JPS5872526A - モノクロ−ルｈｂｓ抗体の製造方法 - Google Patents
モノクロ−ルｈｂｓ抗体の製造方法Info
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- JPS5872526A JPS5872526A JP17051181A JP17051181A JPS5872526A JP S5872526 A JPS5872526 A JP S5872526A JP 17051181 A JP17051181 A JP 17051181A JP 17051181 A JP17051181 A JP 17051181A JP S5872526 A JPS5872526 A JP S5872526A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、モノクロールＨＢｓ抗体の製造方法に係わ多
、さらに詳しくは形質転換された継代培養型細胞によっ
てモノクロールヒト抗体を製造する方法に関する。
、さらに詳しくは形質転換された継代培養型細胞によっ
てモノクロールヒト抗体を製造する方法に関する。
ＨＢｓｉ抗体は、Ｂ型肝炎ウィルスによる汚染を受けた
人に注射することによＩＢ型肝炎の発症を防止する効果
のあることが明らかとさｎており、その他輸血後肝炎の
防止、ＨＢｓ 抗原陽性の母親から生れてくる児へのＢ
型肝炎感染の防止、その他あらゆるＢＷ肝炎感染の危険
性があるとき、ＨＢｓＢｓ抗体再投与ことによって感染
を未然に防ぐことができるということが次第に明らかに
されてきてお夛、医学における貢献度の極めて高いもの
として、早急な製剤の提供という市場要求性の非常に高
い医薬である０ このようなり型肝炎感染予防の目的で、わが国でもかな
シのＨＢｓ 抗体の実験的投与がこれまでに行われてき
ているが、これを製造する立場から考えて、継続的に大
量のＨＢｓ 抗体製剤を供給する見通しを得ることが困
難で、未だに市販されるＫは至ってｉない。
人に注射することによＩＢ型肝炎の発症を防止する効果
のあることが明らかとさｎており、その他輸血後肝炎の
防止、ＨＢｓ 抗原陽性の母親から生れてくる児へのＢ
型肝炎感染の防止、その他あらゆるＢＷ肝炎感染の危険
性があるとき、ＨＢｓＢｓ抗体再投与ことによって感染
を未然に防ぐことができるということが次第に明らかに
されてきてお夛、医学における貢献度の極めて高いもの
として、早急な製剤の提供という市場要求性の非常に高
い医薬である０ このようなり型肝炎感染予防の目的で、わが国でもかな
シのＨＢｓ 抗体の実験的投与がこれまでに行われてき
ているが、これを製造する立場から考えて、継続的に大
量のＨＢｓ 抗体製剤を供給する見通しを得ることが困
難で、未だに市販されるＫは至ってｉない。
このＨＢｓ 抗体の生産方法の新しい技術として最近
、ヒトの癌化リンパ様細胞系を用いてＨＢａ抗体を産生
ずる技術が導入され、注目されはじめている。それらに
は、現在細胞融合法、形質転換法の２種の技術があル、
前者は、免疫された供血者のＢリンパ球管骨髄肺細胞と
ｉ’ｎ ｖｉｔｒｏで融合させる方法であシ、後者は免
疫した供血者の３３ ＋７ンバ球＠Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂ
ａｒｒウィルス（ＥＢウィルス）等の向リンパ性ウィル
スに感染させて増殖可能な形に変換させる方法である。
、ヒトの癌化リンパ様細胞系を用いてＨＢａ抗体を産生
ずる技術が導入され、注目されはじめている。それらに
は、現在細胞融合法、形質転換法の２種の技術があル、
前者は、免疫された供血者のＢリンパ球管骨髄肺細胞と
ｉ’ｎ ｖｉｔｒｏで融合させる方法であシ、後者は免
疫した供血者の３３ ＋７ンバ球＠Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂ
ａｒｒウィルス（ＥＢウィルス）等の向リンパ性ウィル
スに感染させて増殖可能な形に変換させる方法である。
しかしながら、これらの方法はいまだ未熟であり、その
抗体産生量、抗原がウィルスであることの安全性、夾雑
抗原による精製の困難さなどの未解決の点も多く、実用
化には多くの困難がある。
抗体産生量、抗原がウィルスであることの安全性、夾雑
抗原による精製の困難さなどの未解決の点も多く、実用
化には多くの困難がある。
本発明の目的は、モノクロールと）ＨＢｉ 抗体の形質
転換法による製造方法を提供することであるＯ 本発明の他の目的は、抗体産生能の高いＨＢｓ抗体産生
