JPS59120100A - 水性試料中の細菌の検出方法 - Google Patents
水性試料中の細菌の検出方法Info
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- JPS59120100A JPS59120100A JP58236505A JP23650583A JPS59120100A JP S59120100 A JPS59120100 A JP S59120100A JP 58236505 A JP58236505 A JP 58236505A JP 23650583 A JP23650583 A JP 23650583A JP S59120100 A JPS59120100 A JP S59120100A
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- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、還元性基質を指示薬として用いて細菌の存在
を検出する水性試料の臨床分析に関する・従来技術 特異的で有効な抗体の利用可能性の増大に相応して、よ
シ迅速な感染の臨床的診断方法が要求されている。感染
の標、準的診断方法は、感染している細菌を含むと考え
られる試料を培養するものであるが、この方法は熟練者
でなければできない時間のかかる方法である。このため
、体液中の細菌を検出及び定量するための化学的方法が
探究されている。
を検出する水性試料の臨床分析に関する・従来技術 特異的で有効な抗体の利用可能性の増大に相応して、よ
シ迅速な感染の臨床的診断方法が要求されている。感染
の標、準的診断方法は、感染している細菌を含むと考え
られる試料を培養するものであるが、この方法は熟練者
でなければできない時間のかかる方法である。このため
、体液中の細菌を検出及び定量するための化学的方法が
探究されている。
1つの公矧方法は指示薬として還元性色原体を欧州する
ものである。この方法はウロスクリーンTM(Uros
creenTM; トリフェニルテトラゾリウム)とし
て知られる試薬を使用するものであって、[推定的細菌
尿症の簡易な半定量的鑑別方法(ASimple Se
m1quantitative Diagnostic
Screening Method for Pres
umptiveBacteriuria) J +ファ
イザー(Pfizer) +ダイアグノスチイノクス・
ディビジョン(Diagnostics+Divisi
on )−ニューヨーク(小冊子)、1974年に記載
されている。ウロスクリーンTMハ多数ノ細菌の存在下
で4時間のインキュベーション後に還元されてビンクル
赤の子爵性析出物になる緩衝化された乾燥試薬である。
ものである。この方法はウロスクリーンTM(Uros
creenTM; トリフェニルテトラゾリウム)とし
て知られる試薬を使用するものであって、[推定的細菌
尿症の簡易な半定量的鑑別方法(ASimple Se
m1quantitative Diagnostic
Screening Method for Pres
umptiveBacteriuria) J +ファ
イザー(Pfizer) +ダイアグノスチイノクス・
ディビジョン(Diagnostics+Divisi
on )−ニューヨーク(小冊子)、1974年に記載
されている。ウロスクリーンTMハ多数ノ細菌の存在下
で4時間のインキュベーション後に還元されてビンクル
赤の子爵性析出物になる緩衝化された乾燥試薬である。
製造業者は、色の濃いまたは血液を含んだ尿では結果が
不鮮明になると注釈している。
不鮮明になると注釈している。
このタイプの方法には重大な問題がある。臨床感染には
著しい数の白血球を伴うことが多く、それが分析のだめ
の試料中にも存在するであろう。
著しい数の白血球を伴うことが多く、それが分析のだめ
の試料中にも存在するであろう。
さらに感染がない場合でさえ、尿のような試料中に著し
い数の白血球が存在することもある。都合の悪いことに
、白血球もまた、ウロスクリーンTMのような公昶の色
原体全還元し得るため、白血球による色原体の還元は誤
った陽性の結果を生ずる。
い数の白血球が存在することもある。都合の悪いことに
、白血球もまた、ウロスクリーンTMのような公昶の色
原体全還元し得るため、白血球による色原体の還元は誤
った陽性の結果を生ずる。
このため、公知の細菌アッセイは信頼性がなく、定量化
はできない。
はできない。
発明の目的
本発明の目的は細閘アッセイにおける白血球妨害の問題
全解決することにるる。
全解決することにるる。
発明の構成
本発明の目的は、検出可能な最終生成物を形成する還元
性指示薬と試料を接触せしめながらまたは接触せしめる
前に、細菌を溶解せずに白血球を選択的に溶解するのに
充分な量の界面活性剤と試料を接触せしめ、インキュベ
ートし、そして存在する細菌の量全最終生成物の量の関
数として検出することによって達成される。
性指示薬と試料を接触せしめながらまたは接触せしめる
前に、細菌を溶解せずに白血球を選択的に溶解するのに
充分な量の界面活性剤と試料を接触せしめ、インキュベ
ートし、そして存在する細菌の量全最終生成物の量の関
数として検出することによって達成される。
作用
本発明は、細菌もしくは白血球または両者を含む可能性
のある水性試料を分析する方法に関する。
のある水性試料を分析する方法に関する。
このような試料は一般に、尿、血液及び脳を髄液のよう
な体液金倉む。疾病及び感染の診断における手段として
試料の細胞成分を検定するために分析を行なう。本発明
によれば、水性臨床標本中の種々の細胞成分を区別する
ことができる。
な体液金倉む。疾病及び感染の診断における手段として
試料の細胞成分を検定するために分析を行なう。本発明
によれば、水性臨床標本中の種々の細胞成分を区別する
ことができる。
任意の手段によって白血球を溶解すると白血球細胞の還
元能が阻吾されることが判明した。「細胞浴屏」とは細
胞単位の破壊または分解を意味する。還元阻吾は細胞膜
を完全または不完全に溶解すると起こる。
元能が阻吾されることが判明した。「細胞浴屏」とは細
胞単位の破壊または分解を意味する。還元阻吾は細胞膜
を完全または不完全に溶解すると起こる。
本発明は選択的溶解方法、すなわち、細菌全溶解せずに
白血球を溶解する方法を用いるものである。選択的溶解
が可能なのは、2種の細胞の間に構造上の相違があるた
めである。細菌は硬い細胞壁で包まれているのに対し7
、白血球にはこの硬い構造がない。白血球の硬い構造全
破壊するいくつかの化学的及び機械的操作は細胞壁の状
態に影響を与えず、細胞壁は完全な状態に保たれる。
白血球を溶解する方法を用いるものである。選択的溶解
が可能なのは、2種の細胞の間に構造上の相違があるた
めである。細菌は硬い細胞壁で包まれているのに対し7
、白血球にはこの硬い構造がない。白血球の硬い構造全
破壊するいくつかの化学的及び機械的操作は細胞壁の状
態に影響を与えず、細胞壁は完全な状態に保たれる。
白血球を選択的に溶解する手段は、超音波振動による試
料の処理、すなわち、超旨波処理と称される手法を才む
。選択的溶解のだめのこの処理は当業界では公昶である
。一定条件の出刃及び暴露時間を用いて超斤波処理する
ことによって白血球全選択的に溶解し得る。超音波処理
に適当な装置としては、音響変換6に一ホーン集成装置
及びマイクロチップ〔ヒート・システムズーウルトラン
ー二ノクス社(Heat Systems−Ultra
sonics+Inc、)+ニーーヨーク州プレーンビ
ーーから人手可能〕全装着した超音波発振器〔たとえば
、ブランソンJ−17A4 (Bran+on mod
el J−17A ) +プランソン、イオニック・
パワー社(Branson IonicPower C
o、) 、コネティカット州ダンベリー〕が挙げられる
。白血球の選択的溶解のだめの超音波処理法は、試料を
水浴中に保持しながら100ワ2トの出力を用いて20
秒間の超音波処理に2回暴露すること金含んでなる。
料の処理、すなわち、超旨波処理と称される手法を才む
。選択的溶解のだめのこの処理は当業界では公昶である
。一定条件の出刃及び暴露時間を用いて超斤波処理する
ことによって白血球全選択的に溶解し得る。超音波処理
に適当な装置としては、音響変換6に一ホーン集成装置
及びマイクロチップ〔ヒート・システムズーウルトラン
ー二ノクス社(Heat Systems−Ultra
sonics+Inc、)+ニーーヨーク州プレーンビ
ーーから人手可能〕全装着した超音波発振器〔たとえば
、ブランソンJ−17A4 (Bran+on mod
el J−17A ) +プランソン、イオニック・
パワー社(Branson IonicPower C
o、) 、コネティカット州ダンベリー〕が挙げられる
。白血球の選択的溶解のだめの超音波処理法は、試料を
水浴中に保持しながら100ワ2トの出力を用いて20
秒間の超音波処理に2回暴露すること金含んでなる。
選択的白血球溶解の好ましい方法は、細胞を界面活性剤
と充分に接触させることである。これらの界面活性剤は
、組直細胞は溶解しないが白血球細胞を溶解するのに充
分な濃度及び量で用いる。
と充分に接触させることである。これらの界面活性剤は
、組直細胞は溶解しないが白血球細胞を溶解するのに充
分な濃度及び量で用いる。
界面活性剤溶液の濃度は一般に概60.01〜1.0%
である。
である。
選択的に白血球を溶解する有用な界面活性剤は中性、す
なわち、ノニオン界面活性剤である。これらの例として
はたとえば、次のものが挙げられる°オクチルフェノキ
シポリエトキシエタノール〔トリトン(Triton)
X −100]、]n−ノニルフエノキシボリグリセ
ロールオリーン(Olin)10G:11、iニアルコ
ールのポリエチレングリコールエーテル〔タージトール
(Tergitol) 15−8−12)、ポリオキシ
エチレン(23)ラウリルエーテル〔ブリッジ(Bri
j) 35 J、及びポリオキ/エチレン(8)ステア
レート〔ミルジ(Myrj) 45 )。
なわち、ノニオン界面活性剤である。これらの例として
はたとえば、次のものが挙げられる°オクチルフェノキ
シポリエトキシエタノール〔トリトン(Triton)
X −100]、]n−ノニルフエノキシボリグリセ
ロールオリーン(Olin)10G:11、iニアルコ
ールのポリエチレングリコールエーテル〔タージトール
(Tergitol) 15−8−12)、ポリオキシ
エチレン(23)ラウリルエーテル〔ブリッジ(Bri
j) 35 J、及びポリオキ/エチレン(8)ステア
レート〔ミルジ(Myrj) 45 )。
いくつかのアニオン界面活性剤も選択的白血球溶解剤と
して有用である。これらの例はサポニン及びジギトニン
である。
して有用である。これらの例はサポニン及びジギトニン
である。
白血球を選択的に溶解する手段及び白血球を選択的に溶
解するのに充分な界面活性剤の濃度を決定する手段は以
下の試験に従わなければならない。
解するのに充分な界面活性剤の濃度を決定する手段は以
下の試験に従わなければならない。
溶解手段は、その手段の白血球の還元活性に対する効果
を細菌の還元活性に対する効果と比較することによって
試1験する。壱在的白血球赳元阻害剤の選択性を評価す
るこの方法は次の辿シである。
を細菌の還元活性に対する効果と比較することによって
試1験する。壱在的白血球赳元阻害剤の選択性を評価す
るこの方法は次の辿シである。
処理が白血球細胞の溶解に有用〃・否がを決定するため
に、燐酸塩で緩衝化された生理食塩液(PBS)(0,
’85%塩化す1リウム中0.05M燐酸カリウム緩#
液)中の白血球浮遊m(細胞約0.5×106III!
