JPS5878597A - ヘテロ多糖s−194 - Google Patents

ヘテロ多糖s−194

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JPS5878597A
JPS5878597A JP57183815A JP18381582A JPS5878597A JP S5878597 A JPS5878597 A JP S5878597A JP 57183815 A JP57183815 A JP 57183815A JP 18381582 A JP18381582 A JP 18381582A JP S5878597 A JPS5878597 A JP S5878597A
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nutrient medium
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    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01NPRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/08Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests containing solids as carriers or diluents
    • A01N25/10Macromolecular compounds
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C05FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05FORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00Other organic fertilisers
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205Bacterial isolates
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005Glycopeptides, glycoproteins
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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    • C12R2001/01Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
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    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘテロ多糖(het’eropolysacchari
des )がある種の舅生物によシ生産されることが知
られている。これらのへテロ多糖のいくつかはl水性コ
ロイドとして機能し、その粘度及び流動学的性°質によ
り、水性系の濃化剤として使われてきた。
他の技術の分野と同様に、濃化、懸濁及び/もしくは安
定剤として有用な性質を有する新規へテロ多糖を発見す
る目的の研究が行われてきた。本発明の目的は新しいア
ルカリ土類金属菌(Alcaligenes 5tra
in)から生産される新規へテロ多糖を与えることであ
る。また、この新規化合物の製造法を与えることも目的
である。さらに、濃化または懸濁または安定剤と己て新
規へテロ多糖を含有する組成物を与えることも目的であ
る。本発明の他の目的は本発明の以下の記載から明らか
になるだろう。
本発明は選ばれた炭素源上の微生物の作用により製造さ
れる新規へテロ多糖に関する。
さらに、本発明は制御された条件下選ばれた炭素源及び
培養培地成分の細菌培養によシ製造されるヘテロ多糖の
新規製造法に関する。
本発明のへテロ多糖は主に炭水化物からなる高分子量多
糖である。時々「樹脂」と呼ばれるが、ヘテロ多糖とい
う語がより正確かつ明確であると信する。本発明の以下
の記載においては、ヘテロ多糖S−194もしくは単に
S−194と呼ぶ。
この新規化合物は、アルカリ土類金属 (Alcaligenes )の微生物の適当な栄養培
地での培養により回収できる量製造される。ヘテロ多糖
製造に用いられるこの種の微生物の拘束されない水久烹
託は1981年9月17日、受託番号ATOO3196
1でアメリカン・タイプやカルチャー・コレクション(
American Type C!ulture Co
11ection)に行われている。
微生物はコロラド州デンバー近くのロンキー山脈中グレ
ーシア ベーシン(GlacierBasin )地区
の水たまりから単離した。微生物は30”Q、4日培養
のY M (Difco )寒天平板上から樹脂状のコ
ロニーとして釣菌した。
単離菌は肉汁寒天上で培養を行い純粋にした。
ATOO31961菌の菌学的研究により、該菌がBe
rgey’s Mannalにおけるアルカリ土類金属
のいすにも相当しないことが示された。
YMマフラス種菌は新しいNA平板上から出発し、30
℃で回転振盪機上に置く。約24時間後、この種苗を炭
素源として氷解澱粉3優を用いたB−1フラスコに接種
する。
このフラスコもまた30℃で!!盪機上に置く。
約72時間後、フラスコは粘稠な培養液状態を示し、9
911PAの2倍量を添加することにより繊維質の沈澱
が観察された。
別のYMマフラス種菌は上記の方法で調製され、24時
間で種々の培地とグルコース3優を含むフラスコ5本に
接種するために用いた。これらのフラスコは30℃で約
72時間振盪培養し、pH1粘度、多糖の収率、生成物
の粘度を測定した。結果は表1.に」す。
E−1培地はリン酸二カルシウム5.!i’、i酸マグ
ネシウム0.1,9.、硝酸アンモニウム0.9.!i
’、ブロモソイ(Promosoy) 100 Cセン
トラル・ンーヤΦチェマーシイeディビイジョン(Ce
ntral 5oya Chemurgy Divis
ion)により市販されている大豆粉の酵素氷解物〕0
.5g、グルコース30g、水道水1tを含む。E−1