細胞を提供する方法であシ、使用する免疫原のウィルス
としての安全性を確保し、しかも妻鼻−夾雑抗体産生細
胞のない細胞増殖系を提供することである。
転換法による製造方法を提供することであるＯ 本発明の他の目的は、抗体産生能の高いＨＢｓ抗体産生
細胞を提供する方法であシ、使用する免疫原のウィルス
としての安全性を確保し、しかも妻鼻−夾雑抗体産生細
胞のない細胞増殖系を提供することである。
本発明は、ＨＢｓ 抗体、特にその水溶液全尿素又はグ
アニジンのような蛋白変性剤の存在下において加熱する
とＨＢｓ 抗原の抗原性が増加するので、これをヒトＢ
リンパ球に感作させると測いＨＢｓ抗体産生能が得られ
るという知見にもとづく。
アニジンのような蛋白変性剤の存在下において加熱する
とＨＢｓ 抗原の抗原性が増加するので、これをヒトＢ
リンパ球に感作させると測いＨＢｓ抗体産生能が得られ
るという知見にもとづく。
即ち、本発明はヒ） ＩＪンバ系細胞に免疫原を接触さ
せて抗体産生を刺激し、その後継代培養可能な増殖型に
細胞を形質転換し、モノクロールヒト抗体ｔｊＲ造する
方法において、ＨＢｓ 抗原會尿素、グアニジンのよう
な蛋白変性剤の存在下に加熱したものを免疫原として用
いることにより、ヒ）Ｂリンパ細胞に対して該細胞に４
る抗体産生に３ｐＨ＃すること′に％黴とするモノクロ
ールＨＢａ 抗体の製造法である。
せて抗体産生を刺激し、その後継代培養可能な増殖型に
細胞を形質転換し、モノクロールヒト抗体ｔｊＲ造する
方法において、ＨＢｓ 抗原會尿素、グアニジンのよう
な蛋白変性剤の存在下に加熱したものを免疫原として用
いることにより、ヒ）Ｂリンパ細胞に対して該細胞に４
る抗体産生に３ｐＨ＃すること′に％黴とするモノクロ
ールＨＢａ 抗体の製造法である。
さらに詳しくは、本発明は、上述のとと（して刺激され
たしトＢリンパ細胞に Ｑ Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ ｔ−感
作させて形質転換をおこさせて増殖型の細胞となし、■
この増殖型細胞を継代培養し、この細胞からＨＢｇ
抗体を産生する細胞を選別、淡、縮し、■ この選別、
濃縮した細胞を生育培地で増殖させ、ＨＢｓ 抗体を連
続的に産生せし峠て次いで培地からＨＢｓ 抗体″を回
収することからなるモノクロールヒトＨＢｓ 抗体の
製造法である。
たしトＢリンパ細胞に Ｑ Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ ｔ−感
作させて形質転換をおこさせて増殖型の細胞となし、■
この増殖型細胞を継代培養し、この細胞からＨＢｇ
抗体を産生する細胞を選別、淡、縮し、■ この選別、
濃縮した細胞を生育培地で増殖させ、ＨＢｓ 抗体を連
続的に産生せし峠て次いで培地からＨＢｓ 抗体″を回
収することからなるモノクロールヒトＨＢｓ 抗体の
製造法である。
本発Ｆ！ＡＩＣて使用されるＨＢｓ 抗原は、一般的
にヒトのＨＢｓ 抗原陽性の血漿から回収されるもので
ある。
にヒトのＨＢｓ 抗原陽性の血漿から回収されるもので
ある。
血漿からのＨＢｓ 抗原の回収は、たとえに硫安沈澱
法、コーンの冷エタノール分画法〔コーンＥ。
法、コーンの冷エタノール分画法〔コーンＥ。
Ｊｏ、ストロングＬ、 Ｋ、、ヒユーズＷ、Ｌ、、マル
７オードＤ、 Ｊ、、アッシュワースＪ、 Ｎ、、メ
リンＭ、及びティラーＨ，Ｌ、 （Ｃｏｂｎ Ｅ、
Ｊ、、ＳｔｒｏｎｇＬ、 Ｅ。
７オードＤ、 Ｊ、、アッシュワースＪ、 Ｎ、、メ
リンＭ、及びティラーＨ，Ｌ、 （Ｃｏｂｎ Ｅ、
Ｊ、、ＳｔｒｏｎｇＬ、 Ｅ。
Ｈｕｇｈｅｓ Ｗ、Ｌ、、Ｍｕｌｆｏｒｄ Ｄ−Ｊ
、、ＡｇｈｗｏｒｔｈＪ、 Ｎ、、Ｍｅｌｉｎ Ｍ、
ａｎｄ Ｊａｙｌｏｒ Ｈ，Ｌ＊ ） ：ジャーナル
オプ アメリカン ケミカル ンサイエテイ （Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｓ −ｏｃｉｅｔ３’）を第６８巷、第４５９ペー
ジ、１９４６年〕などの周知の血漿蛋白分画法によって
行われる。例えば、α・β−グロブリン画分はコーンの
分画法による■及びＩＶ−１画分として、又硫安沈澱法
による３５％飽和よ＃）ｓｏｓ飽和において沈澱する画
分としても得られる０蛋白画分の水溶液が混濁している
場合は、その後の操作ｔ’４易とするための清澄化を行
うことができる。清澄化は例えに遠心分離、又は中性に
おいても約６０℃に加熱、生成法１ｊｌろ去することな
