JPH0322970A - 酸性プロテアーゼを生産するリゾプス属の変異株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の対象は．土壌試料より分離されたリゾプス・リ
ゾポデイホルミス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｒｈｉｚｏｐｏ
ｄｉ−ｆｏｒｍｉｓ）種の菌株であり，この菌株はＢａ
ａｒｎ　（オランダ国）のＣｅｎｔｒａａｌ　Ｂｕｒｅ
ａｕ　ｖｏｏｒ　ＳｃｈｉｍｍｅｌＣｕｌ　Ｌｕｒｅｓ
の寄託番号ＣＢＳ　２２７．７５をもつ。

本発明は，プロテアーゼ収量の増加を目的とするリゾブ
ス属の菌株である．この目的はこの菌株を変異させ，そ
して適当な変異株を選択することにより達戒される。

リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属の出発菌株を変異させ
，より高いプロテアーゼ生産性をもつ変異株を選択し，
これを，同化可能な炭素源および窒素源を含有する培地
で．３と７の間の９１１値および２５℃と５０℃の間の
温度で培養し．生産された酵素を分離することを特徴と
する，リゾプス属の菌株の好気的培養により広いｐＨ一
作用範囲をもつ酸性プロテアーゼを高収量で製造するこ
とができる。

変異は好適には紫外線照射で行われる。この変異処理は
選択した菌株を用いて１回または数回くり返される。

したがって本発明の対象は．下記の条件のもとに振盪培
養で＞１０ｍＴＵ／　ｄの蛋白質分解活性を生或する限
り，そしてこの生成されたプロテアーゼが下記のテスト
（等電点分画電気泳動及び免疫学的試験）に基いて野生
株リゾプス・リゾポデイホルミスＣＢ５　２２５．７５
のそれと向しである限り．上記の方法で単離された出発
菌株の変異株である。特に次の変異株が挙げられる。

リゾプス・リゾボデイホルミスＩ［−３４（ＣＢＳ　２
１９．８０）リゾプス・リゾポデイホルミスＩ［Ｉ−４
６（ＣＢＳ　２２０．８０）リゾプス・リゾボデイホル
≧スＩ［［−５９（ＣＢＳ　２２１．８０）リゾプス・
リゾポデイホルミスＩＩＩ−６５（ＣＢＳ　２２２．８
０）上記変異株の単離は次の方法で行われる。

麦芽汁肉汁寒天で胞子着生した野生菌株の斜面培養物を
殺菌した０．００５％ナトリウムラウリルサルフエート
溶液で洗い出し，菌糸破片を分離するため胞子懸濁液を
殺菌したガラスフリソト（Ｄ−３）により濾過し，つい
で６００００／分で１５分遠心分離する。沈降した胞子
を殺菌したＯ．　１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）中に入
れ，顕微鏡下で胞子の濃度を約１０＠個／　ｍｌに調整
する。ついでこのように調整した胞子溶液を紫外線ラン
プ（波長２５４ｎｍ，　　１３ワット）で９９．９％の
殺滅率まで照射する。このように照射した胞子を次の組
成のカゼイネート寒天平仮に添加する。

大豆粉　　　　　０．１０％ＣａＣＩｚ　・２｝１ｚＯ
　　０．０２％コーン・スティーブ・リカ−　　　０．
１０％　　カゼイ　ン　　　　０．４０％グルコース　
　　０．５０％　寒天　　　　１．６０％ゼラチン　　
　　０．５０％　ｐＨ値　　　　５．５麦芽エキス　　
　０．５０％ デソキシコール　酸ナトリウム　０．１０％ＫｌｉＺＰ
Ｏ．．　　　　　　　　　　　０．２４％Ｍｇｃｌｚ　
　　・　６｝１ｚ０　　　　　０．１０％ＭｎＳＯ４　
　’４８ｚＯ　　　　　Ｏ．０５％この平板を３０’ｃ
で２〜３日間培養する。ついで強いカゼイン分解の環形
或をもつコロニーだけを菌株培養物として分離し，さら
に検査をする。

