JP2792813B2 - 新規な白血球インターフェロン - Google Patents
新規な白血球インターフェロンInfo
- Publication number
- JP2792813B2 JP2792813B2 JP5218449A JP21844993A JP2792813B2 JP 2792813 B2 JP2792813 B2 JP 2792813B2 JP 5218449 A JP5218449 A JP 5218449A JP 21844993 A JP21844993 A JP 21844993A JP 2792813 B2 JP2792813 B2 JP 2792813B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- huifn
- gene
- ifn
- human
- interferon
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規で明確な、ヒト白
血球インターフェロンタンパク質系列(ファミリー)[本
明細書中ではＨuＩＦＮ−αIIまたはＨuＩＦＮ−αIIと
称し、その個々のものを、例えば、ＨuＩＦＮ−αII.１
またはＨuＩＦＮ−αII１の如く表す]であって、ウイル
ス性疾患および新生物疾患の治療に有用なタンパク質系
列、並びにその様にインターフェロンタンパク質の製造
方法に関するものである。更に詳しくは、本発明は、組
換えＤＮＡ技術により、新規な独特のヒトインターフェ
ロン系列、並びにその製造方法を見出したことに基くも
のである。 【０００２】本発明の技術的背景を明らかにすると共
に、特殊な場合には、その実際面での詳細部分を補充す
るのに役立つと思われる刊行物等を明細書中で引用し、
便宜上、番号を付すと共に、添付の文献目録にまとめて
示した。 【０００３】 【従来の技術】ヒト白血球インターフェロンは、最初、
天然起源から極めて不純な沈澱物の形で得られた(１)。
この仕事に続いて、ヒト白血球インターフェロンは、実
質上、全てが密接なホモロジィ関係を示し、同じ抗ウイ
ルス活性の程度を異にする１クラスの、即ち１系列の物
質であることが見出された。この仕事は後に、いくつか
の文献で証明された(２、３、４、５)。この白血球イン
ターフェロンの系列(一般に省略してＨuＩＦＮ−αと称
する)は、抗ウイルス活性の程度を異にする１５または
それ以上の個々の物質で構成されているということが報
告された。このヒト白血球インターフェロン種は、その
成熟型のものが約１６５〜１６６アミノ酸からなってい
ること、およびそれぞれの配列の基礎となるＤＮＡ配列
並びにグリコシル化部位および報告されている動物種で
の抗ウイルス活性、などにより特性化されて来た。実
際、これらのヒト白血球インターフェロンタンパク質の
内、少くとも１個は、公認のヒトにおける臨床試験にお
いて成功を収めている。これらのインターフェロン種は
組換えＤＮＡ技術、とりわけ当該技術分野で用いられて
いる、トランスフェクトされた大腸菌(Ｅ.coli)を利用
して生産されて来たし、現在も生産されている。即ち、
これらの先行技術により、今日、臨床研究面での使用に
必要であることが分っている極めて高純度のタンパク質
をトランスフェクトされた宿主系を用いた組換えＤＮＡ
技術を介して大量に回収し、充分量のヒト白血球インタ
ーフェロン種を生産することができるようになった。そ
の様な従来技術は既述の文献並びに今日の技術に関する
その他の文献に記載されている。 【０００４】広範な研究がなされ、様々な人々がヒト白
血球インターフェロン系列の研究に労力を費した。これ
までに発見され、研究されたヒト白血球インターフェロ
ンは疑いもなく、特性上のホモロジィ、アミノ酸長さお
よび抗ウイルス活性において共通したものを有する単１
のタンパク質系列にまとめられる。同様の研究は、動
物、特にウシのインターフェロンに関しても成功を収め
ている(６)。 【０００５】第２のヒトインターフェロン類は、いわゆ
るヒト線維芽細胞インターフェロン(β−インターフェ
ロンまたはＨuＩＦＮ−βと称する)である。この化合物
に関しても広範な研究がなされており、驚くべきこと
に、上記の如く、ヒト白血球インターフェロンが一般に
１５またはそれ以上の種からなると定義されるのと対照
的に、単一のポリペプチドまたはタンパク質であると思
われている(７)。 【０００６】第３番目のヒトインターフェロン類はヒト
ガンマインターフェロン(ＨuＩＦＮ−γ)と称される
(８、９)。ヒトガンマインターフェロンは白血球および
線維芽細胞に由来するヒトインターフェロンの特性であ
る抗ウイルス活性および抗増殖作用を示すことが報告さ
れているが、これらと対照的に、白血球およびβインタ
ーフェロンよりも、より短いアミノ酸配列を有し、pＨ
２において不安定であるという特徴を有することが明ら
かにされた(１０)。このことから、ヒトガンマインター
フェロンが実質上、がん患者の治療に有用であることを
示す様な、上記抗増殖作用に関する特徴についてもっと
主張されるべきであると考えられている。そこで、ヒト
ガンマインターフェロンに関して集中的に、あるいは個
々別々に研究がなされて来た。 【０００７】ヒト線維芽細胞インターフェロン(ＨuＩＦ
Ｎ−β)とヒト白血球インターフェロン(ＨuＩＦＮ−α)
に関しては、その構造(アミノ酸長さおよびホモローガ
スな配列部分)および生物学的な特性(抗ウイルス活性)
は類似しているので、ヒト線維芽細胞の場合は、これま
で唯１個の遺伝子が存在するだけであるのに、ヒト白血
球インターフェロンは、複数個の物質からなる一系列の
ものからなるということは奇妙なことに思われる。これ
は、ヒト白血球インターフェロンの場合には、白血球系
列の進化論的な分枝および拡張があって複数の遺伝子が
存在することになり、一方、ヒト線維芽細胞インターフ
ェロンの場合には、唯一個のはっきりした遺伝子が保持
されたことを示している。 【０００８】 【発明が解決しようとする課題】本発明者らは上記の点
に興味を抱き、ＨuＩＦＮ−β遺伝子について詳しく研
究を行った。この研究は、既知のＨuＩＦＮ−β遺伝子
の成熟した暗号領域にまたがったフラグメントから調製
したＤＮＡプローブを用いて、低いハイブリダイゼーシ
ョン・ストリンジエンシィにおいてヒトゲノムＤＮＡラ
イブラリィ(１１)をスクリーニングすることにより行っ
た。その結果、思いがけず、これまでその存在が知られ
ていなかった、新規で明確なヒト白血球インターフェロ
ン系列の発見という驚異的な成果をあげることができ
た。本発明は、この新規で明確なヒト白血球インターフ
ェロンの発見に基いて完成された。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明はヒト白血球イン
ターフェロン化合物群の間に見出された新規かつ明確に
他と区別し得る系列または群(グループ)に関するもので
ある。この新しいヒト白血球インターフェロン系列また
は群は、これまでに報告されたヒト白血球インターフェ
ロン系列の遺伝子と実質上ホモロジィ(例えば、約７０
％)な暗号領域を有するが、そのホモロジィは上記の値
以上ではなく、またそのアミノ酸残基の長さもこれまで
に報告されたヒト白血球インターフェロンの系列に属す
るものよりも長いことが分った。即ち、従来知られてい
るヒト白血球インターフェロン系列は、その成熟型にお
いて約１６５〜１６６個のアミノ酸から成っている。本
発明に係るヒト白血球インターフェロン、即ち、この第
IIのヒト白血球インターフェロン系列の代表的なもの
は、約１７２個のアミノ酸から成ることが分った。同様
に生物学的な抗ウイルス活性に関しても、本発明のヒト
白血球インターフェロンの抗ウイルス活性は、従来から
のヒト白血球インターフェロンの内の幾つかのものの活
性と比較したとき、それらと重複する活性を有し、さら
に広い活性スペクトルを有することがわかった。 【００１０】本発明はこれまでに報告されたヒト白血球
インターフェロンから明確に区別される、新規なヒト白
血球インターフェロンの新系列に関し、さらに、その製
造方法を開示するものである。本発明は、その様な新規
で独特なヒト白血球インターフェロンを組換えＤＮＡ技
術を利用して、それらを、あるいはそれらの各々を直接
成熟型で、あるいは融合タンパク質中間体の形を介し、
市場化の前段階として必要な臨床試験を行うのに必要な
量を生産することを可能ならしめるものである。本発明
の生産物は、そのあらゆる型が、ヒトに対する予防また
は治療、とりわけウイルス感染症および悪性腫瘍、並び
に免疫抑制または免疫欠損症状の治療に用いるのに適す
る。その様な型には、様々なオリゴマーが含まれ、さら
に、グリコシル化されたものやアレル変異体、または個
々のメンバーまたは種のその他の誘導体をも含む。本発
明においては、これらの生産物を、一般的に取扱われて
いる微生物または細胞培養システムにより生産する。 【００１１】本発明はこの様にして生産された新規で独
特なヒト白血球インターフェロン、並びにそれを生産す
る方法および手段に関するものである。本発明はまた、
新規で独特なヒト白血球インターフェロンの遺伝子配列
を発現し得る形で含有している複製可能なＤＮＡ発現ビ
ヒクルを提供するものである。更にまた、本発明は、上
記の発現ビヒクルによってトランスフェクトされた微生
物株または細胞培養、並びにその様なトランスフェクト
された株または培養であって本発明の新規で独特なヒト
白血球インターフェロンを生産し得る株または培養を含
む発酵培地を提供するものである。 【００１２】さらにまた本発明は、該インターフェロン
遺伝子配列、ＤＮＡ発現ビヒクル、微生物株および細胞
培養の様々な調製方法、並びにそれらの特殊な態様に関
するものである。さらにまた本発明は、該微生物および
細胞培養のための発酵培地に関するものである。また、
ある宿主系では、所望のインターフェロンを生産し、そ
れを成熟型で宿主から分泌させる様にベクターを工夫す
ることもできる。なお、本明細書で用いる「アレル変異
体」とは、同一遺伝子座に起こったＤＮＡ配列の差に基
づく、個体差レベルで認められる変異体をいう。 【００１３】本発明の態様の一般的記述 本発明は、本発明に係る特に新規で独特なヒト白血球イ
ンターフェロンの遺伝子配列を担った発現ベクターによ
ってトランスフェクトされ得る、様々な細菌、酵母、あ
るいは哺乳類または脊椎動物の細胞培養系を用いて実施
することができる。その様な系は当該技術分野で良く知
られており、数多くの文献がある。例えば、本発明にお
いては、微生物大腸菌Ｋ−１２株２９４(ＡＴＣＣ Ｎo.
３１４４６)を、他の当該技術分野で既知の大腸菌の菌
株や様々な寄託機関に寄託されている他の公共的な微生
物と同様に、広範囲に用いることができる。これらの他
の微生物には、例えば、バチルス(Ｂacillus)、サルモ
ネラ(Ｓalmonella)およびセラチア(Ｓeratia)の菌株が
含まれる。さらに、種々の酵母株についても記述されて
おり、それらを本発明に用いることができる。最も注目
されるのは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション(American Type Calture Collection)にＡＴＣＣ
Ｎo.４４０７６の下で寄託されているサッカロミケス
・セレビシエ(Ｓaccharomyces cerevisiae)の特定の
株、ＲＨ２１８である。同様に、様々な細胞培養系が開
発されて使用されており、それらを本発明の工程に用い
ることができる。例えば、ＷＩ３８、ＢＨＫ、Ｔ３、Ｃ
ＨＯおよびＶeroセルライン等の様々な培養物を用いる
ことができる。 【００１４】これらの系それぞれについて、機能的に結
合しているヘテロローガスな遺伝子セグメント(本発明
では、新規で独特なヒト白血球インターフェロンをコー
ドしているヘテロローガスな遺伝子セグメント)を発現
させる様に指令する種々のプロモーター系が開発されて
おり、それらを用いることができる。遺伝子と、特定の
発現宿主系内で適切なプロモーターとの機能的な結合
は、本発明の新規で独特なヒト白血球インターフェロン
を、該アミノ酸と結合しているプレ配列または他の人工
的な発現物質を全く含まない、成熟型として発現させ得
る様、結合させることによって行われる。別法として、
本発明の新規で独特なヒト白血球インターフェロンをそ
れ自身の信号配列と機能的に結合させ、細胞膜を通過し
て移送される際に該信号配列が開裂されることにより、
成熟型のものが分泌される様にすることもできる。加え
て、本発明の新規で独特なヒト白血球インターフェロン
遺伝子を、該新規で独特なヒト白血球インターフェロン
のアミノ酸配列と、そのＮ末端に結合したホモローガス
なタンパク質との融合タンパク質を生産させる様、機能
的に結合させることができる。これらの全ての態様は、
これまでに報告されているヒト白血球インターフェロン
(４)と異る性質および構造を有する、新規で独特なヒト
白血球インターフェロン類または系列の発見、同定、並
びにその生産の可能性に関する基本的な前提条件を満す
ので、本発明の範囲内に含まれるものである。 【００１５】好ましい態様についての記述 本発明方法は、遺伝子配列、遺伝子の単離、発現させる
ための連結、精製および生物学的な確認等の手段を介し
て本発明の新規で独特なヒト白血球インターフェロンを
同定するための、代表的な態様によって例示される。こ
の方法では、元々、他のβ遺伝子が存在するか否かを決
定する目的で、ヒトゲノムライブラリィのプローブにヒ
トβインターフェロンの遺伝子を用いた。これらの実験
の結果、最初にβインターフェロン遺伝子ではなく、む
しろ、白血球系列のインターフェロンにより近いと思わ
れる遺伝子が同定された。本発明はこの結論を具体化し
たものである。 【００１６】図面の説明 図１は制限エンドヌクレアーゼ・マッピング法に基づく
ＩＦＮ−αII遺伝子の配列を示す模式図である。この遺
伝子(図２および図３)の配列決定された領域（ＩＦＮ−
αＩＩ．２遺伝子の０.０kb〜０.３kb領域を除く)に含
まれる制限エンドヌクレアーゼ部位も示されている。Ｉ
ＦＮ−αII.１の地図において、太く描いた部分はＩＦ
Ｎプレタンパク質の暗号配列に対応する部分である。キ
ロ塩基対(kb)に基くサイズスケールを地図下方に示し
た。ＩＦＮ−αII遺伝子内の制限エンドヌクレアーゼ部
位を次に示す:ＡccＩ(Ａ)、ＢamＨＩ(Ｂ)、ＢglII(Ｂ
g)、ＥcoＲＩ(Ｅ)、ＨindIII(Ｈ)、ＮcoＩ(Ｎ)、ＰstＩ
(Ｐ)およびＰvuII(Ｐv)。 【００１７】図２および図３はＩＦＮ−αII遺伝子間の
ＤＮＡ配列の関係を示す模式図である。ＩＦＮ−αII.
