JPS5872526A - モノクロ−ルhbs抗体の製造方法 - Google Patents
モノクロ−ルhbs抗体の製造方法Info
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- JPS5872526A JPS5872526A JP17051181A JP17051181A JPS5872526A JP S5872526 A JPS5872526 A JP S5872526A JP 17051181 A JP17051181 A JP 17051181A JP 17051181 A JP17051181 A JP 17051181A JP S5872526 A JPS5872526 A JP S5872526A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、モノクロールHBs抗体の製造方法に係わ多
、さらに詳しくは形質転換された継代培養型細胞によっ
てモノクロールヒト抗体を製造する方法に関する。
、さらに詳しくは形質転換された継代培養型細胞によっ
てモノクロールヒト抗体を製造する方法に関する。
HBsi抗体は、B型肝炎ウィルスによる汚染を受けた
人に注射することによIB型肝炎の発症を防止する効果
のあることが明らかとさnており、その他輸血後肝炎の
防止、HBs 抗原陽性の母親から生れてくる児へのB
型肝炎感染の防止、その他あらゆるBW肝炎感染の危険
性があるとき、HBsBs抗体再投与ことによって感染
を未然に防ぐことができるということが次第に明らかに
されてきてお夛、医学における貢献度の極めて高いもの
として、早急な製剤の提供という市場要求性の非常に高
い医薬である0 このようなり型肝炎感染予防の目的で、わが国でもかな
シのHBs 抗体の実験的投与がこれまでに行われてき
ているが、これを製造する立場から考えて、継続的に大
量のHBs 抗体製剤を供給する見通しを得ることが困
難で、未だに市販されるKは至ってiない。
人に注射することによIB型肝炎の発症を防止する効果
のあることが明らかとさnており、その他輸血後肝炎の
防止、HBs 抗原陽性の母親から生れてくる児へのB
型肝炎感染の防止、その他あらゆるBW肝炎感染の危険
性があるとき、HBsBs抗体再投与ことによって感染
を未然に防ぐことができるということが次第に明らかに
されてきてお夛、医学における貢献度の極めて高いもの
として、早急な製剤の提供という市場要求性の非常に高
い医薬である0 このようなり型肝炎感染予防の目的で、わが国でもかな
シのHBs 抗体の実験的投与がこれまでに行われてき
ているが、これを製造する立場から考えて、継続的に大
量のHBs 抗体製剤を供給する見通しを得ることが困
難で、未だに市販されるKは至ってiない。
このHBs 抗体の生産方法の新しい技術として最近
、ヒトの癌化リンパ様細胞系を用いてHBa抗体を産生
ずる技術が導入され、注目されはじめている。それらに
は、現在細胞融合法、形質転換法の2種の技術があル、
前者は、免疫された供血者のBリンパ球管骨髄肺細胞と
i’n vitroで融合させる方法であシ、後者は免
疫した供血者の33 +7ンバ球@Epstein B
arrウィルス(EBウィルス)等の向リンパ性ウィル
スに感染させて増殖可能な形に変換させる方法である。
、ヒトの癌化リンパ様細胞系を用いてHBa抗体を産生
ずる技術が導入され、注目されはじめている。それらに
は、現在細胞融合法、形質転換法の2種の技術があル、
前者は、免疫された供血者のBリンパ球管骨髄肺細胞と
i’n vitroで融合させる方法であシ、後者は免
疫した供血者の33 +7ンバ球@Epstein B
arrウィルス(EBウィルス)等の向リンパ性ウィル
スに感染させて増殖可能な形に変換させる方法である。
しかしながら、これらの方法はいまだ未熟であり、その
抗体産生量、抗原がウィルスであることの安全性、夾雑
抗原による精製の困難さなどの未解決の点も多く、実用
化には多くの困難がある。
抗体産生量、抗原がウィルスであることの安全性、夾雑
抗原による精製の困難さなどの未解決の点も多く、実用
化には多くの困難がある。
本発明の目的は、モノクロールと)HBi 抗体の形質
転換法による製造方法を提供することであるO 本発明の他の目的は、抗体産生能の高いHBs抗体産生
細胞を提供する方法であシ、使用する免疫原のウィルス
としての安全性を確保し、しかも妻鼻−夾雑抗体産生細
胞のない細胞増殖系を提供することである。
転換法による製造方法を提供することであるO 本発明の他の目的は、抗体産生能の高いHBs抗体産生
細胞を提供する方法であシ、使用する免疫原のウィルス
としての安全性を確保し、しかも妻鼻−夾雑抗体産生細
胞のない細胞増殖系を提供することである。
本発明は、HBs 抗体、特にその水溶液全尿素又はグ
アニジンのような蛋白変性剤の存在下において加熱する
とHBs 抗原の抗原性が増加するので、これをヒトB
リンパ球に感作させると測いHBs抗体産生能が得られ
るという知見にもとづく。
アニジンのような蛋白変性剤の存在下において加熱する
とHBs 抗原の抗原性が増加するので、これをヒトB
リンパ球に感作させると測いHBs抗体産生能が得られ
るという知見にもとづく。
即ち、本発明はヒ) IJンバ系細胞に免疫原を接触さ
せて抗体産生を刺激し、その後継代培養可能な増殖型に
細胞を形質転換し、モノクロールヒト抗体tjR造する
方法において、HBs 抗原會尿素、グアニジンのよう
な蛋白変性剤の存在下に加熱したものを免疫原として用
いることにより、ヒ)Bリンパ細胞に対して該細胞に4
る抗体産生に3pH#すること′に%黴とするモノクロ
ールHBa 抗体の製造法である。
せて抗体産生を刺激し、その後継代培養可能な増殖型に
細胞を形質転換し、モノクロールヒト抗体tjR造する
方法において、HBs 抗原會尿素、グアニジンのよう
な蛋白変性剤の存在下に加熱したものを免疫原として用
いることにより、ヒ)Bリンパ細胞に対して該細胞に4
る抗体産生に3pH#すること′に%黴とするモノクロ
ールHBa 抗体の製造法である。
さらに詳しくは、本発明は、上述のとと(して刺激され
たしトBリンパ細胞に Q Epstein Barr Virus t−感
作させて形質転換をおこさせて増殖型の細胞となし、■
この増殖型細胞を継代培養し、この細胞からHBg
抗体を産生する細胞を選別、淡、縮し、■ この選別、
濃縮した細胞を生育培地で増殖させ、HBs 抗体を連
続的に産生せし峠て次いで培地からHBs 抗体″を回
収することからなるモノクロールヒトHBs 抗体の
製造法である。
たしトBリンパ細胞に Q Epstein Barr Virus t−感
作させて形質転換をおこさせて増殖型の細胞となし、■
この増殖型細胞を継代培養し、この細胞からHBg
抗体を産生する細胞を選別、淡、縮し、■ この選別、
濃縮した細胞を生育培地で増殖させ、HBs 抗体を連
続的に産生せし峠て次いで培地からHBs 抗体″を回
収することからなるモノクロールヒトHBs 抗体の
製造法である。
本発F!AICて使用されるHBs 抗原は、一般的
にヒトのHBs 抗原陽性の血漿から回収されるもので
ある。
にヒトのHBs 抗原陽性の血漿から回収されるもので
ある。
血漿からのHBs 抗原の回収は、たとえに硫安沈澱
法、コーンの冷エタノール分画法〔コーンE。
法、コーンの冷エタノール分画法〔コーンE。
Jo、ストロングL、 K、、ヒユーズW、L、、マル
7オードD、 J、、アッシュワースJ、 N、、メ
リンM、及びティラーH,L、 (Cobn E、
J、、StrongL、 E。
7オードD、 J、、アッシュワースJ、 N、、メ
リンM、及びティラーH,L、 (Cobn E、
J、、StrongL、 E。
Hughes W、L、、Mulford D−J
、、AghworthJ、 N、、Melin M、
and Jaylor H,L* ) :ジャーナル
オプ アメリカン ケミカル ンサイエテイ (Jo
urnal of American Chemica
l S −ociet3’)を第68巷、第459ペー
ジ、1946年〕などの周知の血漿蛋白分画法によって
行われる。例えば、α・β−グロブリン画分はコーンの
分画法による■及びIV−1画分として、又硫安沈澱法
による35%飽和よ#)sos飽和において沈澱する画
分としても得られる0蛋白画分の水溶液が混濁している
場合は、その後の操作t’4易とするための清澄化を行
うことができる。清澄化は例えに遠心分離、又は中性に
おいても約60℃に加熱、生成法1jlろ去することな
どによって行われる〇 かくして回収、精製されfcHBa 抗原は、尿素又
はグアニジンのような蛋白変性剤の存在下で加熱処理さ
扛る。蛋白変性剤の使用量は、2〜8モル、好ましくは
6〜8モルである0白該処!i、I:辿常媒質の存在下
に行われる0かかる媒質は水及び生理的に受入れられる
塩類の水溶液を含む0加熱される溶液ははソ中性である
ことが好ましく、そのpHは5〜9、好ましくは6.5
〜7.5である。
、、AghworthJ、 N、、Melin M、
and Jaylor H,L* ) :ジャーナル
オプ アメリカン ケミカル ンサイエテイ (Jo
urnal of American Chemica
l S −ociet3’)を第68巷、第459ペー
ジ、1946年〕などの周知の血漿蛋白分画法によって
行われる。例えば、α・β−グロブリン画分はコーンの
分画法による■及びIV−1画分として、又硫安沈澱法
による35%飽和よ#)sos飽和において沈澱する画
分としても得られる0蛋白画分の水溶液が混濁している
場合は、その後の操作t’4易とするための清澄化を行
うことができる。清澄化は例えに遠心分離、又は中性に
おいても約60℃に加熱、生成法1jlろ去することな
どによって行われる〇 かくして回収、精製されfcHBa 抗原は、尿素又
はグアニジンのような蛋白変性剤の存在下で加熱処理さ
扛る。蛋白変性剤の使用量は、2〜8モル、好ましくは
6〜8モルである0白該処!i、I:辿常媒質の存在下
に行われる0かかる媒質は水及び生理的に受入れられる
塩類の水溶液を含む0加熱される溶液ははソ中性である
ことが好ましく、そのpHは5〜9、好ましくは6.5
〜7.5である。
所定のpHt−維持するため緩衝液管用いることが推奨
され、リン識塩類、炭酸塩類、トリス塩酸塩、などによ
る無機塩、緩衝溶液、′酢酸塩類、グリシン塩酸塩など
の有機酸塩緩衝溶液が媒質として用いられる。
され、リン識塩類、炭酸塩類、トリス塩酸塩、などによ
る無機塩、緩衝溶液、′酢酸塩類、グリシン塩酸塩など
の有機酸塩緩衝溶液が媒質として用いられる。
加熱温度は通常60℃〜120℃の範囲である0加熱時
間は加熱温度によって異なるが、要するに抗原価で表わ
される抗原性を向上するとともに感染性を破壊す名に十
分な時間である0具体的には約3分間〜24時間の加熱
が好ましく、低温では長く、高温では短時間でよい0例
えij、60’C=lθ〜′24時間、120℃−3〜
5分の組合せという具合である0 加熱処理を施した後、要すれにろ過清澄化し、更に水、
又は生理的食塩水などの等張液に対して透析して変性剤
、its塩類、生成低分子物質などt除去する。減圧透
析など公知の方法で濃縮を行うこともできる。適当な濃
度に調製したf(Bs 抗原溶液は除菌ろ過して免疫
原とすることができる。
間は加熱温度によって異なるが、要するに抗原価で表わ
される抗原性を向上するとともに感染性を破壊す名に十
分な時間である0具体的には約3分間〜24時間の加熱
が好ましく、低温では長く、高温では短時間でよい0例
えij、60’C=lθ〜′24時間、120℃−3〜
5分の組合せという具合である0 加熱処理を施した後、要すれにろ過清澄化し、更に水、
又は生理的食塩水などの等張液に対して透析して変性剤
、its塩類、生成低分子物質などt除去する。減圧透
析など公知の方法で濃縮を行うこともできる。適当な濃
度に調製したf(Bs 抗原溶液は除菌ろ過して免疫
原とすることができる。
免疫原で抗体産生を刺激するヒトのリンパ細胞線、生体
内で抗体産生能を担うB細胞が用いられる。刺激は、免
疫原を生体内に投与し、その後Bリンパ細胞をヒトから
採取してもよいが、よシ好ましい態様は、Bリンパ細胞
を生体外に取9出1そOままあ、るいは培養した後、免
疫原で刺激をおこなう方法である。
内で抗体産生能を担うB細胞が用いられる。刺激は、免
疫原を生体内に投与し、その後Bリンパ細胞をヒトから
採取してもよいが、よシ好ましい態様は、Bリンパ細胞
を生体外に取9出1そOままあ、るいは培養した後、免
疫原で刺激をおこなう方法である。
B細胞の分離は、好適にはファイコール・コンレイ゛の
比重遠心法(J、 Cl1n、 Lab、 Inv@s
t。
比重遠心法(J、 Cl1n、 Lab、 Inv@s
t。
21、5uppi、 77−89 (1968))
によって行われる0 免疫原による生体外での刺激は、たとえば精製HBs
抗原の適量と、Bリンパ細胞t−30〜40℃で10〜
50時間接触させておこなう。これは一般的には培地中
で行われ、培地としては、RPMI1640等が好適に
用いられる0生体内で行うときは、通常のワクチン投与
法に準じて行うことができる。
によって行われる0 免疫原による生体外での刺激は、たとえば精製HBs
抗原の適量と、Bリンパ細胞t−30〜40℃で10〜
50時間接触させておこなう。これは一般的には培地中
で行われ、培地としては、RPMI1640等が好適に
用いられる0生体内で行うときは、通常のワクチン投与
法に準じて行うことができる。
形質転換には向リンパ性ウィルス、たとえばE−pst
ein Barrウィルス(EBウィルス)が用いられ
る0肖該ウイルスは正常細胞を増殖型の細胞に形質転換
させるC Nature 2’69 420−422(
1977))ウィルスとして知られる。形質転換は例え
ば、次の如くして行われるoB95−8由来EBウイル
ス(マイコプラズマフリー Bs5−8培地からの上清
としてうる)を用い、あらかじめ細胞転換可能量のウィ
ルスを調製する0この調製されたウィルスt−B9ンバ
球の培養系培地に適量滴下し、好ましくは37℃におい
て5〜20日間接触させるOBリンパ球の培養は、たと
え□ ば37℃、5 % Co、下でRPMI 1640
+I O〜20−牛脂仔血清中でおこなう。又、この培
養は培地にグルタミンを添加した培養培地中でおこなっ
てもよい0 HBs 抗体を産生ずる細胞は、たとえばPHA法(
特開昭53−29920号)、放射免疫分析法(App
l、 Microbiol、 25.567 (197
3))などによって追跡さ扛る。
ein Barrウィルス(EBウィルス)が用いられ
る0肖該ウイルスは正常細胞を増殖型の細胞に形質転換
させるC Nature 2’69 420−422(
1977))ウィルスとして知られる。形質転換は例え
ば、次の如くして行われるoB95−8由来EBウイル
ス(マイコプラズマフリー Bs5−8培地からの上清
としてうる)を用い、あらかじめ細胞転換可能量のウィ
ルスを調製する0この調製されたウィルスt−B9ンバ
球の培養系培地に適量滴下し、好ましくは37℃におい
て5〜20日間接触させるOBリンパ球の培養は、たと
え□ ば37℃、5 % Co、下でRPMI 1640
+I O〜20−牛脂仔血清中でおこなう。又、この培
養は培地にグルタミンを添加した培養培地中でおこなっ
てもよい0 HBs 抗体を産生ずる細胞は、たとえばPHA法(
特開昭53−29920号)、放射免疫分析法(App
l、 Microbiol、 25.567 (197
3))などによって追跡さ扛る。
HBs 抗体産生゛細胞の選別d、たとえばアフィニ
テイクロマトグラフイー法などの自体既知の方法にて行
われる。具体的に杖、たとえは培養番細胞を懸濁後、こ
れを固定化HBa 抗原を接触させ、抗体産生細胞を
吸収することによって行われる。
テイクロマトグラフイー法などの自体既知の方法にて行
われる。具体的に杖、たとえは培養番細胞を懸濁後、こ
れを固定化HBa 抗原を接触させ、抗体産生細胞を
吸収することによって行われる。
固定化HBa 抗原に関して、HBs 抗原として
は、好ましくは免疫原として使用したものが用いられ、
ま九固定化担体としてはアガロース、セルロースなどが
あげられる。吸収後、好ましくはたとえば培養液、生理
食塩水などにて洗浄し、次いでデキストラナーゼなどの
酵素などで担体を分解して付着している細胞全回収する
。細胞は、たとえは遠心分離などにて洗浄後#!締され
る。 これは、たとえばJ、 Immunol、、 I
O,313(1973)に記数の方法に準じて行われ
る。その他特異抗体産生細胞の回収方法として、細胞融
合法、形質転換性において利用される技術〔たとえは、
螢光抗体法による分離(Rev、 Set、 In5
tru、、 43.404 (1972)入抗原を結合
させた赤血球でロゼツト化する方法(Nature、
269.420 (1977))などにても行われる〇 かくして、選別、濃縮されたHBs 抗体産生糸の細
胞から、たと、tiJRPMI 1640+lO〜2
0チ牛脂仔血清又は、これにグルタミン′kfA加した
培地で37℃、51CO,害囲気下で培養することによ
り、永久培養系の細胞をえる。培養は通常5〜15日間
行い、新らたな培地とと夛かえて再度培養をくり返す。
は、好ましくは免疫原として使用したものが用いられ、
ま九固定化担体としてはアガロース、セルロースなどが
あげられる。吸収後、好ましくはたとえば培養液、生理
食塩水などにて洗浄し、次いでデキストラナーゼなどの
酵素などで担体を分解して付着している細胞全回収する
。細胞は、たとえは遠心分離などにて洗浄後#!締され
る。 これは、たとえばJ、 Immunol、、 I
O,313(1973)に記数の方法に準じて行われ
る。その他特異抗体産生細胞の回収方法として、細胞融
合法、形質転換性において利用される技術〔たとえは、
螢光抗体法による分離(Rev、 Set、 In5
tru、、 43.404 (1972)入抗原を結合
させた赤血球でロゼツト化する方法(Nature、
269.420 (1977))などにても行われる〇 かくして、選別、濃縮されたHBs 抗体産生糸の細
胞から、たと、tiJRPMI 1640+lO〜2
0チ牛脂仔血清又は、これにグルタミン′kfA加した
培地で37℃、51CO,害囲気下で培養することによ
り、永久培養系の細胞をえる。培養は通常5〜15日間
行い、新らたな培地とと夛かえて再度培養をくり返す。
かくして培地中に抗体が産生せしめられる。
HBa 抗体の回収は、例えば固定化HBs ワク
チンによるHBs 抗体の回収法によっておこなう(4
1111昭53−44620ン。しかし、これKかぎら
れるものではなくその他にもr−グロブリンの回収法と
して知られるものも利用できる。例えに1硫安分画法、
DEAE−交換体クロマトグラフィー法、ポリエチレン
グリコール分画法などがある。なお、追加処理として、
静注用r−グロブリン製剤とするために公知の処理(酸
処理、#素処理、ポリエチレングリコール処理ンを施す
ことはむろん自由である。、 精Jfll HB a 抗体は、水解液中に一度ts整
後、適当な安定剤、賦型剤’r h%澗させ、要すれは
除菌ろ過をおこない、凍結乾燥全おこない、常法に従っ
て製剤化することができる。
チンによるHBs 抗体の回収法によっておこなう(4
1111昭53−44620ン。しかし、これKかぎら
れるものではなくその他にもr−グロブリンの回収法と
して知られるものも利用できる。例えに1硫安分画法、
DEAE−交換体クロマトグラフィー法、ポリエチレン
グリコール分画法などがある。なお、追加処理として、
静注用r−グロブリン製剤とするために公知の処理(酸
処理、#素処理、ポリエチレングリコール処理ンを施す
ことはむろん自由である。、 精Jfll HB a 抗体は、水解液中に一度ts整
後、適当な安定剤、賦型剤’r h%澗させ、要すれは
除菌ろ過をおこない、凍結乾燥全おこない、常法に従っ
て製剤化することができる。
本発明によるモノクロールHBtz 抗体の製造方法
によるときは、通常のHBss 抗原を免疫原とした
ときに比して、抗体産生能のよい継代培養可能な細胞を
えることができる。また本発明の製造方法によるときは
、夾雑蛋白の混入が少なくきわめて回収効率がよい。し
かも、本発明で使用した免疫原は、加熱処理によって感
染性が確実に不活化されているので、発明の実施に際し
、製造者にとっても安全性が十分保持される。
によるときは、通常のHBss 抗原を免疫原とした
ときに比して、抗体産生能のよい継代培養可能な細胞を
えることができる。また本発明の製造方法によるときは
、夾雑蛋白の混入が少なくきわめて回収効率がよい。し
かも、本発明で使用した免疫原は、加熱処理によって感
染性が確実に不活化されているので、発明の実施に際し
、製造者にとっても安全性が十分保持される。
以下の実施例で本発明をさらに説明する。
実施例1
B 95−8 jllmtRPMI−1640K20
*牛脂仔血清(以下FC8と略記)を加えた培養液(以
下、単に培養液と略記)で培養し、7日目の培養上清を
分離してTD、。l O/lのEBウィルス源をえた。
*牛脂仔血清(以下FC8と略記)を加えた培養液(以
下、単に培養液と略記)で培養し、7日目の培養上清を
分離してTD、。l O/lのEBウィルス源をえた。
手術後摘出されたヒト扁桃細胞よ〕リンパ系細胞’jl
−7フイコール・コンレイ比重遠心法により分離し、こ
の1MI(1〜2X10’個/l )に本発明の免疫
原を加えた。免疫原は、以下の方法で調製した。
−7フイコール・コンレイ比重遠心法により分離し、こ
の1MI(1〜2X10’個/l )に本発明の免疫
原を加えた。免疫原は、以下の方法で調製した。
HBm&原価81:(’IES法)全示すプール血漿1
ooyをコーンのエタノール分画法で分画して、得た画
分IV−1ipH7,6のリン酸緩衝溶液と1100℃
で10分加熱処理して、生じた沈澱上除去して得友抗原
価16]Cの上清180mに6モル濃度となるよう尿素
を加え、85℃で1時間加熱−した。1時間加熱後抗原
価は32xであった。溶液は生理食塩液に対し、減圧透
析してリン酸塩類及び尿素を除き次いで除菌ろ過して免
疫原として用いられる溶液をえ九〇 この溶液のldf免疫原として、前記のリンパ系細胞の
培養培地(RPMI 164G +10〜2oqb牛
脂仔血渭)に加え、5SCO□下、37℃、48時間培
妥した後、培養液1mあたり前述の0゜2dのEBウィ
ルス上清液を加え感染させた。これt培養液中で3週間
静置培養し、抗体の産生tPHA法にて追跡しなカニら
細胞の増殖をおこなったO 増殖した細胞からHBa抗体産生細胞を回収するために
、前記免疫原全臭化シアンで活性化したアガロースに共
有結合せしめ、固定化HBs 抗原を得、これの十分
量と細胞t−接触さぜ、HBa 抗体産生細胞上吸着せ
しめた。固定化HBs 抗原は培養細胞の懸濁液の1
7当シ、1IIi添加した。
ooyをコーンのエタノール分画法で分画して、得た画
分IV−1ipH7,6のリン酸緩衝溶液と1100℃
で10分加熱処理して、生じた沈澱上除去して得友抗原
価16]Cの上清180mに6モル濃度となるよう尿素
を加え、85℃で1時間加熱−した。1時間加熱後抗原
価は32xであった。溶液は生理食塩液に対し、減圧透
析してリン酸塩類及び尿素を除き次いで除菌ろ過して免
疫原として用いられる溶液をえ九〇 この溶液のldf免疫原として、前記のリンパ系細胞の
培養培地(RPMI 164G +10〜2oqb牛
脂仔血渭)に加え、5SCO□下、37℃、48時間培
妥した後、培養液1mあたり前述の0゜2dのEBウィ
ルス上清液を加え感染させた。これt培養液中で3週間
静置培養し、抗体の産生tPHA法にて追跡しなカニら
細胞の増殖をおこなったO 増殖した細胞からHBa抗体産生細胞を回収するために
、前記免疫原全臭化シアンで活性化したアガロースに共
有結合せしめ、固定化HBs 抗原を得、これの十分
量と細胞t−接触さぜ、HBa 抗体産生細胞上吸着せ
しめた。固定化HBs 抗原は培養細胞の懸濁液の1
7当シ、1IIi添加した。
十分の接触後培養液で洗浄し、未吸着細胞を除去した。
吸着体を分取し、これ’を再び培養液中に懸濁し、これ
にダキストラナーゼ1mg/dを添加して、23℃で1
時間処置する。この俳、細胞のみを遠心分離で分取し、
flBg 抗体継代培養産細胞tうる。この細胞’i
i 0.5〜1×lθ 個/dの初期濃度の培地中に懸
濁し、15日間培養した。培養液を3〜4日目ごとに分
取し、培養液からHBm抗体の精製量おこなった。
にダキストラナーゼ1mg/dを添加して、23℃で1
時間処置する。この俳、細胞のみを遠心分離で分取し、
flBg 抗体継代培養産細胞tうる。この細胞’i
i 0.5〜1×lθ 個/dの初期濃度の培地中に懸
濁し、15日間培養した。培養液を3〜4日目ごとに分
取し、培養液からHBm抗体の精製量おこなった。
精製は、PHAil :20,000を示すHBs抗体
含有培養液10tf前記固定化HBs 抗原に接触させ
、HBI 抗体を吸着させた後、pH7,2のリン龍緩
衝液(PBS)で洗浄後、3MKSCN溶液を通してH
Bs+ 抗体を溶離させ、溶離後、PBSに対して減圧
透析してKSCNを除去した後、除菌ろ過してPHA価
1:800X10’を示し、人に注射することができる
HBs %異抗体濃縮r−グロプリン溶液24dt−得
た。
含有培養液10tf前記固定化HBs 抗原に接触させ
、HBI 抗体を吸着させた後、pH7,2のリン龍緩
衝液(PBS)で洗浄後、3MKSCN溶液を通してH
Bs+ 抗体を溶離させ、溶離後、PBSに対して減圧
透析してKSCNを除去した後、除菌ろ過してPHA価
1:800X10’を示し、人に注射することができる
HBs %異抗体濃縮r−グロプリン溶液24dt−得
た。
実施例2
ヒトの白血球よシフアイルコート・コンレイの比重遠心
法を用いてリンパ球を単離した0゛このリンパ球f:R
PMI 164 G + 15 %牛脂仔血fft+
2mMグルタミンの培地で培養した0このリン/(系細
胞培養培地(1〜2XlO’個/dの細胞密度)に実施
例1で使用し友免疫原の代りにダアニジン処理したもの
食用いこれを培養液1dあた夛l−の割合で添加し、3
7℃、48時間培養した0培養後、培養液1mあたハ実
−例1で調製したEBウィルス上清液を加え感染、させ
た。感染後、5sco、下で3週間、静置培養した。
法を用いてリンパ球を単離した0゛このリンパ球f:R
PMI 164 G + 15 %牛脂仔血fft+
2mMグルタミンの培地で培養した0このリン/(系細
胞培養培地(1〜2XlO’個/dの細胞密度)に実施
例1で使用し友免疫原の代りにダアニジン処理したもの
食用いこれを培養液1dあた夛l−の割合で添加し、3
7℃、48時間培養した0培養後、培養液1mあたハ実
−例1で調製したEBウィルス上清液を加え感染、させ
た。感染後、5sco、下で3週間、静置培養した。
HBm 抗体産生細胞t−選択、−紬するために、実
施例1で使用した方法でセルロースと免疫原と會共有結
合せしめて、HBI 抗体産生細胞の吸着のための固定
化HBs 抗原を得た。以後、実施例1と同様の操作
によシHB畠 抗体継代培養細胞を得た。これを0.5
〜lXl0’個/dの初期細胞密層になるように培地中
でJB ’t@ シ、数日間培養1分堆し、この培養液
lOtからHBs 抗体の精製を行った。精製は、実施
?lJlと同様に行い、抗体価1,0OOXIO’のヒ
トに注射可能な)IBs 特異抗体濃縮r−グロブリン
溶液20mを得た。
施例1で使用した方法でセルロースと免疫原と會共有結
合せしめて、HBI 抗体産生細胞の吸着のための固定
化HBs 抗原を得た。以後、実施例1と同様の操作
によシHB畠 抗体継代培養細胞を得た。これを0.5
〜lXl0’個/dの初期細胞密層になるように培地中
でJB ’t@ シ、数日間培養1分堆し、この培養液
lOtからHBs 抗体の精製を行った。精製は、実施
?lJlと同様に行い、抗体価1,0OOXIO’のヒ
トに注射可能な)IBs 特異抗体濃縮r−グロブリン
溶液20mを得た。
手続補正書(自発)
昭和56年12月23日
特許庁長官 殿
1、事件の表示
昭和56年 特許 願第170511号事件との関係
特許出願人 7、補正の対象 (1)願書を別紙の訂正願書の通り訂正する。
特許出願人 7、補正の対象 (1)願書を別紙の訂正願書の通り訂正する。
(2)明細書の発明の名称「モノクロールHBa抗体の
製造方法」全「モノクロナールHBs抗体の製造方尚に
訂正する。
製造方法」全「モノクロナールHBs抗体の製造方尚に
訂正する。
(3)明細書の特許請求の範囲全別紙の通り訂正する0
(4)明細書第2頁第6行、第2頁第8行、第4頁第1
6行、第5頁第1行、第5頁第12行、第12頁第6行
にそれぞれ「モノクロール」とある會それぞれ「モノク
ロナール」に訂正する。
6行、第5頁第1行、第5頁第12行、第12頁第6行
にそれぞれ「モノクロール」とある會それぞれ「モノク
ロナール」に訂正する。
(5)明細書第4頁m1行に「モノクロール」とあ′る
を「モノクロナール」に訂正する。
を「モノクロナール」に訂正する。
(91
2、特許請求の範囲
(1) ヒトBリンパ系細胞に免疫原を接触させ、抗
体産生を刺激しその後継代培養可能な増殖型に細胞を形
質転換し、モノクロナールヒト抗体t−製造する方法に
おいて、HBs抗原全尿素、グアニジンのような蛋白変
性剤の存在下に加熱したものt免疫原として用いること
によシヒ)Bリンパ細胞に対して該細胞による抗体産生
を刺激すること′ft%徴とする!Z!ロナーナーB塵
抗体の製造方法。
体産生を刺激しその後継代培養可能な増殖型に細胞を形
質転換し、モノクロナールヒト抗体t−製造する方法に
おいて、HBs抗原全尿素、グアニジンのような蛋白変
性剤の存在下に加熱したものt免疫原として用いること
によシヒ)Bリンパ細胞に対して該細胞による抗体産生
を刺激すること′ft%徴とする!Z!ロナーナーB塵
抗体の製造方法。
(2)抗体産生を刺激されたヒトBリンパ細胞に(i)
Epatein Barr、Virus k感作さ
せて形質転換tおこさせて増殖型の細胞劣なし、■ こ
の増殖型細胞からHBa抗体を産生する細胞を選別、濃
縮し、 ■ この選別、濃縮した細胞を生育培地で増殖させ、H
Ba抗体奪連続的に産生せしめ、次いで培地からHBs
抗体を回収することからなる特許請求の範囲第(1)項
記載のモノクロナールHBa抗体の製造、方法。
Epatein Barr、Virus k感作さ
せて形質転換tおこさせて増殖型の細胞劣なし、■ こ
の増殖型細胞からHBa抗体を産生する細胞を選別、濃
縮し、 ■ この選別、濃縮した細胞を生育培地で増殖させ、H
Ba抗体奪連続的に産生せしめ、次いで培地からHBs
抗体を回収することからなる特許請求の範囲第(1)項
記載のモノクロナールHBa抗体の製造、方法。
Claims (2)
- (1) ヒ)Bリンパ系細胞に免疫原を接触させ、抗
体産生を刺激しその後継代培養可能な増殖4ρ 型に細胞上形質転換、モノクロールヒト抗体を製造する
方法において、HBa抗IfAt−尿素、グアニジンの
ような蛋白変性剤の存在下に加熱したもの全免疫原とし
て用いることによりヒ)Bリンパ細胞に対して該細胞に
よる抗体産生を刺激すること管特徴とするモノクロール
HBs抗体の製造方法。 - (2) 抗体産生を刺激されたと)B9ンバ細胞にQ
Epstein Barr Virus f感作さ
せて形質転換をおこさせて増殖型の細胞となし、■ こ
の増殖型細胞からHBs抗体を産生ずる細胞を選別、濃
縮し、 ■ この選別、績縮した細胞を生育培地で増殖させ、H
Bss抗体を連続的に産生せしめ、次いで培地からHB
a抗体を回収することから表る特許請求の範囲第(1)
項記載のモノクロールヒト抗体の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP17051181A JPS5872526A (ja) | 1981-10-23 | 1981-10-23 | モノクロ−ルhbs抗体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP17051181A JPS5872526A (ja) | 1981-10-23 | 1981-10-23 | モノクロ−ルhbs抗体の製造方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5872526A true JPS5872526A (ja) | 1983-04-30 |
Family
ID=15906298
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP17051181A Pending JPS5872526A (ja) | 1981-10-23 | 1981-10-23 | モノクロ−ルhbs抗体の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5872526A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4883752A (en) * | 1984-10-26 | 1989-11-28 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Method for preparing monoclonal antibody to Hbsag |
KR20190032288A (ko) | 2017-06-29 | 2019-03-27 | 카와사키 주코교 카부시키 카이샤 | 철도차량용 기어형 유연축 커플링 및 그를 구비한 철도차량용 대차 |
-
1981
- 1981-10-23 JP JP17051181A patent/JPS5872526A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4883752A (en) * | 1984-10-26 | 1989-11-28 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Method for preparing monoclonal antibody to Hbsag |
KR20190032288A (ko) | 2017-06-29 | 2019-03-27 | 카와사키 주코교 카부시키 카이샤 | 철도차량용 기어형 유연축 커플링 및 그를 구비한 철도차량용 대차 |
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