて行われた。

試験細胞培養は、該当する投与酸の被験物質と共に毎日
保温された。

５日間経過の後に細胞を遠心分離し、ＲＰＭ１１６４０
培地で洗浄し、そして直接的ＰＥＣテストに導入した。

このために、細胞を１０％の羊赤面球懸濁液とアガロー
ス溶液中で混合し、平板面上に注ぎ広げた。こうして作
られたゲル層中で保温（インキュベーション）中に促進
された淋巴球は抗体をその周囲に分泌し、その抗体は拡
散してそこに存在する羊廂球に結合する。テンジクネズ
ミ補体を加えた後には血球は溶廂する。そして赤褐色の
ゲル中に肉眼で認められる円形の明るい斑点すなわちプ
ラークの溶面斑が成立する。このような溶血斑の中心に
は、抗体を産生ずる細胞が存在する。特異的免疫グロブ
リンを産生ずる淋巴細胞の数は、従って得られたプラー
ク数と処置され得る。

ＰＨＡテストにおいては、植物レクチンＰＨＡを用いる
促進可能性機能試験により、成熟したすなわち促進可能
な淋巴球の数が逆−９して得られる。淋巴球はレクチン
により、細菌性またはウィルス性抗原によると同様に、
球芽状変形を誘発される。これは直接にまたはリンホキ
ニンの分泌により増殖に導く。

一定時間内における放射性チミジンのとりこみは、そこ
で促進された細胞の数を計算する指樟である。成熟した
または免疫的に能力のある細胞のみが促進される。それ
で、ある物質の淋巴球成熟への影響をこの試験を用いて
追跡することができる。すべてについて促進は最適以下
でなくてはならず、つぎに他の同質の淋巴球集団はさら
に高い濃度において促進され、それ以上ではもはや効果
が見られないであろう。本発明によるズプチドは種々の
濃度で培地に加えられた。

両方の試験システムにおいて、本発明のノナはプチドに
よる淋巴球促進は、投与量依存的な中央の高い鐘形の曲
線が認められた（第１表および第２表参照）。

本発明のノナはプチドを用いた実験結果第１表　　ＰＦ
Ｏテスト 第２表　　ＰＨＡテスト （ＰＨＡ　２０μ９７ｍ１添加、テスト期間７２時間）
対　　　照　　　　１１４，３１１ ５．０　　　　　　　１０７，６７０　　　　　ＬＪ、
９４１．０　　　　　　　１１３，９７８　　　　１．
０００．５　　　　　　　１１，８３１　　　　１．２
６０、１２５　　　　　１３７．５１９　　　　１．２
００．０１２５　　　　１０１，５９４　　　　０．８
９本発明の化合物は、免疫欠損、ウィルス性、真菌性な
らびに慢性細菌性感染症、自己免疫病の処置および細胞
膜特性が免疫学的に著量な素化を生じた細胞（例えば腫
瘍細胞）に起因する疾病の療法に用い得ろう 本発明はさらにここに記述するズプチドのＴ淋巴細胞の
成熟に影響する全面的一般利用、およびこのＲプチドを
有効成分として含有する薬剤に関する。

本発明のはプチドの投与は、静脈内、皮下または鼻腔中
に行い得る。非経口的の場合の投与量は０．０１〜１０
■（体重１に２１日当り約０．１〜１００μｍ）、鼻腔
内では１回の投与量は０．１〜１００■である。非経口
的投与の場合の喰は、好ましくは体重１に９１日当りｏ
、ｉ〜１０μ？、最適には０．２〜５ｔｔｆである。従
来有毒な特性は認められないので、重症の嚇合には増肴
してもよい。また投与量を減らすことも可能である。

本発明の化合物は、鼻腔内または非経口的投与に対応し
て薬学的に調合され得る。鼻腔内投与のためには、この
化合物はこのための通常の添加剤すなわち安定剤または
不活性の希釈剤と混合され、常法により適当な投与用量
形すなわち永訣、アルコール性寸たは油性の懸濁液ある
いは水性、アルコール性または油性の溶液とされる。油
性の担体または溶縛としては、例えばひまわり油または
肝油のような植物性または動物性の油が考慮に入江らね
、る。皮下および静脈内投与のためには、有効な化合物
またはその生理学的に受容可能な塩は、溶液、懸濁液ま
たは乳濁液中に最も好ましくけ溶解促進剤、乳化剤また
はその他の補助剤と共に用いられる。