どによって行われる〇 かくして回収、精製されｆｃＨＢａ 抗原は、尿素又
はグアニジンのような蛋白変性剤の存在下で加熱処理さ
扛る。蛋白変性剤の使用量は、２〜８モル、好ましくは
６〜８モルである０白該処！ｉ、Ｉ：辿常媒質の存在下
に行われる０かかる媒質は水及び生理的に受入れられる
塩類の水溶液を含む０加熱される溶液ははソ中性である
ことが好ましく、そのｐＨは５〜９、好ましくは６．５
〜７．５である。
、、ＡｇｈｗｏｒｔｈＪ、 Ｎ、、Ｍｅｌｉｎ Ｍ、
ａｎｄ Ｊａｙｌｏｒ Ｈ，Ｌ＊ ） ：ジャーナル
オプ アメリカン ケミカル ンサイエテイ （Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｓ −ｏｃｉｅｔ３’）を第６８巷、第４５９ペー
ジ、１９４６年〕などの周知の血漿蛋白分画法によって
行われる。例えば、α・β−グロブリン画分はコーンの
分画法による■及びＩＶ−１画分として、又硫安沈澱法
による３５％飽和よ＃）ｓｏｓ飽和において沈澱する画
分としても得られる０蛋白画分の水溶液が混濁している
場合は、その後の操作ｔ’４易とするための清澄化を行
うことができる。清澄化は例えに遠心分離、又は中性に
おいても約６０℃に加熱、生成法１ｊｌろ去することな
どによって行われる〇 かくして回収、精製されｆｃＨＢａ 抗原は、尿素又
はグアニジンのような蛋白変性剤の存在下で加熱処理さ
扛る。蛋白変性剤の使用量は、２〜８モル、好ましくは
６〜８モルである０白該処！ｉ、Ｉ：辿常媒質の存在下
に行われる０かかる媒質は水及び生理的に受入れられる
塩類の水溶液を含む０加熱される溶液ははソ中性である
ことが好ましく、そのｐＨは５〜９、好ましくは６．５
〜７．５である。
所定のｐＨｔ−維持するため緩衝液管用いることが推奨
され、リン識塩類、炭酸塩類、トリス塩酸塩、などによ
る無機塩、緩衝溶液、′酢酸塩類、グリシン塩酸塩など
の有機酸塩緩衝溶液が媒質として用いられる。
され、リン識塩類、炭酸塩類、トリス塩酸塩、などによ
る無機塩、緩衝溶液、′酢酸塩類、グリシン塩酸塩など
の有機酸塩緩衝溶液が媒質として用いられる。
加熱温度は通常６０℃〜１２０℃の範囲である０加熱時
間は加熱温度によって異なるが、要するに抗原価で表わ
される抗原性を向上するとともに感染性を破壊す名に十
分な時間である０具体的には約３分間〜２４時間の加熱
が好ましく、低温では長く、高温では短時間でよい０例
えｉｊ、６０’Ｃ＝ｌθ〜′２４時間、１２０℃−３〜
５分の組合せという具合である０ 加熱処理を施した後、要すれにろ過清澄化し、更に水、
又は生理的食塩水などの等張液に対して透析して変性剤
、ｉｔｓ塩類、生成低分子物質などｔ除去する。減圧透
析など公知の方法で濃縮を行うこともできる。適当な濃
度に調製したｆ（Ｂｓ 抗原溶液は除菌ろ過して免疫
原とすることができる。
間は加熱温度によって異なるが、要するに抗原価で表わ
される抗原性を向上するとともに感染性を破壊す名に十
分な時間である０具体的には約３分間〜２４時間の加熱
が好ましく、低温では長く、高温では短時間でよい０例
えｉｊ、６０’Ｃ＝ｌθ〜′２４時間、１２０℃−３〜
５分の組合せという具合である０ 加熱処理を施した後、要すれにろ過清澄化し、更に水、
又は生理的食塩水などの等張液に対して透析して変性剤
、ｉｔｓ塩類、生成低分子物質などｔ除去する。減圧透
析など公知の方法で濃縮を行うこともできる。適当な濃
度に調製したｆ（Ｂｓ 抗原溶液は除菌ろ過して免疫
原とすることができる。
免疫原で抗体産生を刺激するヒトのリンパ細胞線、生体
内で抗体産生能を担うＢ細胞が用いられる。刺激は、免
疫原を生体内に投与し、その後Ｂリンパ細胞をヒトから
採取してもよいが、よシ好ましい態様は、Ｂリンパ細胞
を生体外に取９出１そＯままあ、るいは培養した後、免
疫原で刺激をおこなう方法である。
内で抗体産生能を担うＢ細胞が用いられる。刺激は、免
疫原を生体内に投与し、その後Ｂリンパ細胞をヒトから
採取してもよいが、よシ好ましい態様は、Ｂリンパ細胞
を生体外に取９出１そＯままあ、るいは培養した後、免
疫原で刺激をおこなう方法である。
Ｂ細胞の分離は、好適にはファイコール・コンレイ゛の
比重遠心法（Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｌａｂ、 Ｉｎｖ＠ｓ
ｔ。
比重遠心法（Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｌａｂ、 Ｉｎｖ＠ｓ
