JPS5878590A - プラスミド含有微生物の培養方法 - Google Patents
プラスミド含有微生物の培養方法Info
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- JPS5878590A JPS5878590A JP17872581A JP17872581A JPS5878590A JP S5878590 A JPS5878590 A JP S5878590A JP 17872581 A JP17872581 A JP 17872581A JP 17872581 A JP17872581 A JP 17872581A JP S5878590 A JPS5878590 A JP S5878590A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、有用な遺伝情報を担うデオキシリポ核酸Ｃ以
下ＤＮＡと記す）フラグメントを含有するプラスミドを
微生物に形質転換し、有用な微生物を育成する場合にお
いて、溶原性ファージの溶原化の維持に必要な蛋白質（
以下レプレッサー蛋白質と記す）の遺伝情報を担うファ
ージＤＮＡを同プラスミドに組み込み、レプレッサー蛋
白質あ遺伝情報を担うファージ遺伝子（以下レプレッサ
ー遺伝子と記す）ＤＮＡに変異を生じた溶原性ファージ
との関係を利用することにより、同プラスミドを含有す
る微生物を優先的に生育させる培養方法である。
下ＤＮＡと記す）フラグメントを含有するプラスミドを
微生物に形質転換し、有用な微生物を育成する場合にお
いて、溶原性ファージの溶原化の維持に必要な蛋白質（
以下レプレッサー蛋白質と記す）の遺伝情報を担うファ
ージＤＮＡを同プラスミドに組み込み、レプレッサー蛋
白質あ遺伝情報を担うファージ遺伝子（以下レプレッサ
ー遺伝子と記す）ＤＮＡに変異を生じた溶原性ファージ
との関係を利用することにより、同プラスミドを含有す
る微生物を優先的に生育させる培養方法である。
近年、有用な遺伝情報を担うＤＮＡフラグメントを含有
するプラスミドを微生物に形質転換し、有用な遺伝子産
物を微生物に生産させることによって微生物育種を行な
う試みがなされている。しかしながら、有用な遺伝情報
を担うＤＮＡフラグメントを含有する組み換え型プラス
ミドは、微生物内では、一般に不安定であシ、脱落しや
すいことが知られている。したがって、上記方法で有用
遺伝子産物を工業的レベルで生産する場合、微生物内で
のプラスミドの不安定さは生産性の低下をまねくことに
なる。
するプラスミドを微生物に形質転換し、有用な遺伝子産
物を微生物に生産させることによって微生物育種を行な
う試みがなされている。しかしながら、有用な遺伝情報
を担うＤＮＡフラグメントを含有する組み換え型プラス
ミドは、微生物内では、一般に不安定であシ、脱落しや
すいことが知られている。したがって、上記方法で有用
遺伝子産物を工業的レベルで生産する場合、微生物内で
のプラスミドの不安定さは生産性の低下をまねくことに
なる。
この問題点を解決するため、プラスミドが脱落した菌株
が生存できない状況をつくることによってプラスミドを
含有する菌株のみを培養する方法がいくつか報告されて
いる（特開昭５６−１５６９６、特開昭５５−１５６５
９１ ）。
が生存できない状況をつくることによってプラスミドを
含有する菌株のみを培養する方法がいくつか報告されて
いる（特開昭５６−１５６９６、特開昭５５−１５６５
９１ ）。
その多くはプラスミド上に特定の抗生物質に対する耐性
を担う遺伝子を存在せしめ、培地中に上記特定の抗生物
質を添加する培養方法を用いたもの゛である。しかしな
がら抗生物質を添加する培養方法では、抗生物質を大量
に培養液中に添加し、なければならない点や、抗生物質
を除くための余分な精製過程を必要とする点など、工業