il/rT111!?含む)1mek211i1のアッ
セイ試験管の谷々にピペットで分注する。特定の超音波
処理法を試験しようとする場合には、試験管の一方を超
音波で処理し、他方は対照として未処理のままにしてお
く。pH7,0のPBS 1rnl全各試験管に加える
。特定の界面活性剤の溶解効果を試験するためには、白
血球浮遊液1祠を2個のアッセイ試験管の各々にピペッ
トで分注する。一方の試験管には界面活性剤全試験濃度
(たとえば0.01グラムパーセント〜1.0グラムパ
ーセント)で含むPBS1−を入れ、他方にはPBS
l−を入れ、対照とする。全試験管に10チグルコース
50マイクロリツトル及びPMS (フェナジンメトス
ルフェート)(I In9/mJメタノール)50マイ
クロリツトルを加える。試験管をポルテックス(Vor
tex; V”vへ。
に、燐酸塩で緩衝化された生理食塩液(PBS)(0,
’85%塩化す1リウム中0.05M燐酸カリウム緩#
液)中の白血球浮遊m(細胞約0.5×106III!
il/rT111!?含む)1mek211i1のアッ
セイ試験管の谷々にピペットで分注する。特定の超音波
処理法を試験しようとする場合には、試験管の一方を超
音波で処理し、他方は対照として未処理のままにしてお
く。pH7,0のPBS 1rnl全各試験管に加える
。特定の界面活性剤の溶解効果を試験するためには、白
血球浮遊液1祠を2個のアッセイ試験管の各々にピペッ
トで分注する。一方の試験管には界面活性剤全試験濃度
(たとえば0.01グラムパーセント〜1.0グラムパ
ーセント)で含むPBS1−を入れ、他方にはPBS
l−を入れ、対照とする。全試験管に10チグルコース
50マイクロリツトル及びPMS (フェナジンメトス
ルフェート)(I In9/mJメタノール)50マイ
クロリツトルを加える。試験管をポルテックス(Vor
tex; V”vへ。
ニーーヨーク州ロチェスター)のような攪拌機上で攪拌
する。各試験管にMTTC3−(4,5−ジメチル−2
−チアゾリル) −2,5−ジフェニル−2H−テトラ
ゾリウムプロミド〕(10■/ゴメタノール)15マイ
クロリツトルを加え、溶液を混合し、次いで37℃で3
0分間インキュベートする。インキュヘート後、試験管
をMTT還元について調べる。
する。各試験管にMTTC3−(4,5−ジメチル−2
−チアゾリル) −2,5−ジフェニル−2H−テトラ
ゾリウムプロミド〕(10■/ゴメタノール)15マイ
クロリツトルを加え、溶液を混合し、次いで37℃で3
0分間インキュベートする。インキュヘート後、試験管
をMTT還元について調べる。
MTT還元は赤紫色(パープル)の存在によって示され
る。超音波処理されたまたは界面活性剤で処理された浮
遊液がほとんどまたは全く還元を示さないが対照がかな
りのせ元を示す場合には、溶解手段はこの試験の最初の
部分を満足させる。
る。超音波処理されたまたは界面活性剤で処理された浮
遊液がほとんどまたは全く還元を示さないが対照がかな
りのせ元を示す場合には、溶解手段はこの試験の最初の
部分を満足させる。
阻害剤が選択的か否かまたは白血球と同様に細菌にも影
響を与えるか否かを決定するために、PBS中の細菌細
胞浮遊液(細胞約1091固/me)2.57d’ff
12個のアッセイ試験管の各々にピペットで分注する。
響を与えるか否かを決定するために、PBS中の細菌細
胞浮遊液(細胞約1091固/me)2.57d’ff
12個のアッセイ試験管の各々にピペットで分注する。
浮遊液中の適当な微生物としては次のものが挙げられる
:大腸菌(Escherichia coli)、プロ
テウス・ブルガリス(Proteus vulgari
s )1ンユウドモナス・アエルギノーザ(Pseud
omonasaeruginosa )、スタフィロコ
ッカス・アウレウス(Staphylococcus
aureus )、及びストレプトコッカス フェカー
リス(Streptococcusfaecalis)
。一方の試験管には前述の白血球浮遊液と同様な試験処
理を行なう。すなわち、超音波処理を行なうかまたはP
BS2.57rLl中界面活性剤で処理する。他方は対
照として未処理のままとし、PBS 2.5 dのみを
加える。各試験管に10%グルコース、PMS (1m
9/mJメタノール)及びMTT<−xomg/m!!
メタノール)を各々100マイクロリツトル加える。溶
液を混合し、37℃で15分間インキュベートした後、
MTT還元を目視検査する。前述の通り、還元活性は赤
紫色の形成によって証明される。本発明に包含される、
選択的白血球溶解の手段である超音波処理法及び界面活
性剤は、前述の試験によれば、白血球還元を阻害する(
すなわち、対照では着色するのに対し、試験浮遊液では
ほとんどまたは全く着色が見られない)が細菌還元活性
を阻害しない(試験浮遊液及び対照浮遊液の両方で着色
が見られる)・ものである。
:大腸菌(Escherichia coli)、プロ
テウス・ブルガリス(Proteus vulgari
s )1ンユウドモナス・アエルギノーザ(Pseud
omonasaeruginosa )、スタフィロコ
ッカス・アウレウス(Staphylococcus
aureus )、及びストレプトコッカス フェカー
リス(Streptococcusfaecalis)
。一方の試験管には前述の白血球浮遊液と同様な試験処
理を行なう。すなわち、超音波処理を行なうかまたはP
BS2.57rLl中界面活性剤で処理する。他方は対
照として未処理のままとし、PBS 2.5 dのみを
加える。各試験管に10%グルコース、PMS (1m
9/mJメタノール)及びMTT<−xomg/m!!