１遺伝子の配列を、２５０塩基からなる５'非翻訳配列
(ウイルス性の誘導に必要であると思われる領域をコー
ドするのに充分な配列)、および推定のポリアデニル化
部分を通過した３'非翻訳領域を含めて詳しく示した。
ＩＦＮ−αII.２、αII.３およびαII.４遺伝子のヌク
レオチドは、ＩＦＮ−αII.１のそれと異なるもののみ
を示した。ＩＦＮ−αII.１配列中の(・・・)で示したギャ
ップは他の遺伝子への挿入適応部位であり；(△−△−
△)、ＩＦＮ−αII.２、αII.３およびαII.４配列にお
ける欠除は、ＩＦＮ−αII.１との最大のホモロジィ部
分である；(＊)はＩＦＮ−αII.１のメッセンジャーＲ
ＮＡの推定のキャップサイトである；(←)は５'非翻訳
領域であり；(→)は３'非翻訳領域である。ＩＦＮ−αI
I.４の１９９位よりも上流の配列は未だ得られていな
い。ＩＦＮ−αII.４の最初の２つのヌクレオチドは対
応するＩＦＮ−αII.１の塩基と同一であるために記載
されていない。 【００１８】図４はＩＦＮ−αII遺伝子系列によってコ
ードされているポリペプチドのアミノ酸配列を示す模式
図である。ＩＦＮ−αII.１プレタンパク質の完全なア
ミノ酸配列が示されている。アミノ酸残基中、挿入／欠
失部位についてはアンダーラインを付して示した。ＩＦ
Ｎ−αII.１のシグナル(信号)ペプチドの残基はＳ１か
らＳ２３までであり、成熟タンパク質の残基は１から１
７２までである。 【００１９】図５はＨuＩＦＮ−αII１遺伝子を含有し
ているファージ組換え体の構造を示す模式図である。暗
号領域を交叉した斜線で示し、プレ配列(左側の斜線で
陰影を付けた部分)と分け、さらに、ＨuＩＦＮ−αII１
遺伝子および組換えファージλ２４.１の非翻訳領域の
制限地図をも示した。 【００２０】図６はヒトＩＦＮ−α遺伝子系列のサザー
ン・ブロット分析の結果を示す写真の模写図である。高
分子量のヒトゲノムＤＮＡ(５μg)を、表示されている
様に種々の制限エンドヌクレアーゼで消化し、０.８％
アガロースゲル電気泳動に付し、ニトロセルロース濾紙
上に移した。次のＩＦＮ−α暗号領域、即ちＨuＩＦＮ
−αI１(レーンa)およびＨuＩＦＮ−αII１(レーンb)か
ら導かれたプローブを用い、ストリンジエント条件下で
ハイブリダイゼーションを行った。分子量標準には、Ｅ
coＲＩ消化バクテリオファージλシャロン３０Ａ ＤＮ
ＡおよびpＢＲ３２２ ＤＮＡ、並びにＲsaＩ消化pＢＲ
３２２ ＤＮＡを用いた。 【００２１】図７および図８はＨuＩＦＮ−αII１とＨu
ＩＦＮ−αI１のヌクレオチド配列、並びにＨuＩＦＮ−
αII１でコードされたタンパク質およびクラスＩのＨu
ＩＦＮ−αI１遺伝子系列のタンパク質を対比させて示
した図である。ＨuＩＦＮ−αI１のアミノ酸残基中、下
線を施したものは今日までに報告されている、クラスＩ
のＨuＩＦＮ−αI１種の全てに見出されている残基であ
る。ＨuＩＦＮ−αII１ＤＮＡ配列の下方のアミノ酸残
基は、ＨuＩＦＮ−αII１とＨuＩＦＮ−αI１との相違
部分を示している。星印は、コードされているアミノ酸
配列には変化をもたらすことのない、ヌクレオチド配列
上の変化を示している。ＨuＩＦＮ−αI１のポリアデニ
ル化信号(ＡＡＴＡＡＡ)にはオーバーラインを付した。
提案し得るＨuＩＦＮ−αII１のポリアデニル化信号(Ａ
ＴＴＡＡＡ)にはアンダーラインを付した。垂直な矢印
は、ＨuＩＦＮ−αI１のメッセンジャーＲＮＡのキャッ
プサイトを示している。中空の三角形で示した部位は、
５'末端と、最長のＨuＩＦＮ−αII１ cＤＮＡクローン
に見出された、ポリ(Ａ)付加に係る３'部位を示してい
る。 【００２２】図９はウイルス的に誘導されたクラスＩお
よびクラスIIのＩＦＮ−α転写物の分析結果を示す図で
ある。各レーンは、それぞれ５μgのポリＡ(+)ＲＮＡ分
析に係る。図中、(Ａ)はクラスＩ(ＩＦＮ−αI２)プロ
ーブ、(Ｂ)はクラスII(ＩＦＮ−αII１)プローブを用い
たハイブリダイゼーションの結果を示す。レーン１、２
および３は供与者１から、レーン４、５および６は供与
者２からの試料を用いた結果である。レーン１および４
は非誘導対照であり、レーン２および５はニューキャッ
スル症ウイルス(Ｎewcastle Ｄisease virus)、レーン
３および６はセンダイ・ウイルス(Ｓendai virus)によ
り、それぞれ誘導されたものである。分子量マーカーは
pＬeＩＦＡ２５のＥcoＲＩ＋ＰstＩ消化(３.６kbおよび
０.９kb)およびpＨuＩＦＮ−αIItrpのＥcoＲＩ＋Ｈind
III消化(４.３kbおよび１.２kb、図１１)によって誘導
された。０.９kb pＬeＩＦＡ２５フラグメントは、ＩＦ
Ｎ−αI２の暗号領域を含有しており、また、１.２kb p
ＨuＩＦＮ−αIItrp１フラグメントはＩＦＮ−αII１の
暗号領域を含有している。 【００２３】図１０は、大腸菌内で成熟ＩＦＮ−αタン
パク質を合成するためのプラスミドの構造を示す模式図
である。巾の厚くなっている部分がＩＦＮ−α挿入部分
であり、成熟暗号領域は、陰影を付けて示されている：
ＨuＩＦＮ−αII１trp。 【００２４】 【実施例】詳しい説明：実施例 ヒトＩＦＮ−α遺伝子(ＨuＩＦＮ−αII)の同定 ヒトゲノムＤＮＡライブラリィ(１１)を、ＨuＩＦＮ−
β遺伝子の成熟暗号領域にまたがるフラグメントから調
製したプローブを用い、低いハイブリダイゼーションス
トリンジエンシィ下においてスクリーニングした。この
スクリーニング法で回収された７個の陽性クローンの
内、４個が、制限マッピング、サザーン分析、およびＨ
uＩＦＮ−βプローブを用いた、高ストリンジエンシィ
下でのハイブリダイゼーションの結果、ＨuＩＦＮ−β
遺伝子を含有していることが分った。残る３個の組換え
体はヒトゲノムの重複セグメントであって、低いストリ
ンジエンシィ下においてのみ、ＨuＩＦＮ−βプローブ
とハイブリダイズする、関連性の薄い遺伝子を含有する
ものと思われる。これらのクローンの内の１個(λ２４.
１)から得たハイブリダイズし得る領域を含む４.１キロ
塩基のＨindIIIフラグメントをpＢＲ３２２にサブクロ
ーンし、制限エンドヌクレアーゼマッピング(図５)、お
よびヌクレオチド配列決定による特性化を行った。 【００２５】このフラグメントのＤＮＡ配列分析の結果
(図７および図８)、インターフェロン遺伝子は、その暗
号領域のヌクレオチド配列において、ＨuＩＦＮ−βと
のホモロジィ(４８％)よりも、ＨuＩＦＮ−α遺伝子と
のホモロジィ(例、ＨuＩＦＮ−αI１と７０％、表１)を
多く有していることが明らかになった。同様に、ＨuＩ
ＦＮ−αI１タンパク質およびλ２４.１の遺伝子産物
は、いずれもＨuＩＦＮ−βと３０％のアミノ酸ホモロ
ジィを示すにすぎないのに対し、それらは相互に、約５
２％のホモローガスな関係を示した。従って、λα２
４.１に含まれている遺伝子は、ＩＦＮ−βでなくＩＦ
Ｎ−αをコードしていると結論される。しかしながら、
このタンパク質の配列は他のＨuＩＦＮ−α遺伝子産物
とは驚く程、異っている。 【００２６】この新規なＨuＩＦＮ−αは、そのカルボ
キシ末端に５または６個のアミノ酸を付加しており、そ
の内の３個は各タンパク質において同一のものである
(図７および図８)。この様な類似性はヌクレオチドのホ
モロジィ程度にも同様に反映されている(表１)。これら
の観察結果は総合的に、この新規なＨuＩＦＮ−αが、
既に配列決定された機能的なＨuＩＦＮ−α遺伝子を含
む、クラスＩのＩＦＮ−α遺伝子系列と区別される、ホ
モローガスな遺伝子産物であることを強く示唆している
といえる。そこで、本発明者らはこの遺伝子をクラスＩ
のＩＦＮ−α遺伝子と判別するために、ＨuＩＦＮ−α
II１と命名した。 【００２７】このＨuＩＦＮ−αII１配列は７８−８０
位に潜在的なグリコシル化配列、asn−met−thrを含有
している。興味深いことには、ＨuＩＦＮ−βの同じ位
置に同様の配列が認められ、これは、インビボで炭水化
物の付加により修飾されることが知られている(２０)。 【００２８】ＨuＩＦＮ−αII１がヒトゲノム内でＩＦ
Ｎ−α遺伝子の新しい系列であると定義し得るか否かを
試験するために、ＨuＩＦＮ−αI１およびＨuＩＦＮ−
αII１暗号領域から導かれたプローブを用い、両遺伝子
のクロスハイブリダイゼーションを起こさせない様なス
トリンジエント条件下、ヒトゲノムＤＮＡのブロットハ
イブリダイゼーション分析を行った。これらの実験の結
果、図６に示す如く、ＨuＩＦＮ−αI１プローブおよび
ＨuＩＦＮ−αII１プローブは別個の遺伝子系列をはっ
きりと示すことが証明された。このＨuＩＦＮ−αII１
プローブで、ヒトゲノム中には６〜７個のクラスII遺伝
子が存在していることが証明された。 【００２９】ウイルスによって誘導可能な、クラスIIの
ＩＦＮ−α遺伝子の発現：ＨuＩＦＮ−αII１タンパク
質またはその近縁のクラスIIのＩＦＮ−α遺伝子産物の
いずれも、ウイルス的に誘導されたセルラインからのイ
ンターフェロン標品中に同定されたことがない(２１、
２２)ばかりか、リンパ芽球様セルラインから調製され
たcＤＮＡライブラリィ(３)またはウイルスによって誘
導された末梢血中リンパ細胞中に見出されるＤＮＡ配列
に対応する配列を含有していない。クラスIIのＨuＩＦ
Ｎ−α遺伝子がウイルス感染に応答して転写されるか否
かを調べるために、センダイウイルスまたはニューキャ
ッスル症ウイルスで誘導された２供与者から得た末梢血
中リンパ細胞からのＲＮＡをブロットハイブリダイゼー
ション法で分析した。ウイルスと一緒に６時間インキュ
ベートした後、培養中からポリＡ+ＲＮＡを単離し、ホ
ルムアルデヒドゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロース
濾紙上に移してクラスＩ(ＨuＩＦＮ−αI２)またはクラ
スII(ＨuＩＦＮ−αII１)プローブを用いてハイブリダ
イズした。図９に見られる様に、クラスＩ(図９Ａ)およ
びクラスII(図９Ｂ)のＩＦＮ−α遺伝子の転写は、いず
れもニューキャッスル症ウイルス(レーン２および５)お
よびセンダイウイルス(レーン３および６)の両者によっ
て誘導され、両供与者からの非誘導培養中には検出する
ことができなかった(レーン１および４)。クラスＩおよ
びクラスII遺伝子の発現レベルを比較するために、これ
らの各プローブでハイブリダイズした濾紙をＨuＩＦＮ
−αI２(図９Ａ)またはＨuＩＦＮ−αII１(図９Ｂ)の暗
号領域を含有しているＤＮＡマーカーが等しい強度(デ
ータは表示されていない)のシグナルを示すまでフイル
ムにさらした。この分析の結果、クラスII遺伝子はクラ
スＩ遺伝子と類似のレベルで転写されることが分った
(図９)。加えて、センダイウイルスはＮＤＶの数倍のク
ラスＩおよびクラスIIインターフェロン・メッセージを
誘導すると思われる。このことは、クラスＩおよびクラ
スII遺伝子がウイルス感染に対する応答において、同様
な制御を受けていることを示唆するものである。 【００３０】ＩＦＮ−αII１遺伝子が発現されていると
いう結論を確認するため、センダイウイルス−誘導末梢
血中リンパ細胞から単離したポリＡ(+)ＲＮＡから相補
的ＤＮＡライブラリィを組立てた。ストリンジェント・
ハイブリダイゼーション条件下、ＨuＩＦＮ−αII１暗
号領域プローブを用いて１０,０００個のプラークをス
クリーニングした。こうして２個のＨuＩＦＮ−αII１
クローンを回収した。ＤＮＡ配列決定の結果から、２個
のcＤＮＡクローンの内、長い方はmＲＮＡのポリ(Ａ)か
らＨuＩＦＮ−αII１の信号ペプチドの暗号配列内に伸
びていることが示された。ＨuＩＦＮ−αII１遺伝子中
の対応する配列を図７および図８に示す。 【００３１】抗ウイルス活性を有するタンパク質をコー
ドしているクラスIIのＩＦＮ−α遺伝子：クラスIIのＩ
