JPS5856682A - 酸性プロテアーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の対象は、土壌試料よシ分離されたリゾプス・リ
ゾポデイホルずス（Ｒｈｉｇｏｐｕｇｒｈｉｇｏｐｏｄ
ｉｆｏｒｍｉｇ　）種の菌株の培養による広い作用範囲
をもつ酸性プロテアーゼの製造方法である。この菌株は
Ｂａａｒｎ　（オランダ国）のＣｅｎｔｒａａｌ　Ｂｕ
ｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　８ａｈｉＵ１ｅｌ−Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ−の寄託番号ＣＢＳ　２２７．７５をもつ。

本発明はリゾプス属の菌株のプロテアーゼ収量の増加を
目的とする。この目的はこの１株を変異させ、そして適
尚な変異株を選択することにより達成される。

それ故に１本発明の対象は、リゾプス （Ｒｈｉｇｏｐｕｓ　）属の出発菌株を変異させ、より
高いプロテアーゼ生産性をもつ変異株を選択し、これを
、同化可能な炭素源および窒素源を含有する培地で、３
と７の間の閣値および２５℃と５０℃の間の温度で培養
し、生産された酵素を分離することを特徴とする、リゾ
プス属の菌株の好気的培養によ）広い一一作用範囲をも
つ酸性プロテアーゼを高収量で製造する方法である。

変異は好適には紫外線照射で行なわれる。この変異処ｊ
ｌＵ選択した菌株を用いて１回ま九は数回く夛返される
。

を九本発明の対象は、下記の条件のもとに振盪培養で＞
　１０　ｍｌ　ＴＶ／＠ｌの蛋白質分解活性を生成する
限）、そしてこの生成され九プロテアーゼが下記のテス
ト（尋電点分画電気泳動及び免疫学的試験）に基いて舒
生φリゾプス・リゾボデイホルミスＣＢ８２２５．７５
のそれと同じである限シ、上記の方法で単離され九出発
菌株の変異株である。％に次の変異株が挙げられる。

リゾプス・リゾボデイホルミス璽−５４（ＣＢｉ１２１
９．８０）リゾプス・リゾボデイホル電ス厘−４＋６（
ＣＢ８２２０．８０）リゾプス・リゾボデイホルミスｌ
−５９（ＣＢ８２２１．８０）リゾプス・リゾボデイホ
ルミス璽−６５（ＣＢＢ２２２．ＢＯ）上記変異株の単
離は次の方法で行なわれる。

麦芽汁肉汁寒天で胞子着生した野生菌株の斜面培養物を
殺菌し九０．００５％ナトリクムラクリルサルフエート
溶液で洗い出し、菌糸破片を分離する丸め胞子懸濁液を
殺菌したガラスフリット（Ｄ−３）により一過し、つい
で４０００Ｕ／分で１５分遠心分離する。沈降した胞子
を殺菌した０、１　Ｍ酢酸緩衝液（１１１１４，５）中
に入れ、顕黴鋺下で胞子の濃度を約１０”個／ｄに調整
する。

つ−でこのように調整し九胞子溶液を紫外［９ンプ（波
長２５４ｎ鳳、１３ワツト）で９９．９％の殺滅率まで
照射する。このように照射し九胞子を次の組成のカゼイ
ネート寒天平板に添加する。

大豆粉　　　　０．１０％ＣａＣＪ２・２Ｈ２００，０
２％コーン・ステイープ・リカー　０．１０％　カゼイ
７　　　　Ｇ、４０％グルコース　　　　０．５０％寒
　天　　　１．６０％ゼラチン　　　　　０．５０％声
値　　　　５．５麦芽エキス　　　　０．５０％ デソキシコミル酸ナトリウム０．１０％Ｉ町ＰＯ４０，
２４％ ＭｆＣ４，・６Ｈ２００，１０％ Ｍｎ８０４−４１２０　　　　　　０．０５％この平板
を３０℃で２〜５日間培養する。ついで強いカゼイン分
解の環形成をもつコｏ　＝　−だけを菌株培養物として
分離し、さらに検査をする。

この新規な菌株を、その蛋白質分解効率を検査するため
に３０℃で振盪培養で培養する（邪魔［を４つ５００ｄ
エルレンマイヤーフラスコ、振動数Ｕ／分）。この培地
の組成社次の如くである。

ＫＨ２ＰＯ４０，２５％ Ｎａｎｏ、　　　　　　　　　　　　　　　　　０．（
１６％カゼイン　　　　　　　　　　　　２．００％ゼ
ラチン　　　　　　　　　　　０．８０％大豆粉　　　
　　　　　　　　　０．５０％麦芽エキス　　　　　　
　　　　０．５０％トウモロコｍでんぷん加水分解した
）２．００％２０％ふすまエキス　　　　　　　　　　
１（１，００％（容量％）１０％オートフレークエ中ス
　　　　　　１０．００％（容量％）−５，５ これによシ野生菌株から一連の変異株−これらは明かに
よ）高いプロテアーゼ活性を生成する−が単離される。

最も活性の高い菌株から出発して、更に上昇した活性を
もつ菌株に導く変異試験が開始される。この試験は結局
３回行なわれ、総計で次の菌株が分離され、そしてプロ
テアーゼ収量が決定畜れた。

第１表 ツンダ国）のｃ＠ｎｔｒ’４　Ｂｕｒ＠ａｕ　ｖｏｏｒ
　８ｃｈｉｍｌｌＩｅｌ−Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　（Ｃ１１
Ｂ）に寄託されている。

第１表の菌株によシ生成されたプロテアーゼは野生株Ｃ
Ｂ８２２７．７５のそれと同じ性質を所有する。これら
のプμテアーゼはｐＨ２，５と６．５の間の弱い酸性領
域にシける特に広い作用スペクトルによって卓越する０
作用の最適−はｐＨ４，５であ）、８０％最大活性の領
域は声３．５〜５．９であシ、６０％最大活性の領域は
ｐｉ１５．０〜６．４である。このプロテアーゼは特に
飼料への添加物、ｌＩＫ家禽、豚、仔牛、有用魚の飼育
および肥育における結果の改爽の丸めの添加物として適
する。しかし、その上Ｋｔ九とのグμテアーゼは、酸性
プロテアーゼが使用されることのできる他の使用目的、
例えば食品加工工場における使用、病院および家庭にお
ける酸性の洗浄剤および清浄剤、特にカツヘル、床、お
よびテーブルの清浄剤としての使用、製菓における皮革
用補助剤としての使用、さらに高度ＫＭＩＩＬ九形で医
薬の使用領域にシいて消化剤としての使用などのような
使用目的に用いられる。

本プロテアーゼの製造方法は、液体あるいは固体の培地
に上記の選択し九変異株を培養するととＫよ〉行なわれ
、その場合、一般に液体の培地が好適である。栄養溶液
での培養では、通常の好気的振盪培養法ま九は醗酵法に
したがって培養が行なわれる。

本発明で使用される培地は通常の方法で製造され、そし
て炭素源、窒素源、および他の微生物にとって必ｉｔ栄
養物質中成長物質を含有する。適当な炭素源としては、
でんぷん、デキストリン、ａｍ、グルコース、７ラクト
ース、マルトース、および糖含有廃物が挙げられる。窒
素源としては、アンモニウム塩、尿素、カゼイン、ゼラ
チン、コーン・ステイープ・リカー、および大豆粉もし
くは大豆粕が問題となる。さらに、例えば燐酸水素ナト
リウム、燐酸水素カリウム、燐酸水素アンモニウム、カ
ルシウム嵐マグネシウム塩のような無機塩を培地に添加
することができる。さらにｔ九、例えば酵母エキスやビ
タミンのような成長物質を培地に添加することも好まし
いことである。

醗酵温度は２５〜５０℃の範囲内にあるが、２７〜５２
℃の間の温度を選ぶのが有利である。

培地の陣値は５．０〜７．０であることができ、好まし
くは４．０〜６．０である。培養は一般に２０〜９６時
間行なわれる。

本発明方法により製造されたプロテアーゼ社、通常の方
法でＰ遇しあるいは遠心分離した培養液から、有機溶剤
や添加あるいは例えば硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモ
ニウムでの塩析によシ沈澱させ、そして淡縮することが
できる。精製は透析法あるいはイオン交換樹脂での地理
によシ行なうことができる。

本プロテアーゼの蛋白質分層活性の確認はアンソン（ム
ｎ５ｔｏりの測定の全知の原則にし九がって行なわれる
。すなわち、適当に希釈し友量の酵素溶液を、同容量の
１．２％カゼイン溶液とともに４０℃で２０分間恒温保
持し、この場合これに０．６％乳酸、６モル尿素、およ
び０．１モルクエン酸または酢酸を含有させる。カゼイ
ン溶液の一値は２Ｍの苛性ソーダの添加によ）　４．５
　Ｋ調整する。上記の恒温保持後、容量比１：１で０．
４Ｍのトリクロル酢酸を添加し、生成し九消化されない
カゼインの沈澱をＦ別し、Ｐ液中に分解で生じ九蛋白質
分解物を任意の蛋白質測定方法によって調査する。どれ
に対しては、例えばＭ＠ｔｈｏａｓ　ｏｆ　Ｉｎｇｙｍ
ｏｌｏｆ７５　（１９５７）　４４８頁以下にＬａｙｎ
・によ）記載され先方法が適する。

各試料に対し、ブランク値をつくることが必要であ）、
辷れには第１にトリクロル酢酸が添加され、つぎにカゼ
イン溶液が添加される。このブランク値は、試薬−ブラ
ンク値のほかに、消化前に酵素溶液中にすでに存在して
いる低分子のペプチドを示す。１値（Ｈａｕｐｔｖ＠ｒ
ｔ）とブランク値との間の差が上記した方法で吸光度で
比較され、これがこの測定ではチロシンの一定量を与え
る。このチ誼シンの量が存在する酵素の蛋白質分解活性
に対する尺度となる。酵素単位（〒Ｕ）は、毎分主催と
ブランク値の間の酵素溶液の代りに使用する１モルチロ
シン溶液と同じ吸光差異を生ぜしむる酵素量である。

蛋白質分解活性の測定は、４．５より高い一値および低
い一値では、カゼイン溶液の適切な調整によ）そのｉま
可能であるが、その場合酢酸添加をクエン酸で城）替え
ることが有利である。

例　　１ 培地の調製のために、１１の水に大豆粉３ｇ、コーン・
ステープ・リカー５１％カゼイン１５．９．　ゼ５テア
１９、ＩＩＩ、ＰＯ４２，４ｙ、ＩＭｆ８０４・７Ｂ、
００−５　５’、　　ＭｎＣｊ・４Ｈ２００，１ｇ、　
Ｃ＆Ｃ１２・２Ｈ２００，１ｇ、およびトウモロコシで
んぷん２ｏｌを溶解も−しくけ分散した。との栄養溶液
の御飯を５．３とじ九。上記のトウモロコシでんぷんは
アンラーゼによシ最高に分解されたものである。この殺
菌した栄養溶液に変異株厘−５４の胞子を接種し、振盪
培養器中で最適な通気のもとに３０’ｅで約５０時間培
養を行なった。この培養時間後、菌体をＦ別し、そして
菌体を含まない培養Ｐ液を上記し先方法によるプロテア
ーゼ活性の測定のために使用した。この場合、この培養
−液は５７　ｍＴＵ／−の酵素活性に達する゛ととが判
明し九。

例　　２ 培地の調製の丸めに、１１の水道水に大豆粉（脱脂し＊
’）１０９、コーン・ステイープ・リカー５１％カゼイ
ン１２１．ゼラチン５ＪＦｓ殻物原料の酒精蒸留残滓ｓ
　ｇ、　ｘａ２ｐｏ４２．４１１．１ａｙｏ、　１１　
％　　夏Ｉｆ４Ｃ４１１１％　Ｆ＠８０４０．０１　ｇ
、シよび生のトウモロコシでんぷん３０１１を溶解もし
くは分散し友。この栄養溶液の御飯をオートクレーブ処
理後に５．５に調整した。この栄養溶液を入れ九１１の
エルレンマイヤーフラスコに、１０＋ｌのツアペック−
ドック前培養物（でんぷん５％および酵母エキス０．５
％を加えた）−との前培養物は変異株璽−５９の胞子を
接種し、３０℃で２４時間振盪培養したものである−を
添加し、通気のもとて約７２〜９６時間、一値が６．８
〜７．ＯＫ上昇するまで培養し喪。その俵、菌体を一別
し、透明な培養Ｆ液を上記し先方法によるプロテアーゼ
活性の測定の丸めに使用した。この場合、この培養ｆ液
は２８重ＴＴＩ／ｄ＝の酵素活性に達することが判明し
た。

Ｍａｎａｖｉｌｌｅ社のフィルター・−ｋ　ル（Ｆｉｌ
ｔｅｒＣ・１）５１Ｉおよびスタンダード−スーパーｅ
セル（８ｔａｎｄａｒｌ　Ｓｕｐ＠ｒ　Ｃ＠ｌ　）　５
　ｊｌの添加のもとにおける１０個の１１振盪７５スコ
の混合物からの培養Ｐ液の清澄濾過、５ｏトールでの出
発容量の％の濃縮、そして攪拌下Ｋ＞ｆｆろ水分を包ま
ない硫酸ナトリウム５？うの添加での沈澱−この場合５
８〜４０’Ｃの温度を用いた−によ）プロテアーゼを分
離した。しかしまえ、このプロテアーゼは一３〜５℃の
温度で２容量のエタノール、メタノール、アセトン、を
九は他の水と混合し得る溶剤の滴下によ）沈澱させるこ
ともできる。この沈澱物を吸引−過し、そして真空乾燥
し九。

例　　３ 上述した測定方法の使用のもとに、例１および例２ＧＣ
より分離したプロテアーゼの活性を一値の関係において
調査しえ。第３表には、最適の活性ないし最適一値にお
いて測定され九活性ＯＳＯ％の活性が存在する御飯が示
される。この値から認められるように、例１および例２
で使用した変異株のプμテアーゼは、野生株ＣＢ８２２
７．７５から分離され九プロテアーゼと同様に広いそし
て上記し九使用領域に有利な田作用範囲を所有する。

第３表 何　４ 変異株リゾプス・リゾポディホルミス厘−３４゜厘−４
６、■−５９、シよび厘−６５から得たプロテアーゼを
、等電点分画電気泳動法もしくは０ｕｃｈｔ＠ｒｌｏｎ
ｙの交叉反応法（Ｋｒｅｕｉｇｒ＊ａｋｔｉｏｎ）にし
たがって、！生株ＣＢ８２２７．７５から得九プロテア
ーゼと比較した。この場合、全部のプ關テアーゼの完全
な同一性が明らかＫなつ九。

等電点分画電気泳動法 装置：マルチ＊　−ル（Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ）　２１１
７　。

ＬＫＢインストラメンッ １１１ｍＢ　２１０　Ｂ　　パワー・サプライ材料：　
ＬＫＢアンホラインＰムＧプレート、　ＬＫＢイ／スト
２メンツ ｌ１ｇ５゜５−９．５ 陽極液：　Ｉ　Ｍ　Ｈ，ＰＯ４ 陰極液：　ｌ　Ｍ　）ＩａＯＨ 水冷した装置にポリアクリルアミドゲルを置い死後、電
極液を浸し良紙の電極片をゲルの縁に置く。陰極と陽極
との間のゲルの中央線上に５鵬の幅の一紙片をおき、そ
して１０ＩＬ！の塩を含まない試料溶液（５ダ／−蛋白
質）を滴下する。装置の閉鎖後、１０１１ＡＯ電流の強
さで一勾配を形成させ、５０分後に試料−紙片を除去し
、そして１５１１ムの電流の強さに高める。２〜２゜５
時間後に分離は終了すゐ。

一勾配の決定 一勾配社、度盛夛をした表面−陣電極により、陰極と陽
極の間の声の経過をいくつかの線上に補足し、そしてｐ
Ｈ／　ｃｍ−図をつ〈夛上げるというようにして決定さ
れる。

固定および着色 固定液：トリフルル酢酸５７．５．９とスルホナリテル
酸１７．２５１ＫＭ留水を加え てｓ　ｏｏ、４にする。

脱色液：エタノール５ｏＯ−と酢酸１６〇−からなる混
合物を蒸留水で希釈して ２００　（＋＋ｔＫする。

着色液：脱色液４００−中にコ第１ジー・プＪＬ／　−
（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ　）　（）　−２５０
を０．４４ｊ’。

一一図Ｏ調製後、蛋白質沈殿およびアンホライン除去の
ためにゲルを１時間撹拌している固定液中に放置し、５
分間脱色液で洗浄し、続いて６０℃で１０分間着色液中
に置く。このゲルを脱色液で数回洗浄することＫより、
背色に着色し九蛋白質バンドを背景から明瞭に目立九せ
るまで脱色する。

声−図に基いて蛋白質の等電点を決定する。

材料 交叉反応に対しては、フランクフルトのミルス社（Ｆｉ
ｒｍａ　Ｍｉｌ・りの免疫拡散板（工ｕｕｎｄｉｆｆｕ
ｓｉｏｎｓｐｌａｔｔ＠ｎ　）を使用する（コードムロ
４−２７４−１）。仁の既製の板は、硼酸塩／食塩緩衝
液（声７．５−イオン強度０．１７５％）中に０．９％
のアガロースを含有する。この板はさらに静菌剤として
０．０１％のテオメルナール（Ｔｈｉｏｍ＠ｒｓａｌ　
）および蛋白沈澱線に対する指示薬としてトリバンプル
ー（テｒｙｐａｎ）１ｍ・）を含有する。

プロテアーゼＣＢ８２２７．７５に対する抗体は家兎か
ら得られ九ものである。

正の対照として、プロテアーゼＣＢ８２２７．７５−そ
れで免疫が実施された−を使用し丸。

実施 上記拡散板の中央に２５　ｓｌの抗血精をピペットでお
き、その外側にある凹所に５　ｗｉｇ　／　ｗＬないし
１０〜／−の濃度で各２ｓｓｌの蛋白質溶液をおいた。

拡散時間：４℃で７２時間である。

沈澱線はアガロース中に含有されているトリーくンプル
ー指示薬によシ検出される。免疫学的交叉反応は、抗体
を生成するプロテアーゼが試験したプロテアーゼと同じ
であるときにだけ正の結果となる。これは沈澱線の溶解
によシ確かめられる。

代理人江崎光好 代理人江崎光史 ドイツ連邦共和国デュツセルド ルフ・メランクトーンストラー セ１１ ｏ発　明　者　ロルフ・シュミット ドイツ連邦共和国デュツセルド ルフ・アム・ネットヒエスフエ ルト１３ ０発　明　者　アルブレヒト・ウアイスドイツ連邦共和
国エルクラード ・アムゼルウエーク８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　リゾプス属の出発菌株を変異させ、よシ高い
   プロテアーゼ生童性を４つ変異株を選択し、これを、同
   化可能な縦素源および窒素源を含有す石培地で、３と７
   の間の一値および２５℃と５０℃の間の温度で培養し、
   生産された酵素を分離することを特徴とする、リゾプス
   属の菌株の好気的培養によシ広い一一作用範囲をもつ酸
   性プロテアーゼを高収量で製造する方法。 （２）　　変異が紫外線照射によ〉行なわれることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 （１ｉ）変異手段および選択手段が１目または数回くシ
   返えされることを特徴とする特許請求の範囲第１項また
   は第２項記載の方法。 （４）振盪培養で＞１０ｘａＴＵ／−の蛋白質分解活性
   を生成し、そのプロテアーゼが下記野生株のそれと同じ
   である、野生株リゾプス・リゾポデイホルミスＣＢ８２
   ２７．７５の変異株。 （５）下記の寄託番号をもつ野生株リゾプス・リゾボデ
   イホルミスＣＢ８２２７．７５の変異株リゾプス・リゾ
   ボデイホルミスｌ−５４（ＣＢ８２１９．８０）リゾプ
   ス・リゾボデイホル之ス厘−４４（ＣＢＩｉ２２０．１
   ！Ｏ）リゾプス・リゾボデイホルミスＩ−５９（ＣＢＳ
   　２２１．８０）リゾプス・リゾポデイホルミス厘−６
   ５（ＣＢＢ２２２．８０）（６）特許請求の範囲第１項
   ないし第３項記載の方法によシ製造し九プ四テアーゼを
   飼料添加剤として使用する方法。