この新規な菌株を，その蛋白質分解効率を検査するため
に３０℃で振盪培養で培養する（邪魔板をもつ５００ｄ
エルレンマイヤーフラスコ，　振動１１　ｕ　／分）。

この培地の組戒は次の如くである。

？ＨｚＰＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　０．２５　　％ＮａＮ０，　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　０．０６　　％カゼイン　　　　　
　　　　　　　　　２．００％ゼラチン　　　　　　　
　　　　　　０．８０％大豆＄５）０．５０％ 麦芽エキス　　　　　　　　　　　　　０．５０％トｎ
ｎコシでんぷん（ｉん不ん加水分解した）　　２．００
％２０％ふすまエキス　　　　　１０．００％（容量２
）ｌＯ％オートフレークエキス　１０．００％（容量２
）ｐＨ　５．５ これにより野生菌株から一連の変異株■これらは明かに
より高いプロテアーゼ活性を生成する一が単離される。

最も活性の高い菌株から出発して．更に上昇した活性を
もつ菌株に導く変異試験が開始される。この試験は結局
３回行われ，総計で次の菌株が分離され，そしてプロテ
アーゼ収量が決定された。

第１表 これらの菌株のうち５次の菌株がＢａａｒｎ　（オラン
ダ国）のＣｅｎｔｒａａｌ　Ｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　
Ｓｃｈｉｍｎ＋ｅｌ−Ｃｕ）ｔｕｒｅｓ　（ＣＢＳ）に
寄託されている。

第２表 第１表の菌株にまり生成されたプロテアーゼは野生株Ｃ
ＢＳ　２２７．７５のそれと同じ性質を所有する．これ
らのプロテアーゼはｐｌ｛２．５と６．５の間の弱い酸
性領域における特に広い作用スペクトルによって卓越す
る。作用の最適ｐｔ＋はｐＨ４．５であり，８０％最大
活性の領域はｐｌ＋　３．３〜５．９であり，６０％最
大活性の領域はｐＨ３．０〜６．４である。このプロテ
アーゼは特に飼料への添加物，特に家禽，豚，仔牛，有
用魚の飼育および肥育における結果の改良のための添加
物として適する，しかしその上にまたこのプロテアーゼ
は．酸性プロテアーゼが使用されることのできる他の使
用目的，例えば食品加工工場における使用，病院および
家庭における酸性の洗浄剤および清浄剤，特にカツヘル
，床，およびテーブルの清浄剤としての使用，製革にお
ける皮革用補助剤としての使用，さらに高度に精製した
形で医薬の使用領域において消化剤としての使用などの
ような使用目的に用いられる。

本プロテアーゼの製造方法は，液体あるいは固体の培地
に上記の選択した変異株を培養することにより行われ，
その場合，一般に液体の培地が好適である。栄養溶液で
の培養では．通常の好気的振盪培養法または醗酵法にし
たがって培養が行われる。

本発明で使用される培地は通常の方法で製造され，そし
て炭素源，窒素源，および他の徽生物にとって必要な栄
養物質や生長物質を含有する。適当な炭素源としては，
でんぷん，デキストリン蔗糖，クルコース，フラクトー
ス，マルトース，および糖含有廃物が挙げられる。窒素
源としては，アンモニウム塩，尿素，カゼイン，ゼラチ
ン，コーン・ステイープ・リカー，および大豆粉もしく
は大豆粕が問題となる。さらに，例えば燐酸水素ナトリ
ウム，燐酸水素カリウム，燐酸水素アンモニウム，カル
シウム塩，マグネシウム塩のような無機塩を培地に添加
することができる。さらにまた，例えば酵母エキスやビ
タξンのような戒長物質を培地に添加することも好まし
いことである。