ｔ。
２１、５ｕｐｐｉ、 ７７−８９ （１９６８））
によって行われる０ 免疫原による生体外での刺激は、たとえば精製ＨＢｓ
抗原の適量と、Ｂリンパ細胞ｔ−３０〜４０℃で１０〜
５０時間接触させておこなう。これは一般的には培地中
で行われ、培地としては、ＲＰＭＩ１６４０等が好適に
用いられる０生体内で行うときは、通常のワクチン投与
法に準じて行うことができる。
によって行われる０ 免疫原による生体外での刺激は、たとえば精製ＨＢｓ
抗原の適量と、Ｂリンパ細胞ｔ−３０〜４０℃で１０〜
５０時間接触させておこなう。これは一般的には培地中
で行われ、培地としては、ＲＰＭＩ１６４０等が好適に
用いられる０生体内で行うときは、通常のワクチン投与
法に準じて行うことができる。
形質転換には向リンパ性ウィルス、たとえばＥ−ｐｓｔ
ｅｉｎ Ｂａｒｒウィルス（ＥＢウィルス）が用いられ
る０肖該ウイルスは正常細胞を増殖型の細胞に形質転換
させるＣ Ｎａｔｕｒｅ ２’６９ ４２０−４２２（
１９７７））ウィルスとして知られる。形質転換は例え
ば、次の如くして行われるｏＢ９５−８由来ＥＢウイル
ス（マイコプラズマフリー Ｂｓ５−８培地からの上清
としてうる）を用い、あらかじめ細胞転換可能量のウィ
ルスを調製する０この調製されたウィルスｔ−Ｂ９ンバ
球の培養系培地に適量滴下し、好ましくは３７℃におい
て５〜２０日間接触させるＯＢリンパ球の培養は、たと
え□ ば３７℃、５ ％ Ｃｏ、下でＲＰＭＩ １６４０
＋Ｉ Ｏ〜２０−牛脂仔血清中でおこなう。又、この培
養は培地にグルタミンを添加した培養培地中でおこなっ
てもよい０ ＨＢｓ 抗体を産生ずる細胞は、たとえばＰＨＡ法（
特開昭５３−２９９２０号）、放射免疫分析法（Ａｐｐ
ｌ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ２５．５６７ （１９７
３））などによって追跡さ扛る。
ｅｉｎ Ｂａｒｒウィルス（ＥＢウィルス）が用いられ
る０肖該ウイルスは正常細胞を増殖型の細胞に形質転換
させるＣ Ｎａｔｕｒｅ ２’６９ ４２０−４２２（
１９７７））ウィルスとして知られる。形質転換は例え
ば、次の如くして行われるｏＢ９５−８由来ＥＢウイル
ス（マイコプラズマフリー Ｂｓ５−８培地からの上清
としてうる）を用い、あらかじめ細胞転換可能量のウィ
ルスを調製する０この調製されたウィルスｔ−Ｂ９ンバ
球の培養系培地に適量滴下し、好ましくは３７℃におい
て５〜２０日間接触させるＯＢリンパ球の培養は、たと
え□ ば３７℃、５ ％ Ｃｏ、下でＲＰＭＩ １６４０
＋Ｉ Ｏ〜２０−牛脂仔血清中でおこなう。又、この培
養は培地にグルタミンを添加した培養培地中でおこなっ
てもよい０ ＨＢｓ 抗体を産生ずる細胞は、たとえばＰＨＡ法（
特開昭５３−２９９２０号）、放射免疫分析法（Ａｐｐ
ｌ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ２５．５６７ （１９７
３））などによって追跡さ扛る。
ＨＢｓ 抗体産生゛細胞の選別ｄ、たとえばアフィニ
テイクロマトグラフイー法などの自体既知の方法にて行
われる。具体的に杖、たとえは培養番細胞を懸濁後、こ
れを固定化ＨＢａ 抗原を接触させ、抗体産生細胞を
吸収することによって行われる。
テイクロマトグラフイー法などの自体既知の方法にて行
われる。具体的に杖、たとえは培養番細胞を懸濁後、こ
れを固定化ＨＢａ 抗原を接触させ、抗体産生細胞を
吸収することによって行われる。
固定化ＨＢａ 抗原に関して、ＨＢｓ 抗原として
は、好ましくは免疫原として使用したものが用いられ、
ま九固定化担体としてはアガロース、セルロースなどが
あげられる。吸収後、好ましくはたとえば培養液、生理
食塩水などにて洗浄し、次いでデキストラナーゼなどの
酵素などで担体を分解して付着している細胞全回収する
。細胞は、たとえは遠心分離などにて洗浄後＃！締され
る。 これは、たとえばＪ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 Ｉ
Ｏ，３１３（１９７３）に記数の方法に準じて行われ
る。その他特異抗体産生細胞の回収方法として、細胞融
合法、形質転換性において利用される技術〔たとえは、
螢光抗体法による分離（Ｒｅｖ、 Ｓｅｔ、 Ｉｎ５
ｔｒｕ、、 ４３．４０４ （１９７２）入抗原を結合
させた赤血球でロゼツト化する方法（Ｎａｔｕｒｅ、
２６９．４２０ （１９７７））などにても行われる〇 かくして、選別、濃縮されたＨＢｓ 抗体産生糸の細