新規な有効物質およびそれに村１．シする生理学的に受
容可能な塩のための溶媒としては、例えば水、生理的食
塩水または例えばエタノール、プロパンジオエルあるい
はグリセリンのごときアルコール類、ならびにグルコー
スまたはマニトールのごとき糖類溶液、あるいは上記の
各種溶媒の混合液が考慮される。

実施例１　ズプチドを結合させる一般的操作法（第３表
） ジメチルホルムアミドあるいはジメチルアセタミド１０
〜１００　ｍｅ中２−アミノ酸あるいは２−Ｒプチド１
０ミリモルおよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１
．３５１の溶液に、アミノ酸あるいけばプチドエステル
塩酸塩１０ミリモル、Ｎ−エチルモルホリン１．６−お
よびジシクロへキシルカルボジイミド２，２Ｆを０℃に
おいて加える。２〜３時間０℃において攪拌し、しかる
後室温において終夜静置する。

〔後処理Ｉ〕

沈殿物（：）シクロヘキシル尿素）を吸引除去し、ろ液
を濃縮する。残留物を水および氷酢酸の間で分配する。

酢酸相を順次にＮａＨＯＯｇ飽和溶液、ＫＨＥＩｏ　４
／に２Ｓ０４緩衝液およびＮａＨＯＯ３飽和溶液と共に
振盪し、Ｎａ２日０４上で乾燥させ濃縮する。

残留物を多くの場合石油エーテルと共にすりつぶすかま
たは酢酸エステル／石油ニーデルから結晶析出せしめる
。

〔後処理■〕

バッチ（シンクロヘキシル尿素に伴って沈殿する肉質）
をＮａＨＣＯ３の飽和溶性１０ｍ／および約５倍獣の水
（溶媒の酸により決定ずろ）と共に攪（千し、吸引採取
し、水で洗浄し、そしてＰ２Ｏ５上で乾・けする。

実（イり１例１の一般的操作法および合［ｙ、方式にギ
。

じて製造されプヒはゾチドを次に示す。

実施例２　ベンジルオキシカルボニル基の選択的除去の
ための一般的操作法（第４ 表） はプヂド２５〜１０ｆを、そハ、ぞれの溶解性に従い約
１５０ｍｆ！のメタノールまたはトリフルオロエタノー
ル中に溶解あるいは懸濁させた。窒素ガスで洗いながら
パラジウム／カーボン触媒を加え、つぎに撹拌し７つつ
そして約１〜２規定の塩酸を加えつつｐＨ４，５（自動
滴定装置）において水素を溶液中に通じる。塩酸がそれ
以上とり込まれなくなったら再び窒素ガスで洗い、触媒
を濾過除去し、炉液を濃縮する。残畜物を原則としてエ
ーテルと共にすりつぶし、吸引採取する。

実施例２の一般操作法例よって調製されるはブチじエス
テル塩酸噂は次のとおりでちるつ実施例ろ　ズプチドメ
チルエステルのけん化のための一般的操作法（第５表） ペプチド１０ミリモルをジオキザン／水（８：２）混合
液５０　ｍｌ中に溶解する。つぎに１規定Ｎａ、０Ｈ１
１−を攪拌しながら加え、その後１時間室温において撹
拌する。しかる後少量（１〜２　ｍｅ　）の１規定Ｈ２
ｓｏ４で中和し、沈殿物を集める。残留物を水冷下にお
いて１規定Ｈ２Ｓ０ａと酢酸エステル５０　ｍｌの間で
分配する。酢酸エステル相を順次にＫＨ２Ｓ　Ｏ４／Ｋ
　２　ｅ　Ｏ４緩衝液および水で洗浄し、　Ｎａ２ｓｏ
４上で乾燥し、濃縮する。残留物からシンクロヘキシル
アミン塩がエーテル中に調製される。

実施例乙の一般的操作法によって製造された２ペプチド
は次のとおりである。

［’Ｇ］、ｕ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−０Ｈの合成ジメチ
ルホルムアミド２０　ｍｔ中にＨ−ＡＥＩｐ（ＯＢｌ、
Ｌ”）−ＯＨ１，９？　（１０ミリモル）およびＨＯＢ
ｔ　１．３５１の！！！！ｆ＠液に１１１）１ｕ−ＯＴ
ｃｐ　３．４　ｒをカロえ、数時間室ｉにおいて攪拌し
、そして終夜静置する。翌日に高度へ空中で濃縮し、残
留物をエーテルと共にすりつぶす。沈殿物を吸引採取し
、エーテルで洗浄する。収量け２．７ｆである。物へは
′まり多少のＨＯＢｔを含むので、セファデックス■Ｌ
■ｔ２０（カラム寸法１００Ｘ４α）に７０チメタノー
ルによりクロマトグラフ例かける。収電２．５５ｆ　（
８５％）、融点１１４〜１５９°、〔α］ｏ＝→−１，
９°（ｃ＝１、メタノール中）。

