KR930000056B1

KR930000056B1 - Immunoassay for estriol-3-sulfate

Info

Publication number: KR930000056B1
Application number: KR1019920016406A
Authority: KR
Inventors: 아끼꼬 구보데라; 도우이찌 다나까
Original assignee: 니홍메디피직스 가부시끼가이샤; 야마오까 세이자부로
Priority date: 1984-10-19
Filing date: 1992-09-08
Publication date: 1993-01-06

Abstract

내용 없음.No content.

Description

에스트리올-3-설페이트의 면역분석Immunoassay of Estriol-3-Sulfate

제1도는 세파로스 4B에 고정된 항-에스트리올-3-설페이트 항체의 스캐차드 플로트 그래프를 나타내는 것이다.1 shows a scatter plot of anti-estriol-3-sulfate antibodies immobilized on Sepharose 4B.

제2도는 에스트리올-3-설페이트와 혈장 단백질의 비특이성 결합에 대한 각종 물질의 영향을 나타내는 것이다. 여기서, ○-○는 물질을 첨가하지 않은 경우,는 시스테인(0.1몰/ι)를 첨가한 경우,는 글리신(0.2몰/ι)을 첨가한 경우 및는 글루타민(0.1몰/ι)을 첨가한 경우이다.2 shows the effect of various substances on nonspecific binding of estriol-3-sulfate and plasma protein. Where ○-○ is the case where no substance is added, Is added cysteine (0.1 mol / ι), Is when glycine (0.2 mol / ι) is added and Is the case where glutamine (0.1 mol / ι) was added.

제3도는 에스트리올-3-설페이트의 방사성 면역 분석 시험에 의한 검정 곡선을 나타내는 것이다.3 shows the calibration curve by radioimmunoassay test of estriol-3-sulfate.

제4도는 정상 임신 기간동안의 에스트리올 -3-설페이트 및 에스트리올의 현장 농도를 나타내는 것이다. 여기서,는 결합된 에스트리올 값 및 △는 비결합된 에스트리올 값이다.4 shows the in situ concentrations of estriol-3-sulfate and estriol during normal pregnancy. here, Is the bound estriol value and Δ is the unbound estriol value.

본 발명은 에스트리올-3-설페이트의 면역 분석에 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 에스트리올-3-설페이트에 특이성을 갖는 항체의 제조용 시약으로 이용되는 6-치환-에스트리올-3-설페이트, 그의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.The present invention relates to an immunoassay of estriol-3-sulfate. More particularly, the present invention relates to 6-substituted-estriol-3-sulfate used as a reagent for the preparation of an antibody having specificity for estriol-3-sulfate, a method for preparing the same and use thereof.

에스트리올-3-설페이트는 태아에게 있어 에스트리올의 주 대사 물질이라고 보고되었다[U.Goebelsmann et al. : Acta Endocrinol.,273(1965) 및550 (19 66)]. 또한 에스트리올-3-설페이트가 변하지 않은 채로 태아에서 임부에게로 이동될 수 있다는 것이 제안되었다. 임신 또는 태아의 기능적 성장 과정의 태반을 진단하는데 있어서 에스트리올-3-설페이트의 측정은 매우 중요하다. 그러나, 종래의 방법에 의한 에스트리올-3-설페이트의 측정은 가수분해, 가용매 분해, 용매 추출, 크로마토그래피 분리등과 같은 난이한 공정을 필요로 하며, 에스트리올-3-설페이트를 직접 분석하는 어떤 확실한 방법도 아직 개발되지 않고 있다.Estriol-3-sulfate has been reported to be the main metabolite of estriol in the fetus [U. Goebelsmann et al. Acta Endocrinol., 273 (1965) and 550 (19 66)]. It has also been suggested that estriol-3-sulfate can be transferred from the fetus to the mother unchanged. The measurement of estriol-3-sulfate is very important in diagnosing the placenta of pregnancy or the fetal functional growth process. However, measurement of estriol-3-sulfate by conventional methods requires difficult processes such as hydrolysis, solvolysis, solvent extraction, chromatographic separation, and the like. No definite method of analysis has yet been developed.

최근, 면역 분석의 높은 민감성 때문에 임상 화학을 포함한 각종 분야에서 면역에서 면역 분석에 대한 많은 관심이 기울여지고 있다. 에스트리올-3-설페이트의 정량 분석을 위한 확실한 분석 방법을 개발하기 위해 광범위한 연구가 진행되었으며, 에스트리올-3-설페이트에 높은 특이성을 나타내는 항체가 성공적으로 제조되었다. 이항체를 표지된 에스트리올-3-설페이트와 결합시켜 사용하면 가수분해, 가용매분해, 용매추출 및 크로마토그래피 분리와 같은 난이한 공정을 거치지 않고도 높은 미감성을 갖는 단순 공정의 에스트리올-3-설페이트의 면역 분석이 수행될 수 있다.Recently, much attention has been paid to immunoassays in immunity in various fields including clinical chemistry because of the high sensitivity of immunoassays. Extensive research has been conducted to develop robust assay methods for the quantitative analysis of estriol-3-sulfate, and antibodies which have been highly produced for estriol-3-sulfate have been successfully prepared. When combined with labeled estriol-3-sulfate, the antibody binds to a simple, high-sensitivity estriol, without the need for difficult processes such as hydrolysis, solubilization, solvent extraction, and chromatographic separation. Immune analysis of 3-sulfate can be performed.

본 발명에서, 특징적인 것은 에스트리올-3-설페이트에 특이성을 갖는 항체를 제조하기 위해 하기 일반식(Ⅰ)의 6-치환-에스트리올-3-설페이트 단백질 접합체(이후 “ESP 접합체”로 약칭한다)를 이용한다는 것이다.In the present invention, it is characterized by the 6-substituted-estriol-3-sulfate protein conjugate of the following general formula (I) (hereinafter referred to as "ESP conjugate") for the production of antibodies having specificity for estriol-3-sulfate. Abbreviated).

(상기식중, A는 =N-O- 또는 -O-CO-이고, n은 1-4의 정수이며, -NH-P는 아미노형에서 수소원자를 제거한 단백질의 잔기이다)(Wherein A is = N-O- or -O-CO-, n is an integer of 1-4, and -NH-P is the residue of the protein which removed the hydrogen atom from the amino type)

ESP접합체(Ⅰ)는 신규의 물질이며, 일반식ESP conjugate (Ⅰ) is a novel substance and is of general formula

(식중, A 및 n은 상기에 정의한 바와 같다)의 상응하는 카르복실산을 수성 매질에서 수용성 카르보디이미드와 같은 축합제 존재하에 일반식Wherein the corresponding carboxylic acids of formula A and n are as defined above in the presence of a condensing agent such as a water soluble carbodiimide in an aqueous medium.

H₂N-PH ₂ NP

(식중, P는 상기에 정의한 바와 같다)의 단백질과 축합시킴으로써 제조될 수 있다.It can be prepared by condensation with a protein of the formula (P is as defined above).

더욱 특별하게는, ESP접합체 (Ⅰ)은 예를 들어, A가 =N-O-이고, n이 1의 정수이며, -NH-P가 아미노형에서 수소원자를 제거한 소혈청 알부민의 잔기인 경우, 하기의 도식에 나타낸 방법에 의해 6-옥소에스트리올-3, 16, 17-트리아실레이트로 부터 제조될 수 있다.More specifically, the ESP conjugate (I) is, for example, when A is = NO-, n is an integer of 1, and -NH-P is a residue of bovine serum albumin which has been dehydrogenated from the amino type, It can be prepared from 6-oxoestriol-3, 16, 17-trisylate by the method shown in the scheme.