的に有利といえない。さらに培養後の排水中に含まれる
抗生物質によっておこる自然界での耐性菌の不必要な増
加をまねく恐れがある。
を担う遺伝子を存在せしめ、培地中に上記特定の抗生物
質を添加する培養方法を用いたもの゛である。しかしな
がら抗生物質を添加する培養方法では、抗生物質を大量
に培養液中に添加し、なければならない点や、抗生物質
を除くための余分な精製過程を必要とする点など、工業
的に有利といえない。さらに培養後の排水中に含まれる
抗生物質によっておこる自然界での耐性菌の不必要な増
加をまねく恐れがある。
これに対して本発明者らは、溶原性ファージのレプレッ
サー遺伝子ＤＮＡを宿主微生物内で増殖可能なプラスミ
ドに組み込み、同宿主嶽生伝子変異株の共存下に培養す
ることによってプラスミドを含有する微生物を優先的に
培養することに成功した。
サー遺伝子ＤＮＡを宿主微生物内で増殖可能なプラスミ
ドに組み込み、同宿主嶽生伝子変異株の共存下に培養す
ることによってプラスミドを含有する微生物を優先的に
培養することに成功した。
すなわち本培養方法は、プラスミドを含有する微生物を
培養する場合、本プラスミド上に組み込んだレプレッサ
ー遺伝子の発現によシ培地中に共存するレプレッサー遺
伝子変異ファージに耐性を示し、同ファージの感染が成
立しないので生育できるが、プラスミドの脱落した微生
物はレプレッサー遺伝子変異ファージに感受性になり同
ファージの感染が成立、死滅し、その結果培地中で生存
している微生物は、殆んどがプラスミドを含有している
という原理を利用したものである。
培養する場合、本プラスミド上に組み込んだレプレッサ
ー遺伝子の発現によシ培地中に共存するレプレッサー遺
伝子変異ファージに耐性を示し、同ファージの感染が成
立しないので生育できるが、プラスミドの脱落した微生
物はレプレッサー遺伝子変異ファージに感受性になり同
ファージの感染が成立、死滅し、その結果培地中で生存
している微生物は、殆んどがプラスミドを含有している
という原理を利用したものである。
上記の本培養方法を用いることによって、抗生物質の添
加を行なう培養方法に比べてコスト的に安価に培養でき
、かつ培養後の精製工程等の処理についても問題は少な
ぐなる。さらに、抗生物質の添加を行なう培養方法に比
べて微生物の生育が非常に速い点は注目すべき特徴であ
る。また本培養方法では、微生物の生育可能な培地なら
ば、どのような培地を用いてもよいことも利点の一つで
ある。
加を行なう培養方法に比べてコスト的に安価に培養でき
、かつ培養後の精製工程等の処理についても問題は少な
ぐなる。さらに、抗生物質の添加を行なう培養方法に比
べて微生物の生育が非常に速い点は注目すべき特徴であ
る。また本培養方法では、微生物の生育可能な培地なら
ば、どのような培地を用いてもよいことも利点の一つで
ある。
したがって、レプレッサー遺伝子ＤＮＡフラグメントを
組み込んだプラスミドに、有用な遺伝子ＤＮＡフラグメ
ントを組み込み、本培養方法を用いて培養を行なえば、
同プラスミドを含有する微生物を優先的に増殖させるこ
とができ、醗酵生産における生産性の低下を防ぐことが
できる。
組み込んだプラスミドに、有用な遺伝子ＤＮＡフラグメ
ントを組み込み、本培養方法を用いて培養を行なえば、
同プラスミドを含有する微生物を優先的に増殖させるこ
とができ、醗酵生産における生産性の低下を防ぐことが
できる。
本培養方法は、溶原性フ、アージとその宿主微生物、例
えば細菌ではニジエリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ ）とその溶原性ファージφ８０．λ、
ス 等、枯草菌とその溶原性ファージρ１１．φ
１０５等、放線菌ではノカルディアーメデイテラニ（Ｎ
ｏｃａｒｄｉａ ｍｅｌｔｅｒｒａｎｅｉＡＴＣＣ″′
