JPS5871460A - Antigen for assaying estradiol-3-glucuronide and preparation thereof - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain an antibody-forming antigen which enables specific detection of estradiol-3-glucuronide (ED3G), by bonding bovine serum albumin to the position of C6 of the B ring of ED3G by a specified method. CONSTITUTION:An antigen of formulaI(wherein -NH-BSA is a bovine serum albumin residue, and G is glucuronyl of formula II), which is used for forming an antibody for assaying ED3G which serves as an indicator for foreknowing ovulation and for treating infertility, etc., is obtained by a method wherein a commercially available compound, shown by formula III, is used as a starting material, a glucuronyl group of formula IV is made to react with OH of C3 of the A ring, then = O of C6 of the B ring is replaced by =NOCH2COOH, next bovine serum albumin is made to react therewith, and hydrolysis is effected thereon. The antigen thus obtained is injected under the skin of a rabbit, and thereby an antibody is formed. By using an antiserum thus obtained from the rabbit, ED3G in the humor of a patient can be detected specifically and accurately.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はエストラジオール−３−グルクロナイドの免疫
学的測定用抗原およびその製造法に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to an antigen for immunological measurement of estradiol-3-glucuronide and a method for producing the same.

さらに詳しくは、エストラジオール−３−グルクロナイ
ドの特異抗血清を得るだめのハブテン蛋白結合抗原の新
規合成法に関する。More specifically, the present invention relates to a novel method for synthesizing a hubten protein-binding antigen to obtain a specific antiserum for estradiol-3-glucuronide.

エストラジオールはエストロゲンの一種であシ遊離型九
抱合型等が知られている。このうち遊離型は血中には存
在するが・尿中には通常出現せず１グルクロン酸抱合型
あるいは硫酸抱合型として排せつされる。なかでもグル
クロン酸抱合型については一近時１その生理的意義が注
目されるようになり１臨床病理的には為血中および尿中
のエストラジオール−３−グルクロナイドとエストラジ
オール−１７−グルクロナイドを分画測定することによ
リ１***の予知、不妊症の薬物療法の指標に役立つこと
が指適されている。Estradiol is a type of estrogen, and free forms, nine-conjugated forms, etc. are known. Although the free form exists in the blood, it does not normally appear in the urine and is excreted as the 1-glucuronide-conjugated or sulfate-conjugated form. Among these, the glucuronide-conjugated type has recently attracted attention for its physiological significance.1 Clinically and pathologically, estradiol-3-glucuronide and estradiol-17-glucuronide in blood and urine have been fractionated. It has been suggested that measurement of this protein can be useful in predicting ovulation and as an indicator for drug therapy for infertility.

従来鳥体液中のエストラジオールは結合型エストラジオ
ールを加水分解して１遊離型としだ後１抽出後１コーバ
ー反応を利用した比色法為または蛍光法あるいは免疫測
定法等を組合せて測定されてきた。しかし々がら氷解操
作を必要とするこれらの測定法は、操作が煩雑であシ１
総エストラジオール量から遊離エストラジオール量を差
引くことによって、抱合型と蛋白結合型の総量と遊離エ
ストラジオールの比率を測定することは可能であるが１
グルクロン酸抱合型であるエストラジオール−３−グル
クロナイドとエストラジオール−１７−グルクロナイド
の分画測定はほとんど不可能てあった。Conventionally, estradiol in bird body fluids has been measured by a combination of a colorimetric method using a Kober reaction, a fluorescence method, or an immunoassay method after hydrolyzing bound estradiol to obtain a free form, followed by extraction. However, these measurement methods, which require ice-thawing operations, are complicated and difficult to operate.
By subtracting the amount of free estradiol from the total amount of estradiol, it is possible to measure the ratio of the total amount of conjugated and protein-bound estradiol to free estradiol.
It has been almost impossible to measure the fractionation of glucuronidated estradiol-3-glucuronide and estradiol-17-glucuronide.

本発明は体液中のエストラジオール−３−グルクロナイ
ドを免疫学的に測定する時に必要となる特　−異抗体を
作製するためのハプテン−蛋白結合抗原の新規な合成法
に関するものであり為該抗原を用いて作製された抗体を
使用することによ９１体液中のエストラジオール−３−
グルクロナイドを検体中に共存する類似物質の影響を受
けることなく特異的に測定することが可能となる。The present invention relates to a novel method for synthesizing a hapten-protein-bound antigen for producing a specific antibody necessary for immunologically measuring estradiol-3-glucuronide in body fluids, and therefore uses the antigen. Estradiol-3-3-
It becomes possible to specifically measure glucuronide without being affected by similar substances coexisting in the sample.

近時１体液中のホルモンの測定法として賞月されている
ラジオイムノアッセイは放射性核種で標識したホルモン
と該ホルモンに対する抗体の結合比が反応液中に加えら
れた抗原、すなわちＡ非標識ホルモンの量によって変化
することを利用した方法であり一感度が高く為多数検体
の測定が可能であることから）臨床検査に適した方法と
なっている。しかしながら１その特異性に関しては議論
の多いところである。すなわち１一般に体液中には測定
対象物質と類似の構造を有する物質が多数共存している
ので）測定に用いる抗体は測定対象物質とのみ反応する
もの、即ち特異性が高く）交叉反応性の低いものが要求
される。測定対象物質との結合定数が犬で為かつ１特異
性の高い抗体が用意されれば該対象物質を測定するため
のラジオイムノアッセイは、はぼ確立したことになる。Radioimmunoassay, which has recently been praised as a method for measuring hormones in body fluids, is based on the binding ratio of a hormone labeled with a radionuclide to an antibody against the hormone. This method is suitable for clinical testing because it is highly sensitive and can measure a large number of samples. However, there is much debate regarding its specificity. In other words, (1) in general, many substances with similar structures to the substance to be measured coexist in body fluids), so the antibodies used for measurement are those that react only with the substance to be measured, i.e., have high specificity) and have low cross-reactivity. things are required. If an antibody with a high binding constant for a substance to be measured and a high monospecificity is prepared, a radioimmunoassay for measuring the substance to be measured will be almost established.