胞から、たと、ｔｉＪＲＰＭＩ １６４０＋ｌＯ〜２
０チ牛脂仔血清又は、これにグルタミン′ｋｆＡ加した
培地で３７℃、５１ＣＯ，害囲気下で培養することによ
り、永久培養系の細胞をえる。培養は通常５〜１５日間
行い、新らたな培地とと夛かえて再度培養をくり返す。
は、好ましくは免疫原として使用したものが用いられ、
ま九固定化担体としてはアガロース、セルロースなどが
あげられる。吸収後、好ましくはたとえば培養液、生理
食塩水などにて洗浄し、次いでデキストラナーゼなどの
酵素などで担体を分解して付着している細胞全回収する
。細胞は、たとえは遠心分離などにて洗浄後＃！締され
る。 これは、たとえばＪ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 Ｉ
Ｏ，３１３（１９７３）に記数の方法に準じて行われ
る。その他特異抗体産生細胞の回収方法として、細胞融
合法、形質転換性において利用される技術〔たとえは、
螢光抗体法による分離（Ｒｅｖ、 Ｓｅｔ、 Ｉｎ５
ｔｒｕ、、 ４３．４０４ （１９７２）入抗原を結合
させた赤血球でロゼツト化する方法（Ｎａｔｕｒｅ、
２６９．４２０ （１９７７））などにても行われる〇 かくして、選別、濃縮されたＨＢｓ 抗体産生糸の細
胞から、たと、ｔｉＪＲＰＭＩ １６４０＋ｌＯ〜２
０チ牛脂仔血清又は、これにグルタミン′ｋｆＡ加した
培地で３７℃、５１ＣＯ，害囲気下で培養することによ
り、永久培養系の細胞をえる。培養は通常５〜１５日間
行い、新らたな培地とと夛かえて再度培養をくり返す。
かくして培地中に抗体が産生せしめられる。
ＨＢａ 抗体の回収は、例えば固定化ＨＢｓ ワク
チンによるＨＢｓ 抗体の回収法によっておこなう（４
１１１１昭５３−４４６２０ン。しかし、これＫかぎら
れるものではなくその他にもｒ−グロブリンの回収法と
して知られるものも利用できる。例えに１硫安分画法、
ＤＥＡＥ−交換体クロマトグラフィー法、ポリエチレン
グリコール分画法などがある。なお、追加処理として、
静注用ｒ−グロブリン製剤とするために公知の処理（酸
処理、＃素処理、ポリエチレングリコール処理ンを施す
ことはむろん自由である。、 精Ｊｆｌｌ ＨＢ ａ 抗体は、水解液中に一度ｔｓ整
後、適当な安定剤、賦型剤’ｒ ｈ％澗させ、要すれは
除菌ろ過をおこない、凍結乾燥全おこない、常法に従っ
て製剤化することができる。
チンによるＨＢｓ 抗体の回収法によっておこなう（４
１１１１昭５３−４４６２０ン。しかし、これＫかぎら
れるものではなくその他にもｒ−グロブリンの回収法と
して知られるものも利用できる。例えに１硫安分画法、
ＤＥＡＥ−交換体クロマトグラフィー法、ポリエチレン
グリコール分画法などがある。なお、追加処理として、
静注用ｒ−グロブリン製剤とするために公知の処理（酸
処理、＃素処理、ポリエチレングリコール処理ンを施す
ことはむろん自由である。、 精Ｊｆｌｌ ＨＢ ａ 抗体は、水解液中に一度ｔｓ整
後、適当な安定剤、賦型剤’ｒ ｈ％澗させ、要すれは
除菌ろ過をおこない、凍結乾燥全おこない、常法に従っ
て製剤化することができる。
本発明によるモノクロールＨＢｔｚ 抗体の製造方法
によるときは、通常のＨＢｓｓ 抗原を免疫原とした
ときに比して、抗体産生能のよい継代培養可能な細胞を
えることができる。また本発明の製造方法によるときは
、夾雑蛋白の混入が少なくきわめて回収効率がよい。し
かも、本発明で使用した免疫原は、加熱処理によって感
染性が確実に不活化されているので、発明の実施に際し
、製造者にとっても安全性が十分保持される。
によるときは、通常のＨＢｓｓ 抗原を免疫原とした
ときに比して、抗体産生能のよい継代培養可能な細胞を
えることができる。また本発明の製造方法によるときは
、夾雑蛋白の混入が少なくきわめて回収効率がよい。し
かも、本発明で使用した免疫原は、加熱処理によって感
染性が確実に不活化されているので、発明の実施に際し
、製造者にとっても安全性が十分保持される。
以下の実施例で本発明をさらに説明する。
実施例１
Ｂ ９５−８ ｊｌｌｍｔＲＰＭＩ−１６４０Ｋ２０
＊牛脂仔血清（以下ＦＣ８と略記）を加えた培養液（以
下、単に培養液と略記）で培養し、７日目の培養上清を
分離してＴＤ、。ｌ Ｏ／ｌのＥＢウィルス源をえた。
＊牛脂仔血清（以下ＦＣ８と略記）を加えた培養液（以
下、単に培養液と略記）で培養し、７日目の培養上清を
分離してＴＤ、。ｌ Ｏ／ｌのＥＢウィルス源をえた。