醗酵温度は２５〜５０℃の範囲内にあるが，２７〜３２
℃の間の温度を選ぶのが有利である。培地のρＨ値は３
．０〜７．０であることができ，好ましくは４，０〜６
．０である。培養は一般に２０〜９６時間行われる．本
発明方法により製造されたプロテアーゼは，通常の方法
で濾過しあるいは遠心分離した培養液から，有機溶剤の
添加あるいは例えば硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニ
ウムでの塩析により沈殿させ，そして濃縮することがで
きる。精製した透析法あるいはイオン交換樹脂での処理
により行うことができる。

本プロテアーゼの蛋白質分解活性の確認はアンソン（Ａ
ｎｓｏｎ）の測定の公知の原則にしたがって行われる。

すなわち，適当に希釈した量の酵素溶液を，同容量の１
．２％カゼイン溶液とともに４０℃で２０分間恒温保持
し，この場合これに０．６％乳酸，６モル尿素，および
０．１モルクエン酸または酢酸を含有させる。カゼイン
溶液のｐｉ値は２Ｎの苛性ソーダの添加により４．５に
調整する。上記の恒温保持後，容量比１：ｌで０．４Ｎ
のトリクロル酢酸を添加し．生或した消化されないカゼ
インの沈殿を濾別し，濾液中に分解で生じた蛋白質分解
物を任意の蛋白質測定方法によって調査する。これに対
しては．例えばＭｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ　３　（１９５７）４４８頁以下にＬａｙｎｅに
より記載された方法が適する。

各試料に対し，ブランク値をつくることが必要であり，
これには第１にトリクロル酢酸が添加され．つぎにカゼ
イン溶液が添加される。このブランク値は，試薬−ブラ
ンク値のほかに，消化前に酵素溶液中にすでに存在して
いる低分子のベプチドを示す。主値（Ｈａｕｐｔｗｅｒ
ｔ）とブランク値との間の差が上記した方法で吸光度で
比較され，これがこの測定ではチロシンの一定量を与え
る。このチロシンの量が存在する酵素の蛋白質分解活性
に対する尺度となる。酵素単位（ＴＵ）は，毎分主値と
ブランク値の間の酵素溶液の代りに使用する１モルチロ
シン溶液と同じ吸光差異を生ぜしむる酵素量である。

蛋白質分解活性の測定は，４．５より高いｐｉ｛値およ
び低いρロ値では，カゼイン溶液の適切な調整によりそ
のまま可能であるが，その場合酢酸添加をクエン酸で取
り替えることが有利である。

例１ 培地の調製のために，１Ｎの水に大豆粉３ｇ．コーン・
スチープ・リカ−３ｇ，カゼイン１５ｇ，ゼラチン７ｇ
．　　ＫＨｘＰＯｔ２．４ｇ，　　ＭｇＳＯｎ・７Ｈ！
０　０．５ｇ　．ＭｎＣｌ　・４Ｈｚ０　０．１ｇ　，
　　ＣａＣｌ＝　１　２１ｈ０　０．１ｇ　．およびト
ウモロコシでんぷん２０ｇを溶解もしくは分散した。こ
の栄養溶液のｐ｝ｌ値を５．３とした。上記のトウモロ
コシでふんはアミラーゼにより最高に分解されたもので
ある。この殺菌した栄養溶液に変異株■−３４の胞子を
接種し，振盪培養器中で最適な通気のもとに３０℃で約
５０時間培養を行った。この培養時間後，菌体を濾別し
，そして菌体を含まな？培養”は液を上記した方法によ
るプロテアーゼ活性の測定のために使用した。この場合
，この培養濾液は３７ｍＴＵ／一の酵素活性に達するこ
とが判明した。