ＦＮ−α遺伝子が活性なタンパク質をコードしているか
否かを決定し、また、それらの宿主域をクラスＩのＩＦ
Ｎ−αポリペプチドのそれと比較する目的で、ＨuＩＦ
Ｎ−αII１遺伝子の発現のための細菌性ベクターを組立
てた。得られたプラスミドは、trpオペロンプロモータ
ー、リボゾーム結合部位およびメチオニン開始コドン
と、それぞれの成熟ＩＦＮ−α暗号領域の最初のアミノ
酸残基とが結合したものである。表２から分かる様に、
３つのプラスミドの各々で形質転換された大腸菌株を、
培地中のトリプトファンを消耗する様な条件下で増殖さ
せ、この大腸菌のエキスを調製したところ、このエキス
は細胞変性効果阻止分析(cytopathic effects inhibiti
on assay)による測定の結果、有意量の抗ウイルス活性
を有することが分った。各ＩＦＮ−αの相対的な抗ウイ
ルス活性を、２個のクラスＩＨuＩＦＮ−αタンパク
質、即ち、ＨuＩＦＮ−αI２およびＨuＩＦＮ−αI１
と、小水胞性口内炎ウイルスにチャレンジさせたウシセ
ルライン(ＭＤＢＫ)セルライン、並びに脳心筋炎ウイル
スにチャレンジさせたヒト肺腫瘍(Ａ５４９)セルライン
を用いて比較した。両細胞型に対し、ＨuＩＦＮ−αII
１とＨuＩＦＮ−αI２とは略等しい活性を示した。従っ
て、クラスIIのＩＦＮ−αタンパク質の活性は他のセル
ライン同様、これらのセルラインでもクラスＩのＩＦＮ
−α遺伝子産物の比活性をオーバーラップしていると思
われる。 【００３２】さらに、ＨuＩＦＮ−αII１に付随する抗
ウイルス活性を特性化するために、ＩＦＮ−αおよびＩ
ＦＮ−βに対する抗血清を調製し、そのＨuＩＦＮ−α
II１活性に対する中和能力を調べた。抗ＨuＩＦＮ−β
はＨuＩＦＮ−αII１の活性に対して有意な影響を及ぼ
さないが、ヒト白血球培養からのセンダイウイルス誘導
インターフェロンに対して調製された抗血清はＨuＩＦ
Ｎ−αII１抗ウイルス活性の中和作用を示した(表３)。
後者の誘導法はＨuＩＦＮ−βでなく、ＨuＩＦＮ−αを
一義的に生産せしめる、ということが既に分っており、
従って、この結果は、タンパク質のホモロジィに基いて
なされたＨuＩＦＮ−αII１のＩＦＮ−α系列への帰属
を確認するものである。 【００３３】２個の区別し得るＩＦＮ−α遺伝子系列：
これまでの研究では、その暗号領域中に少くとも８５％
のヌクレオチドホモロジィ関係を有する約１５の非アレ
ル型ＨuＩＦＮ−α遺伝子からなる系列が示されている
(３)：明確に言えば、これらの遺伝子はＨuＩＦＮ−αI
系列に属する。各遺伝子は、大腸菌内で抗ウイルス活性
を発現させる能力に基き、機能的なインターフェロンポ
リペプチドをコードしていると断定された。 【００３４】その様な遺伝子はＨuＩＦＮ−β cＤＮＡ
プローブを用いてヒトゲノムライブラリィをスクリーニ
ングすることによって初めて単離されたクローン集団か
ら、ＨuＩＦＮ−αIIであると同定された。しかしなが
ら、ＤＮＡホモロジィに関する比較、並びに大腸菌内で
発現されたＨuＩＦＮ−αII１タンパク質の抗原性の研
究に基き、この遺伝子がＨuＩＦＮ−βでなく、ＨuＩＦ
Ｎ−αタンパク質をコードしていることが確定的となっ
た。ＨuＩＦＮ−αII１は１７２アミノ酸残基からなる
成熟ポリペプチドをコードしている。これらの結果は、
ヒトゲノム中に２種のホモローガスであるが別個のＩＦ
Ｎ−α遺伝子が存在していることを証明するものであ
る。 【００３５】ヒトＤＮＡのサザーン・ブロット分析の結
果は、クラスII ＨuＩＦＮ−α遺伝子系列中に６−７個
の異るメンバーが含まれていることを示唆している。 【００３６】クラスＩ ＨuＩＦＮ−α系列のメンバー並
びにＨuＩＦＮ−βのメンバーは染色体９の上に存在し
ており(２３)、ＨuＩＦＮ−γの遺伝子は染色体１２上
に存在している(２４)。最近の研究では、クラスII Ｈu
ＩＦＮ−α系列のメンバーの大多数(全てではない)もま
た染色体９上に存在していることが指摘されている。 【００３７】クラスIIのＩＦＮ−α遺伝子の転写コント
ロール：ＩＦＮ−α mＲＮＡレベルに対する制御の変異
は、ウイルス的に誘導された細胞培養内において個々の
ＨuＩＦＮ−α mＲＮＡ配列が見出される頻度の１０倍
以上の頻度範囲に及ぶことが示唆された。クラスＩおよ
びIIのＩＦＮ−α遺伝子に対する転写制御を比較する目
的で、ヒト末梢血中リンパ細胞におけるインターフェロ
ン生成を誘導するために、ニューキャッスル症ウイルス
(ＮＤＶ)あるいはセンダイウイルスを用いた。ウイルス
誘導の６時間後には、各培養から調製したポリＡ(+)Ｒ
ＮＡ中に比較し得るレベルのクラスＩ mＲＮＡおよびク
ラスII mＲＮＡを容易に認めることができた(図９)。ま
た、センダイウイルスは数倍量のクラスIIおよびクラス
Ｉの両型のＩＦＮ−α転写物を誘導するらしい。このこ
とから、どちらのＩＦＮ−αも、ウイルス誘導によって
同様の転写活性化作用を受けることが示唆された。これ
まで、ヒト白血球またはヒト骨髄芽球様セルラインのセ
ンダイウイルス誘導培養から調製したライブラリィ中に
はクラスII cＤＮＡクローンが観察されていないことか
ら、以上の結果は、クラスIIのＩＦＮ−α合成がウイル
ス的に誘導される、ということの最初に得られた証拠と
いえる。このことは、ＩＦＮ−αII１ mＲＮＡの３'末
端、並びにその暗号領域の大部分を含んだ相補的ＤＮＡ
クローンの単離によって追認された(図７および図８)。 【００３８】ハイブリダイゼーションの条件およびプロ
ーブ類：ハイブリダイゼーションは５×ＳＳＣ(１×Ｓ
ＳＣは、０.１５Ｍ ＮaＣl、０.０１５Ｍクエン酸ナト
リウムからなる)、５×Ｄenhardt's溶液(１２)、０.１
％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.１％ピロリン
酸ナトリウム、５０μg／mlの音波処理による変性鮭精
子ＤＮＡおよび１０％デキストラン硫酸ナトリウム中、
非ストリンジエントおよびストリンジエント条件を与え
るためにそれぞれ２０％または５０％のホルムアミドを
含有させて行った。４２℃でインキュベーションした
後、フィルターを、室温において２×ＳＳＣ、０.２％
ＳＤＳ(非ストリンジエント)中で洗浄するか、あるいは
４２℃において、０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ(スト
リンジエント)中で洗浄する、のいずれかで処理した。
文献記載の如く32Ｐ標識プローブを調製した(１３)。ヒ
トＤＮＡ中のクラスＩおよびII遺伝子を高いストリンジ
エンシィ下で分析するために(図６)、以下のフラグメン
トを用いた(いずれも対応するＩＦＮ−α遺伝子の成熟
暗号領域を含む)：クラスＩのヒト由来、pＨuＩＦＮ−
αI２／１ハイブリッド(１４)の５６５bp ＥcoＲＩフラ
グメント；クラスIIのヒト由来、pＨuＩＦＮ−αII１の
３９０bp ＸbaＩ−ＡccＩフラグメント(プラスミドにつ
いては図１０を参照されたい)。 【００３９】ファージライブラリィの組立てとスクリー
ニング：ＨuＩＦＮ−αII１遺伝子は、ローン(Ｌawn)ら
によって組立てられたヒト胎児の肝臓／バクテリオファ
ージλシャロン４Ａライブラリィ(１１)から、成熟Ｈu
ＩＦＮ−βタンパク質をコードしている５０１bpのＸba
Ｉ−ＢalIIフラグメントから調製したプローブを用いて
単離した。 【００４０】ＤＮＡ配列分析：ＤＮＡ配列は(１６)に記
載の方法により、あるいはＤＮＡをＭ１３mp８およびmp
９ベクター(１７)にサブクローンし、ジデオキシ鎖ター
ミネーション法(１８)を使って決定した。 【００４１】ウイルス誘導ＲＮＡの調製および分析：末
梢血リンパ球(２×１０9)を、５％の(熱で不活性化し
た)牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０に、４×１０6細
胞／mlとなる様に再懸濁した。培養をＴ−１７５フラス
コ(Ｆalcon)中でインキュベートし、誘導した培養を、
２５ＵＡＵ／１０6細胞のニューキャッスル・ディジー
ズ・ウイルスまたはセンダイウイルスで処理した。ウイ
ルスと共に６時間インキュベートした後、培養を０.０
５％ＥＤＴＡで処理し、細胞を遠心して集め、氷冷媒質
で１回洗浄し、ポリＡ(+)ＲＮＡを調製した(１９)。Ｒ
ＮＡをホルムアルデヒド・ゲル電気泳動にかけ、ノーザ
ン・ブロット分析を行なった。２本鎖cＤＮＡをλgt１
０ベクター(２５)に結合させたことを除き、末梢血リン
パ球cＤＮＡライブラリィを組み立てた(２)。 【００４２】ＩＦＮ−α遺伝子のための細菌性発現プラ
スミドの組み立て：大腸菌のtrpプロモーターのコント
ロール下で成熟ＨuＩＦＮ−αI１および−αI２を発現
させるプラスミドの組み立ては、既に報告されている
(２および１４)。成熟ＨuＩＦＮ−αII１のＮ−末端ア
ミノ酸残基をイニシエーター(メチオニン)コドン、リボ
ソーム結合部位およびtrpプロモーターに直接隣接させ
る類似の組み立てを以下の様に行なった。ＸbaＩ粘着末
端、ＡＴＧコドン、成熟タンパクの１−７アミノ酸のた
めのコドンを含有し、ＮcoＩ粘着で終っている合成ＤＮ
Ａ２本鎖を、ＨuＩＦＮ−αII１暗号配列の残りを含ん
でいる１２９０bp ＮcoＩ−ＨindIIIフラグメントに結
合させ、trp発現ベクター、pＨＧＨ２０７−１(２０)の
ＸbaＩおよびＨindIII部位の間に挿入した。 【００４３】大腸菌内でのＩＦＮ−α抗ウイルス活性の
検出：適当な発現プラスミドを導入した大腸菌Ｋ１２−
２９４株の一夜放置培養を増殖させ、収穫し、抽出して
抗ウイルス分析を行なった(１５)。インターフェロン活
性は、牛の腎臓細胞(ＭＤＢＮ)またはヒトの肺癌細胞
(Ａ５４９)(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション、Ｒockville ＭＤから入手)を使用し、細胞変性
効果(ＣＰＥ)阻止分析により決定した。水疱性口内炎ウ
イルスおよび脳心筋炎(ＥＭＣ)ウイルスを増殖させ、Ｃ
ＰＥ阻止分析に使用した(１４)。この方法で得た値を、
ＮＩＨ白血球標準Ｇ−０２３−９０１−５２７に対する
単位として表わした。ＨuＩＦＮ−αII１の抗原的同一
性は(１４)により決定した。 【００４４】 【表１】 表１．ヒトＩＦＮ−α遺伝子の暗号領域に於けるホモロギーのペア的比較 ＨuＩＦＮ-αＩ.１ ＨuＩＦＮ-αII.１ ＨuＩＦＮ-αＩ.１ ７０.０ ヌクレオチド ＨuＩＦＮ-αII.１ ５７.７ ホモロギー(％) アミノ酸ホモロギー(％) インターフェロン・プレタンパク対間のアミノ酸配列ホ
モロギー％(左下)および相当する暗号領域間のヌクレオ
チドホモロギー％(右上)が示してある。II型インターフ
ェロンの追加の６個のＣ−末端アミノ酸残基あるいは１
８個の追加のヌクレオチド(図６および図９)は、Ｉ型イ
ンターフェロンとの比較に含まれていない。 【００４５】 【表２】 表２．大腸菌抽出物中のＩＦＮ−α活性 下記のもので ＩＦＮ−α活性 比 形質転換され (単位／培養液１Ｌ) Ａ５４９ た大腸菌２９４ Ａ５４９-ＥＭＣ ＭＤＢＫ-ＶＳＶ ＭＤＢＫ pＨuＩＦＮ−αI１ ２.５×１０5 １.９×１０6 ０.１３ pＨuＩＦＮ−αI２ １.４×１０8 １.３×１０8 １.１ pＨuＩＦＮ−αII１ ５.０×１０5 ４.７×１０5 １.１ ヒトおよび牛細胞に対するインターフェロン抗ウイルス
活性。適当な発現プラスミドを含んでいる大腸菌Ｋ１２
(２９４株)培養を増殖させ、インターフェロン分析用の
溶菌液を調製した。溶菌液中のインターフェロン抗ウイ
ルス活性は、脳心筋炎ウイルスでチャレンジしたＭＤＢ
Ｋ(牛の腎臓)細胞および水疱性口内炎ウイルスまたはＡ
５４９(ヒト肺癌腫)細胞を使って、細胞変性効果阻止分
析によって決定した。５５０nＭに於ける光学密度が１.