手術後摘出されたヒト扁桃細胞よ〕リンパ系細胞’ｊｌ
−７フイコール・コンレイ比重遠心法により分離し、こ
の１ＭＩ（１〜２Ｘ１０’個／ｌ ）に本発明の免疫
原を加えた。免疫原は、以下の方法で調製した。
−７フイコール・コンレイ比重遠心法により分離し、こ
の１ＭＩ（１〜２Ｘ１０’個／ｌ ）に本発明の免疫
原を加えた。免疫原は、以下の方法で調製した。
ＨＢｍ＆原価８１：（’ＩＥＳ法）全示すプール血漿１
ｏｏｙをコーンのエタノール分画法で分画して、得た画
分ＩＶ−１ｉｐＨ７，６のリン酸緩衝溶液と１１００℃
で１０分加熱処理して、生じた沈澱上除去して得友抗原
価１６］Ｃの上清１８０ｍに６モル濃度となるよう尿素
を加え、８５℃で１時間加熱−した。１時間加熱後抗原
価は３２ｘであった。溶液は生理食塩液に対し、減圧透
析してリン酸塩類及び尿素を除き次いで除菌ろ過して免
疫原として用いられる溶液をえ九〇 この溶液のｌｄｆ免疫原として、前記のリンパ系細胞の
培養培地（ＲＰＭＩ １６４Ｇ ＋１０〜２ｏｑｂ牛
脂仔血渭）に加え、５ＳＣＯ□下、３７℃、４８時間培
妥した後、培養液１ｍあたり前述の０゜２ｄのＥＢウィ
ルス上清液を加え感染させた。これｔ培養液中で３週間
静置培養し、抗体の産生ｔＰＨＡ法にて追跡しなカニら
細胞の増殖をおこなったＯ 増殖した細胞からＨＢａ抗体産生細胞を回収するために
、前記免疫原全臭化シアンで活性化したアガロースに共
有結合せしめ、固定化ＨＢｓ 抗原を得、これの十分
量と細胞ｔ−接触さぜ、ＨＢａ 抗体産生細胞上吸着せ
しめた。固定化ＨＢｓ 抗原は培養細胞の懸濁液の１
７当シ、１ＩＩｉ添加した。
ｏｏｙをコーンのエタノール分画法で分画して、得た画
分ＩＶ−１ｉｐＨ７，６のリン酸緩衝溶液と１１００℃
で１０分加熱処理して、生じた沈澱上除去して得友抗原
価１６］Ｃの上清１８０ｍに６モル濃度となるよう尿素
を加え、８５℃で１時間加熱−した。１時間加熱後抗原
価は３２ｘであった。溶液は生理食塩液に対し、減圧透
析してリン酸塩類及び尿素を除き次いで除菌ろ過して免
疫原として用いられる溶液をえ九〇 この溶液のｌｄｆ免疫原として、前記のリンパ系細胞の
培養培地（ＲＰＭＩ １６４Ｇ ＋１０〜２ｏｑｂ牛
脂仔血渭）に加え、５ＳＣＯ□下、３７℃、４８時間培
妥した後、培養液１ｍあたり前述の０゜２ｄのＥＢウィ
ルス上清液を加え感染させた。これｔ培養液中で３週間
静置培養し、抗体の産生ｔＰＨＡ法にて追跡しなカニら
細胞の増殖をおこなったＯ 増殖した細胞からＨＢａ抗体産生細胞を回収するために
、前記免疫原全臭化シアンで活性化したアガロースに共
有結合せしめ、固定化ＨＢｓ 抗原を得、これの十分
量と細胞ｔ−接触さぜ、ＨＢａ 抗体産生細胞上吸着せ
しめた。固定化ＨＢｓ 抗原は培養細胞の懸濁液の１
７当シ、１ＩＩｉ添加した。
十分の接触後培養液で洗浄し、未吸着細胞を除去した。
吸着体を分取し、これ’を再び培養液中に懸濁し、これ
にダキストラナーゼ１ｍｇ／ｄを添加して、２３℃で１
時間処置する。この俳、細胞のみを遠心分離で分取し、
ｆｌＢｇ 抗体継代培養産細胞ｔうる。この細胞’ｉ
ｉ ０．５〜１×ｌθ 個／ｄの初期濃度の培地中に懸
濁し、１５日間培養した。培養液を３〜４日目ごとに分
取し、培養液からＨＢｍ抗体の精製量おこなった。
にダキストラナーゼ１ｍｇ／ｄを添加して、２３℃で１
時間処置する。この俳、細胞のみを遠心分離で分取し、
ｆｌＢｇ 抗体継代培養産細胞ｔうる。この細胞’ｉ
ｉ ０．５〜１×ｌθ 個／ｄの初期濃度の培地中に懸
濁し、１５日間培養した。培養液を３〜４日目ごとに分
取し、培養液からＨＢｍ抗体の精製量おこなった。
精製は、ＰＨＡｉｌ ：２０，０００を示すＨＢｓ抗体
含有培養液１０ｔｆ前記固定化ＨＢｓ 抗原に接触させ
、ＨＢＩ 抗体を吸着させた後、ｐＨ７，２のリン龍緩
衝液（ＰＢＳ）で洗浄後、３ＭＫＳＣＮ溶液を通してＨ
Ｂｓ＋ 抗体を溶離させ、溶離後、ＰＢＳに対して減圧
透析してＫＳＣＮを除去した後、除菌ろ過してＰＨＡ価
１：８００Ｘ１０’を示し、人に注射することができる
ＨＢｓ ％異抗体濃縮ｒ−グロプリン溶液２４ｄｔ−得
た。
含有培養液１０ｔｆ前記固定化ＨＢｓ 抗原に接触させ
、ＨＢＩ 抗体を吸着させた後、ｐＨ７，２のリン龍緩
衝液（ＰＢＳ）で洗浄後、３ＭＫＳＣＮ溶液を通してＨ
Ｂｓ＋ 抗体を溶離させ、溶離後、ＰＢＳに対して減圧
透析してＫＳＣＮを除去した後、除菌ろ過してＰＨＡ価
１：８００Ｘ１０’を示し、人に注射することができる
ＨＢｓ ％異抗体濃縮ｒ−グロプリン溶液２４ｄｔ−得