メタノール)を各々100マイクロリツトル加える。溶
液を混合し、37℃で15分間インキュベートした後、
MTT還元を目視検査する。前述の通り、還元活性は赤
紫色の形成によって証明される。本発明に包含される、
選択的白血球溶解の手段である超音波処理法及び界面活
性剤は、前述の試験によれば、白血球還元を阻害する(
すなわち、対照では着色するのに対し、試験浮遊液では
ほとんどまたは全く着色が見られない)が細菌還元活性
を阻害しない(試験浮遊液及び対照浮遊液の両方で着色
が見られる)・ものである。
前述の溶解法は、細胞の還元特性に基づくアッセイと組
み合わせて使用される。活発に代謝を行なっている細胞
は、酸化−還元反応の複合系に携わっている。細胞を含
む培地に薬品を添加すると、細胞はその代謝プロセスの
間に薬品に作用する可能性がある。還元アッセイまたは
還元型アッセイは、試験される細胞によって化学的に還
元されて検出可能な最終生成物を生成する還元性指示薬
を試料に加えることを含んでなる。この型の試験の例は
、フォークマン(Forkman)及びグールキスト(
Dahlquist)の米国特許第3,415,718
号に記載されている。
み合わせて使用される。活発に代謝を行なっている細胞
は、酸化−還元反応の複合系に携わっている。細胞を含
む培地に薬品を添加すると、細胞はその代謝プロセスの
間に薬品に作用する可能性がある。還元アッセイまたは
還元型アッセイは、試験される細胞によって化学的に還
元されて検出可能な最終生成物を生成する還元性指示薬
を試料に加えることを含んでなる。この型の試験の例は
、フォークマン(Forkman)及びグールキスト(
Dahlquist)の米国特許第3,415,718
号に記載されている。
細胞によって還元されて比色分析、電位差滴定または螢
光分析のような任意の手段で検出され得る最終生成物を
生成する任意の化合物が還元分析に有用であり、本明細
書中ではこれを「還元性指示薬」と称するものとする。
光分析のような任意の手段で検出され得る最終生成物を
生成する任意の化合物が還元分析に有用であり、本明細
書中ではこれを「還元性指示薬」と称するものとする。
色原体は好ましい還元性指示薬である。本明細書中で用
いる「色原体」なる用語は、還元によって有色の最終生
成物を生成する還元性指示薬を意味する。本発明の還元
分析に適当な指示薬は、細菌及び白血球によって還元さ
れることができ且つ検出され得る最終生成物を生成する
任意の化合物である。
いる「色原体」なる用語は、還元によって有色の最終生
成物を生成する還元性指示薬を意味する。本発明の還元
分析に適当な指示薬は、細菌及び白血球によって還元さ
れることができ且つ検出され得る最終生成物を生成する
任意の化合物である。
本発明の実施に使用する、検出可能な物質に還元され得
る化合物は、還元阻害剤の不存在下においてその[便化
型が微生物によって還元されて検出可能な生成物を生成
できる任意の化合物であることができる。このような検
出はたとえば、電位差滴定手段によって実施できる。好
ましくは、検出可能な物質は輻射線測定手段によって直
接的に検出され得る物質である。本明細書中において用
いる「輻射線測定手段」なる用語は、輻射線を用いて分
析結果を得る種々の分析的検出手段を含むものと定義す
る。
る化合物は、還元阻害剤の不存在下においてその[便化
型が微生物によって還元されて検出可能な生成物を生成
できる任意の化合物であることができる。このような検
出はたとえば、電位差滴定手段によって実施できる。好
ましくは、検出可能な物質は輻射線測定手段によって直
接的に検出され得る物質である。本明細書中において用
いる「輻射線測定手段」なる用語は、輻射線を用いて分
析結果を得る種々の分析的検出手段を含むものと定義す
る。
輻射線測定手段によって直接的に検出され得る種々の検
出可能な物質を一部次に挙げる:(a)常用の比色分析
検出装置を用いてその存在または濃度を測定するのに使
用できる吸光係数または吸収スペクトルを有する、比色
分析によって検出可能な物質、たとえば、着色剤(すな
わち、染料または顔料);ならびに(b)その物質から
放射される輻射線全演出し得る装置によって検出され得
る輻射線放射物質、たとえば、螢光物質(螢光グローブ
)・染料または染料前駆体は有用な、検出可能な物質で
ある。染料の使用にはいくつかの可能性がある:(1)
酸化還元反応によって染料の色が別の色に変化する、(
2)有色の染料が無色になる、または(3)無色の物質
、すなわち、染料前駆体が有色の染料になる。発色は色
の消失、よりも一般に容易に検出され得るので、本発明
の実施には前記(3)が好ましい。
出可能な物質を一部次に挙げる:(a)常用の比色分析
検出装置を用いてその存在または濃度を測定するのに使
用できる吸光係数または吸収スペクトルを有する、比色
分析によって検出可能な物質、たとえば、着色剤(すな
わち、染料または顔料);ならびに(b)その物質から
放射される輻射線全演出し得る装置によって検出され得
る輻射線放射物質、たとえば、螢光物質(螢光グローブ
)・染料または染料前駆体は有用な、検出可能な物質で
ある。染料の使用にはいくつかの可能性がある:(1)
酸化還元反応によって染料の色が別の色に変化する、(
2)有色の染料が無色になる、または(3)無色の物質
、すなわち、染料前駆体が有色の染料になる。発色は色
の消失、よりも一般に容易に検出され得るので、本発明
の実施には前記(3)が好ましい。
本発明の実施に使用できる染料の例は、ノチレンブルー
、ジクロロインドフェノール、レゾアズリン、ならびに
還元によって有色のホルマザン染料になる種々のテトラ
ゾリウム化合物、たとえば、3−(4,5−ジメチル−
2−チアゾリル)−2,5−ジフェニル−2H−テトラ
ゾリウムプロミド、2,3.5−トリフェニル−2H−
テトラゾリウムクロリド、テトラニトロブルー、テトラ
ゾリウムクロリド及びニトロテトラゾリウムノくイオレ
ットである。
、ジクロロインドフェノール、レゾアズリン、ならびに
還元によって有色のホルマザン染料になる種々のテトラ
ゾリウム化合物、たとえば、3−(4,5−ジメチル−
2−チアゾリル)−2,5−ジフェニル−2H−テトラ
ゾリウムプロミド、2,3.5−トリフェニル−2H−
テトラゾリウムクロリド、テトラニトロブルー、テトラ
ゾリウムクロリド及びニトロテトラゾリウムノくイオレ
ットである。
本発明において有用なテトラゾリウム塩は一般式(1)
で表わされるものでら9、次のように一般式(n)のホ
ルマザン染料に還元され得る。
で表わされるものでら9、次のように一般式(n)のホ
ルマザン染料に還元され得る。
以下余白
(1) (II)前記式(
I)及び(n)において、臂はアニオンを表わし;R1
,R2及びR5は各々、アIJ−)しまたは複素環式置
換基(好ましくは5〜6個の原子を含み、好ましいペテ
ロ原子はN、S、0及びSe である)、たとえば、フ
ェニル、置換されたフェニル、ナフチル、置換されたナ
フチル、置換されたもしくは未置換のチアゾリル、ベン
ツ゛チアソ゛1ノル、オキサゾール、ベンゾキサゾール
、セレナソ゛−ルもしくはベンゾセレナゾール基ヲ堀イ
クし−R2はさらに、アルキル基(たとえ(ハ、メチル
、〕゛チチルキシル、ドデシル等)もしくは置換基(e
置換基金室む)、たとえば、−1(、−OH,−COO
H。
I)及び(n)において、臂はアニオンを表わし;R1
,R2及びR5は各々、アIJ−)しまたは複素環式置
換基(好ましくは5〜6個の原子を含み、好ましいペテ
ロ原子はN、S、0及びSe である)、たとえば、フ
ェニル、置換されたフェニル、ナフチル、置換されたナ
フチル、置換されたもしくは未置換のチアゾリル、ベン
ツ゛チアソ゛1ノル、オキサゾール、ベンゾキサゾール
、セレナソ゛−ルもしくはベンゾセレナゾール基ヲ堀イ
クし−R2はさらに、アルキル基(たとえ(ハ、メチル
、〕゛チチルキシル、ドデシル等)もしくは置換基(e
置換基金室む)、たとえば、−1(、−OH,−COO
H。
−6O3Hs −8R,−NO2等、またはChem−
Rev、+55.355〜483(1955)において
ホルマザンもしくはテトラゾリウム塩のこの位置に存在
するものとして記載されている他の任意の置換基金表わ
すこともでき;置換基R1及びR2は金属キレートまた
は錯体を形成し得る電子共有基を含むことができる。こ
のようなキレート基または錯体の例は、第一、第二及び
第三アミノ、イミノ、置換されたイミノ、オキシム、チ
オエーテル、ケト、チオケト、ヒドロキシル、メルカプ
ト、カルボキシル、スルホ及びホスホ、アルコキシ基−
または錯体である。
Rev、+55.355〜483(1955)において
ホルマザンもしくはテトラゾリウム塩のこの位置に存在
するものとして記載されている他の任意の置換基金表わ
すこともでき;置換基R1及びR2は金属キレートまた
は錯体を形成し得る電子共有基を含むことができる。こ
のようなキレート基または錯体の例は、第一、第二及び
第三アミノ、イミノ、置換されたイミノ、オキシム、チ