(상기 식중, R은 저급알카놀(예. 아세틸, 프로이오닐, 부티릴) 또는 벤조일과 같은 아실기이다)(Wherein R is an acyl group such as lower alkanol (eg acetyl, proionyl, butyryl) or benzoyl)

상기방법에서, 6-옥소에스트리올-3, 16, 17-트리아실레이트(Ⅳ)를 먼저 부분 가수분해하여 6-옥소에스트리올-16, 127-디아실레이트(Ⅴ)를 수득한다. 부분 가수분해는 예를 들면 수성 매질중에서 무기염기, 특히 알칼리 탄산염(예. 탄산나트륨, 탄산칼륨) 또는 알칼리 중탄산염(예. 중탄산나트륨, 중탄산칼륨)과 같은 염기로 -10-30℃의 온도에서 처리함으로써 수행될수 있다. 수성매질은 알칸올(예. 메탄올, 에탄올)과 같은 어떤 불활성수-혼화성 유기 용매를 함유할 수 있다.In this method, 6-oxoestriol-3, 16, 17-trisylate (IV) is first partially hydrolyzed to give 6-oxoestriol-16, 127-diasylate (V). Partial hydrolysis can be effected, for example, by treatment at a temperature of -10-30 ° C. with a base such as an inorganic base, in particular an alkali carbonate (eg sodium carbonate, potassium carbonate) or an alkali bicarbonate (eg sodium bicarbonate, potassium bicarbonate) in an aqueous medium. Can be performed. The aqueous medium may contain any inert water-miscible organic solvent such as alkanols (eg methanol, ethanol).

생성된 디아실레이트(Ⅴ)를 o-카르복시 메틸 히드록실아민과 축합하여 6-옥소에스트리올-o-카르복시메틸옥심-16, 17-디아실레이트(Ⅳ)를 수득한다. 축합은 디아실레이트(Ⅴ)를 불활성 용매(예. 메탄올, 에탄올)중에서 -10-30℃의 온도에서 o-카르복시메틸히드록실아민을 처리함으로써 수행될 수 있다.The resulting disylate (V) is condensed with o-carboxy methyl hydroxylamine to give 6-oxoestriol-o-carboxymethyloxime-16, 17-diasylate (IV). Condensation can be carried out by treating di-acrylate (V) with o-carboxymethylhydroxylamine in an inert solvent (eg methanol, ethanol) at a temperature of -10-30 < 0 > C.

생성된 옥심 유도체(Ⅳ)를 실온(0-30℃) 내지 환류 온도에서 유기 염기(예. 피리딘, 트릴에틸아민, 디메틸아닐린)와 같은 염기 존재하에 클로로술폰산과 반응시켜 6-옥소에스트리올-3-설페이트-o-카르복시메틸옥심-16, 17-디아실레이트(Ⅲ)를 수득한다. 필요하다면 임의의 불활성 용매(예. 벤젠, 톨루엔)를 사용할 수 있다.The resulting oxime derivative (IV) is reacted with chlorosulfonic acid in the presence of a base such as an organic base (e.g. pyridine, triethylethylamine, dimethylaniline) at room temperature (0-30 占 폚) to reflux temperature to give 6-oxoestriol- 3-Sulfate-o-carboxymethyloxime-16, 17-diasylate (III) is obtained. Any inert solvent (eg benzene, toluene) can be used if necessary.

이렇게 제조된 3-설페이트-o-카르복시메틸옥심-16, 17-디아실레이트(Ⅲ)를 가수분해하여 상응하는 3-설페이트-o-카르복시메틸옥심(Ⅱ), 즉 6-옥소에스트리올-3-설페이트-o-카르복시메틸옥심을 수득한다. 가수분해는 공지의 방법에 의해, 예를 들면 수성 매질 및 실온(0-30℃)에서 부기염기(예. 수상화나트륨, 수산화칼륨)와 같은 염기로 처리함으로써 수행될 수 있다.The 3-sulfate-o-carboxymethyloxime-16, 17-diasylate (III) thus prepared was hydrolyzed to give the corresponding 3-sulfate-o-carboxymethyloxime (II), i.e. 6-oxoestriol- 3-Sulfate-o-carboxymethyloxime is obtained. Hydrolysis can be carried out by known methods, for example by treatment with an aqueous medium and with a base such as a subbase (e.g. sodium award, potassium hydroxide) at room temperature (0-30 ° C).

수득된 3-설페이트-o-카르복시메틸옥심(Ⅱ)을 수용성 카르보디이미드(예. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드)와 같은 축합제 존재하에 소혈청 알부민과 같은 단백질과 축합시켜 ESP 접합제(Ia)를 수득한다. 축합은 온화한 조건, 예를 들면 0-10℃에서 서서히 교반하면서 수행하는 것이 바람직하다. 필요하다면, 임의의 불활성 용매(예.피리딘, 인산완충액)를 사용할 수도 있다.The obtained 3-sulfate-o-carboxymethyloxime (II) was prepared in the presence of a condensing agent such as water-soluble carbodiimide (e.g. 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) such as bovine serum albumin. Condensation with the protein yields an ESP conjugate (Ia). Condensation is preferably carried out with gentle stirring at mild conditions, for example 0-10 ° C. If necessary, any inert solvent (eg pyridine, phosphate buffer) may also be used.

예를 들어, A가 -O-CO-이고, n이 2의 정수이며, -NH-P가 아미노형에서 수소를 제거한 소혈청 알부민의 잔기일때, ESP 접합체(Ib)는 다음과 같이 제조할 수있다. 즉, 6-옥소에스트리올-3, 16, 17-트리아실레이트(Ⅵ)를 카르보닐기를 히드록시메틸렌기로 전환시키는 공지 방법에 의해 환원시켜 6-히드록시에스트리올-3, 16, 17-트리아실레이트를 수득하고, 이를 숙신산 무수물과 반응시켜 6-위치에 상응하는 헤미숙시네이트를 수득한다. 헤미숙시네이트르를 수성 매질에서 탄산칼륨과 같은 염기로 가수분해함으로써 3-위치의 아실기를선택적으로 제거한다. 생성된 6-히드록시 에스트리올-16, 17-디아실레이트-6-헤미숙시네이트를 상기와 같은 방법으로 3-위치의 황산화, 16 및 17-위치의 가수분해 및 6-측쇄의 아미드화를 수행하여 ESP 접합체(Ib)를 수득할 수 있다.For example, when A is -O-CO-, n is an integer of 2 and -NH-P is a residue of bovine serum albumin dehydrogenated in amino form, the ESP conjugate (Ib) can be prepared as follows. have. That is, 6-oxoestriol-3, 16, 17-trisylate (VI) is reduced by a known method of converting a carbonyl group to a hydroxymethylene group to 6-hydroxyestriol-3, 16, 17- Triacylates are obtained which are reacted with succinic anhydride to give hemisuccinates corresponding to the 6-position. The hemisuccinate is selectively removed from the 3-position acyl group by hydrolysis in an aqueous medium with a base such as potassium carbonate. The resulting 6-hydroxy estriol-16, 17-diasylate-6-hemisuccinate was subjected to the 3-position sulfate, 16 and 17-position hydrolysis and 6-side chain Amidation can be carried out to afford the ESP conjugate (Ib).