例２ 培地の調製のために，１１の水道水に大豆粉（脱脂した
）　Ｌｏｇ　．コーン・スティーブ・リカ−５ｇ，カゼ
イン１２ｇ　．ゼラチン５ｇ，穀物原料の酒精蒸留残滓
５ｇ，　ＫＨ！ＰＯ４　２．４ｇ，　ＮａＮＯｚ　Ｉｇ
，　ＮＨ４ＣＩ　Ｉｇ，および生のトウモロコシでんぷ
ん３０ｇを溶解もしくは分敗した。この栄養溶液のｐＨ
値をオートクレープ処理後に５．３に調整した。この栄
養溶液を入れたＩＩ！のエルレンマイヤーフラスコに．
ｌＯｍｌのツアペソクー　ドック前培養物（でんぷん５
％および酵母エキス０．５％を加えた）一この前培養物
は変異株Ｉ［１−５９の胞子を接種し，　３０℃で２４
時間振盪培養したものである■を添加し．通気のもとで
約７２〜９６時間，　ｐＨ値が６．８〜７．０に上昇す
るまで培養した。その後．菌体を濾別し，透明な培養濾
液を上記した方法によるプロテアーゼ活性の測？のため
に使用した。この場合，この培養濾液は２８＋ｗＴＵ／
ｍｊの酵素活性に達することが判明した。

Ｍａｎｓｖｉｌｌｅ社のフィルター・セル（Ｆｉｌｔｅ
ｒ　Ｃｅｌ）５ｇおよびスタンダード・スーパー・セル
（Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｓｕｐｅｒ　Ｃｅｌ）５ｇの添加
のもとにおけるＩＯ個の１１振盪フラスコの混合物から
の培養濾液の清澄濾過，５０トールでの出発容量の１７
３の濃縮１そして攪拌下における水分を包まない硫酸ナ
トリウム３９％の添加での沈殿■この場合３８〜４０℃
の温度を用いた■によりプロテアーゼを分離した．しか
しまた，このプロテアーゼは−３〜５℃の温度で２容量
のエタノール，メタノール，アセトン，または他の水と
混合し得る溶剤の滴下により沈殿させることもできる。

この沈殿物を吸引濾過し．そして真空乾燥した。

例３ 上述した測定方法の使用のもとに，例１および例２によ
り分離したプロテアーゼの活性をｐ｝Ｉ値の関係におい
て調査した。第３表には，最適の活性ないし最適ｐＨ値
において測定された活性の５０％の活性が存在するｐｌ
ｌ値が示される。この値から認められるように，例１お
よび例２で使用した変異株のプロテアーゼは，野生株Ｃ
ＢＳ　２２７．７５から分離されたプロテアーゼと同様
に広いそして上記した使用領域に有利なｐＨ作用範囲を
所有する。

第３表 例４ 変異株リゾプス・リゾポデイホルミスＩＩＩ−３４．１
−４６，　　Ｉｌｌ−５９，およびＩ［［−６５から得
たプロテアーゼを，等電点分画電気泳動法もしくはＯｕ
ｃｈｔｅｒｌｏｎｙの交叉反応法（Ｋｒｅｕｚｒｅａｋ
　ｔ　ｉｏｎ）にしたがって，野生株ＣＢＳ　２２７．
７５から得たプロテアーゼと比較した。この場合，全部
のプロテアーゼの完全な同一性が明らかになった。

笠【あ』１０む課ｋ級汰 装置：マルチホール（Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ）２１１７，
ＬＫＢインストラメンツ ＬＫＢ　２１０３　　パワー・サブライ材料：　ＬＫＢ
アンホラインＰＡＧ　　プレート，　ＬＫＢインストラ
メンツ ｐＨ　３．５−９．５ 陽極冫１｝ξ：　Ｉ　　Ｍ　　Ｈ３ＰＯ４陰極液：　Ｉ
　Ｍ　ＮａＯｔｌ 笠４盈１１０紅曳永鉄 水冷した装置にポリアクリルアミドゲルを置いた後，電
極液を浸した紙の電極片をゲルの縁に置く。陰極と陽極
との間のゲルの中央線上に５ｍ＋の幅の濾紙片をおき．
そして１０μｌの塩を含まない試料溶液（５ｍｇ／一蛋
白質）を滴下する。装置の閉鎖後，　１０ａ＋Ａの電流
の強さでｐ｝ｌ勾配を形成させ．　３０分後に試料濾紙
片を除去し．そして１５＋＋＋Ａの電流の強さに高める
。２〜２．５時間後に分離は終了する。

建包虻坐夾完 ｐＨ勾配は，度盛りをした表面−ｐ｝Ｉ電極により，陰
極と陽極の間のｐＨの経過をいくつかの線上に補足し．
そしてｐ　［１　／　ｃｖａ−図をつくり上げるという
ようにして決定される。

里定表主互責負 固定液：トリクロル酢酸５７．５ｇとスルホサリチル酸
１７．２５ｇに蒸留水を加えて５００−にする。

脱色液：．エタノール５００−と酢酸１６０−からなる
混合物を蒸留水で希釈して２０００ｍｌにする。

着色液：脱色液４０〇一中にコオマジー・ブルー（Ｃｏ
ｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ）　Ｇ−２５０を０．４６ｇ
．ＰＮ、図の調製後，蛋白質沈殿およびアンホライン除
去のためにゲルを１時間攪拌している固定液中に放置し
．５分間脱色液で洗浄し，続いて６０”ｃで１０分間着
色液中に置く。このゲルを脱色液で数回洗浄することに
より，青色に着色した蛋白質バンドを背景から明瞭に目
立たせるまで脱色する。

ｐＬ図に基いて蛋白質の等電点を決定する。

Ｏｕｃｈ　ｔｅｒ　Ｉｏｎ　　の′　　応？料 交叉反応に対しては．フランクフルトのミルス社（Ｆｉ
ｒｍａ　Ｍｉｌｅｓ）の免疫拡散板（１＋＋＋＋ｕｎｄ
ｉｆｆｕｓｉｏｎｓｐｌａｔｔｅｎ）を使用する〈コー
ドＮｏ．６４−２７６−１）。この既製の板は，硼酸塩
／食塩緩衝液（ｐ｝１７．５−イオン強度０．１７５％
）中に０．９％のアガロースを含有する。この板はさら
に生菌剤として０．０１％のチオメルサール（Ｔｈｉｏ
ｍｅｒｓａｌ）および蛋白沈殿線に対する指示薬として
トリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎｂｌｕｅ）を含有する。

プロテアーゼＣＢＳ　２２７．７５に対する抗体は家兎
から得られたものである。

正の対照として，プロテアーゼＣＢＳ　２２７．７５　
−それで免疫が実施された■を使用した。

太哉． 上記拡散板の中央に２５μｌの抗血精をピペットでおき
．その外側にある凹所に５ｍｇ／一ないし１０ｎ＋ｇ／
一の濃度で各２５μｌの蛋白Ｘ溶液をおいた．拡散時間
：４℃７２時間である． 沈殿線はアガロース中に含有されているトリバンブルー
指示薬により検出される。免疫学的交叉反応は．抗体を
生戒するプロテアーゼが試験したプロテアーゼと同しで
あるときにだけ正の結果となる。これは沈殿線の溶解に
より確かめられる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）振盪培養で＞１０ｍＴＵ／ｍｌの蛋白質分解活性を
   生成し、そのプロテアーゼが下記野生株それと同じであ
   る、野生株リゾプス・リゾポデイホルミスＣＢＳ２２７
   ．７５の変異株。 ２）下記の寄託番号 リゾプス・リゾポデイホルミスIII−３４（ＣＢＳ２１
   ９．８０）リゾプス・リゾポデイホルミスIII−４６（
   ＣＢＳ２２０．８０）リゾプス・リゾポデイホルミスI
   II−５９（ＣＢＳ２２１．８０）リゾプス・リゾポデイ
   ホルミスIII−６５（ＣＢＳ２２２．８０）をもつ特許
   請求の範囲第１項記載の野生株リゾプス・リゾポデイホ
   ルミスＣＢＳ２２７．７５の変異株。