前述の如く１体液中のエストラジオールを従来法で測定
する場合１一般的には氷解操作が必要になるがラジオイ
ムノアッセイにおいては、エストラジオールグルクロナ
イドと特異的に結合する抗体が用意されれば）水解操作
が不要となり為特異的Ａかつ）高感度な測定が可能とな
るので、今日ではエストラジオールグルクロナイドに限
らす１各種のステロイドホルモンの抱合体を水解せずに
免疫学的に測定するだめの特異抗体の製造法、　Ｉｌｌ
ち１特異抗体を製造するための抗原として、どのような
物質を使用すればよいかという点に免疫学的な測定法を
確立するだめの研究力！進められている。　　　− その一つの例として１エストロゲン−３−グルクロナイ
ドのカルボキシル基にＢＳＡを結合させた島いわゆるハ
プテン−蛋白結合抗原が合成され１該抗原を用いて作製
された抗体を用いて為エストロゲン−３−グルクロナイ
ドを測定する方法が報告されているが）該抗体は特異性
が低く１遊離エストロゲンおよびエストロゲン−１６−
グルクロナイド等に対して）交叉反応性を示すので為満
足出来る結果を与えていない。（Ｐ、−匹ｊｅｅｍ　ｅ
ｔ　ａｌ　：ＢｉｏｃｈＭｃＥＬＬＪπｍ１１５１　、
３６９〜３７６　、１９７５年）また１カルボキシフエ
ニルアゾエストリオール−１６−グルクロナイドのＣ９
位、またはＣ６位にカーポジイミド法を用いてＢＳＡを
結合させた九ノーブテンー蛋白結合抗原の場合為該抗原
を用いて作製された抗体は１遊離エストロゲンに対し為
２・２％以下という比較的低い交叉反応性を示し１改−
良された特異性を示したが１なお不充分であり１この不
充分な特異性はベンゾイル基にＢＳＡを結合させる際に
＼同時にグルクロン酸部分のカルボン酸にもＢＳＡが結
合するためであると推定されテイル。（Ｊ、ＲｏＳｏａ
ｒｅｓ　　ｅｔ　ａｌ　：　ＦＥＢＳ　Ｉｐｔｔ、　６
１．２６３〜２６６．１９７６年） また１エストロンサルフエートのＱ、位ニＢＳＡを結合
させる方法（、Ｔ　、　Ｋｉｍｋａｒａ　ｅｔ　ａｌ　
：　Ｊ　、　５ｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｆ９．１３　、
１０７５　、１９８０年）、ニストロケンＤ環グルクロ
ナイドのＣ，Ｎまたは０４位にＢＳＡを結合させる方法
（Ｔ、動曲ヱｅｔ　牡：Ｊ、Ｓ彷ｍ足Ｂｉｏｃｈｅｏ＋
、　９　、７８５　、１９７８年）の場合１ノ飄ブテン
−蛋白結合抗原を用いて作製された抗体は、いずれもハ
ブテンに対して１高い特′異性を示すことからＡノ・ブ
テンとＢＳＡの結合部位力１ら離れているハブテン分子
の一部分が抗原性決定部位と力っていること一抗体の特
異性は該抗原性決定部位に向けられることが理解される
。As mentioned above, when measuring estradiol in a body fluid using the conventional method 1, ice thawing is generally required, but in radioimmunoassay, if an antibody that specifically binds to estradiol glucuronide is prepared, water lysis is necessary Since no manipulation is required and a highly sensitive measurement is possible, it is now possible to immunologically measure conjugates of various steroid hormones, limited to estradiol glucuronide, without hydrolysis. Method for producing specific antibodies, Ill
In order to determine what kind of substance should be used as an antigen to produce a 1-specific antibody, it is necessary to establish an immunological measurement method! It is progressing. - As an example, a so-called hapten-protein binding antigen is synthesized by binding BSA to the carboxyl group of estrogen-3-glucuronide. However, the specificity of this antibody is low and it is difficult to detect free estrogen and estrogen-16-
Because it shows cross-reactivity (to glucuronides, etc.), it has not given satisfactory results. (P, -jeem e
tal: BiochMcELLJπm1151,
369-376, 1975) and C9 of 1-carboxyphenylazoestriol-16-glucuronide.
In the case of a nine-norbutene protein-bound antigen in which BSA is bound to the C6 position or the C6 position using the carposiimide method, the antibody produced using this antigen has a relatively low ratio of less than 2.2% to 1 free estrogen. 1 change showing cross-reactivity
Although the specificity was improved, it was still insufficient.1 This insufficient specificity is thought to be due to the fact that when BSA is bound to the benzoyl group, BSA also binds to the carboxylic acid of the glucuronic acid moiety at the same time. Estimated tail. (J, RoSoa
res et al: FEBS Iptt, 6
1.263-266.1976) Also, a method for binding 1-estron sulfate to Q, 2-BSA (T, Kimkara et al.
: J, 5teroidBiochf9.13,
1075, 1980), a method for binding BSA to the C, N or 04 positions of Nistroken D-ring glucuronide (T, Motion Et Male: J, S Mitsubishi Biocheo+
, 9, 785, 1978), the antibodies produced using the butene-protein binding antigen all showed high specificity for habuten, indicating that the binding of butene to BSA was It is understood that the specificity of the antibody is directed toward the antigenicity-determining site because a portion of the habten molecule that is remote from the site is associated with the antigenicity-determining site.