た。
実施例２
ヒトの白血球よシフアイルコート・コンレイの比重遠心
法を用いてリンパ球を単離した０゛このリンパ球ｆ：Ｒ
ＰＭＩ １６４ Ｇ ＋ １５ ％牛脂仔血ｆｆｔ＋
２ｍＭグルタミンの培地で培養した０このリン／（系細
胞培養培地（１〜２ＸｌＯ’個／ｄの細胞密度）に実施
例１で使用し友免疫原の代りにダアニジン処理したもの
食用いこれを培養液１ｄあた夛ｌ−の割合で添加し、３
７℃、４８時間培養した０培養後、培養液１ｍあたハ実
−例１で調製したＥＢウィルス上清液を加え感染、させ
た。感染後、５ｓｃｏ、下で３週間、静置培養した。
法を用いてリンパ球を単離した０゛このリンパ球ｆ：Ｒ
ＰＭＩ １６４ Ｇ ＋ １５ ％牛脂仔血ｆｆｔ＋
２ｍＭグルタミンの培地で培養した０このリン／（系細
胞培養培地（１〜２ＸｌＯ’個／ｄの細胞密度）に実施
例１で使用し友免疫原の代りにダアニジン処理したもの
食用いこれを培養液１ｄあた夛ｌ−の割合で添加し、３
７℃、４８時間培養した０培養後、培養液１ｍあたハ実
−例１で調製したＥＢウィルス上清液を加え感染、させ
た。感染後、５ｓｃｏ、下で３週間、静置培養した。
ＨＢｍ 抗体産生細胞ｔ−選択、−紬するために、実
施例１で使用した方法でセルロースと免疫原と會共有結
合せしめて、ＨＢＩ 抗体産生細胞の吸着のための固定
化ＨＢｓ 抗原を得た。以後、実施例１と同様の操作
によシＨＢ畠 抗体継代培養細胞を得た。これを０．５
〜ｌＸｌ０’個／ｄの初期細胞密層になるように培地中
でＪＢ ’ｔ＠ シ、数日間培養１分堆し、この培養液
ｌＯｔからＨＢｓ 抗体の精製を行った。精製は、実施
？ｌＪｌと同様に行い、抗体価１，０ＯＯＸＩＯ’のヒ
トに注射可能な）ＩＢｓ 特異抗体濃縮ｒ−グロブリン
溶液２０ｍを得た。
施例１で使用した方法でセルロースと免疫原と會共有結
合せしめて、ＨＢＩ 抗体産生細胞の吸着のための固定
化ＨＢｓ 抗原を得た。以後、実施例１と同様の操作
によシＨＢ畠 抗体継代培養細胞を得た。これを０．５
〜ｌＸｌ０’個／ｄの初期細胞密層になるように培地中
でＪＢ ’ｔ＠ シ、数日間培養１分堆し、この培養液
ｌＯｔからＨＢｓ 抗体の精製を行った。精製は、実施
？ｌＪｌと同様に行い、抗体価１，０ＯＯＸＩＯ’のヒ
トに注射可能な）ＩＢｓ 特異抗体濃縮ｒ−グロブリン
溶液２０ｍを得た。
手続補正書（自発）
昭和５６年１２月２３日
特許庁長官 殿
１、事件の表示
昭和５６年 特許 願第１７０５１１号事件との関係
特許出願人 ７、補正の対象 （１）願書を別紙の訂正願書の通り訂正する。
特許出願人 ７、補正の対象 （１）願書を別紙の訂正願書の通り訂正する。
（２）明細書の発明の名称「モノクロールＨＢａ抗体の
製造方法」全「モノクロナールＨＢｓ抗体の製造方尚に
訂正する。
製造方法」全「モノクロナールＨＢｓ抗体の製造方尚に
訂正する。
（３）明細書の特許請求の範囲全別紙の通り訂正する０
（４）明細書第２頁第６行、第２頁第８行、第４頁第１
６行、第５頁第１行、第５頁第１２行、第１２頁第６行
にそれぞれ「モノクロール」とある會それぞれ「モノク
ロナール」に訂正する。
６行、第５頁第１行、第５頁第１２行、第１２頁第６行
にそれぞれ「モノクロール」とある會それぞれ「モノク
ロナール」に訂正する。
（５）明細書第４頁ｍ１行に「モノクロール」とあ′る
を「モノクロナール」に訂正する。
を「モノクロナール」に訂正する。
（９１
２、特許請求の範囲
（１） ヒトＢリンパ系細胞に免疫原を接触させ、抗
体産生を刺激しその後継代培養可能な増殖型に細胞を形
質転換し、モノクロナールヒト抗体ｔ−製造する方法に
おいて、ＨＢｓ抗原全尿素、グアニジンのような蛋白変
性剤の存在下に加熱したものｔ免疫原として用いること
によシヒ）Ｂリンパ細胞に対して該細胞による抗体産生
を刺激すること′ｆｔ％徴とする！Ｚ！ロナーナーＢ塵
抗体の製造方法。
体産生を刺激しその後継代培養可能な増殖型に細胞を形
質転換し、モノクロナールヒト抗体ｔ−製造する方法に
おいて、ＨＢｓ抗原全尿素、グアニジンのような蛋白変
性剤の存在下に加熱したものｔ免疫原として用いること
によシヒ）Ｂリンパ細胞に対して該細胞による抗体産生
を刺激すること′ｆｔ％徴とする！Ｚ！ロナーナーＢ塵
抗体の製造方法。
（２）抗体産生を刺激されたヒトＢリンパ細胞に（ｉ）
Ｅｐａｔｅｉｎ Ｂａｒｒ、Ｖｉｒｕｓ ｋ感作さ
せて形質転換ｔおこさせて増殖型の細胞劣なし、■ こ
の増殖型細胞からＨＢａ抗体を産生する細胞を選別、濃
縮し、 ■ この選別、濃縮した細胞を生育培地で増殖させ、Ｈ