培地のpHは約7.6から7.8である。
111+ 閾  闇  閣  闇 最終培地における濃度(ppm) )jaBO40,05B+3 Mnα2 ”4 H200,5Mn ”FeSO40,
5Fe+2 0uct2.              0.01 
 Cu+2ZnC1!2              
 Q、02  Zn+2Co(J2  ” 6H200
,01Co”NaMoO4・2H200,01Mo+6
フラスコの振盪培養で製造したS−194は以下の特徴
的な性質を示す。データは室温で得たものである。
1、粘度と剪断ン 1、 1.04060 rpm、       166
0cP 1820cPスピン3 ■ 6rp”+        11.800cPスピ
ン3 ct 2、塩及び染料適合性: A、塩 1、 0aα2 (飽和)         適合2、
 ポリリン酸アンモニウム     適合3、60優N
 H4N o、          適合4、 14A
j12 (SO4)3・18H20適合5、 140a
(lt2 @ 2H20適合6.1憾にα      
      適合*得07.られた溶液について沈澱ま
たはゲル化の観察を行つ7’C;いずれも 観察きれなかった。
B、染料 C,ポリリン酸アンモニウム溶液における粘度 初期値     24時間後   係変化率910cP
      720cP     −203、手ざわり
/流動性: 平滑かつ連続的流れニゲル化なし:ゴムのような手ざわ
シ 4、作業収率41 (working yield v
alue ) :、62ダイン/c1/11標準水道水
中1憾溶液*標準水道水は脱イオン水に0.014 C
aC4及びQ、1INaαを含むものである。
ヘテロ多糖S−194は、微生物ATOO31961菌
を接種し制御した条件下で適当な水性栄養培地の好気性
培養を行うことによシ生産される。培地は炭素1.窒素
源及び無恢塩類を含む。
一般的に、炭水化物(例えば、グルコースフルクトース
、マルトース、砂糖、キシロース、マンニトール等)は
栄養培地中単独でまたは同化炭素源を組み合せて使用す
ることができる。培地で使用する炭水化物または炭水化
物類の正確な量は一部分培地の他の成分によるが、一般
的に炭水化物の量は培地重量をたり通常約2壬から5優
の間で変化する。これらの炭素源類は培地中で絹み合せ
ることができる。一般的に、多くの蛋白質性物質は培養
工程中窒素源として用いることができる。
適当な窒素源は、例えば、酵母氷解物、生酵母、大豆粉
、綿実粉、カゼイン氷解物、コーンスチープリカー、発
酵性残渣の可溶性粉、トマトペースト#を含む。単独で
もしくは組み合せて用いられる窒素源は好適には水性培
地重量あたり約0.05から0.2優までの#!、囲の
量で用いられる。プロモンイ(Promosoy)10
0は0.005から0.4幅の範囲で使用することがで
きる。
培養培地中に加えられる栄養無機塩類はナトリウム、カ
リウム、アンモニウム、カルシウム、リン酸、硫酸、塩
素、炭酸及び同様のイオンを生じさせることができる通
常の塩類である。また、コバルト、マン刀ン、鉄、マグ
ネシウムのような微量金属も含む。
冥施例中に記載した培地は使用することができる広範囲
の培地の単なる実例にすぎず、限定するものではないこ
とに注意されたい。
別法の培地として、S−194は低Ca++条件下、即
、脱イオン水または実質的にca++イオンが存在しな
い他の水性系(換言すれば、最終培養液における14多
糖あたり約4 ppmCa濃度より少ない)においても
生育できる。
培養は約25°Cから35°Cの範囲の温度で行われる
が、最蓮の結果としては約28℃から32℃までの温度
で培養を行うのが好ましい。A T OC31’961
菌を生育させ多糖S−194に生育させる栄養培地のp
Hは約6がらiまで変化させることができる。
多糖S−194は表面及び液体いずれの培養法において
も生産されるが、液体培養を行うのが好ま、しい。
小規模の培養は菌を適当な栄養培地に接種、生産培地に
移行後、約30 ”Qの恒温で数日間振盪培養を行うこ
とにより便利に行われる。
培養は1段もしくは数段の種菌段階を経た後滅菌した培
地を入れたフラスコで始められる。種菌段階の栄養培地
は炭素及び窒素源の適当な組合せのいずれにおいてもで
きる。種菌のフラスコは約30″Oの恒温室で1〜2日
、または、光分生育するまで振盪し、得られた生育のあ
る量は第2段の種菌段階もしくは生産培地のいずれかの
接種に使用される。もし使用するならば、中間段階の種
菌のフラスコは要は同様の方法によシ展開される:即、
最終の種菌段階からのフラスコ内容物の一部をたフラス
コは恒温で数日振盪し、培養終了時にフラスコ内容物を
インプロパツールのような適当なアルコールの2−3倍
量またはOHMの組成(85:15のアルコール:水足
沸点混合物)のアルコールにより沈澱させて回収する。
大規模の場合、攪拌機及び培養培地に通気する装置を備
えた適当なタンクで培養を行うことが好適である。この
方法によれば、栄養培地をタンクで調合し約121℃の
温度まで加熱し滅菌す゛る。冷却後、滅菌した培地に生
産培地に前もって生育させた種菌を接種し、栄養培地を
攪拌及び/もしくは通気し約30℃の温度に維持しなが
ら、培養を例えば2日から4日間の期間、行わせる。こ
のS −194の製造法は特に大量の製造に適している
ATOO31961菌は広範囲の培地条件で生育するこ
とができるが、以下・の好適な条件を推薦する。
この菌は゛YM寒天上で維持しなければならない。肉汁
寒天は使用すべきではない。多糖を生産しない変種が観
察された。この変種は肉汁寒天上野性種から区別するこ
とはできない。しかし、7M寒天上では容易に識別でき
る。
YM萼天上、3日培養後、コロニーは1.5−2mの大
きさに達する。典型的な野性種のコロニーは黄色、円形
、金縁、半レンズ状不透明、光沢を有している。コロニ
ーは固く弾性がある。変種のコロニーは盛り上がり(し
かし半レンズ状では彦い)、固いというより柔かいまた
は粘質状である。
凶は3日から4日ごとに移植する。その中で、生育の密
集している場所よシも疎な単一コロニーをさらに選んで
生育させるために釣菌する。
2、種菌の調整 新鮮YM寒天平板(48−72時間)1−YMもしくは
YM+0.25憾に、2 HP o4  フラスコから
出発するために用いる。これらのフラスコは30℃で振
盪培養し、24時間後新しいYM’もしくはYM+0.