オエーテル、ケト、チオケト、ヒドロキシル、メルカプ
ト、カルボキシル、スルホ及びホスホ、アルコキシ基−
または錯体である。
本発明に有用なテトラゾリウム塩としてはさらに一般式
(It)のビス化合物を挙げることかでさる。
(It)のビス化合物を挙げることかでさる。
これは微生物によって還元されて一般式(IV)のホ/
l/ マfンを形成できる。
l/ マfンを形成できる。
以下余白
I(H
1
R2R2
前記式(1)及び(IV)において、fつはアニオンを
表わし、Xはアルキレンまたはアリーレン基を表わし、
Rlr R2及び軸は式(1)及び(、I[)に関して
前述した置換基を表わす。
表わし、Xはアルキレンまたはアリーレン基を表わし、
Rlr R2及び軸は式(1)及び(、I[)に関して
前述した置換基を表わす。
本発明の実施に有用なテトラゾリウム塩の特定の例は次
の通りである。
の通りである。
a) )リフェニルデトラゾリウムクロリド(TTC
); b)2.2’−(p−ジフェニレン)−ビス(3゜5−
ジフェニル)テトラゾリウムクロリド(ネオテトラゾリ
ウムクロリドまたはNTとしても知られる); c)NTのメトキシ誘導体(BT ブルーテトラゾリウ
ムとしても知られる); d)2−(p−ヨードフェニル)−3−(p−ニトロフ
ェニル)−5−フェニルテトラゾリウムクロリド(IN
T); e)2.2’−ジ−p−ニトロフェニル−5,5′−ジ
フェニル−3,3’−(3,3’−ジメトキシ−4,4
′−ビフェニレン)ンテトラゾリウムクロリドにドロー
BTとしても知られる); f) 2.2’、5.5’−テトラ−p−ニトロフェ
ニル−3,3’−(3,3’−ジメトキシ−4,4’−
ビフェニレンラージテトラゾリウムクロリド(テトラ−
ニトロgTJたはTNB Tとしても知られる);g)
3−(4,5−’ジメチルーチアゾリルー2)−2
,5−ジフェニルテトラゾリウムプロミド(MTT); h)2.2’−ジー(3−ニトロフェニル)−5゜5′
−ジメチル−3,3’−(4,4’−ビフェニレン)ジ
テトラゾリウム久ロリド(イエローテトラゾリウムまた
はYTとしても知られる); i)2,3.5−)す(p−ニトロフェニル)−テトラ
ゾリウムプロミド(TNTTC);j) 2−フェニ
ル−3−(3−メトキシ−4−フェニル)−5−(p−
二トロフェニル)−テトラゾリウムクロリド(十ニトロ
BTとしても知られる);及び k) 、2 、5−ジ(p−ニトロフェニル)−3−
(3−メ)キシ−4−フェニル)−テトラゾリウムクロ
リド(半TNBTとしても知られる)。
); b)2.2’−(p−ジフェニレン)−ビス(3゜5−
ジフェニル)テトラゾリウムクロリド(ネオテトラゾリ
ウムクロリドまたはNTとしても知られる); c)NTのメトキシ誘導体(BT ブルーテトラゾリウ
ムとしても知られる); d)2−(p−ヨードフェニル)−3−(p−ニトロフ
ェニル)−5−フェニルテトラゾリウムクロリド(IN
T); e)2.2’−ジ−p−ニトロフェニル−5,5′−ジ
フェニル−3,3’−(3,3’−ジメトキシ−4,4
′−ビフェニレン)ンテトラゾリウムクロリドにドロー
BTとしても知られる); f) 2.2’、5.5’−テトラ−p−ニトロフェ
ニル−3,3’−(3,3’−ジメトキシ−4,4’−
ビフェニレンラージテトラゾリウムクロリド(テトラ−
ニトロgTJたはTNB Tとしても知られる);g)
3−(4,5−’ジメチルーチアゾリルー2)−2
,5−ジフェニルテトラゾリウムプロミド(MTT); h)2.2’−ジー(3−ニトロフェニル)−5゜5′
−ジメチル−3,3’−(4,4’−ビフェニレン)ジ
テトラゾリウム久ロリド(イエローテトラゾリウムまた
はYTとしても知られる); i)2,3.5−)す(p−ニトロフェニル)−テトラ
ゾリウムプロミド(TNTTC);j) 2−フェニ
ル−3−(3−メトキシ−4−フェニル)−5−(p−
二トロフェニル)−テトラゾリウムクロリド(十ニトロ
BTとしても知られる);及び k) 、2 、5−ジ(p−ニトロフェニル)−3−
(3−メ)キシ−4−フェニル)−テトラゾリウムクロ
リド(半TNBTとしても知られる)。
これらの化合物に関するよシ詳細な情報は、ヒストケミ
ストリー、セオレティカル・アンド・アプライド(I(
istochemjstry+Theoretical
andApplied) 、 A 、 G 、 E
、パース(Pearse)著、第2巻、第3版、880
〜883ページ、チャーチル・リビングストン(Cbu
rchill Livingstone)+ニシンバラ
及びロンドン、1972年力・ら得られる。
ストリー、セオレティカル・アンド・アプライド(I(
istochemjstry+Theoretical
andApplied) 、 A 、 G 、 E
、パース(Pearse)著、第2巻、第3版、880
〜883ページ、チャーチル・リビングストン(Cbu
rchill Livingstone)+ニシンバラ
及びロンドン、1972年力・ら得られる。
水性試料中の細菌の溶液式アッセイは、選択的溶解Vこ
よる白血球阻害及びそれに続く還元分析という前述の手
法を用いるものである。尿のような体液の試料を試験用
に入手する。試料は新鮮で均質であることが好ましい。
よる白血球阻害及びそれに続く還元分析という前述の手
法を用いるものである。尿のような体液の試料を試験用
に入手する。試料は新鮮で均質であることが好ましい。
好ましい白血球阻害手段は、前述の中性またはアニオン
界面活性剤の1つを利用するものであシ、これは細菌を
溶解せずに白血球を選択的に溶解するのに有効な濃度で
加える。検出可能な最終生成物を生成する還元性基質、
好ましくは、色原体を指示薬として加える。
界面活性剤の1つを利用するものであシ、これは細菌を
溶解せずに白血球を選択的に溶解するのに有効な濃度で
加える。検出可能な最終生成物を生成する還元性基質、
好ましくは、色原体を指示薬として加える。
ここで好ましい色原体指示薬はMTTで、その好ましい
使用濃度は5X10−5M〜5X10’Mfある。
使用濃度は5X10−5M〜5X10’Mfある。
細胞から基質に電子を移動させることによって還元反応
を速めることのできる電子移動剤を加えるのが好ましい
。染料の還元峨位と細胞の遺元亀位との中間の還元電位
を有する、適当に置換されたフェナジン類、ベンゾキノ
ン類及びナフトキノン類が有用である。有用なら子移動
剤の例はフェナジンノドスルフェート(PMS)でらり
、7×10−5M〜4X10 Mで使用するのが好ま
しい。他の有用な電子移動剤としては、フェナジンエチ
ルスルフェート、メルトラブル−、メナジオン、トリメ
チルベンゾキノン等が挙げられる。
を速めることのできる電子移動剤を加えるのが好ましい
。染料の還元峨位と細胞の遺元亀位との中間の還元電位
を有する、適当に置換されたフェナジン類、ベンゾキノ
ン類及びナフトキノン類が有用である。有用なら子移動
剤の例はフェナジンノドスルフェート(PMS)でらり
、7×10−5M〜4X10 Mで使用するのが好ま
しい。他の有用な電子移動剤としては、フェナジンエチ
ルスルフェート、メルトラブル−、メナジオン、トリメ
チルベンゾキノン等が挙げられる。
アッセイへの他の有用な添加剤としては、細胞反応にエ
ネルギー源を提供するグルコースまたは他の代謝され得
る化合物が挙げられる。
ネルギー源を提供するグルコースまたは他の代謝され得
る化合物が挙げられる。
色原体還元の量は、精度の必要性に応じていくつかの方
法で検出できる。発色の目視検査によって充分な情報が
得られる場合には、試料を混合し、次いで好ましくは3
0分間またはそれ以下、20〜45℃においてインキユ
ベートシ、然る後に目視検IE f ル。パーキン−エ
ルマー(Perkin−Elmer)572のような分
光光度計で吸光度を測定することによって、結果のより
正確で定量的だ読みが得られる。色原体還元の量は37
℃における5 40 nmの吸光度の10分間の変化と
して定義する。吸光度法においては標準曲線が有用であ
る。
法で検出できる。発色の目視検査によって充分な情報が
得られる場合には、試料を混合し、次いで好ましくは3
0分間またはそれ以下、20〜45℃においてインキユ
ベートシ、然る後に目視検IE f ル。パーキン−エ
ルマー(Perkin−Elmer)572のような分
光光度計で吸光度を測定することによって、結果のより
正確で定量的だ読みが得られる。色原体還元の量は37
℃における5 40 nmの吸光度の10分間の変化と
して定義する。吸光度法においては標準曲線が有用であ
る。
この曲線は、既知量の細菌を含む浮遊液に前述の還元ア
ッセイ法を行なうことによって得られた吸光度値をプロ
ットすることによって作製する。次いで、臨床試料から
の吸光度値を標準曲線と比較して存在する細菌数を読み
取る。
ッセイ法を行なうことによって得られた吸光度値をプロ
ットすることによって作製する。次いで、臨床試料から
の吸光度値を標準曲線と比較して存在する細菌数を読み
取る。
細菌の存在を検出することは臨床診断において有効な手