１３６８５）とその溶原性ファージβ、ｒ等の関係にあ
る微生物に応用可能である。さらに、今後発見される溶
原性ファージとその宿主にも応用可能と考えられる。溶
原性ファージのレプレッサー遺伝子変異株、例えばレプ
レッサー欠損株、レプレッサ一温度感受性株などはファ
ージ粒子を変異処理、例えば紫外線照射、ＮＴＧ処理等
を行なうことによって容易に得ることができる。スファ
ージではレプレッサー欠損株の単離［Ａ、’ Ｄ、カイ
ゼル（ｐ、、Ｄ、 Ｋａ：Ｌｓｅｒ ）＋ヴイロロジー
（ｖｉｒｏｌｏｇｙ ） ｉ５巻、４２ページ（１９５
７））が行なわれている。
えば細菌ではニジエリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ ）とその溶原性ファージφ８０．λ、
ス 等、枯草菌とその溶原性ファージρ１１．φ
１０５等、放線菌ではノカルディアーメデイテラニ（Ｎ
ｏｃａｒｄｉａ ｍｅｌｔｅｒｒａｎｅｉＡＴＣＣ″′
１３６８５）とその溶原性ファージβ、ｒ等の関係にあ
る微生物に応用可能である。さらに、今後発見される溶
原性ファージとその宿主にも応用可能と考えられる。溶
原性ファージのレプレッサー遺伝子変異株、例えばレプ
レッサー欠損株、レプレッサ一温度感受性株などはファ
ージ粒子を変異処理、例えば紫外線照射、ＮＴＧ処理等
を行なうことによって容易に得ることができる。スファ
ージではレプレッサー欠損株の単離［Ａ、’ Ｄ、カイ
ゼル（ｐ、、Ｄ、 Ｋａ：Ｌｓｅｒ ）＋ヴイロロジー
（ｖｉｒｏｌｏｇｙ ） ｉ５巻、４２ページ（１９５
７））が行なわれている。
溶原性ファージの精製とＤＮＡ の抽出は、従来から知
られているセシウムクロライド密度勾配遠心法とローリ
ング法（Ｆ、フランケルＣＦ、Ｆｒａｎｋｅｌ ） ＋
プロシーデインダス・オブ命ザ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンスＵ、 Ｓ、Ａ （ｐｒｏｃｅｅａ
ｌｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮａｔｔｎａｌＡｃａｄｅｍ
ｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ、 Ｓ、Ａ ） ４９
巻、３６６ページ（１９６３））を用いればよい。
られているセシウムクロライド密度勾配遠心法とローリ
ング法（Ｆ、フランケルＣＦ、Ｆｒａｎｋｅｌ ） ＋
プロシーデインダス・オブ命ザ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンスＵ、 Ｓ、Ａ （ｐｒｏｃｅｅａ
ｌｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮａｔｔｎａｌＡｃａｄｅｍ
ｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ、 Ｓ、Ａ ） ４９
巻、３６６ページ（１９６３））を用いればよい。
溶原性ファージのレプレッサー遺伝子をプラスミドに組
み込むには、ファージＤＮＡ とプラスミドＤＮＡを制
限エンドヌクレアーゼで処理した後にＤＮＡ連結酵素を
用いて両者を結合させればよい。制限エンドヌクレアー
ゼはプラスミドを開裂できるような酵素であればどのよ
うなものでもよいが、レプレッサー遺伝子を分断しない
ものが、望ましい。またプラスミドとしてり、 微生物
ｏ菌体内で自己増殖しうるプラスミド、例えば細菌では
ニジエリシア・ヨリノｐＢＲ３２２、ｐＳＣ！１０１等
、枯草菌のｐＵＢｌｌｏ。
み込むには、ファージＤＮＡ とプラスミドＤＮＡを制
限エンドヌクレアーゼで処理した後にＤＮＡ連結酵素を
用いて両者を結合させればよい。制限エンドヌクレアー
ゼはプラスミドを開裂できるような酵素であればどのよ
うなものでもよいが、レプレッサー遺伝子を分断しない