０になるまで増殖させた細胞培養液１Ｌ当たりの抗ウイ
ルス活性の量で結果を表わした。 【００４６】 【表３】 表３．ＨuＩＦＮ−αII１活性をＨuＩＦＮ−αに対する抗体で中和する インターフェロン活性(単位／ml) インターフェロン 対照 ＋抗ＩＦＮ−α ＋抗ＩＦＮ−β ＨuＩＦＮ−αI２ ６４ ＜４(＞１６) ３２(２) ＨuＩＦＮ−αII１ ３８４ ＜４(＞９６) １５２(２) 天然ＨuＩＦＮ−α １２８ ＜４(＞３２) ＮＤ 天然ＨuＩＦＮ−β ６４ ＮＤ ＜４(＞１６) 表２の脚注に示した様にしてインターフェロンを調製
し、分析した。純化した天然のＨuＩＦＮ−αでウサギ
を免疫することにより抗ＩＦＮ−αを調製した。抗ＩＦ
Ｎ−βは、天然のＨuＩＦＮ−βで牛を免疫することに
より調製した。( )内の数値は、抗血清処理後の抗ウイ
ルス活性に於ける減少倍率を示す。 【００４７】 【表４】 表４．Ｉ型およびII型ＩＦＮ−α暗号領域の修正された ヌクレオチドのずれ％ 置換部位(％) 不動部位(％) ＨuＩＦＮ−αI１/ＨuＩＦＮ−αII１ ３０.２７ ６９.１９ ヌクレオチド配列の各ペアの修正したずれ％を計算し
た。ヌクレオチド配列を図２および図３ならびに図５に
示す様に並べた。II型ＩＦＮ−α遺伝子の最後の１８ヌ
クレオチド(１６７−１７２のアミノ酸をコードしてい
る)を互いに比較したが、Ｉ型対II型の比較では除外し
た。 【００４８】本発明のヒト白血球インターフェロンは、
既に報告されているヒト白血球インターフェロン(例え
ば(４)参照)と比較すると、多分より広い生物活性スペ
クトラムを持っているという特性を有する。更に、本発
明の新規な独特の白血球インターフェロンは、既に報告
されているヒト白血球インターフェロン(４)と比較する
と、アミノ酸レベルで、約７０％以下のホモロギー(通
常は約５０〜６０％の範囲)しか持っていないという特
徴を有する。更に、本発明のこの新規な独特のヒト白血
球インターフェロンは、その成熟型では１６６以上のア
ミノ酸残基、最も普通には約１７２のアミノ酸を持って
いることで特徴づけられる。 【００４９】本明細書には、特定の態様のみを開示した
が、本発明はこれらの特定の態様にのみ限定されるもの
ではない。 【００５０】文献 １．イサック(Isaacs)ら、ジャーナル・オブ・プロシー
ディングス・リサーチ・ソサエティ(J.Proc.R.Soc.)、B
147、258 (1957) ２．ゲツデル(Goeddel)ら、ネーチャー(Nature)、287、
411 (1980) ３．ゲツデル(Goeddel)ら、ネーチャー(Nature)、290、
20 (1981) ４．ヨーロッパ特許出願公開 No.0043980 ５．ヨーロッパ特許出願公開 No.0032134 ６．ヨーロッパ特許出願公開 No.0088622 ７．ヨーロッパ特許出願公開 No.0048970 ８．グレイ(Gray)ら、ネーチャー(Nature)、295、503
(1982) ９．ヨーロッパ特許出願公開 No.0077670 10．リンデルクネセット(Rinderknecht)ら、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Che
m.)、259、67 (1984) 11．ローン(Lawn)、セル(Cell)、15、1157 (1978) 12．デナート(Dennardt)、バイオケミカル・バイオフィ
ジカル・リサーチ・コミュニケーション(Biochem.Bioph
y.Res.Comm.)、23、641 (1966) 13．テイラー(Taylor)ら、バイオケミカル・バイオフィ
ジカル・アクタ(Biochem.Biophys.Acta)、442、324 (19
76) 14．ヴェック(Weck)ら、ヌクレイック・アシッド・リサ
ーチ(Nucleic Acids Res.)、9、6153 (1981) 15．ゲツデル(Goeddel)ら、ヌクレイック・アシッド・
リサーチ(Nucleic Acids Res.)、8、4057 (1980) 16．マクサム(Maxam.A.M.)ら、メソッド・オブ・エンザ
イモロジー(Meth.Enzymol.)、65、499 (1980) 17．メッシング(Messing)ら、ヌクレイック・アシッド
・リサーチ(Nucleic Acids Res.)、9、309 (1981) 18．サンガー(Sanger)ら、プロシーディングス・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Nat
l.Acad.Sci.)、(USA)、74、5463 (1977) 19．ウールリッヒ(Ullrich)ら、サイエンス(Science)、
196、1313 (1977) 20．ハーベメ(Havell)ら、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)、252、4425 (197
7) 21．ズーン(Zoon)ら、サイエンス(Science)、207、527
(1980) 22．アレン(Allen)ら、ネーチャー(Nature)、287、408
(1980) 23．オベルバッハ(Owerbach)ら、プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Pro
c.Natl.Acad.Sci.)、(USA)、78、3123 (1981) 24．ネイラー(Naylor)ら、ジャーナル・オブ・エクスペ
リメンタル・メディシン(J.Exp.Med.)、57、1020 (198
3) 25．フィン(Huynh)ら、ＤＮＡクローニング・テクニッ
クス(DNA Cloning Techniques)：ア・プラクティカル・
アプローチ(A Practical Approach)、編著:グローバー
(D.Glover)、ＩＲＬプレス (1984)。
血球インターフェロンタンパク質系列(ファミリー)[本
明細書中ではＨuＩＦＮ−αIIまたはＨuＩＦＮ−αIIと
称し、その個々のものを、例えば、ＨuＩＦＮ−αII.１
またはＨuＩＦＮ−αII１の如く表す]であって、ウイル
ス性疾患および新生物疾患の治療に有用なタンパク質系
列、並びにその様にインターフェロンタンパク質の製造
方法に関するものである。更に詳しくは、本発明は、組
換えＤＮＡ技術により、新規な独特のヒトインターフェ
ロン系列、並びにその製造方法を見出したことに基くも
のである。 【０００２】本発明の技術的背景を明らかにすると共
に、特殊な場合には、その実際面での詳細部分を補充す
るのに役立つと思われる刊行物等を明細書中で引用し、
便宜上、番号を付すと共に、添付の文献目録にまとめて
示した。 【０００３】 【従来の技術】ヒト白血球インターフェロンは、最初、
天然起源から極めて不純な沈澱物の形で得られた(１)。
この仕事に続いて、ヒト白血球インターフェロンは、実
質上、全てが密接なホモロジィ関係を示し、同じ抗ウイ
ルス活性の程度を異にする１クラスの、即ち１系列の物
質であることが見出された。この仕事は後に、いくつか
の文献で証明された(２、３、４、５)。この白血球イン
ターフェロンの系列(一般に省略してＨuＩＦＮ−αと称
する)は、抗ウイルス活性の程度を異にする１５または
それ以上の個々の物質で構成されているということが報
告された。このヒト白血球インターフェロン種は、その
成熟型のものが約１６５〜１６６アミノ酸からなってい
ること、およびそれぞれの配列の基礎となるＤＮＡ配列
並びにグリコシル化部位および報告されている動物種で
の抗ウイルス活性、などにより特性化されて来た。実
際、これらのヒト白血球インターフェロンタンパク質の
内、少くとも１個は、公認のヒトにおける臨床試験にお
いて成功を収めている。これらのインターフェロン種は
組換えＤＮＡ技術、とりわけ当該技術分野で用いられて
いる、トランスフェクトされた大腸菌(Ｅ.coli)を利用
して生産されて来たし、現在も生産されている。即ち、
これらの先行技術により、今日、臨床研究面での使用に
必要であることが分っている極めて高純度のタンパク質
をトランスフェクトされた宿主系を用いた組換えＤＮＡ
技術を介して大量に回収し、充分量のヒト白血球インタ
ーフェロン種を生産することができるようになった。そ
の様な従来技術は既述の文献並びに今日の技術に関する
その他の文献に記載されている。 【０００４】広範な研究がなされ、様々な人々がヒト白
血球インターフェロン系列の研究に労力を費した。これ
までに発見され、研究されたヒト白血球インターフェロ
ンは疑いもなく、特性上のホモロジィ、アミノ酸長さお
よび抗ウイルス活性において共通したものを有する単１
のタンパク質系列にまとめられる。同様の研究は、動
物、特にウシのインターフェロンに関しても成功を収め
ている(６)。 【０００５】第２のヒトインターフェロン類は、いわゆ
るヒト線維芽細胞インターフェロン(β−インターフェ
ロンまたはＨuＩＦＮ−βと称する)である。この化合物
に関しても広範な研究がなされており、驚くべきこと
に、上記の如く、ヒト白血球インターフェロンが一般に
１５またはそれ以上の種からなると定義されるのと対照
的に、単一のポリペプチドまたはタンパク質であると思
われている(７)。 【０００６】第３番目のヒトインターフェロン類はヒト
ガンマインターフェロン(ＨuＩＦＮ−γ)と称される
(８、９)。ヒトガンマインターフェロンは白血球および
線維芽細胞に由来するヒトインターフェロンの特性であ
る抗ウイルス活性および抗増殖作用を示すことが報告さ
れているが、これらと対照的に、白血球およびβインタ
ーフェロンよりも、より短いアミノ酸配列を有し、pＨ
２において不安定であるという特徴を有することが明ら
かにされた(１０)。このことから、ヒトガンマインター
フェロンが実質上、がん患者の治療に有用であることを
示す様な、上記抗増殖作用に関する特徴についてもっと
主張されるべきであると考えられている。そこで、ヒト
ガンマインターフェロンに関して集中的に、あるいは個
々別々に研究がなされて来た。 【０００７】ヒト線維芽細胞インターフェロン(ＨuＩＦ
Ｎ−β)とヒト白血球インターフェロン(ＨuＩＦＮ−α)
に関しては、その構造(アミノ酸長さおよびホモローガ
スな配列部分)および生物学的な特性(抗ウイルス活性)
は類似しているので、ヒト線維芽細胞の場合は、これま
で唯１個の遺伝子が存在するだけであるのに、ヒト白血
球インターフェロンは、複数個の物質からなる一系列の
ものからなるということは奇妙なことに思われる。これ
は、ヒト白血球インターフェロンの場合には、白血球系
列の進化論的な分枝および拡張があって複数の遺伝子が
存在することになり、一方、ヒト線維芽細胞インターフ
ェロンの場合には、唯一個のはっきりした遺伝子が保持
されたことを示している。 【０００８】 【発明が解決しようとする課題】本発明者らは上記の点
に興味を抱き、ＨuＩＦＮ−β遺伝子について詳しく研
究を行った。この研究は、既知のＨuＩＦＮ−β遺伝子
の成熟した暗号領域にまたがったフラグメントから調製
したＤＮＡプローブを用いて、低いハイブリダイゼーシ
ョン・ストリンジエンシィにおいてヒトゲノムＤＮＡラ
イブラリィ(１１)をスクリーニングすることにより行っ
た。その結果、思いがけず、これまでその存在が知られ
ていなかった、新規で明確なヒト白血球インターフェロ
ン系列の発見という驚異的な成果をあげることができ
た。本発明は、この新規で明確なヒト白血球インターフ
ェロンの発見に基いて完成された。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明はヒト白血球イン
ターフェロン化合物群の間に見出された新規かつ明確に
他と区別し得る系列または群(グループ)に関するもので
ある。この新しいヒト白血球インターフェロン系列また
は群は、これまでに報告されたヒト白血球インターフェ
ロン系列の遺伝子と実質上ホモロジィ(例えば、約７０
％)な暗号領域を有するが、そのホモロジィは上記の値
以上ではなく、またそのアミノ酸残基の長さもこれまで
に報告されたヒト白血球インターフェロンの系列に属す
るものよりも長いことが分った。即ち、従来知られてい
るヒト白血球インターフェロン系列は、その成熟型にお
いて約１６５〜１６６個のアミノ酸から成っている。本
発明に係るヒト白血球インターフェロン、即ち、この第
IIのヒト白血球インターフェロン系列の代表的なもの
は、約１７２個のアミノ酸から成ることが分った。同様
に生物学的な抗ウイルス活性に関しても、本発明のヒト
白血球インターフェロンの抗ウイルス活性は、従来から
のヒト白血球インターフェロンの内の幾つかのものの活
性と比較したとき、それらと重複する活性を有し、さら
に広い活性スペクトルを有することがわかった。 【００１０】本発明はこれまでに報告されたヒト白血球
インターフェロンから明確に区別される、新規なヒト白
血球インターフェロンの新系列に関し、さらに、その製
造方法を開示するものである。本発明は、その様な新規
で独特なヒト白血球インターフェロンを組換えＤＮＡ技
術を利用して、それらを、あるいはそれらの各々を直接
成熟型で、あるいは融合タンパク質中間体の形を介し、
市場化の前段階として必要な臨床試験を行うのに必要な
量を生産することを可能ならしめるものである。本発明
の生産物は、そのあらゆる型が、ヒトに対する予防また
は治療、とりわけウイルス感染症および悪性腫瘍、並び
に免疫抑制または免疫欠損症状の治療に用いるのに適す
る。その様な型には、様々なオリゴマーが含まれ、さら
に、グリコシル化されたものやアレル変異体、または個
々のメンバーまたは種のその他の誘導体をも含む。本発
明においては、これらの生産物を、一般的に取扱われて
いる微生物または細胞培養システムにより生産する。 【００１１】本発明はこの様にして生産された新規で独
特なヒト白血球インターフェロン、並びにそれを生産す
る方法および手段に関するものである。本発明はまた、
新規で独特なヒト白血球インターフェロンの遺伝子配列
を発現し得る形で含有している複製可能なＤＮＡ発現ビ
ヒクルを提供するものである。更にまた、本発明は、上
記の発現ビヒクルによってトランスフェクトされた微生
物株または細胞培養、並びにその様なトランスフェクト
された株または培養であって本発明の新規で独特なヒト
白血球インターフェロンを生産し得る株または培養を含
む発酵培地を提供するものである。 【００１２】さらにまた本発明は、該インターフェロン
遺伝子配列、ＤＮＡ発現ビヒクル、微生物株および細胞
培養の様々な調製方法、並びにそれらの特殊な態様に関
するものである。さらにまた本発明は、該微生物および
細胞培養のための発酵培地に関するものである。また、
ある宿主系では、所望のインターフェロンを生産し、そ
れを成熟型で宿主から分泌させる様にベクターを工夫す
ることもできる。なお、本明細書で用いる「アレル変異
体」とは、同一遺伝子座に起こったＤＮＡ配列の差に基
づく、個体差レベルで認められる変異体をいう。 【００１３】本発明の態様の一般的記述 本発明は、本発明に係る特に新規で独特なヒト白血球イ
ンターフェロンの遺伝子配列を担った発現ベクターによ
ってトランスフェクトされ得る、様々な細菌、酵母、あ
るいは哺乳類または脊椎動物の細胞培養系を用いて実施
することができる。その様な系は当該技術分野で良く知
られており、数多くの文献がある。例えば、本発明にお
いては、微生物大腸菌Ｋ−１２株２９４(ＡＴＣＣ Ｎo.