25優に2 HP o、  フラスコに移植する(1−
51接種)。30℃で24−30時間振盪後、これらの
フラスコの′2本を下記の種菌培地3Li含む1ガロン
培養槽に接種するために用いる。
グルコース       30憾 に2 HP Oa          O,5係ブロモ
ソイ(Promosoy)100  0.24Mg5O
,−7H200,011 NH4No30.09憾 消泡剤         0.1−0.05424−3
0時間で5−10係の接種量を最終培養槽に接種するた
めに用いる。この培養は以下の消泡剤でも適している。
K−60/Ba1mb     0.011SAG47
1        0.05優 −FOA200   
    0.054DOW 0        0.0
5幅プロフロ油(Proflo 0il)      
0.1043.7OL培養槽培地 最終培養槽培地はリン酸一度がより低いことを除けば種
菌培地と同様である: グルコ、−ス        30優 に2 HPO40,054 ブロモソイ(Promogoy)100   0.20
4MgSO4・7 H,OO,014 NH4NO,0,09係 消泡剤          0.01−0.05憾p)
Iは35優KOHによシロ、 5−7.0に制御する。
培養は30℃で行う。60−72時間の培養時間で、培
養液粘度がBrookfield LVF粘度計、スピ
ンドルNa4.60rpm、室温の条件で測定すると3
400−4900 cP  である。3憾グルコースの
変換効率は44−594である。
フラスコ実験によシNa2HPO4に直き換えることが
できないことが示された。ナトリウムまたはその他に対
して敏感な微生物はカリウムに対する限定された要求を
有する。また最近のフラスコ実験によればより高濃度の
フロモソイ゛(Promosoy) 100、即ち、0
.4憾がよシ高収量の多糖収率をもたらすことが示され
た。
4、回収 培養終了後、ヘテロ多糖S−194はへテロ多糖に対し
て溶解力が少なくかつ反応し々い溶媒で培養液と混合可
能な溶媒で処理することにより回収できる。この方法で
ヘテロ多糖は溶液から沈澱する。使用する溶媒の量は一
般的に培養液量の約2から約3倍量の範囲である。使用
できる種々の溶媒はア七トン及び、メタノール、エタノ
ール、イソプロパツール、n−ブタノール、aec−ブ
タノール1第3ブタノール、インブタノール、n−7ミ
ルアルコールのような低級アルカノール類である。イソ
プロパツールが好適である。回収前に最終培養液のpH
をH2S o、で6.5−6.8に調整する。典型的に
は、培養液を短時間(例えば、約10から15分)約7
5℃の温度に加熱し、約30℃からそれ以下に冷却後溶
媒を加える。培養液からヘテロ多糖を沈澱させるために
、使用するアルコール濃度55−56憾が必、要である
。固体は濾過等により液体から分離して回収し、昇温し
て乾燥させる。
5、乾燥 生成物は55℃で1時間以上強制通風トレイ乾燥機で乾
燥させる。
診j口多糖S−194 ATOO31961菌によって生産されるヘテロ多糖は
主に炭水化物、約10優の〇−アセチル基、約10憾の
蛋白質から成り、実質的にピルビン酸を含まない。
多糖S−194の炭水化物部分は約9憾のグルクロン酸
(多糖重量を基に)とおよそのモル比が4=1の中性糖
、グルコースとラム一ノースを含む。
コロイド滴定(DIMDAO/スルホン酸法)及び電位
差滴定共に多糖が酸性(多糖I当たり陰性基0.5−0
.7ミリ当蓋)であることを示している。
9−114のアセチル含量は多糖S −194の0.2
1水性溶液をアルカリ性ヒドロキシルアミン試薬続いて
酸性塩化第2鉄試薬と処理することにより決定した〔ニ
ス・ヘストリン(S、 Heatrin)、J−Bto
l* Chem−1180”%249−261頁、19
49年〕。
S−194,20■を2 N H2SO,,1−で10
0″C4時間加水分解した。冷却後、3■/−のキシロ
ース、0.5−を内部標準として加えた。試料に飽和B
 a (OH)2’ 3 、ml k加え中和、さらに
コンゴーレッド2摘を加え、色が赤くなるまでBa (
OH)2  を加えた。同体00゜を加え過剰のヒドロ
キシルイオンを中和した。
遠心(2000rpm、30分)後、すべての試料の上
清液を濃縮した。乾燥試料をヒドロキシルイオンHα塩
(蕉燥ピリジン中401119/mg)0.1−に誘導
体とし90°045分加熱した。冷却した試料に再蒸留
した無水酢酸0、1−を加え、試料90℃45分加熱し
た。
糖をそのアルドノニトリル誘導体としてガ長クロマトグ
ラフィー 6 / X 2■内径ガラスカラム、100
/120メツシユ5upelcoport上3%5P−
2330で分離した。糖は標準試料と比較′して同定、
定量した〔ジヱー・ケー・ベアー゛ド(J* K、 B
a1rd 、エム・ジエー・ホルロイド(M* J、 
Ho1royde) 、デー・シー・エルウ、ツド(D
、 Cm Rllwood )  、Carbohyd
r。
Reaa、 27巻、464’−467頁、1973年
〕1中性糖の決定は表2参照。
表  2 S−194における全中性糖 糖         重量幅 ラムノース      20−21 グルコース      73−77 マンノース リボース アラビノース     微量 〈54(全量で) 多糖の種々の中性糖はまたピリジン:酢酸エチル:水(
2:5:5)の上層を溶媒とし′%II/hatm!n
 Hn 1クロマトグラフイ一用PMを使用する下降法
ペーパークロマトグラフィーによっても特徴づけされた
。クロマトグラムは硝酸銀浸漬試薬及び酸性フタル酸ア
ニリン噴霧試薬で染色した。構成糖は糖の標準品との同
時クロマトグラフィー及びフタル酸アニリン試薬による
特異的呈色反応により同定した。
多糖のグルクロン酸含量は17%塩酸による脱炭酸、標
準水酸化ナトリウム中への遊離二酸化炭素を捕促し逆滴
定を行い決定した〔ビー・エルeブラウニング(B、L
Browning ) 、木材化学方法(Metho’
di of、−Wood Chemistry)第2巻
、632−633頁、1967年〕。脱炭酸法はS−1
94の3種の異なった試料で8.8.8.9.9.24
の値を与えた。
F紙電気泳動は上記酸加水分解中和物に存在するウロン
酸の分離及び試験的な同定に使用した。この試料及び既
知ウロン酸標準品の一定量をOamag電気泳動用濾紙
N168−011に塗布し、電気泳動f Oamag 
Model HVE電気泳動装置を用いpH2,7緩衝
液中で2.0時間行った。り、ロマトグラムは風乾後、
分離したウロン酸の位置を求めるために硝酸銀浸漬試薬
で染色した。この方法によりグルクロン酸及びマンニュ
ロン酸標品の相対移動度を有する2つのウロン酸のスポ
ットが見られ、後者のスポットは酸水解抵抗性ウロン酸
含有三糖類を示している。
S−194本来の赤外吸収スペクトルは乾燥した物質を
KBr錠剤で測定した。ヘテロ多糖はヒドロキシル、メ
チル、エステル残基金示すそれぞれ、3400 cm−
” % 2900twr−”、1725m−1の吸収を
示した。− 培養後、S−194の試料を透析、凍結乾燥した。試料
はサンフォード(5anford )とコンラド(0o
nrad)、生化学(Biochemiatry)、5
巻、1508−1517頁、1966年にアセチル化し
たアルジトールのような糖のメチルエーテル誘導体はガ
スクロマトグラフィーで分離した。グルコース及びラム
ノースのO−メチル誘導体の相対量は表3に示した。
表  3 メチル化S−194の加水分解−物中00−メチル化糖
の相対量 メチル化糖      結合  およそのモル比2g 
3     Me2ラムノース 1,4    12t
3+4.6Me4グルコース 末端     12.3
14   Me3グルコース l、6    1213
@6   Me3グルコース 1,4    12.4
     Me2グルコース 1,3.6    1従
って、S7−194は大部公表3の5種の糖が等モル量
と大部分が末端に結合していないグルクロン酸から成る
6種の構成糖のくシ返し単位からなる。
4種の異なった試料によって決定したヘテロ多糖S−1
94は以下の特徴的な性質を有する: 表  4 S−194の溶液め性質 試料随 試  験        BD867 BD1103 
BD1104 BD11051幅粘度/ S TW (
cP)    730  900   1120  1
190wyv(ダイン/1−d)         3
6.0   37     48    50pH安定
性          2−12 2−12  2−1
2  2−12a、海水         319.3
  −    −    −b、飽和Oaα2” 2H
zO30,9−−−d、標準塩水        35
0.2  −        −多糖S−194は水に
低濃度で溶解すると水性媒体に粘度を与える。これは濃
化剤、懸濁剤、゛乳化剤、安定剤、潤滑剤、薄膜形成剤
、結合剤として、特に水性系で有用である。S−194
は高い粘度作業収率価(warkingyield v
olue 、 WYV)、優秀な熱、剪断、酵素安定性
を有する。塩水における良好な粘度、pH2,o −1
2,0の範囲にわたる変わらない粘度を示す。また、熱
硝酸アンモニウム組成物中でのかなシ良好な濃化効率を
有する。ガール(guar) 、ヒドロキシプロピル化
ガール、もしくはヒドロキシエチルセルロースと合せた
S−194の水性溶液は相乗的な粘性を示し、それぞれ
各々一種類の多糖溶液と比較すると増加している。特に
、下記の応用もしくは生成物において使用される:粘着
剤、壁結合用セメント、速乾性化合物、カン密閉、ボイ
ラー用化合物(boiler compounds)、
ラテックスクリーミング(1atex creamin
g) 、溶接棒融剤(fluxes) 、硬質はんだ用
糊(brazing paste )、陶器製の光渭剤
及び押出成形用、クリーナ及び光沢剤、乳液(ラテック
ス1アスフアルト、シリコン)、銀の回収、種子の被覆
、殺虫剤または除草剤の噴霧制御、流動、性(flow
able)殺虫剤及び除草剤、タバコの結合剤、水性イ
ンク、安定な泡沫、皮革の仕上げ、織物の捺染及び仕上
げ、ウェットエンドペーパ(wet−end pape
r )添加剤、(wet−end paper )保持
及び形成助剤、抗粘着化合物(anti−stick、
 compouuds)、型出し剤、液体樹脂、スラリ
状及び包装爆発物、石油及び水用井戸掘削泥、石油用(
workove’r)及び完成液、石油用、刺激液、化
粧品、薬学用懸濁液及び乳液。
またこの多糖は、ゼリー及び他の高濃度糖含有系、クエ
ン酸を基にした飲料水を含む飲料、アイスクリーム及び
ヨーグルトを含む乳製品、サラダドレツシン・グ、(d
ry mix )、糖衣、あんかけ剤、シロップ、プデ
ィング、粉のような食品、カン詰及びレトルト食品、パ
ン用の増量剤のような食品関係忙おける利用もある。
S −494の本来の応用は懸濁液肥料である。懸濁液
製造に用いられる物質は窒素、リン酸、カリウムを種々
の割合で含有するすべての型の肥料に共通のものである
。窒素性物質ハアンモニア、アンモニウム塩、尿素、及
び、通前UAN溶液と呼ばれる尿素/硝酸アンモニウム
混液を含む。リン酸の源はリン酸及び窒素源としても使
われるリン酸アンモニウムを含む。最も通常使用される
塩類はlo−34−0と11−37−0のような液体ポ
リリン酸アンモニウムであシ、他の等級のものも使用さ
れる。近年リン酸モノアンモニウA(MAP)及びリン
酸ジアンモニウム(DAP)のようなオルトリン酸アン
モニウムが使用に供される機会が増えた。尿素/ポリリ
ン酸アンモニウム、28−28−0、のような特別な組
合せも使用される。カリウム源は主に塩化カリウムの不
純物を含む等級のものであるが、硫酸及び硝酸塩も使用
される。
今日まで市販使用されてきた唯一の懸濁液安定剤はクレ
ー〔アタパルジャイト (attapulgite )またはベントナイト〕で
あった。クレ、−はいくつかの欠点を有している:粘度
はしばしばUAN溶液によシ影響され、高度な剪断混合
が完全水利及びクレー粒子の膨潤に必要であり、深刻な
塵埃問題が大量に使用されるとしばしば生じる。クレー
はまたクレー表面に殺虫剤を吸着しある種の殺虫剤を不
活性化する。(guar) 、セルロース誘導体、キサ
ンタンガムのような通常の多糖及び濃化剤は通常高濃度
のポリリン酸またはオルトリン酸アンモニウムと両立し
がたい。
多糖S−194は広範囲のリン酸アンモニウム塩と矛盾
を生ぜず、良好な懸濁液を製造する固有の流動学的性質
を有し、吸収により殺虫剤を不活性化することなく、使
用される量゛が少なくクレーに伴って起きた塵埃問題を
緩和する。
懸濁液肥料におけるS−194の使用はまず利用できる
水または水/UAN組成物・で9S−19゛4溶液の製
造、次にリン酸アンモニウムの添加、塩化カリウムと続
くことを含む。
S−194はまた28−0−0または32−〇−0のよ
うな尿素/硝酸アンモニウム溶液に直接溶解する。ある
混合段階の製品の製造において、すでにクレーを含み、
窒素溶液で稀釈された基剤懸濁成金しばしば(uran
)溶液と混合する。これは塩を懸濁させるためのクレー
が不光分であることによる。S −194で粘度を付加
したUAN溶液の使用はクレー系における粘度損失をも
防ぐのに有効である。
懸濁液肥料におけるS−194の使用m度は0.5−5
.0ボンド/トン、好適には1.0−30ボンド゛/ト
ン(0,05−0,15憾)である。粘性尿素/硝酸ア
ンモニウム溶液の製造においては、好適な範囲は重量あ
たり0.15壬かう0.54までであるが、重量あた。
90.05憾から1.01 tでで使用することができ
る。
S−194は低濃度での高粘度、低剪断率、優秀な剪断
安定性のため流動性(flowable)殺虫剤の懸濁
液において特に有効である。流動物(flowable
s )の製造時、よシ効果的な生成物でよ、多安定な懸
濁液を製造するため殺虫剤を小さ、な粒径に砕くするこ
とがよく行われ、工程中、ボールミル、サントミル、ア
トリター(attriters ) t?使用して粒子
に砕き高い剪断性を与える。濃化剤の剪断破壊を回避す
るために製粉工程の終わりに近い時点で濃化剤を加える
ことがよく行われる。S−194は剪断安定性があるの
で貴重な工程時間を減するため最初に加えてもよい。
本発明はさらに参考のため以下に実施例を挙げるが、例
を示すものであって限定を意図するものではない。
実施例l S−194の製造  ′□ ・ YM培地100d?含む最初の種菌フラスコに新しいN
A平板上の菌(アルカリゲネス30℃で24時間振盪培
養後、その1噛を新しいY’Mフラスコ数本に移植する
。同じ培養時間後、これらのフラスコ中から2本を下記
の培地3tf含む5を培養槽に接種したニゲルコース 
      3.0憾 に2HPO4o、g o優 ブロモソイ100      0.20係Mg5Oi 
@7H200,01優 NH,No30.094 SAG471消泡剤       0.07優温度は3
0℃に保ち、1t/分の割合で通気した。攪拌は400
 rpmで出発し、それ以後良好な混合を確保するため
増加させた。24時間後この種菌駒2.5tを下記の培
地20tを含む30を培養槽に接種したニ ゲルコース      3.0  係 に、HP o、   ・パ°・    0.05憾ブロ
モソイ 100      0.20憾Mg5O,・7
H,OO,04優 NH4NO30,09憾 5AG471消泡剤      0.054温度を30
℃に保ち、培養中10t/分の割合で通気した。p)l
は251 KOH添加にょシ自動的に6.7以上に制御
した。攪拌は最初300 rpmに設定し良好な混合を
確保するため必要時に最大700 rpmまで増加させ
た。
この培養で得られた結果を以下に示す。
時 間 pH培養液粘度1 多糖収率 残糖分66時間
 6.75 1200cP   O,8441,048
9時間 7.44 2300cP   1.284  
0.11* Brookfield VLF 、 5p
in Nα4.60rpm培養液を約75℃に10’−
15分加熱し室温まで冷却した。培養液に3倍量の99
係イソプロパツールを加えた。繊維性物質として沈澱し
た多糖を篩で回収した。強制通風トレイ乾燥機で55℃
、約45分乾燥後、繊維を粉にひき、B’D−9’47
としてヘテロ多糖S−194を同定した。
実施例2 S−194の分類 A、形態学的観察 1 コロニーの形態 肉汁寒天上に大変小さなコロニーが1日培養で出現し、
3日培養するとコロニーの直径は約1mに達した。コロ
ニーは黄色色素を産生(非拡散性)、円形、金縁、半レ
ンズ状、不透明で光沢を有していた。弾力のある構造は
観察されなかった。
YM寒天上では小さなコロニーが1日で出現し、3日培
養するとその直径は1.5−2.0調に達した。コロニ
ーは黄色色素を産生(非拡散性)、円形、金縁、レンズ
状、不透明で光沢を有していた。コロニーの構造は大変
弾力性があシ、コロニーを白金線で押すとしばしばほぼ
コロニー全部が移動した。長期間培養していると同心円
が出現した。
2、細胞の形態 菌はダラム陰性、桿菌で混合型鞭毛を有して運動性を有
す、即ち、細胞は単極性及び周鞭毛を有す。カプセル、
胞子及びポリ−β−ヒドロキシブチレート粒子(PHB
)の蓄積は認められなかった。抗酸性染色は陰性であっ
た。
肉汁寒天上、細胞の大きさは0.5−0.6 Xl、5
−2.0μm1細胞は直線状で先細型であった。
YM寒天上では、細胞は肉汁寒天上での大きさより大き
かった。細胞の大きさは0.5−〇、6 X 2.0−
4.0μmで、細胞の大半は直線状でよシ円い末端であ
った。ある種のものは曲線状であった。細胞は位相差顕
微鏡下大変屈折している濃いゼラチン状基質の中で柵状
の配列をしているのがよく観察された。ヴオルチン様物
質がしばしば見られた。
3、液体培養での生育 菌の生育は表面のみに限定されていた。肉汁及びYM液
体培地での試験管培養では共に厚膜状菌膜が形成された
二YM培地では特に厚い菌膜が観察された。
B、生理学的及び生化学的試験 以下は使用した生理学的及び生化学試験の結果の総括で
あシ、表2−1に試験結果を挙げる。チトクロームオキ
シタ゛−ゼ及びカタラーゼは共に陽性であった。微生物
はグルコースを酸化的に利用し、発酵性はなかった。嫌
気的生育は観察されなかった。微生物は4から37℃の
間の温度で生育可能で、40℃ではできなかった。60
℃30分の培養後には残存菌は観察されなかつ、た。耐
Naαの最大濃度は1.54であった。微生物はptl
 6及び8のいずれでも生育し、4及び10においては
生育しなかった。
TSIS大寒では、生育は斜面上に観察され、酸及びア
ルカリ反応いずれも観察されず、穿刺部での生育は認め
られなかった。はとんどすべての標準的微生物学的試゛
験は陰性であった。硝酸塩及び亜硝酸塩は還元されなか
った。リドマスミルクでは、変化は観察されなかった。
微生物は、澱粉、ゼラチン(弱い)、エスクリン(es
culin )、Tween 80は加水分解するが、
カゼイン及びペクチンは水解しない。
微生物はL−7ラビノース、フルクトース、ガラクトー
ス、D−グルコース、ラクトース、マルトース、マンノ
ース、メリビオース、砂糖から酸化的に酸を生成した。
微生物は0.02及び0.14のトリフェニルテトラゾ
リウムクロリドに対し耐性であった。
C0i 栄養試験 全部で129基質について試験を行い、その中から以下
の23基質が微生物の炭素源及びエネルギーとして利用
された。
D−キシロース     サリシン し−アラビノース    コハク酸 り−グルコース    フマール酸 D−マンノース     L−リンゴ酸り−ガラクトー
ス   DL−乳酸 D−フルクトース   ピルビン酸 砂m            p−ヒドロキシ安息香酸
トレハロース  L−α−アラニン マルトース   DL−インロイシン セ°ロビオース  L−グルタミン酸 ラクトース   L−チロシン イヌリン 微生物は脂肪識、アルコール、ポリアルコール類は利用
できなかった。
D、抗生物質感受性試験 ′ 微生物はカルベニシリン、100A、9;クロルテトラ
サイクリン、5μI;エクスロマイシン、15μg;ゲ
ンタミシン、10μI:カナマイシン、30μgに対し
感受性があった。微生物は以下の抗生物質に対しても感
受性を有していたが、抵抗性コロニーが出現した。それ
らはコリスチン、10μI;ノボビオシン、30μg:
ボリミキシンB、300単位:テトラサイクリン、30
μgであった。微生物はペニシリン、10単位;ストレ
プトマイシン、10μIに対し抵抗性であった。
E、同定 S−194菌はダラム陰性桿菌で、混合型鞭毛で運動性
を有しているが、細胞の大部分は単極毛の鞭毛であった
微生物は絶対好気性で、そのチトクロームオキシダーガ
試験は陽性であった。Bergey’sManual 
of Determirative Bacterio
logy 。
Buchanan and Gibbons編、Wil
liams 4Wilkins Company 、ボ
ルチモア、第8版(1974年)によれば、該微生物は
アルカリ土類金属の一員に属しており、現在この属はそ
の帰属が判然としていない。この観点から、該微生物が
アルカリ土類金属の一員であると結論することが適正で
ある。
S−194 試   験          結 果チトクローム 
オキシダーゼ      十カタラーゼ       
       +嫌気性生育            
  一種々の炭水化物からの酸の生成 アドニトール            −L−7ラビノ
ース           +ダルシトール     
        −エタノール           
    −フルクトース              
+ガラクトース              +D−グ
ルコース            +イノシトール  
          −表  2−1 菌の生理学的及び生化学試験の結果 状   験           結 果各fiNaα
濃度での生育 0.54(W/V)           +1.5憾
               十3.0係     
          −6,04− 7,5係                    −
10,0係               一種々のp
Hにおける生育 pH4− pH6+ ph・8               +pHlo 
               −pH12− インドール試験            −メチルレッ
ド(MR)試験       −試   験     
   結 果 イヌリン           − ラクトース           + マルトース           + マンニトール          − マンノース           + メリビオース          + α−メチルグルコシド      − ラフイノース          − ラムノース           − サリシン            − ソルビトール          − 砂糖      十 トレハロース           −D−キシロース
         − 続き) 試    験                結 果
フオゲスープロスカウエル(VP)試験       
−シモンズ クエン酸試験             
 −硝―塩還元                  
  −亜硝酸塩還元                
  −リドマスミルク               
  変化なしアルキニンジヒドロラーゼ(ADH)試験
      −リジンデカルボキシラーゼ(L’DC)
試験      −オルニチンデカルボキシラーゼ(o
pc)試験    −ペプトンからのアンモニア生成 
          −フェニルアラニンデアミナーゼ
(PAD)試販    −H2S生成        
             士ウレアーゼ試験    
              −ホスファターゼ試験 
               −卵黄試験     
                −表  2 (わ 試    験           結 果TSI寒天
上の生育: 斜 面               変化なし穿 刺
              生育せずガス生成   
             −H2生成       
         一種々の温度における生育: 4℃               +30″0   
            +37°C+ 40℃               −43℃   
            −45°C− 50℃               −60℃、30
分における残存菌     −ニー1 しき−) 試    験                 結 
果澱粉加水分解能                 
 十ゼラチン加水分解能              
 +/±カゼイン加水分解能            
    −エスクリン(Escul in)加水分解能
        十Tween80  加水分解能  
           十ペクチン加水分解能    
           −3−ケトラクトースの生成 
            −フンゴーレッドの吸収  
             −トリフェニルテトラゾリ
ウムクロリドに対する生育二〇・02憾       
              や0.104     
                 +実施例3 ’[JAN32懸濁液肥料組成物 S−1940,25係含有の粘性なUAN32溶液は下
記の組成を用いて製造した:S−194       
 0.25係水                22
.75尿素            36.0硝酸アン
モニウム     41.0 肥料は粘性なUAN32溶液に単にリン酸ニアンモニウ
ム及び塩化カリウムの乾燥粉末を加えることにより製造
した。
N−P−に分析 15−10−10 14−0−28 18−6−12粘
性UAN32     34.65優  43.75憾
 48.9優水            27.5  
  11.1    18.7リン酸ニアンモニウム 
  21.75     −    13.05塩化カ
リウム      16.1    45.15  1
9.358−194 0.15係含有の粘性なUAN3
2溶液は以下の組成を用いて製造した:S−194  
           0.15幅水        
        22.85尿素         3
6.0 硝酸アンモニウム     41.0 肥料は粘性なUAN32溶液に単に1〇−34−0ポリ
リン酸及び塩化カリウムを混合して製造した。
N−P−に分析 成  分    10−5−30  10−10−20
 12−8−24粘性UAN32  30.5係   
 25.2係   34.54水          
6.4     13.1      3.2P A 
P      14.7   29.4   23.6
にα     48.4   32.3   38.7
15−10−15 18−9−9 43.1憾   54.9憾 3.3    4.1 29.4    26.5 24.2    14.5 懸濁液はすべての組成物において光分良好であり、市販
装置による空中散布により改善される。
実施例4゜ ポリリン酸アンモニウム、10−34−0゜組成物 懸濁液はまず利用できる水にS−194を溶解し、UA
N溶液を添加、次に10−34−〇を加えて製造された
。最後ににαを加えた。
N−P−に分析 成  分   10−5−30  10−10−20 
 12−6−248−194    0.1優    
0.1係    0.1嗟水         6.3
     13.0      6.9UAN28  
 30.5    25.2    36.610−3
4−0  14.7    29.5    17.7
にα      48.4    32.3    3
8.7成分 12−12−1215−15−102O−
4−8S−1940,110,15係     0.1
54水        14.9     11.15
      7.85UAN28     30.3 
     43,1      63.310−34−
0   35.3      29.4      1
1.8にα         19.4      1
6,2       12.9上記組成物はすべて良好
な懸濁液となった実施例5 28−28−0組成物 懸濁液はまず利用できる水にS−194t−溶解し、U
AN溶液を添加、次に28−28−〇を加えて製造され
た。最後ににαを加えた。
N−P−に分析 成分  15−13−1310−10−1015−10
−15”S−1940,1憾    0.11   0
.1憾水            23.8     
42.1    22.128−28−0      
46.4    58.6   35.7NH40H(
28憾NH3)    8.7    4.3    
−−にα         21.0    0   
 24.2成分  10−10−10’  15−15
−15”S−1940,110,1優 水            32.0       2
2.028−28−0       35.7    
   53.6NH4a−+(2s優1H3)−−−一
にα            32.2       
24.3”p)IFi濃NH4OHで6.5とした。
上記すべての組成物は良好な懸濁液となった。
実施例6 流動性(flowable )殺虫剤 S−194の剪断安定性を証明するために、ガラスピー
ズを摩砕手段として用い高剪断が特に破壊的であるダイ
ノミル型(Dyne−Mil 1Type )KDL−
Pilot (Chicago Boiler Co、
)で0.254溶液を破砕した。S−194の4試料の
粘度を流動剤における濃化剤として最も普通に使用され
ているキサンタムガムと比較する。
多糖の剪断安定剤 ダイノミル摩砕 試  料    初期粘度*   5分   1o分(
1)キサンタンガム   1300   800   
550(2)S−194(1)     950  1
160  1050(3)S−194(2)     
1450  3720  3920(4)S−194(
3)     750  2850  3150(5)
S−194(4)     1200   1750 
 1750*ブルツクフイ一ルドLVT粘度計、スピン
ドルNa2.3 、rpm 流動性(flowable)硫黄組成物もまた以下の組
成に従って製造し、懸濁液の剪断安定性を証明するため
に5分ダイノミル(Dyno −Mill)で破砕した
。低剪断率の粘度を濃化剤として同濃度のキサンタンガ
ムと比較した。
硫黄流動剤(Flowable) 硫黄、工業用(technical)        
    52.01Morwat BRl、5 (n−ブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、Pe 
t roe、hemicals Co5y  Inc、
)Morwet D −425R2,0 (ナツタじンホルムアルデヒドナトリウム濃縮物)エチ
レングリコール                5.
OIgepal Co−630R1,0 (ノニルフェノキシポリ(エチレンオキシ)エタノール
G A F  Oorp 、) Dow Corning Antifoam A   
         O,2濃化剤          
             0・16水       
                  38.14界面
活性剤、分散剤、グリコール、消泡剤を水に分散させ、
次に硫黄粉末、濃化剤を分散させた。懸濁液は5分間ダ
イノミA (])yn。
−Mill)で摩砕した。粘度はブルックフィールドL
VT、スピンドル?4IIL3.3 rpm¥1−用い
て剪断の前後に測定した。
表6−2 殺虫剤組成物の安定性 濃化剤      摩砕前     摩砕後キサンタン
カム    4100cP    2400cPS−1
?4      2800cP    3400cP上
記で製造した懸濁液は室温及び50℃で3ケ月間良好な
流動性と安定性を有していた。
実施例7 粘度の相乗性 (guar’)、 HP−guar、 HEO,S −
194の0.5係溶液を製造した。これらの溶液の1:
l混合物もまた製造した。粘度を決定し結果をグラフに
作図、これから予想粘度を求めた。予想と観測粘度の比
較はS −194が3つすべての多糖と相乗作用がある
ことを示している。
0.5壬S−194337 0,54ガール(Guar)            
112S−194/ガール(Guar)(50150)
    395  1900.5%HP−ガJル(Gu
ar)          295(Jaquar H
P−80) S−194/HP−ガール(Guar)       
520  310(50150) Q、54HEO[セロサイズ(C!ellosize)
   110QP−15M] S−194/HBO(50150)       40
7  190出願人  :  メルク エンド カムパ
ニーイン二一ボレ一テツド

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、 アル々リゲネス属(Alcaligenea )
    微生、物、ATOC!31961の生物学的純粋な培養
    物。 2、 フルカリゲネス属(Alcaligenes )
     if’生物ATCO31961含有培養物が同化炭素
    源の液中通気培養によシヘテロ多糖S−194を回収で
    きる量で生産することのできる当該做生物含有培養物。 3、微生物ATOC31961を同化炭素源含有水性栄
    養培地上での液中通気培養により生育させることを特徴
    とする、ヘテロ多糖S−194を回収するととからなる
    ヘテロ多糖S−194製造法。 4、 同化炭素が炭水化物である特許請求の範囲第3項
    記載の方法。 5、炭水化物がグルコース24−5%である特許請求の
    範囲第3項記載の方法。 6 栄養培地がグJL :I−23,04、K2 HP
     040、 O−54、大豆粉の酵素消化物0.2優、
    NH4NO30,09%、MgS’04 ” 7 H2
    00,01係からなり pH範囲が6.5から7.0で
    あり、培地温度が30℃である特許請求の範囲第3項記
    載の方法。 7、 栄養培地が実質上Oa+を含まない特許請求の範
    囲第3項記載の方法。 8.0−アセチル基約104、グルクロン酸約9憾、蛋
    白質約10係からなり、中性糖グルコースとラムノース
    のモル比がおよそ4:1であり、主として炭水化物であ
    るヘテロ多糖S−194゜ 9、微生物ATOO31961菌を同化炭素源含有水性
    栄養培地上での液中通気培養によシ生育させ、該へテロ
    多糖を回収するこ−とからなる方法によシ製造される特
    許請求の範囲第8項記載のへテロ多糖。 10、実質上Ca イオンを含まない培養培地上で製造
    される特許請求の範囲第8項記載のへテロ多糖。
JP57183815A 1981-10-21 1982-10-21 ヘテロ多糖s−194 Granted JPS5878597A (ja)

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