ものが、望ましい。またプラスミドとしてり、 微生物
ｏ菌体内で自己増殖しうるプラスミド、例えば細菌では
ニジエリシア・ヨリノｐＢＲ３２２、ｐＳＣ！１０１等
、枯草菌のｐＵＢｌｌｏ。
ＩＩＴＰ ５等、ｋ 線菌ではストレプトマイセス・セ
リカラーＣＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃθｓ ｃｏｅｌｉｃｏ
ｌｏｒ ）のｐｓｃ１ｐｓｃ！ ２等であればどのよう
なものでもよい。こうして得られた溶原性ファージのレ
プレッサー遺伝子を組み込んだプラスミドを、宿主微生
物ずれも使用できる。−例としてニジエリシア・コリで
は、塩化カルシウム処理を行なった細胞とプラスミドＤ
ＮＡを反応させる方法［Ｆ、ポリバー等（Ｆ、 Ｅｏｌ
ｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ、 ） Ｉ ジーン（Ｇｅｎｅ
） ２巻、９５ベージい９７７））、枯ラスト化した
細胞とポリエチレングライコールの共存下に、プラスミ
ドＤＮＡ を導入させる方法〔Ｃ，アナグツストポラス
等（、Ｃ、Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓｅｔａｌ、
）、 ジャーナル・オプ・バクテリオロジー（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ） ８１
巻、７４１ページ（１９６１））、 白、チャン’Ｊ
（Ｓ、 ｃｈａｎｇｅｔａｌ、）、モレキュラー・ジ
ェネラル・ジェネテイクス（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｇｅ
ｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ）１６８巻１１１ペー
ジ（１９７９）） 、放線菌では７’ｌ：ｌ）フラスト
化した細胞に、ポリエチレングライコール共存下で、プ
ラスミドＤＮＡを反応させる方法ＣＭ、：ｒ、ビプ等（
Ｍ、 Ｊ、Ｂｉ’ｂｂ ｅｔ ａｌ、 ）。
リカラーＣＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃθｓ ｃｏｅｌｉｃｏ
ｌｏｒ ）のｐｓｃ１ｐｓｃ！ ２等であればどのよう
なものでもよい。こうして得られた溶原性ファージのレ
プレッサー遺伝子を組み込んだプラスミドを、宿主微生
物ずれも使用できる。−例としてニジエリシア・コリで
は、塩化カルシウム処理を行なった細胞とプラスミドＤ
ＮＡを反応させる方法［Ｆ、ポリバー等（Ｆ、 Ｅｏｌ
ｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ、 ） Ｉ ジーン（Ｇｅｎｅ
） ２巻、９５ベージい９７７））、枯ラスト化した
細胞とポリエチレングライコールの共存下に、プラスミ
ドＤＮＡ を導入させる方法〔Ｃ，アナグツストポラス
等（、Ｃ、Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓｅｔａｌ、
）、 ジャーナル・オプ・バクテリオロジー（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ） ８１
巻、７４１ページ（１９６１））、 白、チャン’Ｊ
（Ｓ、 ｃｈａｎｇｅｔａｌ、）、モレキュラー・ジ
ェネラル・ジェネテイクス（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｇｅ
ｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ）１６８巻１１１ペー
ジ（１９７９）） 、放線菌では７’ｌ：ｌ）フラスト
化した細胞に、ポリエチレングライコール共存下で、プ