段であるが、言まれる微生物の同定もまた必要であろう
。微生物の主要な特性の1つは、よく知られたダラム染
色法に対する反応である・細菌は、グラム陽性及びグラ
ム陰性として知られる2群に類別される。これらの2つ
の型の識別は、抗菌療法及びTa菌のより詳細な同定法
の選択に影響を与える有用な決定である。
段であるが、言まれる微生物の同定もまた必要であろう
。微生物の主要な特性の1つは、よく知られたダラム染
色法に対する反応である・細菌は、グラム陽性及びグラ
ム陰性として知られる2群に類別される。これらの2つ
の型の識別は、抗菌療法及びTa菌のより詳細な同定法
の選択に影響を与える有用な決定である。
前述の白血球還元阻害法とダラム陽性菌の選択的阻害と
を組み合わせることによる、ダラム型を区別する細菌ア
ッセイは有用でらる。溶液中で実施する分析は、3,9
−ジエチルトリデカノール硫酸ナトリウム[タージトー
ル(Tergitol) 7 ]のような第2の界面活
性剤を添加して、既に前述した方法を用いて行なう。ク
ーシト−ルアは約0.1〜10%(v/v )の濃度で
用いる場合にはグラム陽性細菌の還元活性阻害剤である
。最適用範囲は7〜8.5である。還元性基質、好まし
くは色原体を前述のようにして加える。好ましい添加剤
は電子移動剤、フェナジンメトスルフェート、グルコー
ス、トリトン(Triton) X −100及びター
シト−ルアである。色原体還元は試料中にダラム陰性細
菌が存在することを示す゛この方法は、高濃度の塩のよ
うなダラム陰性菌の阻害剤と組み合わせるとグラム陽性
細菌の検出Vこも有用である。
を組み合わせることによる、ダラム型を区別する細菌ア
ッセイは有用でらる。溶液中で実施する分析は、3,9
−ジエチルトリデカノール硫酸ナトリウム[タージトー
ル(Tergitol) 7 ]のような第2の界面活
性剤を添加して、既に前述した方法を用いて行なう。ク
ーシト−ルアは約0.1〜10%(v/v )の濃度で
用いる場合にはグラム陽性細菌の還元活性阻害剤である
。最適用範囲は7〜8.5である。還元性基質、好まし
くは色原体を前述のようにして加える。好ましい添加剤
は電子移動剤、フェナジンメトスルフェート、グルコー
ス、トリトン(Triton) X −100及びター
シト−ルアである。色原体還元は試料中にダラム陰性細
菌が存在することを示す゛この方法は、高濃度の塩のよ
うなダラム陰性菌の阻害剤と組み合わせるとグラム陽性
細菌の検出Vこも有用である。
アッセイ組成物は、10−’ M〜10−6Mの濃度の
還元性指示薬、好ましくは色原体、選択的溶解を惹起す
るのに適当な量の、細菌を溶解せずに白血球を選択的に
溶解する界面活性剤、ならびに白血球及び/または細菌
を含むと考えられる水性試料を含んでなる3、このよう
な組成物の好ましい一範囲は7.5〜8.2で、との−
は無機燐酸塩のような緩衝剤によって保持される。さら
に、前に有用であると述べた他の添加剤、たとえば、電
子移動剤(10−4M〜10−6M )及びグルコース
(0,1〜1、f1%)e含むことが好ましい。
還元性指示薬、好ましくは色原体、選択的溶解を惹起す
るのに適当な量の、細菌を溶解せずに白血球を選択的に
溶解する界面活性剤、ならびに白血球及び/または細菌
を含むと考えられる水性試料を含んでなる3、このよう
な組成物の好ましい一範囲は7.5〜8.2で、との−
は無機燐酸塩のような緩衝剤によって保持される。さら
に、前に有用であると述べた他の添加剤、たとえば、電
子移動剤(10−4M〜10−6M )及びグルコース
(0,1〜1、f1%)e含むことが好ましい。
前述のアッセイは、プルツィビログイノツ(Przyb
y l owi cz )及びミリカン(Mi l l
1kan)の米国特許第3,922,158号及びパ
ース(Pierce)及びフランク(Frank)の米
国特許第4,258,001号に記載されたような試験
要素を用いて乾式でも実施できる。このような要素は、
支持体、好ましくは塗布層及び試薬層から成る。試薬層
は試薬/塗布混合層であってもよいし、別個の塗布層を
試薬層上に塗ってもよい。支持体は、前述の特許に記載
された任意の適当な材料、たとえば、ポリ(エチレンテ
レフタレート)から成る。
y l owi cz )及びミリカン(Mi l l
1kan)の米国特許第3,922,158号及びパ
ース(Pierce)及びフランク(Frank)の米
国特許第4,258,001号に記載されたような試験
要素を用いて乾式でも実施できる。このような要素は、
支持体、好ましくは塗布層及び試薬層から成る。試薬層
は試薬/塗布混合層であってもよいし、別個の塗布層を
試薬層上に塗ってもよい。支持体は、前述の特許に記載
された任意の適当な材料、たとえば、ポリ(エチレンテ
レフタレート)から成る。
支持体と試薬層の間に下塗9層を設けることもできる。
下塗り層として有用な材料の例は、ポリ(アクリルアミ
ド−co−N−ビニル−2−ピロリドン)−またはポリ
(アクリルアミド)のようなポリマー及びゾニル(Zo
ny l ) FSNのような界面活性剤である。
ド−co−N−ビニル−2−ピロリドン)−またはポリ
(アクリルアミド)のようなポリマー及びゾニル(Zo
ny l ) FSNのような界面活性剤である。
試薬層はMTTのような還元性色原体味り0.1g/m
2〜0.29/m2)及びPMSのような成子移動剤(
約0.01〜0.1 l/m2)を含む。特定のアッセ
イに使用される要素には、試薬層中に阻害剤として種々
の界面活性剤全混合しなければならないこともある。全
ての細菌をアッセイできるように設計された要素は白血
球の還元活性の選択的阻害剤としてアニオンまたは中性
界面活性剤を含む(約1g/m2〜10.9層m2)。
2〜0.29/m2)及びPMSのような成子移動剤(
約0.01〜0.1 l/m2)を含む。特定のアッセ
イに使用される要素には、試薬層中に阻害剤として種々
の界面活性剤全混合しなければならないこともある。全
ての細菌をアッセイできるように設計された要素は白血
球の還元活性の選択的阻害剤としてアニオンまたは中性
界面活性剤を含む(約1g/m2〜10.9層m2)。
グラム識別アッセイに使用される要素は2種の界面活性
剤、すなわち、白血球を選択的に阻害する界面活性剤(
約1g/m2〜10g/m2)及び一方のグラム型の細
菌を選択的に阻害する界面活性剤(約1 ji7m2〜
1097m2)を含む。塗布/試薬混合層は米国特許第
4.258,001号に記載された高分子構造、たとえ
ば、ポリ(ビニルトルエン−co−p−t−ブチル−ス
チレン−co−メタクリル酸)を含むことができる。試
薬層は要素内のどの位置にあってもよく、試薬は塗布層
に混合することができる。
剤、すなわち、白血球を選択的に阻害する界面活性剤(
約1g/m2〜10g/m2)及び一方のグラム型の細
菌を選択的に阻害する界面活性剤(約1 ji7m2〜
1097m2)を含む。塗布/試薬混合層は米国特許第
4.258,001号に記載された高分子構造、たとえ
ば、ポリ(ビニルトルエン−co−p−t−ブチル−ス
チレン−co−メタクリル酸)を含むことができる。試
薬層は要素内のどの位置にあってもよく、試薬は塗布層
に混合することができる。
これらの乾燥試験要素の使用法は試料を好ましくは10
マイクロリットル試薬層茨而にスポットすることを含ん
でなる。スポットする直前に試料にグルコース0.2g
%を加えるのが好ましい。色原体還元の検出は、反射濃
度計で約540nmで反射濃度(DR)’に測定するこ
とによって行なう。次いで、ブランク対照要素に、PB
S及びグルコースを含むが細胞を含まない液をスポット
する。インキュベーシヨン及び検出の方法は少なくとも
2つある。第一の方法では、550nmにおけるDRを
37℃において10分間測定する。10分間の反射濃度
の変化(ΔDR10分)を、1層分後におけるDRから
0分におけるDRI差し引いてがら対照のΔDRIO分
を差し引くことによって算出する。
マイクロリットル試薬層茨而にスポットすることを含ん
でなる。スポットする直前に試料にグルコース0.2g
%を加えるのが好ましい。色原体還元の検出は、反射濃
度計で約540nmで反射濃度(DR)’に測定するこ
とによって行なう。次いで、ブランク対照要素に、PB
S及びグルコースを含むが細胞を含まない液をスポット
する。インキュベーシヨン及び検出の方法は少なくとも
2つある。第一の方法では、550nmにおけるDRを
37℃において10分間測定する。10分間の反射濃度
の変化(ΔDR10分)を、1層分後におけるDRから
0分におけるDRI差し引いてがら対照のΔDRIO分
を差し引くことによって算出する。
第二の方法では、乾燥要素にスポラl−した後、水分平
衡室中で適当な時間、20〜45℃においてインキュベ
ートする。インキュベートした後、DRを測定する。試
験試料の15分後に3けるDRから細胞を含まない対照
の15分後に2けるDRを差し引くことによって、15
分後におけるΔDRを算出する。
衡室中で適当な時間、20〜45℃においてインキュベ