３１４４６)を、他の当該技術分野で既知の大腸菌の菌
株や様々な寄託機関に寄託されている他の公共的な微生
物と同様に、広範囲に用いることができる。これらの他
の微生物には、例えば、バチルス(Ｂacillus)、サルモ
ネラ(Ｓalmonella)およびセラチア(Ｓeratia)の菌株が
含まれる。さらに、種々の酵母株についても記述されて
おり、それらを本発明に用いることができる。最も注目
されるのは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション(American Type Calture Collection)にＡＴＣＣ
Ｎo.４４０７６の下で寄託されているサッカロミケス
・セレビシエ(Ｓaccharomyces cerevisiae)の特定の
株、ＲＨ２１８である。同様に、様々な細胞培養系が開
発されて使用されており、それらを本発明の工程に用い
ることができる。例えば、ＷＩ３８、ＢＨＫ、Ｔ３、Ｃ
ＨＯおよびＶeroセルライン等の様々な培養物を用いる
ことができる。 【００１４】これらの系それぞれについて、機能的に結
合しているヘテロローガスな遺伝子セグメント(本発明
では、新規で独特なヒト白血球インターフェロンをコー
ドしているヘテロローガスな遺伝子セグメント)を発現
させる様に指令する種々のプロモーター系が開発されて
おり、それらを用いることができる。遺伝子と、特定の
発現宿主系内で適切なプロモーターとの機能的な結合
は、本発明の新規で独特なヒト白血球インターフェロン
を、該アミノ酸と結合しているプレ配列または他の人工
的な発現物質を全く含まない、成熟型として発現させ得
る様、結合させることによって行われる。別法として、
本発明の新規で独特なヒト白血球インターフェロンをそ
れ自身の信号配列と機能的に結合させ、細胞膜を通過し
て移送される際に該信号配列が開裂されることにより、
成熟型のものが分泌される様にすることもできる。加え
て、本発明の新規で独特なヒト白血球インターフェロン
遺伝子を、該新規で独特なヒト白血球インターフェロン
のアミノ酸配列と、そのＮ末端に結合したホモローガス
なタンパク質との融合タンパク質を生産させる様、機能
的に結合させることができる。これらの全ての態様は、
これまでに報告されているヒト白血球インターフェロン
(４)と異る性質および構造を有する、新規で独特なヒト
白血球インターフェロン類または系列の発見、同定、並
びにその生産の可能性に関する基本的な前提条件を満す
ので、本発明の範囲内に含まれるものである。 【００１５】好ましい態様についての記述 本発明方法は、遺伝子配列、遺伝子の単離、発現させる
ための連結、精製および生物学的な確認等の手段を介し
て本発明の新規で独特なヒト白血球インターフェロンを
同定するための、代表的な態様によって例示される。こ
の方法では、元々、他のβ遺伝子が存在するか否かを決
定する目的で、ヒトゲノムライブラリィのプローブにヒ
トβインターフェロンの遺伝子を用いた。これらの実験
の結果、最初にβインターフェロン遺伝子ではなく、む
しろ、白血球系列のインターフェロンにより近いと思わ
れる遺伝子が同定された。本発明はこの結論を具体化し
たものである。 【００１６】図面の説明 図１は制限エンドヌクレアーゼ・マッピング法に基づく
ＩＦＮ−αII遺伝子の配列を示す模式図である。この遺
伝子(図２および図３)の配列決定された領域（ＩＦＮ−
αＩＩ．２遺伝子の０.０kb〜０.３kb領域を除く)に含
まれる制限エンドヌクレアーゼ部位も示されている。Ｉ
ＦＮ−αII.１の地図において、太く描いた部分はＩＦ
Ｎプレタンパク質の暗号配列に対応する部分である。キ
ロ塩基対(kb)に基くサイズスケールを地図下方に示し
た。ＩＦＮ−αII遺伝子内の制限エンドヌクレアーゼ部
位を次に示す:ＡccＩ(Ａ)、ＢamＨＩ(Ｂ)、ＢglII(Ｂ
g)、ＥcoＲＩ(Ｅ)、ＨindIII(Ｈ)、ＮcoＩ(Ｎ)、ＰstＩ
(Ｐ)およびＰvuII(Ｐv)。 【００１７】図２および図３はＩＦＮ−αII遺伝子間の
ＤＮＡ配列の関係を示す模式図である。ＩＦＮ−αII.
１遺伝子の配列を、２５０塩基からなる５'非翻訳配列
(ウイルス性の誘導に必要であると思われる領域をコー
ドするのに充分な配列)、および推定のポリアデニル化
部分を通過した３'非翻訳領域を含めて詳しく示した。
ＩＦＮ−αII.２、αII.３およびαII.４遺伝子のヌク
レオチドは、ＩＦＮ−αII.１のそれと異なるもののみ
を示した。ＩＦＮ−αII.１配列中の(・・・)で示したギャ
ップは他の遺伝子への挿入適応部位であり；(△−△−
△)、ＩＦＮ−αII.２、αII.３およびαII.４配列にお
ける欠除は、ＩＦＮ−αII.１との最大のホモロジィ部
分である；(＊)はＩＦＮ−αII.１のメッセンジャーＲ
ＮＡの推定のキャップサイトである；(←)は５'非翻訳
領域であり；(→)は３'非翻訳領域である。ＩＦＮ−αI
I.４の１９９位よりも上流の配列は未だ得られていな
い。ＩＦＮ−αII.４の最初の２つのヌクレオチドは対
応するＩＦＮ−αII.１の塩基と同一であるために記載
されていない。 【００１８】図４はＩＦＮ−αII遺伝子系列によってコ
ードされているポリペプチドのアミノ酸配列を示す模式
図である。ＩＦＮ−αII.１プレタンパク質の完全なア
ミノ酸配列が示されている。アミノ酸残基中、挿入／欠
失部位についてはアンダーラインを付して示した。ＩＦ
Ｎ−αII.１のシグナル(信号)ペプチドの残基はＳ１か
らＳ２３までであり、成熟タンパク質の残基は１から１
７２までである。 【００１９】図５はＨuＩＦＮ−αII１遺伝子を含有し
ているファージ組換え体の構造を示す模式図である。暗
号領域を交叉した斜線で示し、プレ配列(左側の斜線で
陰影を付けた部分)と分け、さらに、ＨuＩＦＮ−αII１
遺伝子および組換えファージλ２４.１の非翻訳領域の
制限地図をも示した。 【００２０】図６はヒトＩＦＮ−α遺伝子系列のサザー
ン・ブロット分析の結果を示す写真の模写図である。高
分子量のヒトゲノムＤＮＡ(５μg)を、表示されている
様に種々の制限エンドヌクレアーゼで消化し、０.８％
アガロースゲル電気泳動に付し、ニトロセルロース濾紙
上に移した。次のＩＦＮ−α暗号領域、即ちＨuＩＦＮ
−αI１(レーンa)およびＨuＩＦＮ−αII１(レーンb)か
ら導かれたプローブを用い、ストリンジエント条件下で
ハイブリダイゼーションを行った。分子量標準には、Ｅ
coＲＩ消化バクテリオファージλシャロン３０Ａ ＤＮ
ＡおよびpＢＲ３２２ ＤＮＡ、並びにＲsaＩ消化pＢＲ
３２２ ＤＮＡを用いた。 【００２１】図７および図８はＨuＩＦＮ−αII１とＨu
ＩＦＮ−αI１のヌクレオチド配列、並びにＨuＩＦＮ−
αII１でコードされたタンパク質およびクラスＩのＨu
ＩＦＮ−αI１遺伝子系列のタンパク質を対比させて示
した図である。ＨuＩＦＮ−αI１のアミノ酸残基中、下
線を施したものは今日までに報告されている、クラスＩ
のＨuＩＦＮ−αI１種の全てに見出されている残基であ
る。ＨuＩＦＮ−αII１ＤＮＡ配列の下方のアミノ酸残
基は、ＨuＩＦＮ−αII１とＨuＩＦＮ−αI１との相違
部分を示している。星印は、コードされているアミノ酸
配列には変化をもたらすことのない、ヌクレオチド配列
上の変化を示している。ＨuＩＦＮ−αI１のポリアデニ
ル化信号(ＡＡＴＡＡＡ)にはオーバーラインを付した。
提案し得るＨuＩＦＮ−αII１のポリアデニル化信号(Ａ
ＴＴＡＡＡ)にはアンダーラインを付した。垂直な矢印
は、ＨuＩＦＮ−αI１のメッセンジャーＲＮＡのキャッ
プサイトを示している。中空の三角形で示した部位は、
５'末端と、最長のＨuＩＦＮ−αII１ cＤＮＡクローン
に見出された、ポリ(Ａ)付加に係る３'部位を示してい
る。 【００２２】図９はウイルス的に誘導されたクラスＩお
よびクラスIIのＩＦＮ−α転写物の分析結果を示す図で
ある。各レーンは、それぞれ５μgのポリＡ(+)ＲＮＡ分
析に係る。図中、(Ａ)はクラスＩ(ＩＦＮ−αI２)プロ
ーブ、(Ｂ)はクラスII(ＩＦＮ−αII１)プローブを用い
たハイブリダイゼーションの結果を示す。レーン１、２
および３は供与者１から、レーン４、５および６は供与
者２からの試料を用いた結果である。レーン１および４
は非誘導対照であり、レーン２および５はニューキャッ
スル症ウイルス(Ｎewcastle Ｄisease virus)、レーン
３および６はセンダイ・ウイルス(Ｓendai virus)によ
り、それぞれ誘導されたものである。分子量マーカーは
pＬeＩＦＡ２５のＥcoＲＩ＋ＰstＩ消化(３.６kbおよび
０.９kb)およびpＨuＩＦＮ−αIItrpのＥcoＲＩ＋Ｈind
III消化(４.３kbおよび１.２kb、図１１)によって誘導
された。０.９kb pＬeＩＦＡ２５フラグメントは、ＩＦ
Ｎ−αI２の暗号領域を含有しており、また、１.２kb p
ＨuＩＦＮ−αIItrp１フラグメントはＩＦＮ−αII１の
暗号領域を含有している。 【００２３】図１０は、大腸菌内で成熟ＩＦＮ−αタン
パク質を合成するためのプラスミドの構造を示す模式図
である。巾の厚くなっている部分がＩＦＮ−α挿入部分
であり、成熟暗号領域は、陰影を付けて示されている：
ＨuＩＦＮ−αII１trp。 【００２４】 【実施例】詳しい説明：実施例 ヒトＩＦＮ−α遺伝子(ＨuＩＦＮ−αII)の同定 ヒトゲノムＤＮＡライブラリィ(１１)を、ＨuＩＦＮ−
β遺伝子の成熟暗号領域にまたがるフラグメントから調
製したプローブを用い、低いハイブリダイゼーションス
トリンジエンシィ下においてスクリーニングした。この
スクリーニング法で回収された７個の陽性クローンの
内、４個が、制限マッピング、サザーン分析、およびＨ
uＩＦＮ−βプローブを用いた、高ストリンジエンシィ
下でのハイブリダイゼーションの結果、ＨuＩＦＮ−β
遺伝子を含有していることが分った。残る３個の組換え
体はヒトゲノムの重複セグメントであって、低いストリ
ンジエンシィ下においてのみ、ＨuＩＦＮ−βプローブ
とハイブリダイズする、関連性の薄い遺伝子を含有する
ものと思われる。これらのクローンの内の１個(λ２４.