일반식 P-NH₂로 표시되는 단백질로는 면역 화학의 분야에서 합텐용 담체로서 통상적으로 이용되는 것이 사용될 수 있으며, 그의 특정예로는 알부민, 글로부린 등이 있다. 특히, 소혈청 알부민, 토기 혈청 알부민등을 사용하는 것이 바람직하다.As the protein represented by the general formula P-NH ₂ , one commonly used as a carrier for hapten in the field of immunochemistry may be used, and specific examples thereof include albumin and globurin. In particular, it is preferable to use bovine serum albumin, earthenware serum albumin and the like.

ESP 접합체를 이용하여 에스트리올-3-설페이트에 대한 항체를 제조하기 위해서는, ESP 접합체를 척추동물(예. 소, 말, 양, 염소, 토끼, 쥐, 생쥐)중에서 선택된 생체에 비경구 투여하여 생체내에서 항체를 제조한다. 그리고 생체로부터 체액(예. 혈액)을 채취하고, 임의로 불순물을 제거한다. 보통, 항체를 함유한 혈청, 즉 항-혈청을 이용한다.To prepare an antibody against estriol-3-sulfate using the ESP conjugate, the ESP conjugate is parenterally administered to a living body selected from vertebrates (e.g. cattle, horses, sheep, goats, rabbits, mice, mice). Prepare antibodies in vivo. The body fluid (eg blood) is collected from the living body, and the impurities are optionally removed. Usually, serum containing the antibody, ie anti-serum, is used.

항체와의 결합에 사용되는 표지된 항원으로는 적당히 표지된 에스트리올-3-설페이트가 사용될 수 있다. 표지를 위해, 방사성 물질, 효소, 형광물질, 발광물질등이 이용된다. 이들 표지 물질된 항원의 면역 활성이 남아 있는한 에스트리올-3-설페이트의 어떤 위치에도 도입될 수 있다. 예를 들어,³H 또는¹⁴C로 표지를 수행할때, 에스트리올 -3-설페이트를 구성하는 원소를 상기 표지로 치환하게 되므로, 표지된 항원의 면역 활성은 에스트리올-3-설페이트의 활성으로 부터 변화되지 않는다. 표지를¹²⁵I또는¹³¹I로 수행할때, 적당한 결합체를 사용하여 에스트리올-3-설페이트에 도입하여, 항체에 대한 그의 친화도가 에스트리올 3-설페이트의 친화도와 다르도록 하므로, 면역활성의 유지를 위해 주의가 기울어져야 한다.Appropriately labeled estriol-3-sulfate may be used as the labeled antigen used for binding to the antibody. For labeling, radioactive materials, enzymes, fluorescent materials, luminescent materials and the like are used. It can be introduced at any position of estriol-3-sulfate as long as the immune activity of these labeled antigens remains. For example, when labeling is performed with ³ H or ¹⁴ C, the elements constituting estriol-3-sulfate are replaced with the label, so that the immunological activity of the labeled antigen is determined by It does not change from activity. When the label is carried out at ¹²⁵ I or ¹³¹ I, an appropriate activity is used to introduce into the atriol-3-sulfate so that its affinity for the antibody differs from that of the atriol 3-sulfate. Care must be taken to maintain

표지는 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 방사성의 요오드의 표지는 산화제(예. 클로라민T, 요도다인 클로라이드)를 사용한 방법 또는 효소(예. 락토퍼옥시다제)를 사용한 방법과 같은 직접적 방법, 또는 작용기(예. 카르복실, 아미노, 티올)를 에스트리올-3-설페이트에 도입하고, 작용기를 방사성 등위 원소로 표지된 요오드화 화합물(예. 요오드화 티라민, 요오드화 티로신, 요오드화 히스타민, 볼톤-훈터시약)과 결합시키는 간접적 방법에 의해 수행될 수 있다. 방사성 요오드로 표지하는 대표하는 대표적인 예는 6-옥소에스트리올-3설페이트 o-카르복시메틸옥심을 수용성 카르보디이미드 존재하에 방사성 요오드원자로 표지된 요오드화 히스타민과 축합하여 목적하는 방사성 요오드-표지 항원을 수득하는 것이다. 요오드화 히스타민 대신에 벤젠고리가 방사성 요오드 원자로 표지된 베타-(4-히드록시페닐)에틸 아민 또는 베타-(4-히드록시페닐)알라닌 메틸 에스테르를 사용할 수 있다.Labeling can be carried out by conventional methods. For example, the labeling of radioactive iodine can be carried out by direct methods such as methods using oxidizing agents (e.g. chloramine T, iododine chloride) or enzymes (e.g. lactoperoxidase), or functional groups (e.g. carboxyl, Amino, thiol) by introduction into estriol-3-sulfate and by indirect methods of combining functional groups with iodide compounds labeled with radioisotopes (e.g., tyramine iodide, tyrosine iodide, iodide histamine, bolton-hunther reagent) Can be performed. Representative representative examples of labeling with radioactive iodine are condensation of 6-oxoestriol-3sulfate o-carboxymethyloxime with iodide histamine labeled with radioactive iodine atoms in the presence of a water-soluble carbodiimide to obtain the desired radioactive iodine-labeled antigen. It is. Instead of iodide histamine, beta- (4-hydroxyphenyl) ethyl amine or beta- (4-hydroxyphenyl) alanine methyl ester in which the benzene ring is labeled with a radioactive iodine atom can be used.

진단될 인체로 부터 수득된 혈청 시료(미지량의 에스트리올-3-설페이트 함유)에 다음과 같은 방법에 의해 본 발명의 면역 분석을 수행한다. 즉, 각종 량의 에스트리올 3-설페이트를 혈청에 가하여 표준 용액을 제조한다. 각 표준 용액에, 상술한 바와같이 지정량의 표지된 항원을 가하고, 상술한 항체를 가하여 통상적인 조건하에 항원-항체 반응을 수행힌다. 항원- 항체 결합 생성물(B) 및 항체가 결합하지 않은 항원 분획(F)를 전기영동, 겔 여과, 염석 또는 흡착과 같은 공지의 분리한다. (B) 및 (F)의 표지 역가를 표지항원의 제조에 채택된 표지 방법에 따라 적당한 분석 방법에 의해 측정하고, 상기와 같은 공정을 더 수행한다. 최종적으로 혈청 시료에서의 에스트리올-3-설페이트 농도를 검정 곡선을 참고로 결정한다.상기의 항원-항체 반응에서, 글루타민의 존재는 면역분석의저확성을 증가시키기 위해 바람직하다.Serum samples obtained from the human body to be diagnosed (containing an unknown amount of estriol-3-sulfate) are subjected to the immunoassay of the present invention by the following method. That is, various amounts of estriol 3-sulfate are added to the serum to prepare a standard solution. To each standard solution, the indicated amount of labeled antigen is added as described above, and the antibody described above is added to carry out the antigen-antibody reaction under ordinary conditions. Antigen-antibody binding product (B) and antigen fraction (F) to which antibody is not bound are known known such as electrophoresis, gel filtration, salting or adsorption. The label titers of (B) and (F) are measured by appropriate assay methods according to the labeling method adopted for the preparation of label antigens, and the above process is further carried out. Finally, the estriol-3-sulfate concentration in the serum sample is determined by reference to the assay curve. In the antigen-antibody response above, the presence of glutamine is preferred to increase the accuracy of the immunoassay.

본 발명의 실제적이며 바람직한 예는 하기의 실시예에 더욱 상세하게 나타낸다.이들 실시예에 사용된 유리된 스테로이드, 소혈청 알부민(BSA) 및 소의 감마 글로부린 (BGG)은 시그마 화학사제의 상품이며, 다른 시약은 나까라이 화학사의 제품이다.Practical and preferred examples of the present invention are shown in more detail in the following examples. The free steroids, bovine serum albumin (BSA) and bovine gamma globulin (BGG) used in these examples are commercial products of Sigma Chemicals Co., Ltd. The reagent is a product of Nakarai Chemical.

[실시예 1]Example 1

(A) 6-옥소에스트리올-16, 17-디아세테이트(V : R=COCH₃)의 제조 :(A) Preparation of 6-oxoestriol-16, 17-diacetate (V: R = COCH ₃ ):

메탄올(30ml)에 용해시킨 6-옥소에스트리올-3, 16, 17-트리아세테이트(VI :R=COCH₃)(500mg)[참고, Wright et al. : Steroids,755(1973)]의 용액에 5 % 탄산 칼륨 용액(5ml)을 가하고, 생성된 용액을 빙냉하면서 2시간 동안 방치한다. 0.1N 염산을 이용하여 반응 혼합물을 중화하고, 농축시키고 에틸 아세테이트로 추출한다. 추출물로 세척하고 무수황산 나트륨으로 건조시키고 감압하에 농축시킨다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래 한다[용리액 : n-헥산 : 에틸 아세테이트(2 :1)].용출액을 메탄올로 재결정하여 무색 프리미즘상의 6-옥소에스트리올-16, 17-디아세테이트(V : R=COCH₃)(248mg)를 수득한다. 융점 236-239℃.6-oxoestriol-3, 16, 17-triacetate (VI: R = COCH ₃ ) (500 mg) dissolved in methanol (30 ml) [See Wright et al. Steroids, 755 (1973)] is added 5% potassium carbonate solution (5 ml) and the resulting solution is left for 2 hours with ice cooling. The reaction mixture is neutralized with 0.1 N hydrochloric acid, concentrated and extracted with ethyl acetate. Wash with extract, dry over anhydrous sodium sulfate and concentrate under reduced pressure. The residue is purified by silica gel column chromatography [eluent: n-hexane: ethyl acetate (2: 1)]. The eluate is recrystallized from methanol to give 6-oxoestriol-16, 17-diacetate (V: to give an _{R = COCH 3) (248mg)} . Melting point 236-239 ° C.

IR(KBr) : νmax 3420(Ar-OH), 1740(-OCOCH₃), 1760(CO), NMR(CD CI₃) :0.84(3H, s, 18-CH₃), 2.06(3H, s, 17-OCOCH₃), 2.09(3H, s, 16-OCO CH₃), 4.92(1H, d, J=6Hz, 17-H), 6.98-7.54(3H, m, Ar-H).IR (KBr): ν max 3420 (Ar-OH), 1740 (-OCOCH ₃ ), 1760 (CO), NMR (CD CI ₃ ): 0.84 (3H, s, 18-CH ₃ ), 2.06 (3H, s, 17-OCOCH ₃ ), 2.09 (3H, s, 16-OCO CH ₃ ), 4.92 (1H, d, J = 6 Hz, 17-H ), 6.98-7.54 (3H, m, Ar-H).

(B) 6-옥소에시트리올-o-카르복시메틸옥심-16, 17-디아세테이트(IV : R=COCH₃)의 제조 :(B) Preparation of 6-oxoethyltriol-o-carboxymethyloxime-16, 17-diacetate (IV: R = COCH ₃ ):

메탄올(10ml)에 용해시킨 상기 (A)에서 수득한 6-옥소에스트리올-16, 17-디아세테이트(V : R=COCH₃) (150mg)의 용액에 o-카르복시메틸 히드록실아민 히드로클로라이드(100mg)를 가한다. 1N NaOH용액을 이용하여 생성된 용액을 중화하고 실온에서 밤새 방치한다. 생성된 용액을 농축시키고 에틸 아세테이트로 추출한다. 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 한다. [용리액 : n-헥산 : 에틸 아세테이트(2 :1)]. 용출액을 메탄올로 재결정하여 무색 프리미즘상의6-옥소에스트리올-o-카르복시메틸옥심-16, 17-디아세테이트(IV : R=COCH₃)(126mg)를 수득한다. 융점 188-190℃.O-carboxymethyl hydroxylamine hydrochloride in a solution of 6-oxoestriol-16, 17-diacetate (V: R = COCH ₃ ) (150 mg) obtained in (A) dissolved in methanol (10 ml). (100 mg) is added. The resulting solution is neutralized with 1N NaOH solution and left overnight at room temperature. The resulting solution is concentrated and extracted with ethyl acetate. The extract is subjected to silica gel column chromatography. [Eluent: n-hexane: ethyl acetate (2: 1)]. The eluate was recrystallized from methanol to give 6-oxoestriol-o-carboxymethyloxime-16, 17-diacetate (IV: R = COCH ₃ ) (126 mg) as a colorless prisms. Melting point 188-190 ° C.

IR(KBr) : νmax 3400(Ar-OH), 1620-1540(C=N-, COCH), NMR(CD CI₃) :0.76 (3H, s, 18-CH₃), 2.05(3H, s, 17-OCOCH₃), 2.08(3H, s, 16-OCOCH₃), 4.72(2H, s, =NOCh₂), 6.82-7.37(3H, s, Ar-H).IR (KBr): ν max 3400 (Ar-OH), 1620-1540 (C = N-, COCH), NMR (CD CI ₃ ): 0.76 (3H, s, 18-CH ₃ ), 2.05 (3H, s, 17-OCOCH ₃ ), 2.08 (3H, s, 16-OCOCH ₃ ), 4.72 (2H, s, = NOCh ₂ ), 6.82-7.37 (3H, s, Ar-H).

원소분석 C₂₄H₂₉O₈N :Elemental Analysis C ₂₄ H ₂₉ O ₈ N:

계산치 : C ; 63.74, H ; 6.36, N ; 3.50Calculated Value: C; 63.74, H; 6.36, N; 3.50

실측지 : C ; 63.75, H ; 7.18, N ; 2.30.Found: C; 63.75, H; 7.18, N; 2.30.

(C) 6-옥소에스트리올-3-설페이트-o-카르복시메틸옥심-16, 17-디아세테이트(Ⅲ : R=COCH₃)의 제조 :(C) Preparation of 6-oxoestriol-3-sulfate-o-carboxymethyloxime-16, 17-diacetate (III: R = COCH ₃ ):

피리딘(4ml)에 용해시킨 크로로술폰산(200mg)의 용액을 -10℃에서 냉각한후, 상기 (B)에서 수득한 6-옥소에스트리올-o-카르복시메틸옥심016, 17- 디아세테이트(10mg)를 용해시킨 피리딘(1.5ml)용액에 가하고, 생성된 혼합물을 37℃에서 2.5시간 동안 교반하여, 6-옥소에스트리올-3-설페이트-o-카르복시메틸옥심-16, 17 -디아세테이트(Ⅲ : R=COCH₃)를 제조한다.After cooling a solution of crosulfonic acid (200 mg) dissolved in pyridine (4 ml) at -10 ° C, 6-oxoestriol-o-carboxymethyloxime 016 and 17-diacetate ( 10 mg) was added to a dissolved pyridine (1.5 ml) solution, and the resulting mixture was stirred at 37 ° C. for 2.5 hours to give 6-oxoestriol-3-sulfate-o-carboxymethyloxime-16, 17-diacetate. (III: R = COCH ₃ ) was prepared.

(D) 6-옥소에스트리올-3-설페이트-o-카르복시메틸옥심(Ⅱ)의 제조 :(D) Preparation of 6-oxoestriol-3-sulfate-o-carboxymethyloxime (II):

(C)에서 수득한 6-옥소에스트리올-3-설페이트-o-카르복시메틸옥심-16, 17-디아세테이트(Ⅲ : R=COCH₃)를 함유하는 반응 홍합물을 0.1N NaOH 용액에 쏟아 붓고 실온에서 밤새 방치한다.생성된 용액을 물(300ml)로 희석하고 앰버라이트 XAD-2 컬럼에 통과시킨후 물로 세척한다. 메탄올(50ml)로 컬럼을 용출시킨다. 용출액을 감압하 25℃에서 농축시킨다. 잔류물을 박막 크로마토그래피한다.(전개액 ; 클로로포름 : 메탄올 : 암모니아=15 : 5 : 1 부피비). Rf=0.1에 해당하는 분획을 클로로포름, 메탄올 및 암모니아(15 : 7 : 1 부피)의 혼합물로 용출시켜 무색 무정형 물질인 6-옥소에스트리올-3-설페이트-o-카르복시메틸 옥심(Ⅱ)(78mg)을 수득한다. 융점 : 300℃이상The reaction mussel containing 6-oxoestriol-3-sulfate-o-carboxymethyloxime-16, 17-diacetate (III: R = COCH ₃ ) obtained in (C) is poured into a 0.1N NaOH solution. Pour and leave at room temperature overnight. The resulting solution is diluted with water (300 ml), passed through an Amberlite XAD-2 column and washed with water. The column is eluted with methanol (50 ml). The eluate is concentrated at 25 ° C. under reduced pressure. The residue is subjected to thin layer chromatography (eluent; chloroform: methanol: ammonia = 15: 5: 1 volume ratio). The fraction corresponding to Rf = 0.1 was eluted with a mixture of chloroform, methanol and ammonia (15: 7: 1 volume) to give 6-oxoestriol-3-sulfate-o-carboxymethyl oxime (II), a colorless amorphous substance ( 78 mg) is obtained. Melting Point: 300 ℃ or higher

IR(KBr) : νmax 1060(-SO₃H). NMR(CD₃OD) :0.76(3H, s, 18-CH₃), 4.52(2H, s, =NOCH₂), 7.27(2H, s, 1- 및 2-H), 7.76(1H, s, 4-H).IR (KBr): ν max 1060 (-SO ₃ H). NMR (CD ₃ OD): 0.76 (3H, s, 18-CH ₃ ), 4.52 (2H, s, = NOCH ₂ ), 7.27 (2H, s, 1- and 2-H), 7.76 (1H, s, 4-H).

원소분석 C₂₀H₂₃O₉NS ㆍNa₂ㆍ2H₂O :Elemental Analysis C ₂₀ H ₂₃ O ₉ NS ㆍ Na ₂ ㆍ 2H ₂ O:

계산치 : C ; 44.87, H ; 5.08, N ; 2.62Calculated Value: C; 44.87, H; 5.08, N; 2.62

실측치 : C ; 45.19, H ; 4.96, N ; 2.65.Found: C; 45.19, H; 4.96, N; 2.65.

(E) 6-옥소에스트리올-3-설페이트-o-카르복시메틸옥심-BSA 접합체(Ia : P=소혈청 알부민(BSA))의 제조 :(E) Preparation of 6-oxoestriol-3-sulfate-o-carboxymethyloxime-BSA conjugate (Ia: P = bovine serum albumin (BSA))

0.1M 인산 완충 용액(pH 7.1, 0.5ml)에 용해시킨 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디아미드 히드로클로라이드(100mg) 및 소혈청 알부민(50mg0의 용액을 (D)에서 수득한 6-옥소에스트리올-3 -설페이트-o-카르복시메틸옥심(Ⅱ) (3 0mg)을 용해시킨 피리딘(0.5ml) 용액에 적가하고, 생성된 혼합물을 4℃에서 밤새 교반한다. 생성된 용액을 투석하고 동결 건조하여 6-옥소에스트리올 -3-설페이트 -o-카르복시메틸옥심-BSA 접합체(Ia : P=BSA)(47mg)를 수득한다.A solution of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiamide hydrochloride (100 mg) and bovine serum albumin (50 mg0) dissolved in 0.1 M phosphate buffer solution (pH 7.1, 0.5 ml) was obtained in (D). To a pyridine (0.5 ml) solution in which 6-oxoestriol-3-sulfate-o-carboxymethyloxime (II) (3 0 mg) was dissolved was added dropwise, and the resulting mixture was stirred at 4 ° C. overnight. The solution is dialyzed and lyophilized to give 6-oxoestriol-3-sulfate-o-carboxymethyloxime-BSA conjugate (Ia: P = BSA) (47 mg).

진한 황산을 이용한 착색 반응에서, 상기 합텐-BSA 접합체(Ia) (6-옥소에스트리올-3-설페이트-o-카르복시메틸옥심-BSA 접합체)가 한분자당 약 14스테로이드 분자를 갖는 것을 확인할 수 있다.In the coloring reaction with concentrated sulfuric acid, it can be seen that the hapten-BSA conjugate (Ia) (6-oxoestriol-3-sulfate-o-carboxymethyloxime-BSA conjugate) has about 14 steroid molecules per molecule. .

[실시예 2]Example 2

에스트리올-3-설페이트에 대한 항체의 제조 :Preparation of Antibody Against Estriol-3-Sulfate:

3마리의 수컷 기니아 피그를 면역화에 이용한다. 0.5mg의 6-옥소에스트리올-3-설페이트-o-카르복시메틸옥심-BSA접합체(I a)를 멸균된 등장 식염수(0.25ml)에 용해시키고 프로인트의 완전 보조제(0.25ml)로 에멀션화 한다. 에멀션을 각 대퇴 및 견갑골의 하부에 피하주사 한다. 최초 주사 이후 14일 및 28일후에 피하주사를 반복하고 그후로 각각 30일 후에 반복 주사한다. 4번째의 증강 주사를 실시한지 10일후에 출혈시킨다. 3500rpm에서 20분간 원심분리하여 혈청을 분리하고 -25℃에서 보관한다.Three male guinea pigs are used for immunization. 0.5 mg of 6-oxoestriol-3-sulfate-o-carboxymethyloxime-BSA conjugate (Ia) is dissolved in sterile isotonic saline (0.25 ml) and emulsified with Freund's complete adjuvant (0.25 ml) do. The emulsion is injected subcutaneously in the lower thigh and scapula. Subcutaneous injections are repeated 14 and 28 days after the first injection, followed by repeated injections 30 days after each. Bleeding is performed 10 days after the fourth enhanced injection. Serum is separated by centrifugation at 3500 rpm for 20 minutes and stored at -25 ° C.

[실시예 3]Example 3

고정된 항체의 제조 :Preparation of Immobilized Antibodies:

허비 등의 방법(Hervey et al., Cancer Res.3001-3008, 1975)에 따라 항체를 CNBr-활성화 세파로스-4B(파마시아 파인 케미칼(주)제품)에 결합시킨다. 항-에스트리올-3-설페이트 항 혈청을 황산암모늄(500g/l)과 혼합하고 실온에서 10분간 방치한 후, 2500rpm에서 20분간 원심분리한다. 침전물을 증류수(1.0ml)에 용해하고, 붕산 완충액(0.05몰/l, pH 8.0)에서 투석한다. 용액은 조 “글로블린”분획을 제공한다. CNBr-활성화 세파로스-4B(200mg)를 염산(10^-3몰/l) (100ml)으로 씻어낸다. 황산암모늄(500g/l)으로 처리한 항혈청(1.0ml)을 NaCl(0.5몰/l)-함유 NaHCO₃완충액(0.1몰/l, pH 8.0) (5.0ml)으러 희석하고, 겔과 혼합하고 혼합물을 4℃에서 밤새 교반한다. 결합 완충액을 이용하여 비결합 물질을 씻어내고, 남아있는 활성기를 에타올 아민(1몰/l, pH8.0)과 1시간 동안 반응시킨다. 비공유적으로 흡착된 단백질을 제거하기 위하여 세 세정 회로를 이용하는데, 각 회로에서는 NaCl(1.0몰/l)-함유 아세테이트 완충액(0.1몰/l, pH 4.0) (5.0ml)으로 세척한 후 NaCl(1.0몰/l)-함유 붕산 완충액(0.1몰/l, pH 8.0)으로 세척하는 과정을 거친다. 고정된 항체는 4℃에서 매우 안정하며, 수개월 후에도 결합 친화력이 눈에 띄게 변화하지 않는다.Herbie et al. (Hervey et al., Cancer Res. The antibody is bound to CNBr-activated Sepharose-4B (manufactured by Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) according to 3001-3008, 1975). The anti-estriol-3-sulfate antiserum is mixed with ammonium sulfate (500 g / l) and left at room temperature for 10 minutes and then centrifuged at 2500 rpm for 20 minutes. The precipitate is dissolved in distilled water (1.0 ml) and dialyzed in boric acid buffer (0.05 mol / l, pH 8.0). The solution provides a crude “globulin” fraction. CNBr-activated Sepharose-4B (200 mg) is washed with hydrochloric acid ( ^10-3 mol / l) (100 ml). Antisera (1.0 ml) treated with ammonium sulfate (500 g / l) was diluted with NaCl (0.5 mol / l) -containing NaHCO ₃ buffer (0.1 mol / l, pH 8.0) (5.0 ml), mixed with gel and mixed Stir overnight at 4 ° C. Unbound material is washed off with binding buffer and the remaining active groups are reacted with ethanol amine (1 mol / l, pH8.0) for 1 hour. Three wash circuits are used to remove non-covalently adsorbed proteins, each of which is washed with NaCl (1.0 mol / l) -containing acetate buffer (0.1 mol / l, pH 4.0) (5.0 ml) followed by NaCl ( 1.0 mol / l) -containing boric acid buffer (0.1 mol / l, pH 8.0). The immobilized antibody is very stable at 4 ° C. and does not noticeably change binding affinity even after several months.

[실시예 4]Example 4

표지 항원인 [6.7-³H]-에스트리올-3-설페이트의 제조 :Labeled antigen [6.7- ³ H] - Preparation of S tree ol-3-sulfate:

기니아 피그의 간으로부터 효소 제제를 수득한다 [참조. M.Bouthiller et al. : Steroids,523(1981)]. 간 균질화물을 노리트-A로 처리하여 내생 스테로이드르 제거한다. 아데노신 3'-포스페이트 5'-포스포설페이트(1㎍) 및 0.05M 트리스-HCl완충액(pH 7.4) (0.001M MgCl₂, 0.025M 시스테인 및 0.001M디티오트레이톨을 함유)에 용해시킨 간균질화물(200㎕)과 함께 [6, 7-³H]에스테리올(100μCi)을 37℃에서 2시간 동안 보온한다.에탄올을 이용하여 반응 혼합물로부터 단백질을 제거허고 100rpm에서 15분간 원심분리한다. 상층액을 0.05M 인산 완충액(pH 7.5) (30ml)으로 앰버라이트 XAD-2컬럼(0.5×10cm)에 통과시킨다. 설페이트 분획을 메탄올로 용출시키고 질소 기류하에 증발시키고 예비 박먹 크로마토그래피하여(전개액 ; 클로로포름 : 메탄올 : 암모니아(15 : 5 : 1부피비)의 혼합물)정제한다. 확실한 시료에 해당하는 밴드(Rf=0.32)를 메탄올 및 암모니아(95 : 1부피비)의 혼합물로 용출한다. 메탄올을 용리액으로 사용하는 세파덱스 LH-20컬럼(0.5×15cm) 크로마토그래피하여 용출액을 더 정제하고, 목적 분획을 수거하여 진공중에서 농축함으로써 [6,7-³H] 스트리올-3-설페이트(45.3Ci/mmol), 10.9μCi, 수율 13.6%)를 수득한다. 방사성 화학 순도는 실리카겔 G를 이용한 박막 크로마토그래피에 의한 98% 보다 높다.Enzyme preparations are obtained from the livers of guinea pigs. M. Bouthiller et al. Steroids, 523 (1981). Liver homogenates are treated with norit-A to remove endogenous steroids. Hepatic homogenate dissolved in adenosine 3'-phosphate 5'-phosphosulfate (1 μg) and 0.05M Tris-HCl buffer (pH 7.4) (containing 0.001M MgCl ₂ , 0.025M cysteine and 0.001M dithiothritol) the S. Terry ol ^{(100μCi) [6, 7- 3} H] with (200㎕) and warm for 2 hours at 37 ℃. using ethanol to remove the protein from the reaction mixture in 15 minutes and centrifuged at 100rpm heogo. The supernatant is passed through Amberlite XAD-2 column (0.5 × 10 cm) with 0.05 M phosphate buffer (pH 7.5) (30 ml). The sulfate fraction is eluted with methanol, evaporated under a stream of nitrogen and purified by preparatory thinning chromatography (mixture of eluent; chloroform: methanol: ammonia (15: 5: 1 volume ratio)). Evaporate the band corresponding to the positive sample (Rf = 0.32) with a mixture of methanol and ammonia (95: 1 volume ratio). By Sephadex LH-20 column (0.5 × 15cm) chromatography using methanol as an eluent and further purify the effluent, to collect the desired fraction was concentrated in vacuo by [6,7- ³ H] Streaming ol-3-sulfate ( 45.3 Ci / mmol), 10.9 μCi, yield 13.6%). Radiochemical chemical purity is higher than 98% by thin layer chromatography with silica gel G.

[실시예 5]Example 5

에스트리올-3-설페이트의 측정 :Measurement of Estriol-3-Sulfate:

0.05몰/l의 인산 완충액(pH 7.5, 0.1ml)에 용해시킨 [3H]-에스트리올-설페이트(5500dpm)를 인산 완층액(0.05몰/l, pH7.5)으로 희석한 고정된 항체의 균질 현탁액(1 : 500부피비)(0.2ml)에 가하고,, 실온에서 15분 동안 방치한다. 트리스-HCl완충액(0.1몰/l, pH 8.3)으로 희석한 혈장 시료(0.1ml) (0.1몰/l의 글루타민 함유)를 가하고, 생성된 용액을 4℃에서 16시간 동안 배양한다. 혼합물을 3500rpm에서 20분동안 원심분리 한다. 각각의 상층액의 0.2ml를 부분 시료로 취하여 계수 바이알에 넣고 브라이(Bray) 섬광제와, 혼합한 후, 알로카(Aloka) LSC-673 액체 섬광 분광기내에서 방사능을 계산한다. 수득된 결과들의 스캐차트(Scatchard) 도면은 에스트리올-3-설페이트에 대한 결합 상수(Ka) 4.3×10⁹l/몰의 높은 친화도를 나타낸다(참고, 첨부된 도면 제1도는 세파로스 4B로 고정시킨 항-에스트리올-3-설페이트 항체의 스캐차드 플로트 그래프를 나타낸다).Immobilized antibody diluted with [3H] -estriol-sulfate (5500 dpm) dissolved in 0.05 mol / l phosphate buffer (pH 7.5, 0.1 ml) with a phosphate complete solution (0.05 mol / l, pH7.5). It is added to a homogeneous suspension (1: 500 volume ratio) (0.2 ml) and it is left to stand at room temperature for 15 minutes. A plasma sample (0.1 ml) (containing 0.1 mol / l glutamine) diluted with Tris-HCl buffer (0.1 mol / l, pH 8.3) is added and the resulting solution is incubated at 4 ° C. for 16 hours. The mixture is centrifuged at 3500 rpm for 20 minutes. 0.2 ml of each supernatant is taken as a partial sample, placed in a counting vial, mixed with a Bray scintillant, and the radioactivity calculated in an Aloka LSC-673 liquid scintillation spectrometer. The Scatchard plot of the results obtained shows a high affinity of 4.3 × 10 ⁹ l / mol of binding constant (Ka) for estriol-3-sulfate (see FIG. 1 attached FIG. 1 is Sepharose 4B). Shows a scatter plot of anti-estriol-3-sulfate antibody immobilized with).

[실시예 6]Example 6

희석한 혈장 부분 시료에 대한 측정 :Determination of Dilute Plasma Portion Samples:

에스트리올-3-설페이트와 혈장의 비-특이성 결합을 감소시키기 위해, 완충액에 용해시킨 특정한 물질을 혈장 시료를 함유하는 항원-항체 혼합물에 가하고, 측저을 수행한다. 즉, 실시예 5에서와 같이 트리스-염산 완충액(0.1몰/l)으로 희석한 시료에 글루타민, 시스테인 또는 글리신을 가하고, 실시예 5와 동일한 방법으로 에스트리올-3-설페이트의 검출을 수행한다. 결과는 첨부한 도면 제2도에 나타내며, 상기 결과는 에스트리올-3-설페이트와 혈장 단백질의 비-특이성 결합에 대한 각종 물질의 영향을 나타내고, ○-○는 물질을 첨가하지 않은 경우,는 시스테인(0.1몰/l)을 첨가한 경우, △-△는 글리신)0.2몰/l)을 첨가한 경우 및는 글루타민(0.1몰/l)을 첨가한 경우이다.In order to reduce the non-specific binding of plasma with estriol-3-sulfate, the specific substance dissolved in the buffer is added to the antigen-antibody mixture containing the plasma sample and the bottoming is performed. That is, glutamine, cysteine or glycine was added to the sample diluted with tris-hydrochloric acid buffer (0.1 mol / l) as in Example 5, and the detection of estriol-3-sulfate was performed in the same manner as in Example 5. . The results are shown in Figure 2 of the accompanying drawings, which show the effect of various substances on the non-specific binding of estriol-3-sulfate and plasma proteins, and ○-○ indicates no addition of the substance, When cysteine (0.1 mol / l) is added, Δ-Δ is glycine) 0.2 mol / l) and Is the case where glutamine (0.1 mol / l) is added.

[실시예 7]Example 7

각종 스테로이드의 교차-반응Cross-reaction of various steroids

이성Sane

고정된-항체에 대한 기타 스테로이드들의 교차 반응으로부터 특이성을 펴가한다. 교차-반응성은 표지된 에스트리올-3-설페이트와 항체의 결합을 50% 억제시키고자 할때 필요한 비-표지된 에스트리올-3-설페이트와 각각의 스테로이드의 질량 비율을 계산하여 측정된다. 결과는 하기 표1에 나타낸다.Specificity is addressed from the cross-reaction of other steroids against the immobilized-antibody. Cross-reactivity is measured by calculating the mass ratio of each of the steroids to the non-labeled estriol-3-sulfate that is required to inhibit the binding of the labeled estriol-3-sulfate to the antibody by 50%. The results are shown in Table 1 below.

[표 1]TABLE 1

상기 결과로부터, 본 발명에 의한 항체가 에스트리올-3-설페이트에 대해 고도로 특이하게 반응하며, 세파로스 4B로 고정시킬 경우 다른 에스트로겐 설페이트와 약간 개선된 교차 반응성을 나타내고, 데히드로에피안드로스테론 설페이트(0.77%), 콜레스테롤 설페이트(0.081%) 및 에스트리올(0.033%)을 제외한 다른 스테ㅗ이드 결합체 및 유리 스테로이드들과는 교차-반응하지 않음을 알 수 있다.From the above results, the antibody according to the present invention reacts highly specifically to estriol-3-sulfate and exhibits slightly improved cross-reactivity with other estrogen sulfates when immobilized with Sepharose 4B, and dehydroepiandrosterone sulfate (0.77%), cholesterol sulphate (0.081%) and estriol (0.033%) except that it is not cross-reacted with other steroid conjugates and free steroids.

[실시예 8]Example 8

정밀도 시험 :Precision test:

(A) 감수성(A) sensitivity

1 : 500 비율로 희석한 고정된 항체를 사용하여, 희석한 수컷 혈장시료를 목탄 처리하고 각기 다른 양의 에스트리올-3-설페이트를 가한 후 표지된 에스트리올-3-설페이트의 결합 백분율을 도식화하여 검정 곡선이 그려진다(참고, 첨부한 도면 제3도는 에스트리올-3-설페이트의 방사성 면역 분석시험에 의한 검정 곡선을 나타낸다). 감수성은 15pg로 나타나고, 에스트리올-3-설페이트는 20-1000pg 범위내에서 검출 가능하다.Using a fixed antibody diluted at a 1: 500 ratio, charcoal treated diluted male plasma samples were added to different amounts of estriol-3-sulfate, and then the percent bound of labeled estriol-3-sulfate was determined. The assay curve is plotted and shown (see FIG. 3 attached to the figure shows the calibration curve by radioimmunoassay of estriol-3-sulfate). Susceptibility is shown to be 15 pg and estriol-3-sulfate is detectable within the range of 20-1000 pg.

(B) 회수(B) recovery

정상인 수컷 혈장을 노리트(Norit) A로 처리하고 물로 희석한 후, 희석한 혈장중에서 0.1ml의 부분시료를 각각 0, 50, 100 및 400pg의 비-표지된 에스트리올-3설페이트를 함유하는 용액에 가한다. 희석한 고정된 항체 및 표지된 화합물과 함께 배양한 후, 원심분리하여 결합된 및 유리된 스테로이드를 분리하고, 이어서 방사능을 검출하여 회수 백분율을 측정한다. 즉, 정상인 수컷 혈장에 첨가한 공지량의 에스트리올-3-설페이트가 회수되고 측정된다. 결과는 하기 표 2에 나타내며, 4단계 모두에서 만족스런 결과가 나타난다.Normal male plasma was treated with Norit A and diluted with water, and then 0.1 ml aliquots of diluted plasma containing 0, 50, 100 and 400 pg of non-labeled estriol-3 sulfate, respectively. To the solution. After incubation with diluted immobilized antibody and labeled compound, centrifugation separates bound and free steroids, and then radioactivity is detected to determine percent recovery. That is, a known amount of estriol-3-sulfate added to normal male plasma is recovered and measured. The results are shown in Table 2 below, with satisfactory results in all four steps.

[표 2]TABLE 2

^*) n=5 ^* ) n = 5

(C) 변이 시험(C) mutation test

임부 혈청 시료내의 에스트리올-3-설페이트를 실시예 5에 기재한 방법으로 검출하여 분석내 및 분석간의 변이를 조사한다. 결과는 하기 표 3에 나타낸다. 방사 면역 분석시험에서의 분석내 변이는 검정 곡선상의 3개의 다른 시료들을 사용하여 측정된다. 각각의 점들에서의 개수변이(CV) 값은 8.3% 이하이다. 분석간의 변이는 3가지 다른 시료들을 분석하여 측정된다. CV 값은 8.1% 이하인 것으로 너터났다.Estriol-3-sulfate in pregnant serum samples is detected by the method described in Example 5 to investigate variations in and between assays. The results are shown in Table 3 below. In-assay variation in the radioimmunoassay is measured using three different samples on the assay curve. The number variation (CV) value at each point is 8.3% or less. The variation between analyzes is measured by analyzing three different samples. CV values were lower than 8.1%.

[표 3]TABLE 3

상기 결과들로부터, 본 발명에 대한 에스트리올-3-설페이트의 면역성분이 고도로 정확함을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that the immune component of estriol-3-sulfate for the present invention is highly accurate.

[실시예 9]Example 9

임상시험 :Clinical Trial:

40마리의 임부의혈장시료를 사용하여 임신후 매 주일 마다의 에스트리올-3-설페이트 및 에스트리올의 혈액 농도를 측정한다. 에스트리오-3-설페이트의 검출은 실시예 5의 방법으로 수행하고, 에스트리올의 검출은 하기에 기재한 방법으로 수행한다.Forty pregnant women's plasma samples are used to measure blood concentrations of estriol-3-sulfate and estriol every week after pregnancy. Detection of estrio-3-sulfate is carried out by the method of Example 5, and detection of estriol is carried out by the method described below.

희석한 임부의 혈장(0.2ml)을 에테르(1.0ml)로 추출하고 물(0.1ml)로 세척한다.[³H]-에스트리올(10000rpm)을 가하고, 유기층을 질소 기류하에 건조시킨다. 상기 시료에 붕산 완충액(0.05몰/l : pH8.0)으로 희석한 항 혈청(1 : 600) (0/25ml) [BGG (0.5g/l) 및 BSA(0.6g/l)함유]을 가한다. 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 배양하고 , 암모늄 서레이트(500g/l, 0.25ml)와 혼합한 후, 실온에서 15분 동안 방치한다. 배양혼합물을 3500rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액주에서 0.2ml의 부분 시료를 위하여 검출을 수행한다.The diluted pregnant woman's plasma (0.2 ml) is extracted with ether (1.0 ml) and washed with water (0.1 ml). [ ³ H] -estriol (10000 rpm) is added and the organic layer is dried under a stream of nitrogen. To the sample was added antisera (1: 600) (0/25 ml) [containing BGG (0.5 g / l) and BSA (0.6 g / l)] diluted with boric acid buffer (0.05 mol / l: pH 8.0). do. The resulting solution is incubated for 1 hour at room temperature, mixed with ammonium surrate (500 g / l, 0.25 ml) and left for 15 minutes at room temperature. The culture mixture is centrifuged at 3500 rpm for 10 minutes and detection is performed for 0.2 ml of partial sample in the supernatant.

결과는 첨부한 도면 제4도에 나타낸다. 상기 결과는 정상 임신 기간동안의 에스트리올-3-설페이트 및 에스트리올의 혈장 농도를 나타내고,는 결합된 에스트리올 값 및 △는 비-결합된 에스트리올 값을 나타낸다.The results are shown in Figure 4 of the accompanying drawings. The results indicate plasma concentrations of estriol-3-sulfate and estriol during normal pregnancy, Is the bound estriol value and Δ represents the non-bound estriol value.

Claims

하기 일반식(Ⅰ)의 6-치환-에스트리올-3-설페이트 단백질 접합체를 척추동물의 생체에 비경구 투여하여 생체내에서 항체를 제조하고, 항체를 함유한 체액을 생체로부터 수거함을 특징으로 하는, 에스트리올-3-설페이트에 대한 특이성을 갖는 항체의 제조방법.The antibody is prepared in vivo by parenteral administration of the 6-substituted-estriol-3-sulfate protein conjugate of formula (I) to a living body of a vertebrate, and the body fluid containing the antibody is collected from the living body. A method for producing an antibody having specificity for estriol-3-sulfate.

(상기 식중, A는 =N-O- 또는 -O-CH-이고, n은 1-4의 정수이며, -NH-P는 아미노형에서 수소 원자가 제거된 단백질의 잔기이다).(Wherein A is = N-O- or -O-CH-, n is an integer of 1-4, and -NH-P is the residue of the protein from which the hydrogen atom has been removed from the amino form).

하기 일반식(Ⅰ)의 6-치환-에스트리올-3-설페이트 단백질 접합체를 사용하여 제조되며, 에스트리올-3-설페이트에 대한 특이성을 갖는 항체를 항체로 이용함을 특징으로 하는, 항원-항체 반응을 이용한 면역 분석에 의해 에스트리올-3-설페이트를 함유한 시료중의 에스트리올-3-설페이트의 측정방법.Antigen- Prepared using the 6-substituted-estriol-3-sulfate protein conjugate of formula (I), characterized in that an antibody having specificity for estriol-3-sulfate is used as an antibody. A method for measuring estriol-3-sulfate in a sample containing estriol-3-sulfate by immunoassay using an antibody reaction.

(상기 식중, A는 =N=O- 또는 -O-CO-이고, n은 1-4의 정수이며, -NH-P는 아미노형에서 수소 원자가 제거된 단백질의 잔기이다).(Wherein A is = N = O- or -O-CO-, n is an integer of 1-4, and -NH-P is the residue of the protein from which the hydrogen atom has been removed from the amino form).

제 2항에 있어서, 항원-항체 반응을 글루타민 존재하에 수행하는 방법.The method of claim 2, wherein the antigen-antibody reaction is carried out in the presence of glutamine.