ートする。インキュベートした後、DRを測定する。試
験試料の15分後に3けるDRから細胞を含まない対照
の15分後に2けるDRを差し引くことによって、15
分後におけるΔDRを算出する。
反射濃度を、存在するA胞の量と関連づける標準曲線を
作製できる。既知量の白血球及び細菌を“含む浮遊WL
ヲ調製し、前記方法に従って測定する。
作製できる。既知量の白血球及び細菌を“含む浮遊WL
ヲ調製し、前記方法に従って測定する。
このように、乾式アッセイは迅速で定量的である。
以下余白
実施例
以下の実施例は本発明をさらに詳細に説明するものであ
る。
る。
以下の材料を実施例子で用いた。
白血球浮遊液はヒトの血IX力・ら調製した。
細菌浮遊液はメリーランド州ロックビルのアメリカン・
タイプ・カルテア−・コレクション(American
Type Cu1ture Co11ection)
から入手した微生物から調製した。
タイプ・カルテア−・コレクション(American
Type Cu1ture Co11ection)
から入手した微生物から調製した。
フェナジンメトスルフェート(PMS) 、サポニン、
ジギトニン、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモ
ノオレエート〔トゥイーン(Tween) 80 :]
、ナトリウム3.9ジエチルトリデカクールサルフェー
ト〔タージトール(Tergitol) 7 )、第二
アルコールのポリエチレンクリコールエーテル(タージ
トール15−’S−12)、及びオクチルフェノキシポ
リエトキシエタノール〔トリトン(Triton)X−
100)はミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル
社(Sigma Chemical Co、)から購入
した0 ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル〔プリジ
(Brij) 35]及びポリオキシエチレン(8)ス
テアレート〔ミルジ(Myrj ) 45 )はプラウ
エア州つィルミントンのICIアメリカ社(ICI A
mericas r Inc、 )から入手した。
ジギトニン、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモ
ノオレエート〔トゥイーン(Tween) 80 :]
、ナトリウム3.9ジエチルトリデカクールサルフェー
ト〔タージトール(Tergitol) 7 )、第二
アルコールのポリエチレンクリコールエーテル(タージ
トール15−’S−12)、及びオクチルフェノキシポ
リエトキシエタノール〔トリトン(Triton)X−
100)はミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル
社(Sigma Chemical Co、)から購入
した0 ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル〔プリジ
(Brij) 35]及びポリオキシエチレン(8)ス
テアレート〔ミルジ(Myrj ) 45 )はプラウ
エア州つィルミントンのICIアメリカ社(ICI A
mericas r Inc、 )から入手した。
フルオロケミカル界面活性剤ソ= /l/ (Zony
、l )FSNはプラウエア州つィルミントンのE’、
1.デュポン・ド°ネモアース社(E、1.Dupon
t de Nemoursand Co、 )から入手
した。
、l )FSNはプラウエア州つィルミントンのE’、
1.デュポン・ド°ネモアース社(E、1.Dupon
t de Nemoursand Co、 )から入手
した。
N−ノニルフェノキシポリグリセロール〔オリーン(0
11n)10 G )はコネクティカット州スタンフォ
ードのオリン社(Olin Corp、)から入手した
。
11n)10 G )はコネクティカット州スタンフォ
ードのオリン社(Olin Corp、)から入手した
。
他の全ての薬品は試薬用でろって、ニューヨーク州ロチ
ニスターのイーストマン・コダック社(Eastman
Kodak Company )から人手した。
ニスターのイーストマン・コダック社(Eastman
Kodak Company )から人手した。
溶液式アッセイは、5−セルプログラマー及び温夏調節
器を装宥したパーキン−エルマー(Perkin−El
mer) 572分光光度計全用いて実施した。
器を装宥したパーキン−エルマー(Perkin−El
mer) 572分光光度計全用いて実施した。
乾燥要素アッセイにぐま、常用の反射#:度計を変形し
たものを用いた。
たものを用いた。
多層乾燥試験要素は次の構成で調製した。
■、塗布/試薬層
ポリマービーズ及び結合剤、
界面活性剤、
3− (4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5
−ジフェニル−2■−テトラゾリウムプロミド(MTr
)(o、119/m2)ならびに電子移動剤0 ■、下塗9層 ■、支持体層 ポリ(エチレンテレフタレート) 実施例1〜7 細胞溶解による白血球の還4元活性の選択的阻害ヒトの
血液から調製した、pi(7,0のPBS中に白血球を
含む溶液をアニオンもしくは中性界面活性剤または超音
波によって処理した。顕微鏡検査によ、て細胞が完全に
溶解したことが示された。次いで′、爵液を還元活性に
ついてアッセイした。
−ジフェニル−2■−テトラゾリウムプロミド(MTr
)(o、119/m2)ならびに電子移動剤0 ■、下塗9層 ■、支持体層 ポリ(エチレンテレフタレート) 実施例1〜7 細胞溶解による白血球の還4元活性の選択的阻害ヒトの
血液から調製した、pi(7,0のPBS中に白血球を
含む溶液をアニオンもしくは中性界面活性剤または超音
波によって処理した。顕微鏡検査によ、て細胞が完全に
溶解したことが示された。次いで′、爵液を還元活性に
ついてアッセイした。
白血球浮遊液1dをアッセイ試験管中にピペットで分注
した。pH7,0のPH11mlまたは界面活性剤を含
むpB31mlこのアッセイ試験管に加えた。
した。pH7,0のPH11mlまたは界面活性剤を含
むpB31mlこのアッセイ試験管に加えた。
全試験管に10g%グルコース50μe及びPMS(1
〜/mlメタノール)50m”e加えた。試験管の内容
物を攪拌した。各試;験管にIVITT (10ln9
/rnlメタノール)50μl′f:加え、試験・aの
内容物を再び攪拌し、そして37℃で30分間インキ−
ベートした。
〜/mlメタノール)50m”e加えた。試験管の内容
物を攪拌した。各試;験管にIVITT (10ln9
/rnlメタノール)50μl′f:加え、試験・aの
内容物を再び攪拌し、そして37℃で30分間インキ−
ベートした。
インキュベートした後、溶液をMTTllt元について
目視検査した。MTT趙元は赤紫色(パープル)の存在
によって示される。還元の度合を、1託験を績ん疋観測
者の主覗的評I[lIiし℃よってO(無色、還元なし
)から4+(濃赤紫色、極めて強い還元)まで等級付け
した。1.2及び3は発色の中間的な讃さと中間的な還
元量を表わす。
目視検査した。MTT趙元は赤紫色(パープル)の存在
によって示される。還元の度合を、1託験を績ん疋観測
者の主覗的評I[lIiし℃よってO(無色、還元なし
)から4+(濃赤紫色、極めて強い還元)まで等級付け
した。1.2及び3は発色の中間的な讃さと中間的な還
元量を表わす。
結果を第1表に示す。病院の患者の血液から調製した白
血球の試料から無作為に抽出したものには、少量からか
なりの量まで対照溶WLvcおいて常に若干の検出され
得る還元が見られた。この反応における可変性は、存在
する白血球数及び細胞の活性レベルに患者間で差がある
ためである。この予知できない可変性は剋菌アッセイに
おける白血球妨害を相殺しようとする場合に問題の一部
になる。しかしながら、試験された材料全てについて、
妨害の大きさと無関係に、全ての場合に白血球反応をゼ
ロまで減少させた。
血球の試料から無作為に抽出したものには、少量からか
なりの量まで対照溶WLvcおいて常に若干の検出され
得る還元が見られた。この反応における可変性は、存在
する白血球数及び細胞の活性レベルに患者間で差がある
ためである。この予知できない可変性は剋菌アッセイに
おける白血球妨害を相殺しようとする場合に問題の一部
になる。しかしながら、試験された材料全てについて、
妨害の大きさと無関係に、全ての場合に白血球反応をゼ
ロまで減少させた。
細菌によるMTT還元の溶液アッセイを、阻害効果が選
択的であるか否かを測定するために前述の白血球の研究
で用いられたのと同一の界面活性剤を添加して実施した
。PBS中の細菌細胞浮遊液(細胞〜109個/m1)
2.5m7に表に示された阻害剤を含むPH12,5m
lを那えた。浮遊液VC10%グルコース、pMs (
1my/ml!メタノール)及びMTT(101n9/
mlメタノール)全各々1001Ll加えた。
択的であるか否かを測定するために前述の白血球の研究