Ｂａ抗体奪連続的に産生せしめ、次いで培地からＨＢｓ
抗体を回収することからなる特許請求の範囲第（１）項
記載のモノクロナールＨＢａ抗体の製造、方法。
Ｅｐａｔｅｉｎ Ｂａｒｒ、Ｖｉｒｕｓ ｋ感作さ
せて形質転換ｔおこさせて増殖型の細胞劣なし、■ こ
の増殖型細胞からＨＢａ抗体を産生する細胞を選別、濃
縮し、 ■ この選別、濃縮した細胞を生育培地で増殖させ、Ｈ
Ｂａ抗体奪連続的に産生せしめ、次いで培地からＨＢｓ
抗体を回収することからなる特許請求の範囲第（１）項
記載のモノクロナールＨＢａ抗体の製造、方法。
Claims (2)
- （１） ヒ）Ｂリンパ系細胞に免疫原を接触させ、抗
体産生を刺激しその後継代培養可能な増殖４ρ 型に細胞上形質転換、モノクロールヒト抗体を製造する
方法において、ＨＢａ抗ＩｆＡｔ−尿素、グアニジンの
ような蛋白変性剤の存在下に加熱したもの全免疫原とし
て用いることによりヒ）Ｂリンパ細胞に対して該細胞に
よる抗体産生を刺激すること管特徴とするモノクロール
ＨＢｓ抗体の製造方法。 - （２） 抗体産生を刺激されたと）Ｂ９ンバ細胞にＱ
Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ ｆ感作さ
せて形質転換をおこさせて増殖型の細胞となし、■ こ
の増殖型細胞からＨＢｓ抗体を産生ずる細胞を選別、濃
縮し、 ■ この選別、績縮した細胞を生育培地で増殖させ、Ｈ
Ｂｓｓ抗体を連続的に産生せしめ、次いで培地からＨＢ
ａ抗体を回収することから表る特許請求の範囲第（１）
項記載のモノクロールヒト抗体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17051181A JPS5872526A (ja) | 1981-10-23 | 1981-10-23 | モノクロ−ルｈｂｓ抗体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17051181A JPS5872526A (ja) | 1981-10-23 | 1981-10-23 | モノクロ−ルｈｂｓ抗体の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5872526A true JPS5872526A (ja) | 1983-04-30 |
Family
ID=15906298
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17051181A Pending JPS5872526A (ja) | 1981-10-23 | 1981-10-23 | モノクロ−ルｈｂｓ抗体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5872526A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4883752A (en) * | 1984-10-26 | 1989-11-28 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Method for preparing monoclonal antibody to Hbsag |
| KR20190032288A (ko) | 2017-06-29 | 2019-03-27 | 카와사키 주코교 카부시키 카이샤 | 철도차량용 기어형 유연축 커플링 및 그를 구비한 철도차량용 대차 |
-
1981
- 1981-10-23 JP JP17051181A patent/JPS5872526A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4883752A (en) * | 1984-10-26 | 1989-11-28 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Method for preparing monoclonal antibody to Hbsag |
| KR20190032288A (ko) | 2017-06-29 | 2019-03-27 | 카와사키 주코교 카부시키 카이샤 | 철도차량용 기어형 유연축 커플링 및 그를 구비한 철도차량용 대차 |
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