ラスミドＤＮＡを反応させる方法ＣＭ、：ｒ、ビプ等（
Ｍ、 Ｊ、Ｂｉ’ｂｂ ｅｔ ａｌ、 ）。
ネイチャー（Ｎａｔｕ’ｒｅ ） ２７４巻、３９８ペ
ージ（１９７Ｂ ））等を用いればよい。上記方法によ
す、レプレッサー遺伝子を組み込んだプラスミドによっ
て形質転換された形質転換株は、溶原性ファージのレプ
レッサー欠損株に対して耐性を示し、同ファージのヴイ
ルレント変異株に対して感受性を示すので容易に選択で
きる。
ージ（１９７Ｂ ））等を用いればよい。上記方法によ
す、レプレッサー遺伝子を組み込んだプラスミドによっ
て形質転換された形質転換株は、溶原性ファージのレプ
レッサー欠損株に対して耐性を示し、同ファージのヴイ
ルレント変異株に対して感受性を示すので容易に選択で
きる。
このようにして得られる形質転換株を、レプレッサー遺
伝子に変異を有する溶原性ファージの共存下に培養すれ
ば、プラスミドを含有する微生物のみが生育するので、
プラスミド上に有用遺伝子があれば醗酵生産において高
い生産性が期待できる。
伝子に変異を有する溶原性ファージの共存下に培養すれ
ば、プラスミドを含有する微生物のみが生育するので、
プラスミド上に有用遺伝子があれば醗酵生産において高
い生産性が期待できる。
次に、実施例を記載して本発明を説明する。
実施例１
ニジエリシア・コリ（Ｋｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ
）の溶原性ファージφ８０のレプレッサー遺伝子（以
下ＣＩ遺伝子と記す）ＤｔＪＡ フラグメントをプラス
ミドに組み込み、ニジエリシア・コリを宿主として形質
転換し、生じた組換え型プラスミドを保有する形質転換
株を、ＣＩ遺伝子に変異を有するφ８０ファージの共存
下に培養したところ、プラスミドを含有する宿主の優先
的な培養が可能であった。
）の溶原性ファージφ８０のレプレッサー遺伝子（以
下ＣＩ遺伝子と記す）ＤｔＪＡ フラグメントをプラス
ミドに組み込み、ニジエリシア・コリを宿主として形質
転換し、生じた組換え型プラスミドを保有する形質転換
株を、ＣＩ遺伝子に変異を有するφ８０ファージの共存
下に培養したところ、プラスミドを含有する宿主の優先
的な培養が可能であった。
（１）ＣＩ遺伝子に変異を有するφ８０ファージ（φ８
００工）の取得 ニジエリシア・コリＷ３１１０を宿主としてφ８０ファ
ージを増殖させ、溶菌液（６Ｘ１０１０ＰＦＵ／Ｉ／）
を得た。この溶菌液から２５０００Ｘｆ。
００工）の取得 ニジエリシア・コリＷ３１１０を宿主としてφ８０ファ
ージを増殖させ、溶菌液（６Ｘ１０１０ＰＦＵ／Ｉ／）
を得た。この溶菌液から２５０００Ｘｆ。
６０分の遠心によりファージ粒子を集め、１０ｍＭＭｇ
ＳＯ４溶液に懸濁した。約Ｉ Ｘ １０ ’ ＰＦＵ／
ｋｌのファージ溶液に紫外線（東芝１５’ＷＵＶ ｌａ
ｍｐ ）を５０１の距離で６分間照射した。この時のフ
ァージの生存率は０．７％であった。このファージを、
あらかじめ紫外線を短時間（３０秒）照射したＷ３１１
０に感染させ、軟寒天上テフラークを形成させた。レプ
レッサー欠損株（以下φ８０Ｃ工と記す）は透明なプラ
ークを形成するファージとして単離した。
ＳＯ４溶液に懸濁した。約Ｉ Ｘ １０ ’ ＰＦＵ／
ｋｌのファージ溶液に紫外線（東芝１５’ＷＵＶ ｌａ
ｍｐ ）を５０１の距離で６分間照射した。この時のフ
ァージの生存率は０．７％であった。このファージを、
あらかじめ紫外線を短時間（３０秒）照射したＷ３１１
０に感染させ、軟寒天上テフラークを形成させた。レプ
レッサー欠損株（以下φ８０Ｃ工と記す）は透明なプラ
ークを形成するファージとして単離した。
（２） φ８０のＣＩ遺伝子のクローニングニジエリ
シア・コリＷ３１１０を宿主としてφ８０ファージを増
殖させ、溶菌液（６×１０１０ＰＦＵ／１１１）を得た
。この溶菌液から２５０００Ｘｆ。
シア・コリＷ３１１０を宿主としてφ８０ファージを増
殖させ、溶菌液（６×１０１０ＰＦＵ／１１１）を得た
。この溶菌液から２５０００Ｘｆ。
６０分の遠心によ如ファージ粒子を集め、さらにセシウ
ムクロライド−密度勾配遠心法によってファ−ジ溶液を
精製した。得られたファージ粒子をローリング法で抽出
することによリφ８０ＤＮＡを得た。
ムクロライド−密度勾配遠心法によってファ−ジ溶液を
精製した。得られたファージ粒子をローリング法で抽出
することによリφ８０ＤＮＡを得た。
テトラサイクリン耐性及びアンピシリン耐性遺伝子を有
するｐＢＲ３２２をベクタープラスミドとして用いた。
するｐＢＲ３２２をベクタープラスミドとして用いた。
ｐＢＲ５２２の調製は既知の方法〔Ｄ、Ｂ、フレウェル
（Ｄ、 Ｂ、 Ｃｌｅｗｅｌｌ ）。
（Ｄ、 Ｂ、 Ｃｌｅｗｅｌｌ ）。
ジャーナル・オプ・バクテリオロジー（ＪＯｕｒｎａｏ
ｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ） １１０巻、６６７
ページ（１９７２）］に従った。すなわちＩ）Ｂ Ｒｓ
２２を含有するＷ３１１０１ｕ下ｔ３１１ｏ（、ＢＲ
３２２）と記す）を０５％カザミノ酸、０２％グルコー
ス、’０．１％酵母エキスを含む無機塩培地（Ｎａ２Ｈ
ＰＯａ ６ｇ、 ＫＨＩＰＯ４！＋ｆ−Ｎａ１ｌ
ｏ、５ＬＮＨ４Ｃｊ １ Ｆ ）を１１１Ｏ純水に溶
解し、１２０″ｃ１気圧２０分間で殺菌を行なった後、
別に同条件で殺菌した０、０１ Ｍ ｃａｃｌＲと０．
１ＭＭｆＳＯ。
ｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ） １１０巻、６６７
ページ（１９７２）］に従った。すなわちＩ）Ｂ Ｒｓ
２２を含有するＷ３１１０１ｕ下ｔ３１１ｏ（、ＢＲ
３２２）と記す）を０５％カザミノ酸、０２％グルコー
ス、’０．１％酵母エキスを含む無機塩培地（Ｎａ２Ｈ
ＰＯａ ６ｇ、 ＫＨＩＰＯ４！＋ｆ−Ｎａ１ｌ
ｏ、５ＬＮＨ４Ｃｊ １ Ｆ ）を１１１Ｏ純水に溶
解し、１２０″ｃ１気圧２０分間で殺菌を行なった後、
別に同条件で殺菌した０、０１ Ｍ ｃａｃｌＲと０．
１ＭＭｆＳＯ。
をそれぞれ１０ ｇ／づつ加えた培地を用いて３７でテ
培養を行なツタ。Ｗ ３” １１０ （ｐＥＲ３２２）
２＞（対数増殖期まで増殖したときに１７０／Ｊｇ／
ｍｌになるようにクロラムフェニコールをｆｆｉ加Ｌ、
さらに１７時間３７″Ｃで培養を行なうた。集菌後、リ
ゾチーム−Ｂｒｉｊ ５Ｂ−デオキシコール酸処理によ
って溶菌させ、４８０００Ｘｆ、 ３０分の遠心後、上
清を得た。この上清からフェノール処理、エタノール沈
殿によりプラスミドＤＮＡを濃縮しセシウムクロライド
ーエチ１ ジウムブロマイド平衡、密度勾配遠心法に
よって精製、ＢＥ３２２ ＤＮｈを得た。
培養を行なツタ。Ｗ ３” １１０ （ｐＥＲ３２２）
２＞（対数増殖期まで増殖したときに１７０／Ｊｇ／
ｍｌになるようにクロラムフェニコールをｆｆｉ加Ｌ、
さらに１７時間３７″Ｃで培養を行なうた。集菌後、リ
ゾチーム−Ｂｒｉｊ ５Ｂ−デオキシコール酸処理によ
って溶菌させ、４８０００Ｘｆ、 ３０分の遠心後、上
清を得た。この上清からフェノール処理、エタノール沈
殿によりプラスミドＤＮＡを濃縮しセシウムクロライド
ーエチ１ ジウムブロマイド平衡、密度勾配遠心法に
よって精製、ＢＥ３２２ ＤＮｈを得た。
φ８０ＤＮＡ０．９μｆとｐＢＲ３２２ＤＮＡ ０．７
１１ｆに制限エンドヌクレアーゼの一種であるＫｃｏＲ
工を５７′ｃで３時間作用させてＤＮＡ鎖を切断した。
１１ｆに制限エンドヌクレアーゼの一種であるＫｃｏＲ
工を５７′ｃで３時間作用させてＤＮＡ鎖を切断した。
６５℃５分間の熱処理後、ＡＴＰ；ジチオスレイトール
存在下、 ’ｒ、ファージＤＮＡリガーゼによって１０
で１９時間のＤＮＡ鎖連結反応を行なった。反応液に２
倍量のエタノールを加えてＤＮＡ を沈殿させ遠心によ
ってＤＮＡを回収した。
存在下、 ’ｒ、ファージＤＮＡリガーゼによって１０
で１９時間のＤＮＡ鎖連結反応を行なった。反応液に２
倍量のエタノールを加えてＤＮＡ を沈殿させ遠心によ
ってＤＮＡを回収した。
連結後のＤＮＡを０．１ Ｍ Ｏａｌ１ｇ処理によって
調製したＷ３１１”′０株のコンピテント細胞懸濁液に
加え、０℃１時間反応させた後、４２ｔ″７５秒の処理
を行なった。その後、Ｌ培地、（バクトドリプトンＩＱ
ｆ、バクト酵母エキス５ ｆ、 Ｎａ１ｌ １ｏ Ｉ
を１１（Ｄ純水に溶解した培地）を加え３７ ”Ｃで２
時間培養した。次にｍｏｊ−１になるようにφ８ｏｃ工
を感染させ、さらに１５分間培養後２Ｑｐｆ、／ｍｌア
ンピシリン、１５μｆｌ ／ ｇ／テトラサイクリンを
含有するＬ培地プレートに接種した。！１７℃で一夜培
養後′４７個のコロニーが出現した。各コロニーを純粋
に分離後、４７株すべてが両薬剤耐性と、φ８ｏｃ工耐
性、φ８０ Ｖｉｒ Ｗ＆受性の性質を有することを確
認した。これら４７株すべてがφ８０のＣ工遺伝子がｐ
Ｂ Ｒ３２２にＥＱＱＲ工部位で挿入されているプラ
スミドを含有していた。とのうち、１．７メガダルトン
のＣ工遺伝子フラグメントが唯一 ＢＲ３２２に組み込
まれているプラスミドをｐＫＮ３１９と呼ぶ。ｐＫＮ５
１９は上記 ＢＲ３２２の調製法に準じて精製した。
調製したＷ３１１”′０株のコンピテント細胞懸濁液に
加え、０℃１時間反応させた後、４２ｔ″７５秒の処理
を行なった。その後、Ｌ培地、（バクトドリプトンＩＱ
ｆ、バクト酵母エキス５ ｆ、 Ｎａ１ｌ １ｏ Ｉ
を１１（Ｄ純水に溶解した培地）を加え３７ ”Ｃで２
時間培養した。次にｍｏｊ−１になるようにφ８ｏｃ工
を感染させ、さらに１５分間培養後２Ｑｐｆ、／ｍｌア
ンピシリン、１５μｆｌ ／ ｇ／テトラサイクリンを
含有するＬ培地プレートに接種した。！１７℃で一夜培
養後′４７個のコロニーが出現した。各コロニーを純粋
に分離後、４７株すべてが両薬剤耐性と、φ８ｏｃ工耐
性、φ８０ Ｖｉｒ Ｗ＆受性の性質を有することを確
認した。これら４７株すべてがφ８０のＣ工遺伝子がｐ
Ｂ Ｒ３２２にＥＱＱＲ工部位で挿入されているプラ
スミドを含有していた。とのうち、１．７メガダルトン
のＣ工遺伝子フラグメントが唯一 ＢＲ３２２に組み込
まれているプラスミドをｐＫＮ３１９と呼ぶ。ｐＫＮ５
１９は上記 ＢＲ３２２の調製法に準じて精製した。
（３）プラスミド、、ＫＮ３１９の安定性Ｗ１１１０株
のコンピテント細胞懸濁液を０．１Ｍ Ｃａ１Ｊ４処′
理にょシ調製しｐＫＮ３１９を加え□℃１時間反応させ
た。次にＬ培地を加え３７’ＣＩ ２０分間培養した後
、２０μ９ ／ ｍｌアンピシリン、１５μｆｌｍｌテ
トラサイクリンを含有するＬ培地プレートに接種した。
のコンピテント細胞懸濁液を０．１Ｍ Ｃａ１Ｊ４処′
理にょシ調製しｐＫＮ３１９を加え□℃１時間反応させ
た。次にＬ培地を加え３７’ＣＩ ２０分間培養した後
、２０μ９ ／ ｍｌアンピシリン、１５μｆｌｍｌテ
トラサイクリンを含有するＬ培地プレートに接種した。
６７℃で一夜培養後、ｐＫＮ３１９の形質転換株Ｗ３１
１０（ｐＫＮ３１９ ） 〔ＦＥＲＭ ＢＰ −６８］
を分離した。
１０（ｐＫＮ３１９ ） 〔ＦＥＲＭ ＢＰ −６８］
を分離した。
第１表は、５００ ｍ／フラスコ内にＬ培地５０ｗｅを
分注した培養器に０２％の培養液を接種し、３７℃で培
養を行ない５回線種を行なった時のプラスミド含有株の
割合（％）を示したものである。共存させるφＳＯＣ工
（６，３Ｘ１０１０ｐｐｕ／ｇｌ）は初回の培養時にの
み２ ｍｌ添加した。プラスミド含有株は、本プラスミ
ド上にテトラサイクリン耐性とアンピシリン耐性遺伝子