で用いられたのと同一の界面活性剤を添加して実施した
。PBS中の細菌細胞浮遊液(細胞〜109個/m1)
2.5m7に表に示された阻害剤を含むPH12,5m
lを那えた。浮遊液VC10%グルコース、pMs (
1my/ml!メタノール)及びMTT(101n9/
mlメタノール)全各々1001Ll加えた。
試験管の内容物を攪拌し、37℃で15分間インキ−ベ
ートした後、目視検査した。
ートした後、目視検査した。
第1表に示した結果は、界面活性剤は白血球の還元活性
を阻害するが細菌の還元活性を阻害しないことを示して
いる。このことは、界面活性剤の存在下における白血球
の反応がゼロであるのに対し、界面活性剤の存在下にお
ける細菌の反応カニ4ブたは4+である事実によって示
される。従って、臨床試料が未知量の両方の型の試料を
含む場合、これらの溶解剤は還元に基づくa菌アッセイ
カニら白血球妨害を除く。
を阻害するが細菌の還元活性を阻害しないことを示して
いる。このことは、界面活性剤の存在下における白血球
の反応がゼロであるのに対し、界面活性剤の存在下にお
ける細菌の反応カニ4ブたは4+である事実によって示
される。従って、臨床試料が未知量の両方の型の試料を
含む場合、これらの溶解剤は還元に基づくa菌アッセイ
カニら白血球妨害を除く。
以下全白
第1表
1 トリトンX −1000,05cI)(v/
v) 02 タージトール15−8−1
2 0.1 %(v/v) 03 プ
リン35 1.Og % 04
ミルジ45 1.0 、!7 係
05 サポニン 0.1.9 係
06 ジギトニン 0.025g% 07
超音波処理 CJM用さn−f) 0対照
な し (適用されず) 1−3
十細菌還元 0.05%(v/v) 4+ 4 j
41.0 %(v/v) 4 4 4 4
1.01% 4 4 4 4 1.0y% 4 4 4 4 1.01% 4 4 4 4 0.25 &% 4 4 4 4 (適用されず)4444 実施例8 MTTの細菌及び白血球の両者による還元に対する’r
x−iooの濃度効果を調べだ。細匿if!d胞浮遊液
及び白血球細胞浮遊iを調製した。細胞のm液ハトウィ
ーン80及びグルコース各々0.396、MTT4.O
Xlo−4MXPMS5.4X10−5Mならびに種々
の濃度のTX−1t)Of:含んでいた。TX−100
の各濃度Vこついて細胞を含まない対照溶液を調製した
。
v) 02 タージトール15−8−1
2 0.1 %(v/v) 03 プ
リン35 1.Og % 04
ミルジ45 1.0 、!7 係
05 サポニン 0.1.9 係
06 ジギトニン 0.025g% 07
超音波処理 CJM用さn−f) 0対照
な し (適用されず) 1−3
十細菌還元 0.05%(v/v) 4+ 4 j
41.0 %(v/v) 4 4 4 4
1.01% 4 4 4 4 1.0y% 4 4 4 4 1.01% 4 4 4 4 0.25 &% 4 4 4 4 (適用されず)4444 実施例8 MTTの細菌及び白血球の両者による還元に対する’r
x−iooの濃度効果を調べだ。細匿if!d胞浮遊液
及び白血球細胞浮遊iを調製した。細胞のm液ハトウィ
ーン80及びグルコース各々0.396、MTT4.O
Xlo−4MXPMS5.4X10−5Mならびに種々
の濃度のTX−1t)Of:含んでいた。TX−100
の各濃度Vこついて細胞を含まない対照溶液を調製した
。
37℃で10分間、分光光度計で540nmにおける吸
光度を測定した。第■表に示した結果(ΔA)Qま、1
0分後の540nmに2ける吸光度から0分の540n
mにおける吸光度と適当な対照のΔA540nm’i差
し引いたものを表わす。試験された細菌によるMTT逮
元はo、i、0.5−または1.0係のTX−100の
存在下では阻害さノシなかったが白血球によるMTTの
還元は試験されたMTTの全濃度で阻害された。0.1
%のTX−100の存在下で白血球に関して得られた大
きな負の値は、細胞が徐々に溶解する時に溶液の濁9度
の減少が測定されるためであった。これよシ高濃度のT
X−100の場合には、細胞溶解は速かであシ、0分に
おいてほとんど完全であるため、濁シ度の減少は瞬間的
に起こシ、測定されなかった。
光度を測定した。第■表に示した結果(ΔA)Qま、1
0分後の540nmに2ける吸光度から0分の540n
mにおける吸光度と適当な対照のΔA540nm’i差
し引いたものを表わす。試験された細菌によるMTT逮
元はo、i、0.5−または1.0係のTX−100の
存在下では阻害さノシなかったが白血球によるMTTの
還元は試験されたMTTの全濃度で阻害された。0.1
%のTX−100の存在下で白血球に関して得られた大
きな負の値は、細胞が徐々に溶解する時に溶液の濁9度
の減少が測定されるためであった。これよシ高濃度のT
X−100の場合には、細胞溶解は速かであシ、0分に
おいてほとんど完全であるため、濁シ度の減少は瞬間的
に起こシ、測定されなかった。
以下余白
1冒Q 苦
実施例9
溶液中に訃ける細菌及び白血球によるMTTの還元に対
するノニオン界面活性剤オリーンIOGの効果を調べた
。グルコース0.2係、MTT 2.4 X10−4M
、PMS2.0X10 M及びオリーンIOGをきむ
細菌溶液及び白血球溶液をAmした。試験するオリーン
IOCの谷濃度について細胞を含まない対照溶液をA製
した。前記実施例8と同様にして10分間の54Qnm
におけるΔAi測定した・第■表に示した結果は、白血
球によるMTT還元は0.1.0.5及び1.0%(v
/v)のオリーンIOGで阻害されるが大腸mvcよる
IVITT還元は試験した全濃度のオリーンIOGで阻
害ざ7′LZかったことを示している。
するノニオン界面活性剤オリーンIOGの効果を調べた
。グルコース0.2係、MTT 2.4 X10−4M
、PMS2.0X10 M及びオリーンIOGをきむ
細菌溶液及び白血球溶液をAmした。試験するオリーン
IOCの谷濃度について細胞を含まない対照溶液をA製
した。前記実施例8と同様にして10分間の54Qnm
におけるΔAi測定した・第■表に示した結果は、白血
球によるMTT還元は0.1.0.5及び1.0%(v
/v)のオリーンIOGで阻害されるが大腸mvcよる
IVITT還元は試験した全濃度のオリーンIOGで阻
害ざ7′LZかったことを示している。
以ト迩ミ白
第■表
10分間のΔA540nm
オリーン10Gl17)濃度 大腸−白血球1(v
/v) 5X107/ml 2.3XiO
6/a/!U、1% 0.53
0,010.5% 0.62
−0.t、11i、o% lJ、69
0.02対照 0.32
0.22(界面活性剤なし) *無作= VC抽出した4個の試料の平均実施例10 わせ効果 無作為に抽出した31固の白血球の試料(平均濃度、細
胞4.9 X 10611/y PBS ) ff:、
り/l/ コー ス0.2%、 PMS 0.2mM及
びMTT 0.24mM ’i含む溶液中で37℃にお
いて1o分間インキュベートした。溶ri、はさらに、
グラム陽性細菌の還元活性を阻害する界面活性剤、ター
シト−ルアを0.1%及び/またはTX−100’!r
0.5%含んでいた。対照溶液は界面活性剤以外の前記
成分全全て含んでいた。540nmにおける吸光度を0
分及び10分において測定した。各溶液について10分
間のΔAを前述と同様にして算出した。
/v) 5X107/ml 2.3XiO
6/a/!U、1% 0.53
0,010.5% 0.62
−0.t、11i、o% lJ、69
0.02対照 0.32
0.22(界面活性剤なし) *無作= VC抽出した4個の試料の平均実施例10 わせ効果 無作為に抽出した31固の白血球の試料(平均濃度、細
胞4.9 X 10611/y PBS ) ff:、
り/l/ コー ス0.2%、 PMS 0.2mM及
びMTT 0.24mM ’i含む溶液中で37℃にお
いて1o分間インキュベートした。溶ri、はさらに、
グラム陽性細菌の還元活性を阻害する界面活性剤、ター
シト−ルアを0.1%及び/またはTX−100’!r
0.5%含んでいた。対照溶液は界面活性剤以外の前記
成分全全て含んでいた。540nmにおける吸光度を0
分及び10分において測定した。各溶液について10分
間のΔAを前述と同様にして算出した。
第V衣に示した結果は、白血球による■ゴ還元を阻害す
るTX−100の能力をターシト−ルアが妨害しないこ
とを示している。従って、これら2種の界面活性剤は組
み合わせて使用することがでさ、グラム陰性細菌のアッ
セイを提供できる。このアッセイは、白血球全阻害する
ためにグルコース、PMS 、 MTT 、 TX−1
00をそしてグラム陽性区ヲ阻害するためにターシト−
ルアを、前述したような臨床標本に添加することを含ん
でなる。インキュベートした後、赤紫色(バーグル)に
よって示される還元は、グラム陰性細菌の尺度である。
るTX−100の能力をターシト−ルアが妨害しないこ
とを示している。従って、これら2種の界面活性剤は組
み合わせて使用することがでさ、グラム陰性細菌のアッ