１)から得たハイブリダイズし得る領域を含む４.１キロ
塩基のＨindIIIフラグメントをpＢＲ３２２にサブクロ
ーンし、制限エンドヌクレアーゼマッピング(図５)、お
よびヌクレオチド配列決定による特性化を行った。 【００２５】このフラグメントのＤＮＡ配列分析の結果
(図７および図８)、インターフェロン遺伝子は、その暗
号領域のヌクレオチド配列において、ＨuＩＦＮ−βと
のホモロジィ(４８％)よりも、ＨuＩＦＮ−α遺伝子と
のホモロジィ(例、ＨuＩＦＮ−αI１と７０％、表１)を
多く有していることが明らかになった。同様に、ＨuＩ
ＦＮ−αI１タンパク質およびλ２４.１の遺伝子産物
は、いずれもＨuＩＦＮ−βと３０％のアミノ酸ホモロ
ジィを示すにすぎないのに対し、それらは相互に、約５
２％のホモローガスな関係を示した。従って、λα２
４.１に含まれている遺伝子は、ＩＦＮ−βでなくＩＦ
Ｎ−αをコードしていると結論される。しかしながら、
このタンパク質の配列は他のＨuＩＦＮ−α遺伝子産物
とは驚く程、異っている。 【００２６】この新規なＨuＩＦＮ−αは、そのカルボ
キシ末端に５または６個のアミノ酸を付加しており、そ
の内の３個は各タンパク質において同一のものである
(図７および図８)。この様な類似性はヌクレオチドのホ
モロジィ程度にも同様に反映されている(表１)。これら
の観察結果は総合的に、この新規なＨuＩＦＮ−αが、
既に配列決定された機能的なＨuＩＦＮ−α遺伝子を含
む、クラスＩのＩＦＮ−α遺伝子系列と区別される、ホ
モローガスな遺伝子産物であることを強く示唆している
といえる。そこで、本発明者らはこの遺伝子をクラスＩ
のＩＦＮ−α遺伝子と判別するために、ＨuＩＦＮ−α
II１と命名した。 【００２７】このＨuＩＦＮ−αII１配列は７８−８０
位に潜在的なグリコシル化配列、asn−met−thrを含有
している。興味深いことには、ＨuＩＦＮ−βの同じ位
置に同様の配列が認められ、これは、インビボで炭水化
物の付加により修飾されることが知られている(２０)。 【００２８】ＨuＩＦＮ−αII１がヒトゲノム内でＩＦ
Ｎ−α遺伝子の新しい系列であると定義し得るか否かを
試験するために、ＨuＩＦＮ−αI１およびＨuＩＦＮ−
αII１暗号領域から導かれたプローブを用い、両遺伝子
のクロスハイブリダイゼーションを起こさせない様なス
トリンジエント条件下、ヒトゲノムＤＮＡのブロットハ
イブリダイゼーション分析を行った。これらの実験の結
果、図６に示す如く、ＨuＩＦＮ−αI１プローブおよび
ＨuＩＦＮ−αII１プローブは別個の遺伝子系列をはっ
きりと示すことが証明された。このＨuＩＦＮ−αII１
プローブで、ヒトゲノム中には６〜７個のクラスII遺伝
子が存在していることが証明された。 【００２９】ウイルスによって誘導可能な、クラスIIの
ＩＦＮ−α遺伝子の発現：ＨuＩＦＮ−αII１タンパク
質またはその近縁のクラスIIのＩＦＮ−α遺伝子産物の
いずれも、ウイルス的に誘導されたセルラインからのイ
ンターフェロン標品中に同定されたことがない(２１、
２２)ばかりか、リンパ芽球様セルラインから調製され
たcＤＮＡライブラリィ(３)またはウイルスによって誘
導された末梢血中リンパ細胞中に見出されるＤＮＡ配列
に対応する配列を含有していない。クラスIIのＨuＩＦ
Ｎ−α遺伝子がウイルス感染に応答して転写されるか否
かを調べるために、センダイウイルスまたはニューキャ
ッスル症ウイルスで誘導された２供与者から得た末梢血
中リンパ細胞からのＲＮＡをブロットハイブリダイゼー
ション法で分析した。ウイルスと一緒に６時間インキュ
ベートした後、培養中からポリＡ+ＲＮＡを単離し、ホ
ルムアルデヒドゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロース
濾紙上に移してクラスＩ(ＨuＩＦＮ−αI２)またはクラ
スII(ＨuＩＦＮ−αII１)プローブを用いてハイブリダ
イズした。図９に見られる様に、クラスＩ(図９Ａ)およ
びクラスII(図９Ｂ)のＩＦＮ−α遺伝子の転写は、いず
れもニューキャッスル症ウイルス(レーン２および５)お
よびセンダイウイルス(レーン３および６)の両者によっ
て誘導され、両供与者からの非誘導培養中には検出する
ことができなかった(レーン１および４)。クラスＩおよ
びクラスII遺伝子の発現レベルを比較するために、これ
らの各プローブでハイブリダイズした濾紙をＨuＩＦＮ
−αI２(図９Ａ)またはＨuＩＦＮ−αII１(図９Ｂ)の暗
号領域を含有しているＤＮＡマーカーが等しい強度(デ
ータは表示されていない)のシグナルを示すまでフイル
ムにさらした。この分析の結果、クラスII遺伝子はクラ
スＩ遺伝子と類似のレベルで転写されることが分った
(図９)。加えて、センダイウイルスはＮＤＶの数倍のク
ラスＩおよびクラスIIインターフェロン・メッセージを
誘導すると思われる。このことは、クラスＩおよびクラ
スII遺伝子がウイルス感染に対する応答において、同様
な制御を受けていることを示唆するものである。 【００３０】ＩＦＮ−αII１遺伝子が発現されていると
いう結論を確認するため、センダイウイルス−誘導末梢
血中リンパ細胞から単離したポリＡ(+)ＲＮＡから相補
的ＤＮＡライブラリィを組立てた。ストリンジェント・
ハイブリダイゼーション条件下、ＨuＩＦＮ−αII１暗
号領域プローブを用いて１０,０００個のプラークをス
クリーニングした。こうして２個のＨuＩＦＮ−αII１
クローンを回収した。ＤＮＡ配列決定の結果から、２個
のcＤＮＡクローンの内、長い方はmＲＮＡのポリ(Ａ)か
らＨuＩＦＮ−αII１の信号ペプチドの暗号配列内に伸
びていることが示された。ＨuＩＦＮ−αII１遺伝子中
の対応する配列を図７および図８に示す。 【００３１】抗ウイルス活性を有するタンパク質をコー
ドしているクラスIIのＩＦＮ−α遺伝子：クラスIIのＩ
ＦＮ−α遺伝子が活性なタンパク質をコードしているか
否かを決定し、また、それらの宿主域をクラスＩのＩＦ
Ｎ−αポリペプチドのそれと比較する目的で、ＨuＩＦ
Ｎ−αII１遺伝子の発現のための細菌性ベクターを組立
てた。得られたプラスミドは、trpオペロンプロモータ
ー、リボゾーム結合部位およびメチオニン開始コドン
と、それぞれの成熟ＩＦＮ−α暗号領域の最初のアミノ
酸残基とが結合したものである。表２から分かる様に、
３つのプラスミドの各々で形質転換された大腸菌株を、
培地中のトリプトファンを消耗する様な条件下で増殖さ
せ、この大腸菌のエキスを調製したところ、このエキス
は細胞変性効果阻止分析(cytopathic effects inhibiti
on assay)による測定の結果、有意量の抗ウイルス活性
を有することが分った。各ＩＦＮ−αの相対的な抗ウイ
ルス活性を、２個のクラスＩＨuＩＦＮ−αタンパク
質、即ち、ＨuＩＦＮ−αI２およびＨuＩＦＮ−αI１
と、小水胞性口内炎ウイルスにチャレンジさせたウシセ
ルライン(ＭＤＢＫ)セルライン、並びに脳心筋炎ウイル
スにチャレンジさせたヒト肺腫瘍(Ａ５４９)セルライン
を用いて比較した。両細胞型に対し、ＨuＩＦＮ−αII
１とＨuＩＦＮ−αI２とは略等しい活性を示した。従っ
て、クラスIIのＩＦＮ−αタンパク質の活性は他のセル
ライン同様、これらのセルラインでもクラスＩのＩＦＮ
−α遺伝子産物の比活性をオーバーラップしていると思
われる。 【００３２】さらに、ＨuＩＦＮ−αII１に付随する抗
ウイルス活性を特性化するために、ＩＦＮ−αおよびＩ
ＦＮ−βに対する抗血清を調製し、そのＨuＩＦＮ−α
II１活性に対する中和能力を調べた。抗ＨuＩＦＮ−β
はＨuＩＦＮ−αII１の活性に対して有意な影響を及ぼ
さないが、ヒト白血球培養からのセンダイウイルス誘導
インターフェロンに対して調製された抗血清はＨuＩＦ
Ｎ−αII１抗ウイルス活性の中和作用を示した(表３)。
後者の誘導法はＨuＩＦＮ−βでなく、ＨuＩＦＮ−αを
一義的に生産せしめる、ということが既に分っており、
従って、この結果は、タンパク質のホモロジィに基いて
なされたＨuＩＦＮ−αII１のＩＦＮ−α系列への帰属
を確認するものである。 【００３３】２個の区別し得るＩＦＮ−α遺伝子系列：
これまでの研究では、その暗号領域中に少くとも８５％
のヌクレオチドホモロジィ関係を有する約１５の非アレ
ル型ＨuＩＦＮ−α遺伝子からなる系列が示されている
(３)：明確に言えば、これらの遺伝子はＨuＩＦＮ−αI
系列に属する。各遺伝子は、大腸菌内で抗ウイルス活性
を発現させる能力に基き、機能的なインターフェロンポ
リペプチドをコードしていると断定された。 【００３４】その様な遺伝子はＨuＩＦＮ−β cＤＮＡ
プローブを用いてヒトゲノムライブラリィをスクリーニ
ングすることによって初めて単離されたクローン集団か
ら、ＨuＩＦＮ−αIIであると同定された。しかしなが
ら、ＤＮＡホモロジィに関する比較、並びに大腸菌内で
発現されたＨuＩＦＮ−αII１タンパク質の抗原性の研
究に基き、この遺伝子がＨuＩＦＮ−βでなく、ＨuＩＦ
Ｎ−αタンパク質をコードしていることが確定的となっ
た。ＨuＩＦＮ−αII１は１７２アミノ酸残基からなる
成熟ポリペプチドをコードしている。これらの結果は、
ヒトゲノム中に２種のホモローガスであるが別個のＩＦ
Ｎ−α遺伝子が存在していることを証明するものであ
る。 【００３５】ヒトＤＮＡのサザーン・ブロット分析の結
果は、クラスII ＨuＩＦＮ−α遺伝子系列中に６−７個
の異るメンバーが含まれていることを示唆している。 【００３６】クラスＩ ＨuＩＦＮ−α系列のメンバー並
びにＨuＩＦＮ−βのメンバーは染色体９の上に存在し
ており(２３)、ＨuＩＦＮ−γの遺伝子は染色体１２上
に存在している(２４)。最近の研究では、クラスII Ｈu
ＩＦＮ−α系列のメンバーの大多数(全てではない)もま
た染色体９上に存在していることが指摘されている。 【００３７】クラスIIのＩＦＮ−α遺伝子の転写コント
ロール：ＩＦＮ−α mＲＮＡレベルに対する制御の変異
は、ウイルス的に誘導された細胞培養内において個々の
ＨuＩＦＮ−α mＲＮＡ配列が見出される頻度の１０倍
以上の頻度範囲に及ぶことが示唆された。クラスＩおよ
びIIのＩＦＮ−α遺伝子に対する転写制御を比較する目
的で、ヒト末梢血中リンパ細胞におけるインターフェロ
ン生成を誘導するために、ニューキャッスル症ウイルス
(ＮＤＶ)あるいはセンダイウイルスを用いた。ウイルス
誘導の６時間後には、各培養から調製したポリＡ(+)Ｒ
ＮＡ中に比較し得るレベルのクラスＩ mＲＮＡおよびク
ラスII mＲＮＡを容易に認めることができた(図９)。ま
た、センダイウイルスは数倍量のクラスIIおよびクラス
Ｉの両型のＩＦＮ−α転写物を誘導するらしい。このこ
とから、どちらのＩＦＮ−αも、ウイルス誘導によって
同様の転写活性化作用を受けることが示唆された。これ
まで、ヒト白血球またはヒト骨髄芽球様セルラインのセ
ンダイウイルス誘導培養から調製したライブラリィ中に
はクラスII cＤＮＡクローンが観察されていないことか
ら、以上の結果は、クラスIIのＩＦＮ−α合成がウイル
ス的に誘導される、ということの最初に得られた証拠と
いえる。このことは、ＩＦＮ−αII１ mＲＮＡの３'末
端、並びにその暗号領域の大部分を含んだ相補的ＤＮＡ
クローンの単離によって追認された(図７および図８)。 【００３８】ハイブリダイゼーションの条件およびプロ
ーブ類：ハイブリダイゼーションは５×ＳＳＣ(１×Ｓ
ＳＣは、０.１５Ｍ ＮaＣl、０.０１５Ｍクエン酸ナト
リウムからなる)、５×Ｄenhardt's溶液(１２)、０.１
％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.１％ピロリン
酸ナトリウム、５０μg／mlの音波処理による変性鮭精
子ＤＮＡおよび１０％デキストラン硫酸ナトリウム中、
非ストリンジエントおよびストリンジエント条件を与え
るためにそれぞれ２０％または５０％のホルムアミドを
含有させて行った。４２℃でインキュベーションした
後、フィルターを、室温において２×ＳＳＣ、０.２％
ＳＤＳ(非ストリンジエント)中で洗浄するか、あるいは
４２℃において、０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ(スト
リンジエント)中で洗浄する、のいずれかで処理した。
文献記載の如く32Ｐ標識プローブを調製した(１３)。ヒ
トＤＮＡ中のクラスＩおよびII遺伝子を高いストリンジ
エンシィ下で分析するために(図６)、以下のフラグメン
トを用いた(いずれも対応するＩＦＮ−α遺伝子の成熟
暗号領域を含む)：クラスＩのヒト由来、pＨuＩＦＮ−
αI２／１ハイブリッド(１４)の５６５bp ＥcoＲＩフラ
グメント；クラスIIのヒト由来、pＨuＩＦＮ−αII１の
３９０bp ＸbaＩ−ＡccＩフラグメント(プラスミドにつ
いては図１０を参照されたい)。 【００３９】ファージライブラリィの組立てとスクリー
ニング：ＨuＩＦＮ−αII１遺伝子は、ローン(Ｌawn)ら
によって組立てられたヒト胎児の肝臓／バクテリオファ
ージλシャロン４Ａライブラリィ(１１)から、成熟Ｈu
ＩＦＮ−βタンパク質をコードしている５０１bpのＸba
Ｉ−ＢalIIフラグメントから調製したプローブを用いて
単離した。 【００４０】ＤＮＡ配列分析：ＤＮＡ配列は(１６)に記
載の方法により、あるいはＤＮＡをＭ１３mp８およびmp
９ベクター(１７)にサブクローンし、ジデオキシ鎖ター
ミネーション法(１８)を使って決定した。 【００４１】ウイルス誘導ＲＮＡの調製および分析：末
梢血リンパ球(２×１０9)を、５％の(熱で不活性化し
た)牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０に、４×１０6細
胞／mlとなる様に再懸濁した。培養をＴ−１７５フラス
コ(Ｆalcon)中でインキュベートし、誘導した培養を、
２５ＵＡＵ／１０6細胞のニューキャッスル・ディジー
ズ・ウイルスまたはセンダイウイルスで処理した。ウイ
ルスと共に６時間インキュベートした後、培養を０.０
５％ＥＤＴＡで処理し、細胞を遠心して集め、氷冷媒質
で１回洗浄し、ポリＡ(+)ＲＮＡを調製した(１９)。Ｒ