を有しているので両薬剤耐性を示す。よってプラスミド
含有株の割合（％）は、各線種時にＬ培地プレート上で
コロニーを分離した後、１００株を１５μＩ ／ ｔｅ
ｌテトラサイクリン、２０μ９ ／ ｍｌアンピシリン
を含むＬ培地プレートに移植し、同培地上での生育の有
無をφ８０（：！Ｉｃ７）影響を受けないプラスミド含
有株として用いた。
分注した培養器に０２％の培養液を接種し、３７℃で培
養を行ない５回線種を行なった時のプラスミド含有株の
割合（％）を示したものである。共存させるφＳＯＣ工
（６，３Ｘ１０１０ｐｐｕ／ｇｌ）は初回の培養時にの
み２ ｍｌ添加した。プラスミド含有株は、本プラスミ
ド上にテトラサイクリン耐性とアンピシリン耐性遺伝子
を有しているので両薬剤耐性を示す。よってプラスミド
含有株の割合（％）は、各線種時にＬ培地プレート上で
コロニーを分離した後、１００株を１５μＩ ／ ｔｅ
ｌテトラサイクリン、２０μ９ ／ ｍｌアンピシリン
を含むＬ培地プレートに移植し、同培地上での生育の有
無をφ８０（：！Ｉｃ７）影響を受けないプラスミド含
有株として用いた。
第１表から明らかなようにφ８０Ｃ工の添加によってプ
ラスミド含有株が優先的に生育していることが明らかで
ある。なお、各線種時にφ８０”ＣＩの添加を行なえば
、さらによい成績が得られる。
ラスミド含有株が優先的に生育していることが明らかで
ある。なお、各線種時にφ８０”ＣＩの添加を行なえば
、さらによい成績が得られる。
第 １ 表
特許出願人 鐘淵化学工業株式会社
代理人弁理士浅野真−
Claims (3)
- （１）溶原性ファージの溶原化の維持に必要な蛋白質の
遺伝情報を担うファージ遺伝子デオキシリポ核酸フラグ
メントを、同ファージの宿主微生物内で増殖可能なプラ
スミドに組み込′み、同宿主機生物に含有せしめ、同フ
ァージの溶原化の維持に必要な蛋白質の遺伝情報に変異
の生じた変異ファージの共存下に培養することを特徴と
するプラスミド含有微生物の培養方法。 - （２）宿主微生物がニジエリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ）属に属する微生物である特許請求の範囲第１項
記載の培養方法。 - （３）溶原性ファージがφ８０である特許請求の範囲第
１項記載の培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17872581A JPS5878590A (ja) | 1981-11-06 | 1981-11-06 | プラスミド含有微生物の培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17872581A JPS5878590A (ja) | 1981-11-06 | 1981-11-06 | プラスミド含有微生物の培養方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5878590A true JPS5878590A (ja) | 1983-05-12 |
Family
ID=16053473
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17872581A Pending JPS5878590A (ja) | 1981-11-06 | 1981-11-06 | プラスミド含有微生物の培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5878590A (ja) |
-
1981
- 1981-11-06 JP JP17872581A patent/JPS5878590A/ja active Pending
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