セイを提供できる。このアッセイは、白血球全阻害する
ためにグルコース、PMS 、 MTT 、 TX−1
00をそしてグラム陽性区ヲ阻害するためにターシト−
ルアを、前述したような臨床標本に添加することを含ん
でなる。インキュベートした後、赤紫色(バーグル)に
よって示される還元は、グラム陰性細菌の尺度である。
以下余白
第V衣
ターシト−ルア 0.1%(V/V) 0
.137TX−1000,5%(v/v) −0,0
84ターシト−ルア 0,1% −0,
021+TX−1000,5% 対照(界面活性剤なし) 0.12
5実施例11 前述の手法に従って乾燥要素を調製した。試験要素は試
薬層中に5.38g/m2のTX−10CI−含み、対
照要素は0.22jj/m2のゾニルFSN k含んで
いた。
.137TX−1000,5%(v/v) −0,0
84ターシト−ルア 0,1% −0,
021+TX−1000,5% 対照(界面活性剤なし) 0.12
5実施例11 前述の手法に従って乾燥要素を調製した。試験要素は試
薬層中に5.38g/m2のTX−10CI−含み、対
照要素は0.22jj/m2のゾニルFSN k含んで
いた。
グラム陰性細菌である大腸菌及びプロテウス・プルノブ
リスならびにグラム陽性歯であるスタフイロコンカスー
アウレウス及びストレフトコツカス・フェカーリス全各
々含む4個の細菌浮遊i’kpH7,5の燐酸カリウム
緩衝液中に細胞lXl09個/ml!の濃度で調製した
。無作為に抽出した4個の白血球試料をpH7,5の0
.05MPBS中に細胞7.3.9.4.11.6及び
13.8X106個/威の濃度で浮遊せしめた。各試料
にグルコースを加えて最終濃度を0.2チとした。
リスならびにグラム陽性歯であるスタフイロコンカスー
アウレウス及びストレフトコツカス・フェカーリス全各
々含む4個の細菌浮遊i’kpH7,5の燐酸カリウム
緩衝液中に細胞lXl09個/ml!の濃度で調製した
。無作為に抽出した4個の白血球試料をpH7,5の0
.05MPBS中に細胞7.3.9.4.11.6及び
13.8X106個/威の濃度で浮遊せしめた。各試料
にグルコースを加えて最終濃度を0.2チとした。
各要素に各試料10μlをスポットした。10分間、5
40nmで反射濃度、(DR)’li:監視した0緩衝
液ブランクについても測定し、前述のようにして算出し
た全ΔDR1直を適当な緩#液フ゛ランクのノくノクグ
2ウンド濃度で補正した。
40nmで反射濃度、(DR)’li:監視した0緩衝
液ブランクについても測定し、前述のようにして算出し
た全ΔDR1直を適当な緩#液フ゛ランクのノくノクグ
2ウンド濃度で補正した。
第V衣に示した結果は、乾燥要素形式においてTX −
100は白血球による色原体還元全阻害するがグラム陰
性細菌またはグラム陽性;m面に上る色原体還元は阻害
しないこと金示してい゛る。乾燥ノ杉式の細菌アッセイ
は、白血球阻害剤を含む前述の試験要素を使用す込こと
を含んでなる。要素に細菌及び/または白血球を含む0
J罷性のある試料液tスポットし、前述の手法に従って
処理するOΔDRは試料中に存在する細菌を光わす。
100は白血球による色原体還元全阻害するがグラム陰
性細菌またはグラム陽性;m面に上る色原体還元は阻害
しないこと金示してい゛る。乾燥ノ杉式の細菌アッセイ
は、白血球阻害剤を含む前述の試験要素を使用す込こと
を含んでなる。要素に細菌及び/または白血球を含む0
J罷性のある試料液tスポットし、前述の手法に従って
処理するOΔDRは試料中に存在する細菌を光わす。
以下丘白
細菌を溶解せずに白血球を選択的に溶解するのに充分な
量の界面活性剤を還元性指示薬と共に試料に接触せしめ
、そして還元によって形成された最終生成物の量の関数
として細菌を検出することによって水性試料中の細菌を
検出することを含んでなる本発明の方法は、細菌アッセ
イにおける白血球による妨害を有利に減少させる。
量の界面活性剤を還元性指示薬と共に試料に接触せしめ
、そして還元によって形成された最終生成物の量の関数
として細菌を検出することによって水性試料中の細菌を
検出することを含んでなる本発明の方法は、細菌アッセ
イにおける白血球による妨害を有利に減少させる。
特許出1願人
イーストマン コダ、り カンパニー
特許出願代理人
弁理士 育 木 朗
弁理士 西 舘 和 之
弁理士 石 1) 敬
弁理士 山 口 昭 之
弁理士 西 山 雅 也
一
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、水性試料中の細菌を検出する方法であって、A 該
試料を1.細菌を溶解せずに白血球を選択的に溶解する
のに充分な量の界面活性剤と接触せしめ; B、前記工程Aの試料を、検出可能な最終生成物全形成
する還元性指示薬と接触せしめ↓O前記工程Bの試料を
インキュベートし;そして D 存在する細菌の量を、前記工程Cにおいて還元によ
って形成された最終生成物の量の関数として検出する ことを含んでなる検出方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/453,033 US4610961A (en) | 1982-12-27 | 1982-12-27 | Inhibition of reduction activities of leukocytes |
US453033 | 1982-12-27 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS59120100A true JPS59120100A (ja) | 1984-07-11 |
JPH0468920B2 JPH0468920B2 (ja) | 1992-11-04 |
Family
ID=23798949
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58236505A Granted JPS59120100A (ja) | 1982-12-27 | 1983-12-16 | 水性試料中の細菌の検出方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4610961A (ja) |
EP (1) | EP0113103B1 (ja) |
JP (1) | JPS59120100A (ja) |
CA (1) | CA1206400A (ja) |
DE (1) | DE3365180D1 (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JPS61182576A (ja) * | 1985-02-07 | 1986-08-15 | イーストマン コダツク カンパニー | 置換キノン電子移動剤の分析測定への使用 |
JPWO2003035899A1 (ja) * | 2001-10-23 | 2005-02-10 | デンカ生研株式会社 | 血液中の血球と菌の分離方法および血液中の菌の検出方法 |
JP2013512685A (ja) * | 2009-12-08 | 2013-04-18 | バイオカルティス、ソシエテ、アノニム | 細胞の選択的溶解 |
JP2021518543A (ja) * | 2018-03-22 | 2021-08-02 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッドIDEXX Laboratories, Inc. | 生体試料中の細菌の測定方法 |
Families Citing this family (21)
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DE3783532T2 (de) * | 1986-07-28 | 1993-07-22 | Eastman Kodak Co | Zusammensetzung und verfahren, die substituierte ortho-chinone als elektronen-transfermittel in analytischen bestimmungen verwenden. |
US5141855A (en) * | 1986-07-28 | 1992-08-25 | Eastman Kodak Company | Signal amplifying cobalt (III) redox reagents and methods for the determination of analytes in aqueous fluids |
US5171669A (en) * | 1987-05-04 | 1992-12-15 | Eastman Kodak Company | Cobalt(III) reagents in combination with water soluble polymers |
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