ＮＡをホルムアルデヒド・ゲル電気泳動にかけ、ノーザ
ン・ブロット分析を行なった。２本鎖cＤＮＡをλgt１
０ベクター(２５)に結合させたことを除き、末梢血リン
パ球cＤＮＡライブラリィを組み立てた(２)。 【００４２】ＩＦＮ−α遺伝子のための細菌性発現プラ
スミドの組み立て：大腸菌のtrpプロモーターのコント
ロール下で成熟ＨuＩＦＮ−αI１および−αI２を発現
させるプラスミドの組み立ては、既に報告されている
(２および１４)。成熟ＨuＩＦＮ−αII１のＮ−末端ア
ミノ酸残基をイニシエーター(メチオニン)コドン、リボ
ソーム結合部位およびtrpプロモーターに直接隣接させ
る類似の組み立てを以下の様に行なった。ＸbaＩ粘着末
端、ＡＴＧコドン、成熟タンパクの１−７アミノ酸のた
めのコドンを含有し、ＮcoＩ粘着で終っている合成ＤＮ
Ａ２本鎖を、ＨuＩＦＮ−αII１暗号配列の残りを含ん
でいる１２９０bp ＮcoＩ−ＨindIIIフラグメントに結
合させ、trp発現ベクター、pＨＧＨ２０７−１(２０)の
ＸbaＩおよびＨindIII部位の間に挿入した。 【００４３】大腸菌内でのＩＦＮ−α抗ウイルス活性の
検出：適当な発現プラスミドを導入した大腸菌Ｋ１２−
２９４株の一夜放置培養を増殖させ、収穫し、抽出して
抗ウイルス分析を行なった(１５)。インターフェロン活
性は、牛の腎臓細胞(ＭＤＢＮ)またはヒトの肺癌細胞
(Ａ５４９)(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション、Ｒockville ＭＤから入手)を使用し、細胞変性
効果(ＣＰＥ)阻止分析により決定した。水疱性口内炎ウ
イルスおよび脳心筋炎(ＥＭＣ)ウイルスを増殖させ、Ｃ
ＰＥ阻止分析に使用した(１４)。この方法で得た値を、
ＮＩＨ白血球標準Ｇ−０２３−９０１−５２７に対する
単位として表わした。ＨuＩＦＮ−αII１の抗原的同一
性は(１４)により決定した。 【００４４】 【表１】 表１．ヒトＩＦＮ−α遺伝子の暗号領域に於けるホモロギーのペア的比較 ＨuＩＦＮ-αＩ.１ ＨuＩＦＮ-αII.１ ＨuＩＦＮ-αＩ.１ ７０.０ ヌクレオチド ＨuＩＦＮ-αII.１ ５７.７ ホモロギー(％) アミノ酸ホモロギー(％) インターフェロン・プレタンパク対間のアミノ酸配列ホ
モロギー％(左下)および相当する暗号領域間のヌクレオ
チドホモロギー％(右上)が示してある。II型インターフ
ェロンの追加の６個のＣ−末端アミノ酸残基あるいは１
８個の追加のヌクレオチド(図６および図９)は、Ｉ型イ
ンターフェロンとの比較に含まれていない。 【００４５】 【表２】 表２．大腸菌抽出物中のＩＦＮ−α活性 下記のもので ＩＦＮ−α活性 比 形質転換され (単位／培養液１Ｌ) Ａ５４９ た大腸菌２９４ Ａ５４９-ＥＭＣ ＭＤＢＫ-ＶＳＶ ＭＤＢＫ pＨuＩＦＮ−αI１ ２.５×１０5 １.９×１０6 ０.１３ pＨuＩＦＮ−αI２ １.４×１０8 １.３×１０8 １.１ pＨuＩＦＮ−αII１ ５.０×１０5 ４.７×１０5 １.１ ヒトおよび牛細胞に対するインターフェロン抗ウイルス
活性。適当な発現プラスミドを含んでいる大腸菌Ｋ１２
(２９４株)培養を増殖させ、インターフェロン分析用の
溶菌液を調製した。溶菌液中のインターフェロン抗ウイ
ルス活性は、脳心筋炎ウイルスでチャレンジしたＭＤＢ
Ｋ(牛の腎臓)細胞および水疱性口内炎ウイルスまたはＡ
５４９(ヒト肺癌腫)細胞を使って、細胞変性効果阻止分
析によって決定した。５５０nＭに於ける光学密度が１.
０になるまで増殖させた細胞培養液１Ｌ当たりの抗ウイ
ルス活性の量で結果を表わした。 【００４６】 【表３】 表３．ＨuＩＦＮ−αII１活性をＨuＩＦＮ−αに対する抗体で中和する インターフェロン活性(単位／ml) インターフェロン 対照 ＋抗ＩＦＮ−α ＋抗ＩＦＮ−β ＨuＩＦＮ−αI２ ６４ ＜４(＞１６) ３２(２) ＨuＩＦＮ−αII１ ３８４ ＜４(＞９６) １５２(２) 天然ＨuＩＦＮ−α １２８ ＜４(＞３２) ＮＤ 天然ＨuＩＦＮ−β ６４ ＮＤ ＜４(＞１６) 表２の脚注に示した様にしてインターフェロンを調製
し、分析した。純化した天然のＨuＩＦＮ−αでウサギ
を免疫することにより抗ＩＦＮ−αを調製した。抗ＩＦ
Ｎ−βは、天然のＨuＩＦＮ−βで牛を免疫することに
より調製した。( )内の数値は、抗血清処理後の抗ウイ
ルス活性に於ける減少倍率を示す。 【００４７】 【表４】 表４．Ｉ型およびII型ＩＦＮ−α暗号領域の修正された ヌクレオチドのずれ％ 置換部位(％) 不動部位(％) ＨuＩＦＮ−αI１/ＨuＩＦＮ−αII１ ３０.２７ ６９.１９ ヌクレオチド配列の各ペアの修正したずれ％を計算し
た。ヌクレオチド配列を図２および図３ならびに図５に
示す様に並べた。II型ＩＦＮ−α遺伝子の最後の１８ヌ
クレオチド(１６７−１７２のアミノ酸をコードしてい
る)を互いに比較したが、Ｉ型対II型の比較では除外し
た。 【００４８】本発明のヒト白血球インターフェロンは、
既に報告されているヒト白血球インターフェロン(例え
ば(４)参照)と比較すると、多分より広い生物活性スペ
クトラムを持っているという特性を有する。更に、本発
明の新規な独特の白血球インターフェロンは、既に報告
されているヒト白血球インターフェロン(４)と比較する
と、アミノ酸レベルで、約７０％以下のホモロギー(通
常は約５０〜６０％の範囲)しか持っていないという特
徴を有する。更に、本発明のこの新規な独特のヒト白血
球インターフェロンは、その成熟型では１６６以上のア
ミノ酸残基、最も普通には約１７２のアミノ酸を持って
いることで特徴づけられる。 【００４９】本明細書には、特定の態様のみを開示した
が、本発明はこれらの特定の態様にのみ限定されるもの
ではない。 【００５０】文献 １．イサック(Isaacs)ら、ジャーナル・オブ・プロシー
ディングス・リサーチ・ソサエティ(J.Proc.R.Soc.)、B
147、258 (1957) ２．ゲツデル(Goeddel)ら、ネーチャー(Nature)、287、
411 (1980) ３．ゲツデル(Goeddel)ら、ネーチャー(Nature)、290、
20 (1981) ４．ヨーロッパ特許出願公開 No.0043980 ５．ヨーロッパ特許出願公開 No.0032134 ６．ヨーロッパ特許出願公開 No.0088622 ７．ヨーロッパ特許出願公開 No.0048970 ８．グレイ(Gray)ら、ネーチャー(Nature)、295、503
(1982) ９．ヨーロッパ特許出願公開 No.0077670 10．リンデルクネセット(Rinderknecht)ら、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Che
m.)、259、67 (1984) 11．ローン(Lawn)、セル(Cell)、15、1157 (1978) 12．デナート(Dennardt)、バイオケミカル・バイオフィ
ジカル・リサーチ・コミュニケーション(Biochem.Bioph
y.Res.Comm.)、23、641 (1966) 13．テイラー(Taylor)ら、バイオケミカル・バイオフィ
ジカル・アクタ(Biochem.Biophys.Acta)、442、324 (19
76) 14．ヴェック(Weck)ら、ヌクレイック・アシッド・リサ
ーチ(Nucleic Acids Res.)、9、6153 (1981) 15．ゲツデル(Goeddel)ら、ヌクレイック・アシッド・
リサーチ(Nucleic Acids Res.)、8、4057 (1980) 16．マクサム(Maxam.A.M.)ら、メソッド・オブ・エンザ
イモロジー(Meth.Enzymol.)、65、499 (1980) 17．メッシング(Messing)ら、ヌクレイック・アシッド
・リサーチ(Nucleic Acids Res.)、9、309 (1981) 18．サンガー(Sanger)ら、プロシーディングス・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Nat
l.Acad.Sci.)、(USA)、74、5463 (1977) 19．ウールリッヒ(Ullrich)ら、サイエンス(Science)、
196、1313 (1977) 20．ハーベメ(Havell)ら、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)、252、4425 (197
7) 21．ズーン(Zoon)ら、サイエンス(Science)、207、527
(1980) 22．アレン(Allen)ら、ネーチャー(Nature)、287、408
(1980) 23．オベルバッハ(Owerbach)ら、プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Pro
c.Natl.Acad.Sci.)、(USA)、78、3123 (1981) 24．ネイラー(Naylor)ら、ジャーナル・オブ・エクスペ
リメンタル・メディシン(J.Exp.Med.)、57、1020 (198
3) 25．フィン(Huynh)ら、ＤＮＡクローニング・テクニッ
クス(DNA Cloning Techniques)：ア・プラクティカル・
アプローチ(A Practical Approach)、編著:グローバー
(D.Glover)、ＩＲＬプレス (1984)。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＩＦＮ−αII遺伝子の配列を示す模式図であ
る。 【図２】 ＩＦＮ−αII遺伝子間のＤＮＡ配列の関係を
示す模式図である(前半部)。 【図３】 ＩＦＮ−αII遺伝子間のＤＮＡ配列の関係を
示す模式図である(後半部)。 【図４】 ＩＦＮ−αII遺伝子系列によってコードされ
ているポリペプチドのアミノ酸配列を示す模式図であ
る。 【図５】 ＨuＩＦＮ−αII１遺伝子を含有しているフ
ァージ組換え体の構造を示す模式図である。 【図６】 ヒトＩＦＮ−α遺伝子系列のサザーン・ブロ
ット分析の結果を撮影した写真の模写図である。 【図７】 ＨuＩＦＮ−αII１とＨuＩＦＮ−αI１のヌ
クレオチド配列、およびＨuＩＦＮ−αII１でコードさ
れたタンパク質とクラスＩのＨuＩＦＮ−αI１遺伝子系
列のタンパク質の模式図である(前半部)。 【図８】 ＨuＩＦＮ−αII１とＨuＩＦＮ−αI１のヌ
クレオチド配列、およびＨuＩＦＮ−αII１でコードさ
れたタンパク質とクラスＩのＨuＩＦＮ−αI１遺伝子系
列のタンパク質の模式図である(後半部)。 【図９】 ウイルス的に誘導されたクラスＩおよびクラ
スIIのＩＦＮ−α転写体の分析結果を撮影した写真の模
写図である。 【図１０】 大腸菌内で成熟ＩＦＮ−αタンパク質を合
成するためのプラスミドの構造を示す模式図である。
る。 【図２】 ＩＦＮ−αII遺伝子間のＤＮＡ配列の関係を
示す模式図である(前半部)。 【図３】 ＩＦＮ−αII遺伝子間のＤＮＡ配列の関係を
示す模式図である(後半部)。 【図４】 ＩＦＮ−αII遺伝子系列によってコードされ
ているポリペプチドのアミノ酸配列を示す模式図であ
る。 【図５】 ＨuＩＦＮ−αII１遺伝子を含有しているフ
ァージ組換え体の構造を示す模式図である。 【図６】 ヒトＩＦＮ−α遺伝子系列のサザーン・ブロ
ット分析の結果を撮影した写真の模写図である。 【図７】 ＨuＩＦＮ−αII１とＨuＩＦＮ−αI１のヌ
クレオチド配列、およびＨuＩＦＮ−αII１でコードさ
れたタンパク質とクラスＩのＨuＩＦＮ−αI１遺伝子系
列のタンパク質の模式図である(前半部)。 【図８】 ＨuＩＦＮ−αII１とＨuＩＦＮ−αI１のヌ
クレオチド配列、およびＨuＩＦＮ−αII１でコードさ
れたタンパク質とクラスＩのＨuＩＦＮ−αI１遺伝子系
列のタンパク質の模式図である(後半部)。 【図９】 ウイルス的に誘導されたクラスＩおよびクラ
スIIのＩＦＮ−α転写体の分析結果を撮影した写真の模
写図である。 【図１０】 大腸菌内で成熟ＩＦＮ−αタンパク質を合
成するためのプラスミドの構造を示す模式図である。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(56)参考文献 特開 昭58−41849（ＪＰ，Ａ)
ＮＡＴＵＲＥ，〜290！ 1981，Ｐ.
20−26
ＳＣＩＥＮＣＥ，〜209！ 1980，Ｐ.
1343−1347
ＳＣＩＥＮＣＥ，〜212！ 1981，Ｐ.
1159−1162
矢野 圭二 他１名著 「遺伝子操
作」 共立出版株式会社 （昭56−10−
20），Ｐ．32−40
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．以下のアミノ酸配列： 【化１】 CDLPQNHGLLSRNTLVLLHQMRRISPFLCLKDRRDFRFPQEMVKGSQLQKAHVMS VLHEMLQQIFSLFHTERSSAAWNMTLLDQLHTELHQQLQHLETCLLQVVGEGESA GAISSPALTLRRYFQGIRVYLKEKKYSDCAWEVVRMEIMKSLFLSTNMQERLRSK DRDLGSS を持つヒト白血球インターフェロンまたはそのアレル変
異体。 ２．以下のアミノ酸配列： 【化２】 CDLPQNHGLLSRNTLVLLHQMRRISPFLCLKDRRDFRFPQEMVKGSQLQKAHVMS VLHEMLQQIFSLFHTERSSAAWNMTLLDQLHTELHQQLQHLETCLLQVVGEGESA GAISSPALTLRRYFQGIRVYLKEKKYSDCAWEVVRMEIMKSLFLSTNMQERLRSK DRDLGSS を持つヒト白血球インターフェロンまたはそのアレル変
異体と薬学的に許容し得る担体を含んでいる抗ウイルス
剤。 ３．以下のアミノ酸配列： 【化３】 CDLPQNHGLLSRNTLVLLHQMRRISPFLCLKDRRDFRFPQEMVKGSQLQKAHVMS VLHEMLQQIFSLFHTERSSAAWNMTLLDQLHTELHQQLQHLETCLLQVVGEGESA GAISSPALTLRRYFQGIRVYLKEKKYSDCAWEVVRMEIMKSLFLSTNMQERLRSK DRDLGSS を持つヒト白血球インターフェロンまたはそのアレル変