Ｄ：４１ｕ−Ａｓｐ−６ｅｒ−８ｅｒ−８ｅｒ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｅｎ−ＯＨの合成Ｑ１ｕ　−Ａｅ
　ｐ　（０Ｂｕｔ）−Ｂｏ　ｒ（Ｂｕｉ；　）　−８ｅ
ｒ　（Ｂｕｔ）−Ｓ　ｅｒ（Ｔｈｔ）−Ｔｈｒ（Ｂｕｔ
）−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｅｎ−ＯＢｕｔａｓｃ＋＋ｖ　
（６，９ミリモル）をトリフルオロ酢酸／水／１．２−
Ｊメルカゾトエタン（９：１：１）混合液に溶解する。

室温にｋいて１時間静１配し、濃縮し、残留物をエーテ
ルと共にすりつぶす。収量は６５０１ｎｙ。

精製のためには、物質をメタノール３０ｍ／！中で煮沸
し、冷却後室温において吸引採取する。収量け４３０ｒ
ｒ（６５％）。アミノ酸分析（６規定ＨＣａ中１２０℃
（（、！、−いて２４時間加水分解）の結果は次のとお
りである。

Ａｑｐ　　　Ｔｈｒ　　　Ｓｅｒ　　　Ｑｌｕ　　　Ｏ
ｌｙ　　　Ｔｒｐ計算値　２１３１１　　　　１ 実験値　１．９４　０，８６２，６１　１，００　１．
０４　　−この加水分解条件下においてトリプトファン
は完全に、またセリンおよびスレオニンは部分的に破壊
される、このことによりＴｒｐが全く存在しないことな
らびにＳｅｒおよびＴｈｒの値が低下していることが説
明される。紫外線スＲクトルではＴｒｐに特有の吸収帯
が２７０ｎｍ［ある。

はプチド中の含有量は１分子。アミノ酸分析および紫外
スＲクトルは９５％。〔α球’＝−ｓ４．ｑ。

（Ｃ＝１、ＮｔｓＨＯ０５飽和溶液中）。

特Ｗ［出願人　　ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト
ーづ。

、’−、＋ ドイツ連邦共和国デー−６２３３ケ ルクハイム／タウヌス・ペスタ ロツイシュトラーセ４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）式■ Ｑｌｕ−Ａｓｐ−！；ｅｒ−８ｅｒ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−
   Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−ＯＨ（１）のノナペプチド（
   Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−セリル−
   Ｌ−セリル−Ｌ−セリル−Ｌ−スレオニル−クリシル−
   Ｌ−トリプトフイル？Ｌ−アスパラギン）およびそれと
   有機塩基、アルカリ金属ならびにアルカリ土金属イオン
   との生理学的に受容可能な塩類。 ２）式■ Ｑｌｕ−Ａｅ、ｐ−（ＯＢｕｔ）−８ｅｒ　（Ｂｕｔ）
   −８ｅｒ　（Ｂｕ”−）−８ｅｒ　（Ｂｕｔ）−Ｔｈｒ
   （Ｂｕｔ）−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｅｎ−ＯＢｕｔ　　　
   　　　　　　　　　　　　　　　（［）（ただし式中Ｂ
   ｕｔは第６級ブチル残基または第３級ブチルタイプの他
   の保護基を表わす）の保護されたはプチドをトリプトフ
   ァン含有はプチドに対するはプチド化学における常法に
   より保護基除去し、そして場合により得られるノナはプ
   チドを生理学的に受容可能な塩に導くことを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の化合物の製造方法。 ３）式■ 口１ｕ−Ａｓ　ｐ（ＯＢｕｊ）−８ｅｒ（Ｂｕｔ）−８
   ｅｒ（Ｂｕｔ）−８ｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｔｈｒ（Ｂｕｊ）
   −Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｅｎ−ＯＢｕｌ：　　　　　　　
   　（ＩＩ）（ただし式中Ｂｕｔけ第６級ブチル残基また
   は第６級ブチルタイプの他の保護基を表わす）の化合物
   。 ４）特許請求の範囲第１項記載の式■の化合物を含有す
   る薬剤。