このことはエストロゲン−３−グルクロナイドの場合、
Ａ環０８位に近隣するＣ７、あるいはＣ２位に担体蛋白
を結合させた抗原よシも、Ｂ２Ｏ２位に担体蛋白も結合
させた抗原の方がＡ環の構造を良好に認識する抗体を産
生させる上で有利でちることを示している。This means that in the case of estrogen-3-glucuronide,
Antigens that have a carrier protein bound to the C7 or C2 position near the A-ring position 08 produce antibodies that better recognize the structure of the A-ring than antigens that also have a carrier protein bound to the B2O2 position. It shows that the above is advantageous.

しかしながら、目下のところ）エストラジオール−３−
グルクロナイドの０６位にＢＡＡを結合させることによ
り、エストラジオール−３−グルクロナイドに対する特
異抗血清を得るだめのノ・ブテン−蛋白結合抗原の合成
法についての報告はない。However, currently) estradiol-3-
There has been no report on a method for synthesizing a butene-protein-bound antigen to obtain a specific antiserum against estradiol-3-glucuronide by binding BAA to position 06 of the glucuronide.

このような観点からへ本発明者１ｂエストラジオール−
３−グルクロナイドを免疫学的に測定する時に使用出来
る特異性の高い抗体を作製することを目的として九ノ・
ブテン−Ｂ、８Ａ結合体を鋭意検索した結果１本発明を
完成するに至ったものである。From this point of view, the present inventor 1b estradiol-
Kuno.
As a result of intensive searches for butene-B, 8A conjugates, the present invention has been completed.

本発明は、エストラジオール−３−ゲルクロナイドのＡ
環グルクロン酸部位にＢＳＡが結合しないよう≠にしな
がらステロイド骨格Ｂ環のＣ６位にＢＳＡを結合させた
ハプテン−ＢＳＡ結合体の合成法に関する。The present invention provides A of estradiol-3-gelcuronide.
This invention relates to a method for synthesizing a hapten-BSA conjugate in which BSA is bound to the C6 position of the B ring of the steroid skeleton while ensuring that BSA does not bind to the ring glucuronic acid site.

本発明に基づいて合成された特許請求の範囲第１項に記
載されている物質）すなわち為６−オキツエストラジオ
ールー３−グルクロナイド−６−（０−カルボキシメチ
ル）オキシム−ＢＳＡ結合体を用いて作製された抗体は
、すでに公知の方法で得られたエストラジオール−３−
グルクロナイド−ＢＳＡ結合体を用いて作製された抗体
に比較してＡステロイドのＡ環構造の認識性が特に優れ
ておシ１特異性においても、さらに向上することが明り
ょうとなり１本発明を完成するに至った。The substance described in claim 1 synthesized based on the present invention), that is, 6-oxestradiol-3-glucuronide-6-(0-carboxymethyl)oxime-BSA conjugate. The obtained antibody was obtained using estradiol-3-3, which was obtained by a known method.
It has become clear that the recognition of the A-ring structure of A-steroid is particularly superior to antibodies prepared using glucuronide-BSA conjugates, and the specificity is further improved, thus completing the present invention. I ended up doing it.

本発明に基づいて作製された抗体はエストラジオール−
３−グルクロナイドのラジオイムノアッセイ用として特
に好適であるが１ラジオイムノアツセイに限らず１羊赤
血球またはポリスチレンラテックス粒子を担体とする凝
集反応および凝集阻止反応に用いることも可能である。Antibodies produced based on the present invention are estradiol-
Although it is particularly suitable for radioimmunoassay of 3-glucuronide, it can also be used not only for 1-radioimmunoassay but also for agglutination reactions and agglutination inhibition reactions using 1-sheep red blood cells or polystyrene latex particles as carriers.

本発明は１特許請求の範囲第２項イ）〜二）に記載した
工程に基づいて６−オキソエストラジオール−３−グル
クロナイド−６−（〇−カルボキシメチル）オキシム−
ＢＳＡ結合体を合成する方法に関するものであるが）本
発明のさらに加わった特徴の一つとしてニスドラジオー
ル−３−グルクロナイドのグルクロン酸部分の保護基を
合成工程の最終段階九すなわち１特許請求の範囲第２項
二）に記載した工程において脱離させることにある。The present invention provides 6-oxoestradiol-3-glucuronide-6-(〇-carboxymethyl)oxime-
One of the additional features of the present invention is that the protecting group of the glucuronic acid moiety of nisdradiol-3-glucuronide is added to the protective group in the final stage of the synthesis process, i.e., in claim 1. The objective is to eliminate the compound in the step described in item 2, item 2).

本発明に基づくエストラジオール−３−グルクロナイド
測定用の抗原として用いられる新規ステロイド化合物は
為化学構造式 で示される６−オキツユスト２ジオールー３−グルクロ
ナイド−６−（０−カルボキシメチル）オキシム−ＢＳ
Ａ結合体である。The novel steroid compound used as an antigen for measuring estradiol-3-glucuronide according to the present invention is represented by the chemical structural formula 6-oxysuto-2-3-glucuronide-6-(0-carboxymethyl)oxime-BS.
It is an A-conjugate.

本発明に基づく新規ステロイド化合物は、下記の構成）
すなわち１ で示される６−オキソエストラジオール−１フ〜アセテ
ートをメチル（２，３，４−）リーＯ−アセチルー１α
−プロモー１−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド）ウロ
ネートと反応させ１６−オキソエストラジオール−１フ
ーアセテート−３−グルクロナイド−トリアセテートメ
チルエステル（ｍ）とする工程１ で示される６−オキソエストラジオー／Ｉ／−１７−ア
セテート−３−グルクロナイド−トリアセテートメチル
エステルを酢酸ナトリウムの存在下１ｏ−カルボキシメ
チルヒドロキシルアミン塩酸塩と反応させ６−オキソエ
ストラジオール−１フーアセテート−３−グルクロナイ
ド−トリアセテートメチルエステル−６−（０−カルボ
キシメチル）オキシム（■）とする工程ＡＮ　ＯＣＨ，
ＣＯＯＨ で示される６−オキンエストラジオー＃−１７−アセテ
ート−３−グルクロナイド−トリアセテートメチルエス
テル−６−（０−力ルボキシメチル）オキシムをＢＳＡ
と反応させ６−オキソエストラジオール−１フーアセテ
ート−３−グルクロナイド−トリアセテートメチルエス
テル−Ｌ−（０−カルボキシメチル）オキシム−ＢＳＡ
結合体（Ｖ）　　とする工程１ で示される６−オキソエストラ１ジオール−１７−アセ
テート−３−グルクロナイド−トリアセテートメチルエ
ステル−６−（〇−カルボキシメチル）オキシム−ＢＳ
Ａ　結合体（Ｖ）を部分的に加水分解する工程１以上の
イ）Ａ口）、ハ）に）の各工程を組合せることによって
製造されるものである。The novel steroid compound based on the present invention has the following structure)
That is, 6-oxoestradiol-1-acetate represented by 1 is converted into methyl(2,3,4-)-O-acetyl-1α
-Promo 1-deoxy-D-glucopyranoside) uronate to give 16-oxoestradiol-1-acetate-3-glucuronide-triacetate methyl ester (m) Step 1 6-oxoestradiol/I/-17 shown in Step 1 -acetate-3-glucuronide-triacetate methyl ester is reacted with 1o-carboxymethylhydroxylamine hydrochloride in the presence of sodium acetate to 6-oxoestradiol-1-fuacetate-3-glucuronide-triacetate methyl ester-6-(0-carboxy methyl) oxime (■) process AN OCH,
BSA
6-oxoestradiol-1-fuacetate-3-glucuronide-triacetate methyl ester-L-(0-carboxymethyl)oxime-BSA
Conjugate (V) 6-oxoestral diol-17-acetate-3-glucuronide-triacetate methyl ester-6-(〇-carboxymethyl)oxime-BS shown in Step 1
A It is produced by combining each step of step 1 or above of partially hydrolyzing the conjugate (V), step A) and step C).

次に本発明の実施例を示す。Next, examples of the present invention will be shown.

実施例１゜ 化学構造式（ｎ）で示される市販の化合物、　６−オキ
ソエストラジオール−１フーア・化テート５００■をト
ルエン５＋＋Ｉｌに溶解し）炭酸カドミウム６００■を
加え１ケタール化装置にて脱水後１メチル（Ｌ　３＃４
−トリー〇−アセチルー１α−プロモー１−デオキシ−
Ｄ−グルコピラノシド）ウロネート１ｇを力ｐえて７２
時間還流する。次に反応液をろ過して）触媒をろ去し１
ろ液を濃縮後１シリカゲルカラムクロマトグラフイーに
付し）ベンゼン／酢酸エチル（４：１）溶出画分を濃縮
後−アセトンにより再結晶すると化合物（Ｉｎ）１３Ｑ
■が得られる。Example 1 A commercially available compound represented by the chemical structural formula (n), 6-oxoestradiol-1-Fur tate (500 μm) was dissolved in toluene (5++ Il), 600 μm of cadmium carbonate was added thereto, and the mixture was dehydrated using a 1-ketalizer. 1 methyl (L 3#4
-tri〇-acetyl-1α-promo-1-deoxy-
D-glucopyranoside) 72 by adding 1 g of uronate
Reflux for an hour. Next, filter the reaction solution) to remove the catalyst.
After concentrating the filtrate, it was subjected to silica gel column chromatography (1) and the fraction eluted with benzene/ethyl acetate (4:1) was concentrated and then recrystallized from acetone to give compound (In) 13Q.
■ is obtained.

化合物（ｍ）の分析値 ｍ−Ｐ、　　　１８９＠〜１９０′″ ［α］　　　−１８，５°　（Ｃ＝０．１０　、　ＣＨ
Ｃｂ）元素分析値 Ｃ：　６０．６９　、　Ｈ：　６．１９化学式Ｃ８８Ｈ
４Ｇ０１＠・十Ｈ，Ｏに対する計算値Ｃ：　　６０．６
４　　、Ｈ：　　６．３２ＨＭＲ（ＣＤＱｓ） ０．８４　　　　（３Ｈ，ｓ、ｌ８−ＣＨ，）２．０７
　　　　　（１２Ｈ，ｓ、１７　β−，２’−，３’−
，４’−０ＣＯＣＨ，）３、７４　　　（３Ｈ，ｓ、　
Ｃ００Ｃ鳥）４．０２　　　（ＩＨ，ｍ、５−Ｈ） ４．７２　　　（ＩＨ，ｍ、１７ａ−Ｈ）５．３０　　
　　　（４Ｈ，ｍ、１’−，２’−，３’−，４’−Ｈ
）７．２０　　　（ＩＨ，’ｂｒｓ、４−Ｈ）７．２５
　　　（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ＝＝８，２七、　２−Ｈ）７
．６０　　　（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝＝８七、　１−Ｈ）化合
物（１１７）６２ｍｇをメタノール／酢酸エチル（５：
２）１４＋ｎ／！に溶解し、次に〇−カルボキシメチル
ヒドロキシルアミン塩酸塩１５３■と１０９６酢酸ナト
リウム１．５ｍＪを加え、３５℃で１２時間攪拌後）水
を加え、酢酸エチルで抽出する。有機層を水洗）乾燥後
１溶媒を留去する。残渣をエーテルよシ再結晶すると化
合物（■）５１■が得られる。Analytical value m-P of compound (m), 189@~190'' [α] -18,5° (C=0.10, CH
Cb) Elemental analysis value C: 60.69, H: 6.19 Chemical formula C88H
Calculated value C for 4G01@・10H,O: 60.6
4, H: 6.32HMR(CDQs) 0.84 (3H,s,l8-CH,)2.07
(12H,s, 17 β-,2'-,3'-
,4'-0COCH,)3,74 (3H,s,
C00C bird) 4.02 (IH, m, 5-H) 4.72 (IH, m, 17a-H) 5.30
(4H, m, 1'-, 2'-, 3'-, 4'-H
)7.20 (IH,'brs,4-H)7.25
(IH, dd, J==8,27, 2-H)7
．． 60 (IH, d, J==87, 1-H) 62 mg of compound (117) was mixed with methanol/ethyl acetate (5:
2) 14+n/! Then, 153 μl of 0-carboxymethylhydroxylamine hydrochloride and 1.5 mJ of 1096 sodium acetate were added, and after stirring at 35° C. for 12 hours, water was added and extracted with ethyl acetate. After washing the organic layer with water and drying, one solvent was distilled off. The residue is recrystallized from ether to obtain compound (■) 51■.

化合物（ＩＶ）の分析値 ｍ、ｐ、　　１８５〜１８８” ｔ。Analysis value of compound (IV) m, p, 185-188" t.

〔α〕ゎ　＋６４．３　　（Ｃ：０．１１　、　Ｃ鳥Ｏ
Ｈ）元素分析値 Ｃ：　５６，９１　、　Ｈ：　５．９７　、　Ｎ　：　
１．８１化学式Ｃ■Ｈ４，０ＩｓＮ−Ｈ１ｏに対する計
算値Ｃ、５７，１４、Ｈ：’６．１６　、　Ｎ　：　１
．９ＣＨＭＲ（ＣＤ、ＯＤ　／ＣＤＣｌ５） ０、８４　　　（３Ｈ，ｓ、　１８−ＣＭ、　）２．０
６　　　　　（６Ｈ，ａ、１７−．２’−，３’−，４
’−０ＣＯＣＲ，）２、０８　　　　（６Ｈ，ｓ、１７
−．２’−，３’−，４’−０ＣＯＣＲ，）３、７４　
　　（３Ｈ，ｓ、　Ｃ００ＣＨ，）４．６９　　　（２
Ｈ，ａ、’＝ＮＯＣＨ，−）６．９８　　　（ＩＨ，ｄ
、Ｊ＝９．２七、　２−Ｈ）７．１６　　　（ＩＥ、ｄ
、、Ｔ：２七、　４−Ｉ（）７．５４　　　（ＩＨ，ｄ
、Ｊ：２七、４−Ｈ）化合物（■）４８■をジメチルポ
ルムアミド（以下ＤＭＦと略称す）１．５＋ｎ／に溶解
し）水冷下１　トリーｎ−フチｆｉｖ７　ミ７５０μお
よびインブチルクロロフォルメート１３黒を加え１３０
分後、ＢＳＡ　１２３■を含有する含水ＤＭＦアルカリ
溶液（Ｈｇｏ　／ＤＭＦ　／ＩＮ　ｋＯＨ＝３　ｍｌ　
７２．２　ｍｌ　／　０．１　ｍｌ）を加えｐＨ７，０
〜７．５に調整後、室温で１２時間攪拌する。反応液を
冷水で２４時間透析後〜凍結乾燥に付しへ化合物（Ｖ）
　１６６■を得た。[α]ゎ +64.3 (C: 0.11, C bird O
H) Elemental analysis values C: 56,91, H: 5.97, N:
1.81 Chemical formula C■ Calculated value for H4,0IsN-H1o C, 57,14, H: '6.16, N: 1
．． 9CHMR (CD, OD / CDCl5) 0, 84 (3H, s, 18-CM, ) 2.0
6 (6H, a, 17-.2'-, 3'-, 4
'-0COCR,)2,08 (6H,s,17
−． 2'-, 3'-, 4'-0COCR,)3, 74
(3H,s, C00CH,)4.69 (2
H,a,'=NOCH,-)6.98 (IH,d
, J=9.27, 2-H)7.16 (IE, d
,,T:27, 4-I()7.54 (IH,d
, J: 27, 4-H) Compound (■) 48■ was dissolved in dimethylpolamide (hereinafter abbreviated as DMF) 1.5+n/) under water cooling. Add mate 13 black to 130
After a few minutes, add aqueous DMF alkaline solution containing 123μ of BSA (Hgo /DMF /IN kOH=3 ml
72.2 ml / 0.1 ml) to pH 7.0.
After adjusting to ~7.5, stir at room temperature for 12 hours. After dialysis of the reaction solution with cold water for 24 hours, the compound (V) was subjected to lyophilization.
Obtained 166 ■.

化合物（■）１６５ｍｇを水５０ｍ１に溶解後、　５Ｎ
Ｎａ　ＯＨを用いてｐＨ１２，０〜１２．５に調整し１
室温で４８時間攪拌後、冷水で２４時間透析する。次い
で凍結乾燥に付し１化合物（，１）１３１■を得た。After dissolving 165 mg of compound (■) in 50 ml of water, 5N
Adjust the pH to 12.0-12.5 using NaOH.
After stirring at room temperature for 48 hours, it is dialyzed against cold water for 24 hours. The product was then freeze-dried to obtain 1 compound (,1) in an amount of 131 cm.

化合物（Ｉ）、即ち６−オキソエストラジオール−３−
グルクロナイド−６−（０−カルボキシメチル）オキシ
ム−ＢＳＡ結合体のＢＳＡ　１モル当シのノ・ブテン結
合−ｖ−／ｌ／数をＵＶ法にょシ求めたところ１３．０
モルであった。Compound (I), namely 6-oxoestradiol-3-
The number of butene bonds per mole of BSA in the glucuronide-6-(0-carboxymethyl)oxime-BSA conjugate was determined by UV method and was 13.0.
It was a mole.

実施例２゜ 抗体の作成（ウサギの免疫） 体重２．５〜３−０ｋｇの在来種白色ウサギ３羽に６−
オキソエストラジオール−３−グルクロナイド−６−（
０−カルボキシメチル）オキシム−ＢＳＡ結合体抗原を
以下の如く免疫した。Example 2 Preparation of antibodies (rabbit immunization) 6-
Oxoestradiol-3-glucuronide-6-(
0-carboxymethyl)oxime-BSA conjugate antigen was immunized as follows.

即ち〜抗原２■を滅菌生理食塩液０．５ｍｌに溶解させ
１これをフロイント・コンプリート・アジュバント０．
５コにてエマルジョンにし１このエマルジョンをウサギ
の肩甲部および足２１Ｌ数ケ所に皮下投与した。以後２
ケ月に渡って２週間毎に同様の投与を行った。最後の投
与（第５回目の投与）から１週間後に島このウサギの耳
静脈から１０ｍ１を採血し為これを３０００回転１１０
分間の遠心分離にかけ、得られた抗血清を一２０℃に保
存した。That is, ~2 antigens were dissolved in 0.5 ml of sterile physiological saline, and 1 was mixed with 0.5 mL of Freund's Complete Adjuvant.
An emulsion was prepared in 5 cases, and the emulsion was subcutaneously administered to several places on the shoulder blade and leg 21L of rabbits. From now on 2
Similar doses were given every two weeks for several months. One week after the last administration (fifth administration), 10ml of blood was collected from the ear vein of the rabbit and rotated at 3000 rpm at 110 rpm.
After centrifugation for 1 minute, the resulting antiserum was stored at -20°C.

使用時においては１該抗血清を解凍し、ＢＳＡｏ。Before use, 1. Thaw the antiserum and add BSAo.

０６’％、牛−ｒ−ｆ　０７　！Ｊ　７０．　ｏｓ　％
　ヲ含ｔｒＯ−０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０）を用
いてｌ：３０００の希釈率で希釈し１標準曲線を作成し
た。06'%, cow-r-f 07! J70. os%
A standard curve was prepared by diluting the sample at a dilution rate of 1:3000 using trO-05M borate buffer (pH 8.0).

測定操作 エストラジオール−３−グルクロナイドを含む試料にエ
ストラジオール−３−グルクロナイド−６，７−Ｈ（約
７５００　ｄｐｍ　）および抗血清０．２５−を添加し
、４℃で１時間装置する。次いで５０％硫安溶液０．２
５　ｍｌを添加し、４℃に２０分間放置後、　３０００
回転で１５分間遠心し）得られた上澄液０．２ｍｌをと
多−放射活性を計測する。Measurement procedure Estradiol-3-glucuronide-6,7-H (approximately 7500 dpm) and antiserum 0.25-H are added to a sample containing estradiol-3-glucuronide, and the apparatus is incubated at 4°C for 1 hour. Then 50% ammonium sulfate solution 0.2
After adding 5 ml and leaving it at 4℃ for 20 minutes,
Centrifuge for 15 minutes) 0.2 ml of the supernatant obtained is measured for polyradioactivity.

交叉反応性について ６−オキソエストラジオール−３−グルクビナイド−６
−（０−カルボキシメチル）オキシム−ＢＳＡ結合体で
免疫したウサギから得られた前述の抗血清の特異性を調
べるために３２種のステロイドを用、いて〜その交叉反
応性をエストラジオール−３−グルクロナイド−６，７
−Ｈの本抗血清への結合量を標準曲線より求めた結果を
第１表に示す。Regarding cross-reactivity 6-oxoestradiol-3-glucubinide-6
To investigate the specificity of the aforementioned antiserum obtained from rabbits immunized with -(0-carboxymethyl)oxime-BSA conjugate, we used 32 steroids and determined its cross-reactivity with estradiol-3-glucuronide. -6,7
Table 1 shows the results of determining the binding amount of -H to this antiserum using the standard curve.

第１表の交叉反応の欄における数値は１非標識エストラ
ジオール−３−グルクロナイドの５０９６阻止量を１０
０とし為これに対する各種ステロイドの読みの比率の逆
数を百分率で表示したものである。The values in the cross-reaction column of Table 1 are the amount of inhibition of 5096 of unlabeled estradiol-3-glucuronide by 10
The reciprocal of the ratio of the reading of various steroids to this value is expressed as a percentage.

第１　表：　抗エストラジオールー３−グルクロナイド
血清と特定ステロイ第１表の結果よシ１本発明の新規化
合物を利用した抗原による抗体を使用したもののエスト
ラジオール−３−グルクロナイドに対する特異性が１他
ののものに比較して１極めて高く）交叉反応が低く抑え
られていることが明シようである。Table 1: Anti-estradiol-3-glucuronide serum and specific steroids The results of Table 1 show that the specificity for estradiol-3-glucuronide using the antigen-based antibody using the novel compound of the present invention is 1. It is clear that the cross-reactions (which are extremely high compared to those of the conventional method) are suppressed to a low level.

特許出願人 栄研化学株式会社 手枕補正書（自発） 昭和５６年１１月１ｒ７日 特許庁長官　島１）要衝　殿 １、事件の表示 昭和５６年特許出願第１６８８３４号 ２、発明の名称 ソクテイヨウコウ エストラジオール３　グルクロナイド測定用抗３、補正
をする者 事件との関係　本人 ４、補正の対象 明細書中「発明の詳細な説明」の欄 り、」正の内容 明細書第２０貞１１行目の［Ｂｉめ−ｍｌＪ億ｍｌ・・
・」を「Ｂ１ｏＣ１述、Ｊ、・・・」と補正する。Patent Applicant Eiken Kagaku Co., Ltd. Temakura Amendment (voluntary) November 1r7, 1981 Commissioner of the Japan Patent Office Shima 1) Key Points 1, Indication of the incident 1982 Patent Application No. 168834 2, Name of the invention Sokutei Yokou Estradiol 3 Glucuronide measuring tube 3, Person making the amendment Relationship with the case Principal 4, ``Detailed description of the invention'' column in the specification subject to amendment, ``Correct contents, line 11 of the 20th page of the specification'' [ Bi-mlJ billion ml...
・” is corrected to “B1oC1 mentioned, J, . . .”.

（２）　　明細書簡１１頁９行目の「・・・１０７５　
、　　・、・」を「・、・１０７５〜１０７９　、・・
・」と補正する。(2) “...1075” on page 11, line 9 of the detailed letter
, ・,・” to “・,・1075~1079 ,・
・” is corrected.

（３）　　明細書簡１１頁１２行目の「・・・７８５．
１９７８年）・・・」を「・・・７８５〜７９０．１９
・・・」と補正する。(3) On page 11, line 12 of the detailed letter, “...785.
1978)..." to "...785-790.19
"..." I corrected myself.

（４）　　明細書第１９頁７行目ノ「・・・（ＩＨ２ｍ
。(4) Page 19, line 7 of the specification “...(IH2m
.

５−１（）Ｊを［−−−（ＩＨ，ｍ、　５’−Ｈ）　ｊ
と補正する。5-1()J [---(IH, m, 5'-H) j
and correct it.

（５）　　明細書第１９頁１０行目の「・・・　（ＩＨ
２ｈｒｓ、４−Ｈ）ｊを［・・・（ＩＨ１旨ｓ、４−Ｈ
）Ｊと補正する。(5) “... (IH
2hrs, 4-H) j [...(IH1 effect, 4-H
) Correct as J.

（６）　　明細書画２０頁１行目の「・・・を留去する
。桟道をエーテル・・・」を［・・・を留去ム／メタノ
ール／水：８０　／２０　／２．５　）に付後、残置を
エーテル・・・」と補正する。(6) In the 1st line of page 20 of the specification, "... is distilled off. The road is ether..." is changed to [... is distilled off / methanol / water: 80 / 20 / 2.5] After attaching, the remainder is ether...'' and amended.

（７）　　明細書第２０貞１２行目と１３行目の１２．
０６　　　（６Ｈ，ｓ、　１７−、２’−、３’＋、　
４’−０ＣＯＣＨｓ）２．０８　　　（６Ｈ，ｓ、１７
−．２’−，３’−，４’−０ＣＯＣＲ，）Ｊ（８）　
　明細書第２０貞１６行目の［・・・　（ＩＨ，ｄ。(7) 12. of the 20th line of the specification, lines 12 and 13.
06 (6H,s, 17-, 2'-, 3'+,
4'-0COCHs) 2.08 (6H,s, 17
−． 2'-, 3'-, 4'-0COCR,)J (8)
[... (IH, d.

Ｊ＝９，２七ｊ　２−Ｈ’）　ｊを「・・・（ＩＨ，ｄ
ｄ、　、Ｔ　：９．２七、２−Ｈ）、ｊと補正する。J=9,27j 2-H') j as ``...(IH, d
d, ,T:9.27,2-H),j.

（９）　　明細書第２０貞１７行目の［・・・　（ＩＨ
，ｄ。(9) [... (IH
,d.

Ｊ＝２進、４−Ｈ）ｊを［、・−、（ＩＨ，ｄ、、ｒ　
＝９七、１−Ｈ）ｊと補正する。J=binary, 4-H) j as [, ・-, (IH, d,, r
Correct as =97, 1-H)j.

以上that's all

Claims (1)

【特許請求の範囲】 で示される６−オキソエストラジオール−３−グルクロ
ナイド−６−（〇−カルボキシメチル）オキシム−ＥＳ
Ａ結合体（式中−ＮＨ−ＢＳＡは牛血清アルブミン残基
を表わ゛し１Ｇは ＣＯＯ−Ｊ で示されるグルクロニル基を表わす。以下同様）から成
るエストラジオール−３−グルクロナイド測定用抗原。 す で示される６−オキソエストラジオール−１フーアセテ
ート　（ｎ）をメチル（２，３，４−）ジ−０−アセチ
ル−１α−ブロモ−１−デオキシ−Ｄ−ゲルコピ２ノシ
ド）ウロネートと反応させ１６−オキソエストラジオー
ル−１フーアセテート−３−グルクロナイド−トリアセ
テートメチルエステル（ｍ）とする工程、（式中Ｇ′は − ＣＯＯＣＨ。 で示されるグルクロニル基を表わす。以下同様）で示さ
れる６−オキソエストラジオール−１フーアセテート−
３−グルクロナイド−トリアセテートメチルエステル（
■１）を酢酸ナトリウムの存在下、ｏ−力ルボキシメチ
ルヒドロキシルアミン塩酸塩と反応させ６−オキソエス
トラジオール−１フーアセテート　３−グルクロナイド
−トリアセテートメチルエステル−６−（０−カルボキ
シメチル）オキシム（■）とする工程− ハ）化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−１フーアセテ
ート−３−グルクロナイド−トリアセテートメチルエス
テル−６−（０−カルボキシメチル）オキシム（■）を
牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略称す）と反応させ６
−オキソエストラジオール−１フーアセテート−３−グ
ルクロナイド−トリアセテートメチルエステル−６−（
０−カルボキシメチル）オキシム−ＢＳＡ結合体（Ｖ）
とする工程に ）化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−１フーアセテ
ート−３−グルクロナイド−トリアセテートメチルエス
テル−６−（０−カルボキシメチル）オキシム−ＢＳＡ
結合体（Ｖ）を部分的に加水分解することをＮＯＣ鴇Ｃ
０ＮＨ−ＢＳＡ で示される６−オキソエストラジオール−３−グル、ク
ロナイド−６−（〇−カルボキシメチル）オキシム−Ｂ
ＳＡ結合体（Ｉ）の製造法。 （３）化学構造式 ％式％ で示される６−オキソエストラジオール−３−グルクロ
ナイド−６−（０−力ルボキシメチル）オキシム−ＢＳ
Ａ結合体（Ｉ）から成るエストラジオール−３−グルク
ロナイドの免疫学的測定に使用する抗体作製用抗原。[Scope of Claims] 6-oxoestradiol-3-glucuronide-6-(〇-carboxymethyl)oxime-ES represented by
An antigen for measuring estradiol-3-glucuronide comprising A conjugate (-NH-BSA represents a bovine serum albumin residue and 1G represents a glucuronyl group represented by COO-J; the same applies hereinafter). 6-oxoestradiol-1-fuacetate (n) shown above is reacted with methyl(2,3,4-)di-0-acetyl-1α-bromo-1-deoxy-D-gelcopi-2-noside) uronate 16 -Oxoestradiol-1-fuacetate-3-glucuronide-triacetate methyl ester (m), 6-oxoestradiol- (in the formula, G' represents a glucuronyl group represented by -COOCH. The same applies hereinafter) 1 Fu acetate-
3-Glucuronide-triacetate methyl ester (
(1) was reacted with o-carboxymethylhydroxylamine hydrochloride in the presence of sodium acetate to produce 6-oxoestradiol-1-acetate 3-glucuronide-triacetate methyl ester-6-(0-carboxymethyl)oxime (■ ) - c) Adding 6-oxoestradiol-1-acetate-3-glucuronide-triacetate methyl ester-6-(0-carboxymethyl)oxime (■) represented by the chemical structural formula to bovine serum albumin (hereinafter referred to as BSA). 6)
-Oxoestradiol-1-fuacetate-3-glucuronide-triacetate methyl ester-6-(
0-carboxymethyl)oxime-BSA conjugate (V)
6-oxoestradiol-1-acetate-3-glucuronide-triacetate methyl ester-6-(0-carboxymethyl)oxime-BSA shown by the chemical structural formula
Partially hydrolyzing the conjugate (V)
0NH-BSA 6-oxoestradiol-3-glu, chloride-6-(〇-carboxymethyl)oxime-B
Method for producing SA conjugate (I). (3) 6-oxoestradiol-3-glucuronide-6-(0-hydroxymethyl)oxime-BS represented by the chemical structural formula % formula %
Antigen for antibody production used in immunoassay of estradiol-3-glucuronide consisting of A-conjugate (I).