異体をコードしているＤＮＡを含み、該ヒト白血球イン
ターフェロンまたはそのアレル変異体を発現することが
できる発現ベクターでトランスフェクトされた組換え細
菌宿主細胞中で、該ヒト白血球インターフェロンまたは
そのアレル変異体を発現させることからなる、該ヒト白
血球インターフェロンまたはそのアレル変異体を生産す
る方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US64474084A | 1984-08-27 | 1984-08-27 | |
| US644740 | 1984-08-27 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60189334A Division JP2597543B2 (ja) | 1984-08-27 | 1985-08-27 | 新規な白血球インターフエロン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06234796A JPH06234796A (ja) | 1994-08-23 |
| JP2792813B2 true JP2792813B2 (ja) | 1998-09-03 |
Family
ID=24586145
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60189334A Expired - Lifetime JP2597543B2 (ja) | 1984-08-27 | 1985-08-27 | 新規な白血球インターフエロン |
| JP5218449A Expired - Lifetime JP2792813B2 (ja) | 1984-08-27 | 1993-09-02 | 新規な白血球インターフェロン |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60189334A Expired - Lifetime JP2597543B2 (ja) | 1984-08-27 | 1985-08-27 | 新規な白血球インターフエロン |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0174143B1 (ja) |
| JP (2) | JP2597543B2 (ja) |
| AT (1) | ATE47864T1 (ja) |
| DE (1) | DE3574145D1 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8412564D0 (en) * | 1984-05-17 | 1984-06-20 | Searle & Co | Structure and properties |
| EP0170204B1 (de) * | 1984-08-01 | 1991-09-25 | BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH | Neue genetische Sequenzen, die durch sie codierten Interferon-Peptide vom Typ I und diese sie produzierende Organismen |
| DE3607835A1 (de) * | 1986-03-10 | 1987-09-24 | Boehringer Ingelheim Int | Hybridinterferone, deren verwendung als arzneimittel und als zwischenprodukte zur herstellung von antikoerpern und deren verwendung sowie verfahren zu ihrer herstellung |
| DE3633323A1 (de) * | 1986-10-01 | 1988-04-07 | Boehringer Ingelheim Int | Neue monoklonale antikoerper gegen ifn-omega, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendung zur reinigung sowie zum nachweis von ifn-omega |
| DE3635867A1 (de) * | 1986-10-22 | 1988-05-11 | Boehringer Ingelheim Int | Neue hefeexpressionsvektoren fuer ifn-omega, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendung |
| WO1989008706A1 (fr) * | 1988-03-18 | 1989-09-21 | Institut National De La Recherche Agronomique (Inr | Isoformes de la trophoblastine, nouveaux interferons constitues par lesdites isoformes, leurs procedes d'obtention et leurs applications |
| FR2628744B1 (fr) * | 1988-03-18 | 1991-07-26 | Agronomique Inst Nat Rech | Isoformes de la trophoblastine, nouveaux interferons constitues par lesdites isoformes, leurs procedes d'obtention et leurs applications |
| GB9609932D0 (en) * | 1996-05-13 | 1996-07-17 | Hoffmann La Roche | Use of IL-12 and IFN alpha for the treatment of infectious diseases |
| US6949520B1 (en) | 1999-09-27 | 2005-09-27 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU553400B2 (en) * | 1980-01-08 | 1986-07-17 | Biogen, Inc. | Recombinant dna for producing interferon |
| NZ198445A (en) * | 1980-09-25 | 1984-05-31 | Genentech Inc | Production of human fibroblast interferon by recombinant dna technology |
| EP0072541A3 (en) * | 1981-08-14 | 1984-04-18 | F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. Aktiengesellschaft | Human leukocyte interferons, process for their microbial production, intermediates therefor and compositions containing them |
| AU1152983A (en) * | 1982-01-15 | 1983-07-28 | Cetus Corporation | Interferon alpha 74 |
| CA1217440A (en) * | 1982-08-18 | 1987-02-03 | Michael A. Innis | INTERFERON .alpha. 6L |
-
1985
- 1985-08-23 AT AT85306011T patent/ATE47864T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-08-23 DE DE8585306011T patent/DE3574145D1/de not_active Expired
- 1985-08-23 EP EP85306011A patent/EP0174143B1/en not_active Expired
- 1985-08-27 JP JP60189334A patent/JP2597543B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-09-02 JP JP5218449A patent/JP2792813B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ＮＡＴＵＲＥ，〜２９０！ １９８１，Ｐ．２０−２６ |
| ＳＣＩＥＮＣＥ，〜２０９！ １９８０，Ｐ．１３４３−１３４７ |
| ＳＣＩＥＮＣＥ，〜２１２！ １９８１，Ｐ．１１５９−１１６２ |
| 矢野 圭二 他１名著 「遺伝子操作」 共立出版株式会社 （昭５６−１０−２０），Ｐ．３２−４０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0174143A1 (en) | 1986-03-12 |
| JPS61129200A (ja) | 1986-06-17 |
| DE3574145D1 (en) | 1989-12-14 |
| ATE47864T1 (de) | 1989-11-15 |
| JP2597543B2 (ja) | 1997-04-09 |
| EP0174143B1 (en) | 1989-11-08 |
| JPH06234796A (ja) | 1994-08-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5231176A (en) | Distinct family DNA encoding of human leukocyte interferons | |
| US5120832A (en) | Distinct family of human leukocyte interferons | |
| Goeddel et al. | The structure of eight distinct cloned human leukocyte interferon cDNAs | |
| JP2515308B2 (ja) | ヒト免疫インタ−フエロン | |
| US4414150A (en) | Hybrid human leukocyte interferons | |
| JP2642291B2 (ja) | ハイブリド型ヒト白血球インタフェロンをコードするｄｎａ | |
| JP2721139B2 (ja) | 動物のインターフェロン | |
| NL8103151A (nl) | Polypeptiden, farmaceutische preparaten, die deze poly- peptiden bevatten en werkwijzen ter bereiding ervan. | |
| JPH0753112B2 (ja) | γ−インタ−フエロンの製造法 | |
| JP2792813B2 (ja) | 新規な白血球インターフェロン | |
| JPH10262686A (ja) | ポリペプチド | |
| EP0357067B1 (en) | Recombinant natural killer cell activator | |
| CN108840951A (zh) | 一种由猪白蛋白、猪干扰素γ和猪干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| US4743553A (en) | Synthetic genes for bovine parainfluenza virus | |
| CN107286255A (zh) | 一种由鸡白蛋白、鸡干扰素γ和鸡干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| JPS5841849A (ja) | ヒト白血球インタフエロン | |
| CN107253994A (zh) | 一种由猪白细胞介素2、猪干扰素γ和猪干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN108864295A (zh) | 一种重组牛长效干扰素及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN107383202A (zh) | 一种由鸡白蛋白、鸡干扰素γ和鸡白细胞介素2组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN108794644A (zh) | 一种由牛白细胞介素2、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN107353348A (zh) | 一种重组羊长效干扰素τ及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN107383204A (zh) | 一种由羊白细胞介素2、羊干扰素γ和羊干扰素τ组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN107253995A (zh) | 一种由牛白蛋白、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| KR890001828B1 (ko) | 인터페론-α형의 폴리펩티드의 제조방법 | |
| JPH05294997A (ja) | 魚類のポリペプチド |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |