JPS5851899A - Determination of lipid and related components and composition therefor - Google Patents

Determination of lipid and related components and composition therefor

Info

Publication number
JPS5851899A
JPS5851899A JP14831381A JP14831381A JPS5851899A JP S5851899 A JPS5851899 A JP S5851899A JP 14831381 A JP14831381 A JP 14831381A JP 14831381 A JP14831381 A JP 14831381A JP S5851899 A JPS5851899 A JP S5851899A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
activity
coa
composition
measuring
fatty acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP14831381A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JPS6339238B2 (en
Inventor
Shigeyuki Imamura
茂行 今村
Hideo Misaki
美崎　英生
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toyo Jozo KK
Original Assignee
Toyo Jozo KK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toyo Jozo KK filed Critical Toyo Jozo KK
Priority to JP14831381A priority Critical patent/JPS5851899A/en
Priority to IT22048/82A priority patent/IT1157281B/en
Priority to FR8211073A priority patent/FR2508487B1/en
Priority to CA000405920A priority patent/CA1215903A/en
Priority to US06/392,010 priority patent/US4491631A/en
Priority to DE3249973A priority patent/DE3249973C2/de
Priority to GB08218552A priority patent/GB2105843B/en
Priority to DE19823223874 priority patent/DE3223874A1/en
Priority to CH3917/82A priority patent/CH664631A5/en
Publication of JPS5851899A publication Critical patent/JPS5851899A/en
Publication of JPS6339238B2 publication Critical patent/JPS6339238B2/ja
Granted legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

PURPOSE:A fatty acid is converted into an acyl-CoA, further into dehydroacyl- CoA, hydroxyacyl-CoA and ketoacyl-CoA and the reduced-type NAD which is formed in the course of the reactions is measured to determine the fatty acid. CONSTITUTION:CoASH, ATP or GTP and acyl-CoA synthetase are made to act on a fatty acid. Oxygen and acyl-CoA oxidase are made to act on the product to give dehydroacyl-CoA, which is made to react with water and enoyl CoA hydratase to form hydroxyacyl-CoA. Then, NAD and 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase is made to act on the product to form ketoacyl-CoA and reduced- type NAD and the former is converted into acyl-CoA. The formed reduced-type NAD is measured with a wave length in the absorption region to determine the fatty acid.

Description

【発明の詳細な説明】 存在する遊離脂肪酸、捷たけ脂肪酸エステルから遊離し
た脂肪酸、脂肪酸エステル捷たは脂肪酸エステルに作用
して脂肪酸を遊離せしめる酵素の活性のいずれか１つの
成分の測定法およびｉｌｌｌｌ定用組成物に関する。[Detailed description of the invention] A method for measuring any one component of existing free fatty acids, fatty acids liberated from strained fatty acid esters, fatty acid ester strain, or the activity of an enzyme that acts on fatty acid esters to liberate fatty acids. The present invention relates to a composition for regular use.

従来より血清中の遊離脂肪酸の酵素的測定法とｌ〜では
、存在する遊離脂肪酸に、アノルーＣｏＡ・ンンセター
ゼ（　Ａｃｙｌ−ＣｏＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，　）
活性の存在下にＣｏＡＳＩ（　（　ｍｌ　ｘ　７チ−ム
Ａ）およびＡ−ＴＰ（アデン／ン・トリホスフエ−ト）
を用いてアノルーＣｏＡ　。Conventionally, in the enzymatic measurement method of free fatty acids in serum, the free fatty acids present are treated with anol-CoA synthetase (Acyl-CoA synthetase, ).
CoASI ((ml x 7 team A) and A-TP (aden/triphosphate) in the presence of activity
using anol-CoA.

ＡＭＰ（アデノシン・モノホスフェート）、ピロリン酸
を生成せしめ、次いで生成しだＡＭＰに、ミオキナーゼ
（　Ｍｙｏｋｉｎａｓｅ　）活性の存在下Ａ　’Ｊ’　
Ｐを用いて１モル比のＡＭＰより２モル比のＡＤＰ（ア
デノシン・ジホスフェート）を生成せしめる。さらにこ
の生成したＡ．　Ｄ　Ｐにピルベート・キナーゼ（Ｐｙ
ｒｕｖａｔｅ　Ｋｉｎａｓｅ　）活性の存在下にポスホ
エノーｊｌｚ　ピルベートを用いてＡ　’Ｉ”　Ｐおよ
びピルベートヲ生成せしめ、その後生成したピルベート
にラクテート・デヒドロゲナーゼ（　Ｌａｃｔａｔｅ　
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）活性の存在下に還元型Ｎ
ＡＤ　にコチン・アテニン・ジヌクレオチド）を用いて
ラクテートおよびＮＡＤを生成せしめ、その際反応にお
いて消費される還元型ＮＡＤの量を波長３４．０ｎｍに
て測定して吸光度の減少を求め、１モル比の脂肪酸によ
り２モル比の還元型ＮＡＤを消費する量として測定する
方法が知られている（　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙｌ上，３４．１−３４．５（１９７
９）］。寸だ別法として、遊離脂肪酸にアンルーＣｏＡ
・シンセターゼノ存在下にＣｏＡ　Ｓ　Ｉ（およびＡＴ
Ｐを用いてアン／１／　−　ＣｏＡ　。AMP (adenosine monophosphate) and pyrophosphate are generated, and then the generated AMP is treated with A'J' in the presence of myokinase activity.
P is used to generate 2 molar ratios of ADP (adenosine diphosphate) from 1 molar ratio of AMP. Furthermore, this generated A. Pyruvate kinase (Py
A'I''P and pyruvate are generated using poshoenol pyruvate in the presence of lactate kinase) activity, and then the generated pyruvate is treated with lactate dehydrogenase (Lactate dehydrogenase).
reduced N in the presence of dehydrogenase) activity.
Lactate and NAD were produced using AD (cotine atenine dinucleotide), and the amount of reduced NAD consumed in the reaction was measured at a wavelength of 34.0 nm to determine the decrease in absorbance, and the 1 molar ratio was determined. A method is known in which the amount of reduced NAD consumed at a 2 molar ratio by fatty acids is measured (Analytical Bio
on chemistryl, 34.1-34.5 (197
9)]. As an alternative, unruly CoA is added to the free fatty acids.
・CoA S I (and AT
An/1/-CoA using P.

Ａ　Ｍ　Ｐおよびピｐ　ＩＪン酸を生成せしめ、次いで
生成したアノルーＣｏＡにアノルーＣｏＡ・オキシダー
ゼ（　Ａｃｙｌ−ＣｏＡ・ｏｘｉｄａｓｅ　）活性の存
在下に酸素を消費させて２．３−トランス−エノイル−
ＣＯＡオヨび過酸化水素を生成せしめ、その後生成した
過酸化水素に４−アミノアンチピリン、２．４．−ジブ
ロモフェノールおよびベルオギンダーゼ（ＰｅｒＯｘ　
ｉｄａｓｅ）活性により呈色色素となし、この呈色を測
定する方法〔Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　−１　０８、６−１０（１９８０）’）が知
られている。しかしながら特に、アシル−ＣｏＡ・オキ
シダーゼ活性を利用する方法では、生成する過酸化水素
が用いるＣｏＡ．　Ｓ　Ｈの還元性作用により悪影響を
受けるもので、従って第一反応の終了後に残存したＣｏ
Ａ　Ｓ　ＨをＮ−エチルマレイシドにて非還元性物質に
変化させた後に第二反応を行なわせしめねばならない欠
点があり、同時反応をなし得ないものであった。寸だ血
清中に存在するリパーゼ活性の測定においては、そのリ
パーゼ活性は弱く、従ってリパーゼ活性測定に用いる基
質である脂肪酸エステルからの遊離脂肪酸の量も少なく
、よって上記三方法では感度的に充分に測定し得ないも
のであった。AMP and pipIJ acid are produced, and then the produced anol-CoA is made to consume oxygen in the presence of anol-CoA oxidase (Acyl-CoA oxidase) activity to form 2,3-trans-enoyl-
COA and hydrogen peroxide are generated, and then the generated hydrogen peroxide is treated with 4-aminoantipyrine, 2.4. - dibromophenol and beluogindase (PerOx
idase) activity, and a method of measuring this coloration [Analytical Biochemistry
Stry-1 08, 6-10 (1980)') is known. However, in particular, in the method utilizing acyl-CoA oxidase activity, the generated hydrogen peroxide is the CoA. It is adversely affected by the reducing action of S H, and therefore the Co remaining after the first reaction is
This method has the disadvantage that the second reaction must be carried out after converting A S H into a non-reducing substance with N-ethylmaleside, and simultaneous reactions cannot be carried out. In the measurement of lipase activity present in serum, the lipase activity is weak, and therefore the amount of free fatty acids from fatty acid ester, which is the substrate used for lipase activity measurement, is small, so the above three methods are insufficient in terms of sensitivity. It was impossible to measure.

捷だ前者の測定方法では１モル比の脂肪酸から２モル比
の還元型ＮＡＤＯ量の減少を測定する定量法であるがそ
の測定感度は不充分であった。The former measurement method is a quantitative method that measures the decrease in the amount of reduced NADO from a 1 molar ratio of fatty acids to a 2 molar ratio of reduced NADO, but its measurement sensitivity was insufficient.

本発明者らは、弱いリパーゼ活性の如くの少量の脂肪酸
１，か遊離し得ない場合であっても良好に定量し得る方
法について種々研究した結果、少なくとも被検液中に存
在する脂肪酸１＆は脂肪酸エステルから遊離された脂肪
酸を、１ずアシル−ＣｏＡとなし、次いでこのアシル−
ＣＯＡをデヒドロアシル−ＣｏＡとなし、さらにとのデ
ヒド「コア／ルーＣｏＡをヒドロキンアンルーＣｏＡと
なし、このヒドロキシアシル−ＣｏＡをケトアンルーＣ
ｏＡとなし、次いでこのケトアノルーＣｏＡをアシル−
ＣｏＡとなす工程を組合せることにより、同時反応にて
良好に測定し得ることを見い出した。The present inventors have conducted various studies on methods that can satisfactorily quantify small amounts of fatty acids 1, such as weak lipase activity, even when they cannot be liberated. The fatty acid released from the fatty acid ester is first converted into acyl-CoA, and then this acyl-CoA is converted into acyl-CoA.
COA is changed to dehydroacyl-CoA, and the dehyde core/ru-CoA is changed to hydroquine unru-CoA, and this hydroxyacyl-CoA is converted to ketoanru-C.
oA and then convert this ketoanol-CoA into acyl-CoA.
It has been found that by combining CoA and the following steps, it is possible to perform measurements favorably through simultaneous reactions.

即ちこの反応の最終工程で生成されたアンルーＣｏＡは
被検液中の脂肪酸の鎖長に比べて炭素数２個少ないアン
ル基を有するもので、さらにこのアシル−ＣｏＡは順次
にデヒドロアシル−ＣｏＡ・ヒドロキンアシル−ＣｏＡ
　、ケトアンルーＣＯＡトナリ、次いで２個炭素数を減
じたアシル−ＣｏＡを生成するサイクルを形成する。こ
の形成されるサイクルは被検液中の脂肪酸の炭素数に応
じて高次サイクルをなす。この高次サイクルにて１モル
比の脂肪酸から生成または消費される高モル比の成分を
直接または種々の手段により著しく高感度にて検出　１
５− できる変化として測定する。この測定において被検液中
の脂肪酸は■ＡＴＰまだはＧ　Ｐ　Ｔ　、ｌ！：　Ｃｏ
ＡＳＨおよびアンルーＣｏＡ・シンセタービ活性に基く
反応工程によリーア／ルーＣｏＡとなし、■アシルＣｏ
Ａを酸素およびアンル−Ｃｏ　Ａ・オキシダービ活性に
基く反応工程によりデヒドロアンルーＣｏＡとなし、■
とのデヒドロアンルーＣｏＡを水およびエノイル−Ｃｏ
　Ａ　−ヒドラターゼ（Ｂｎｏｙｌ−ＣｏＡ　ｈｙｄｒ
ａｌａｓｅ　。That is, the Anru-CoA produced in the final step of this reaction has two fewer Anru groups than the chain length of the fatty acid in the test solution, and this acyl-CoA is sequentially converted into dehydroacyl-CoA. Hydroquinacyl-CoA
, a ketoan-COA, and then an acyl-CoA with a reduced number of carbons of two is formed. This cycle formed constitutes a higher-order cycle depending on the number of carbon atoms in the fatty acid in the test liquid. In this higher cycle, components with a high molar ratio produced or consumed from a fatty acid with a 1 molar ratio can be detected with extremely high sensitivity directly or by various means 1
5- Measure as possible changes. In this measurement, the fatty acids in the test solution are ■ATP and G P T , l! : Co
Acyl Co
A is converted into dehydroanru-CoA through a reaction process based on oxygen and anru-Co A/oxidavi activity,
Dehydroanlu-CoA with water and enoyl-Co
A-hydratase (Bnoyl-CoA hydratase)
Alase.

Ｅ、Ｃ，４，。２，１．１７）活性に基く反応工程によ
りヒドロキンアシル−ＣｏＡとなし、■このヒドロキン
アンルーＣｏＡをＮＡＤおよび３−ヒドロキンアシｆｉ
Ｖ−ＣＯＡ、−デヒドロゲナービ（３−Ｈｙｄｒｏｘｙ
ａｓｙｌ　−ＣｏＡ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅＸＥ
、Ｃ，１，１゜１．８５　）活性に基く反応工程により
ケトアンル−ＣｏＡとなし、■このケトアノルーＣｏＡ
をＣｏ　Ａ　Ｓ　Ｉ−Ｉおよび３−ケトアンルーＣＯＡ
・チオラーゼ（３−Ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡｔｈｉｏ
ｌａｓｅＸＥ、　Ｃ，２，３゜１．１６）活性に基く反
応工程により■反応工程にて生ずるアンルーＣｏＡに比
べて炭素数２個の単位で減じたアンルーＣｏＡを生成す
るもので、この生成されたアシル−ＣｏＡは１６−− ■反応工程以後の反応に基いて炭素数２個の単位で分解
するβ酸化サイクルを形成し、その際反応系において検
出できる変化を測定するもので、このようにして１モル
比の脂肪酸からβ酸化サイクルのサイクル数に応じた高
モル比の変化として高感度にて脂肪酸、捷だけ脂肪酸を
遊離せしめる系からの脂肪酸を測定する方法、および測
定用組成物について完成した。E, C, 4,. 2,1.17) Hydroquine acyl-CoA is produced through an activity-based reaction process, and this hydroquine unruly-CoA is converted into NAD and 3-hydroquine acyl-CoA
V-COA, -dehydrogenabi (3-Hydroxy
asyl-CoA dehydrogenase
, C,1,1゜1.85) Ketoanru-CoA is formed by a reaction process based on activity, ■ this ketoanru-CoA is
CoAS I-I and 3-ketoanru-COA
・Thiolase (3-Ketoacyl-CoAthio)
laseXE, C,2,3゜1.16) The activity-based reaction process produces Unruh-CoA, which has a reduced number of carbon atoms by 2 units compared to the Unruh-CoA produced in the reaction process. Acyl-CoA forms a β-oxidation cycle in which it decomposes in units of 2 carbon atoms based on the reaction after the 16-- ■ reaction step, and at this time, changes that can be detected in the reaction system are measured. Completed a method for measuring fatty acids from a system in which fatty acids are released only by shaking, and a composition for measurement, with high sensitivity as a change in high molar ratio according to the number of β-oxidation cycles from a 1 molar ratio of fatty acids. .

本発明は上記の知見に基いて完成されたもので、被検液
中の成分を定量するに当り、下記の反応工程■、■、■
、■、■ ■　脂肪酸をアシル−ＣｏＡにする反応工程、■　アン
ルーＣｏＡをデヒドロアシル−ＣｏＡにする反応工程、 Ｏデヒドロアシル−ＣｏＡヲヒドロキ／アンアシＣｏＡ
にする反応工程、 ■　ヒドロキンアンルーＣｏＡをケトアンルーＣｏＡに
する反応工程、 ■　ケトアノルーＣＯＡをアシル−ＣｏＡにする反応工
程、 および検出できる変化を測定する工程を有することを特
徴とする測定法、および、少なくとも、下記の組成 ・ＡＴＰまたはＯＴＰ。The present invention was completed based on the above knowledge, and in quantifying the components in the test liquid, the following reaction steps
, ■, ■ ■ Reaction step for converting fatty acid into acyl-CoA, ■ Reaction step for converting Anru-CoA into dehydroacyl-CoA,
1. A reaction step for converting hydroquine-an-CoA into keto-an-CoA; 2. A reaction step for converting keto-an-CoA into acyl-CoA; and a step for measuring a detectable change. , at least the following composition: ATP or OTP.

−ＣｏＡＳＩ（ ・ＮＡＤ。-CoASI( ・NAD.

・アンルーＣｏＡ・ノンセターゼ活性の成分、・アンル
−ＣｏＡ・オキンダービ活性の成分、・エノイル−Ｃｏ
Ａ・ヒドラターセ゛活性の成分、・３−ヒドロキシアシ
ル−ＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性の成分、 ・３−ケトアンルーＣｏＡ・チオラーヒ活性の成分、を
含有することを特徴とする測定用組成物である。・Anru-CoA, component of noncetase activity, ・Anru-CoA, component of Okindavi activity, ・enoyl-Co
This is a measurement composition characterized by containing a component of A. hydratase activity, a component of 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase activity, and a component of 3-ketoan-CoA thiolahi activity.

捷ず本発明の被検液としては、少なくとも脂肪酸を含有
するものであればよく、またその脂肪酸としては、例え
ば炭素数６のカプロン酸、炭素数８のカフリＩＶ酸、炭
素数１０のカプリン酸、炭素数１２のラウリン酸、炭素
数１４のミＩＪスチ／酸、炭素数１６のパルミチン酸や
、パルミトレイン酸、炭素数１８のステアリン酸、オレ
イン酸、リノ−ル酸やリル鼻ン酸、などの種々の脂肪酸
が挙られる。さらにこの脂肪酸としては、例えばバター
、マーガリン、チーズ、ハム、牛乳、マヨネーズなどの
飲食品中の遊離脂肪酸や脂肪酸エステルの成分、血清や
尿などの生体液中の遊離脂肪酸や脂肪酸エステル、捷た
はそれらに作用する酵素活性に基く反応生成物、医薬製
剤中の遊離脂肪酸捷たはその塩や脂肪酸エステルの成分
や、脂肪酸または脂肪酸エステルに作用する市販の酵素
試薬の酵素活性に基〈反応生成物などの種々の成分を測
定するための脂肪酸、または遊離される脂肪酸が挙られ
る。さらにまた脂肪酸エステルから脂肪酸を遊離せしめ
るに当っては、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなど
を用いるアルカリケン化に基いて脂肪酸を遊離せしめて
もより、寸たこの脂肪酸エステルに作用して脂肪酸を遊
離せしめるｌ以」−の酵素活性に基いて脂肪酸を遊離せ
しめてもよい。The test solution of the present invention may be any liquid as long as it contains at least a fatty acid, and examples of the fatty acid include caproic acid having 6 carbon atoms, caffri IV acid having 8 carbon atoms, and capric acid having 10 carbon atoms. , 12-carbon lauric acid, 14-carbon acid, palmitic acid, 16-carbon acid, palmitoleic acid, 18-carbon stearic acid, oleic acid, linoleic acid, lyrinnosic acid, etc. Various fatty acids are mentioned. Furthermore, these fatty acids include, for example, components of free fatty acids and fatty acid esters in foods and drinks such as butter, margarine, cheese, ham, milk, and mayonnaise, free fatty acids and fatty acid esters in biological fluids such as serum and urine, Reaction products based on the enzyme activity that acts on them, components of free fatty acids or their salts and fatty acid esters in pharmaceutical preparations, and enzyme activities of commercially available enzyme reagents that act on fatty acids or fatty acid esters. fatty acids for measuring various components such as, or released fatty acids. Furthermore, in liberating fatty acids from fatty acid esters, fatty acids can be liberated by alkaline saponification using sodium hydroxide, potassium hydroxide, etc. Fatty acids may be liberated based on enzymatic activity.

さらに脂肪酸エステルとこの脂肪酸エステルに作用して
脂肪酸を遊離せしめる酵素活性との組合せにおいて、脂
肪酸エステルの成分を測定しようとする場合には該当す
る酵素活性によって脂肪酸を遊離せしめればより、捷だ
酵素活性を測定しようとする場合には該当する脂肪酸エ
ステルの含有物および必要に応じて他の酵素活性を有す
る成分を用いて脂肪酸を遊離せしめればよいもので、脂
肪酸エステルの測定１だけ酵素活性の測定のいずれかの
１つの成分の測定のために用いられる。この脂肪酸エス
テルと該当する酵素活性の組み合せとしては脂肪酸を遊
離せしめ得る組み合せであれば何ら限定されるものでな
く、種々挙られる。例えば脂肪酸エステルがモノグリセ
ライド、ジグリセライドまたはトリクリセライトなどの
グリセライドであり、酵素活性がリパーゼ活性である組
み合せにおいては、グリセライドから遊離される脂肪酸
の測定によってグリセライド捷たはリパーゼ活性のいず
れか１つの成分の測定がなされる。好１しくはグリセラ
イドの測定の際には例えば血清中などのトリグリセライ
ド測定用とすればよく、リパーゼ活性を含有する試薬を
用いて血清に作用せしめ、そのトリグリセライドから脂
肪酸を遊離せしめればよい。寸だリパーゼ活性の測定の
際には例えば血清中の膵リパーゼ活性の測定用とすれば
よく、グリセライドを含有する試薬を用いて血清に作用
せしめ、そのグリセライドから脂肪酸を遊離せしめれば
よい。さらにこの膵リパーゼ活性測定におけるグリセラ
イドとしては、用いるグリセライドによる反応系の濁り
の防止のだめにモノグリセライド捷だはジグリセライド
を用いることが好捷しく、さらにアルブミン、例えば牛
血清アルブミンを用いることが好ましい。さらに脂肪酸
エステルとこの脂肪酸エステルに作用して脂肪酸を遊離
せしめる酵素活性とによる脂肪酸の遊離の系としては、
例えば脂肪酸エステルがレシチンであす、酵素活性がホ
スホリパーセ゛Ａ１活性、ホスホ活性−ゼＡ２活性捷た
はホスホリパービＢ活性である系、脂肪酸エステルがリ
ゾレシチンであり、酵素活性がリゾホスホリパーセ゛活
性である系、脂肪酸エステルがホスファチジン酸であり
、酵素活性がホスファチジン酸ホスファターゼ活性およ
びリパーゼ活性である系、脂肪酸エステルがレシチンで
あシ、酵素活性がホスホリパーゼＣ活性およびリパーゼ
活性である系、脂肪酸エステルがレシチンであり、酵素
活性がホスホリパービＤ活性、ホスファチジン酸ホスフ
ァターゼ活性およびリパーゼ活性である系、脂肪酸エス
テルがアシルコリンであり、酵素活性がコリンエステラ
ーゼ活性でアル系、脂肪酸エステルがコレステロールエ
ステルなどのステロールエステルであり、酵素活性がコ
レステロールエステラーゼ活性である系、し／チノとコ
レステロールとの含有物ト、レシチンコレステロ−ルア
フルトランスフェラーゼ活性、コレステロールエステラ
ーゼ活性またはりゾホスポリハーゼ活性との組合せの系
などが挙られる。これらの被検液において脂肪酸の測定
に基いて、脂肪酸自体の定量や例えばリパーゼ活性の測
定、ｌ−ジグリセライドの定量、ホスホリパーゼＡ、＋
活性の測定、ホスホリバー七゛Ａ２活性の測定、ホスホ
リバー　ヒＢ活性の測定、リゾホスホリパーヒ活性の測
定、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性の測定、ホス
ホリパーゼＣ活性の測定、ホスホリパービＤ活性の測定
、コリンエステラービ活性の測定、コレステロールエス
テラ−ビ活性の測定、レンチンの定Ｈ、コレステロール
エステルの定量、レンチンＪレステロールアンルｌ−ラ
ンスフエラーセ活性の測定、コレステロールの定量など
の種々の測定目的にて用いられる。まだこれらの脂肪酸
を遊離せしめる系において、用いられる各試薬の量は、
測定すべき目的や選択する反応条件によって適宜変更役
割すればよく、特に限定されるものではなく、反応によ
って遊離される脂肪酸の量が定量測定するに充分量遊離
される条件であればよい。また脂肪酸を遊離せしめるに
当っては、通常３７℃近辺の温度条件にて行なえばよく
、１だ反応時間は脂肪酸が充分量遊離されるに要する時
間以上であればよく、通常１分以」−行なわれる。Furthermore, in a combination of a fatty acid ester and an enzyme activity that acts on the fatty acid ester to liberate the fatty acid, when trying to measure the components of the fatty acid ester, it is better to liberate the fatty acid by the corresponding enzyme activity. When trying to measure the activity, it is sufficient to liberate the fatty acid using the content of the relevant fatty acid ester and, if necessary, other components with enzyme activity. Used for the measurement of any one component of the measurement. The combination of the fatty acid ester and the corresponding enzyme activity is not limited to any combination as long as it can liberate the fatty acid, and various combinations may be mentioned. For example, in a combination where the fatty acid ester is a glyceride such as monoglyceride, diglyceride, or triclycerite, and the enzyme activity is lipase activity, the fatty acid released from the glyceride can be measured to determine whether the glyceride or lipase activity of one of the components is high. Measurements are taken. Preferably, when measuring glyceride, it may be used for measuring triglyceride in serum, for example, and a reagent containing lipase activity may be used to act on serum to liberate fatty acids from the triglyceride. When measuring lipase activity, for example, it may be used to measure pancreatic lipase activity in serum, and a reagent containing glyceride may be used to act on serum to liberate fatty acids from the glyceride. Furthermore, as the glyceride used in pancreatic lipase activity measurement, it is preferable to use monoglyceride or diglyceride in order to prevent turbidity of the reaction system due to the glyceride used, and it is further preferable to use albumin, such as bovine serum albumin. Furthermore, the system for releasing fatty acids by fatty acid esters and enzyme activity that acts on these fatty acid esters to release fatty acids is as follows:
For example, the fatty acid ester is lecithin, the enzyme activity is phospholipase A1 activity, phosphoactivase A2 activity, or phospholipase B activity, the fatty acid ester is lysolecithin, and the enzyme activity is lysophospholipase activity, fatty acid ester is phosphatidic acid and the enzyme activity is phosphatidic acid phosphatase activity and lipase activity; the fatty acid ester is lecithin and the enzyme activity is phospholipase C activity and lipase activity; the fatty acid ester is lecithin and the enzyme activity is is phospholipavi D activity, phosphatidic acid phosphatase activity and lipase activity, the fatty acid ester is acylcholine, the enzyme activity is cholinesterase activity and the al type, the fatty acid ester is a sterol ester such as cholesterol ester, and the enzyme activity is cholesterol esterase activity. Examples include a system in which a combination of cylindrical and cholesterol-containing substances, lecithin-cholesterolase activity, cholesterol esterase activity, or lysophospolyhase activity is used. Based on the measurement of fatty acids in these test solutions, quantification of fatty acids themselves, measurement of lipase activity, quantification of l-diglyceride, phospholipase A, +
measurement of phospholipase C activity, measurement of phospholipase A2 activity, measurement of phospholipase B activity, measurement of lysophospholipase activity, measurement of phosphatidic acid phosphatase activity, measurement of phospholipase C activity, measurement of phospholipase D activity, measurement of cholinesterabi activity. It is used for various measurement purposes such as measurement of cholesterol esterase activity, determination of lentin H, cholesterol ester determination, measurement of lentin J, cholesterol esterase activity, and cholesterol quantification. In systems that still liberate these fatty acids, the amounts of each reagent used are:
The role may be changed as appropriate depending on the purpose of measurement and the reaction conditions selected, and there are no particular limitations, as long as the conditions are such that a sufficient amount of fatty acid is released for quantitative measurement of the amount of fatty acid released by the reaction. Furthermore, in order to liberate fatty acids, it is usually sufficient to carry out the reaction at a temperature around 37°C, and the reaction time may be longer than the time required to liberate a sufficient amount of fatty acids, usually 1 minute or less. It is done.

寸だ本発明の被検液中の脂肪酸を測定するだめの■、■
、■、■および■の各反応工程を例示すれば、次の如く
である。How to measure fatty acids in a test solution according to the present invention ■, ■
, (1), (2) and (2) are exemplified as follows.

■　反応工程；脂肪酸をアノルーＣｏＡにする反応工程
である。例えば脂肪酸をＡＴＰおよびＣｏＡＳＨの共存
下にてアシル−ＣｏＡ、ＡＭＰおよびピロリン酸（ｐｐ
ｉ）となす反応を触媒する酵素活性を有するアシル−Ｃ
ｏＡ・／ンセターピ活性、Ａ、ＴＰおよびＣｏ　Ａ　Ｓ
　Ｈに基く反応工程が挙られる。(2) Reaction step: This is a reaction step for converting fatty acids into anol-CoA. For example, fatty acids are combined with acyl-CoA, AMP, and pyrophosphate (pp.
i) Acyl-C having enzymatic activity to catalyze the reaction
oA/ncetapi activity, A, TP and Co A S
Mention may be made of H-based reaction steps.

シンセターゼ活性 ■　反応工程；アンルーＣｏＡをデヒドロアンルＣｏ　
Ａにする反応工程である。例えばアンルーＣｏＡを酸素
の存在下にデヒドロアンル−ＣｏＡおよび過酸化水素と
なす反応を触媒する酵素活性を有するアシル−ＣｏＡ・
オキンダービ活性および酸素に基く反応工程が挙られる
。Synthetase activity■ Reaction process; Anru-CoA is converted to dehydroanru-Co
This is a reaction step to obtain A. For example, acyl-CoA, which has enzymatic activity to catalyze the reaction of unruh-CoA to dehydroanru-CoA and hydrogen peroxide in the presence of oxygen.
Okindarbi activity and oxygen-based reaction processes are mentioned.

オギンダービ活性 ■　反応工程；デヒドロアンル−ＣｏＡをヒドロキンア
シル−ＣｏＡにする反応工程である。例えばデヒドロア
ンルーＣｏＡを水の存在下にヒドロキシアンルーＣＯＡ
となす反応を触媒する酵素活性を有するエノイル−Ｃｏ
Ａ・ヒドラタービ活性および水に基く反応工程が挙られ
る。Ogindarbi activity (1) Reaction step: This is a reaction step to convert dehydroanyl-CoA to hydroquinacyl-CoA. For example, dehydroanru-CoA is mixed with hydroxyanru-COA in the presence of water.
Enoyl-Co has enzymatic activity to catalyze the reaction
A. hydraturbi activity and water-based reaction steps are mentioned.

■　反応工程；ヒトロキ／ア／ルーＣｏＡをケトアンル
ーＣｏＡにする反応工程である。例えばヒドロギンアノ
ルーＣｏＡをＮＡＤの存在下にケトアンルーＣｏＡおよ
び還元型ＮＡＤとなす反応を触媒する酵素活性を有する
３−ヒドロギンアノルーＣｏＡ・デヒドロゲナーヒ活性
およびＮＡＤに基く反応工程が挙られる。(2) Reaction step: This is a reaction step for converting human loki/a/ru-CoA into ketoanru-CoA. For example, a reaction step based on 3-hydrogineano-CoA/dehydrogenase activity and NAD, which has an enzyme activity that catalyzes the reaction of hydrogineano-CoA to ketoan-CoA and reduced NAD in the presence of NAD, can be mentioned.

〔ヒト狛キンア／ルーＣｏＡ） ■　反応工程；ケトアンルーＣｏＡをアノルーＣｏＡに
する反応工程である。例えばケトアンルーＣｏＡをＣｏ
　Ａ　Ｓ　Ｉ−１の存在下にアノルーＣｏＡおよびアセ
チル−ＣｏＡとなす反応を触媒する３−ケトアンルーＣ
ＯＡ・ブオラービ活性およびＣｏＡＳＨに基〈反応工程
が挙られる。[Human Komakina/Rue-CoA] (1) Reaction step: This is a reaction step for converting keto-an-CoA into anor--CoA. For example, Keto Anru-CoA is Co
3-KetoanruC catalyzes the reaction with anol-CoA and acetyl-CoA in the presence of AS I-1
Examples of reaction steps include OA/buolavi activity and CoASH.

これらの各反応工程を遂行せしめるために、各反応に要
する試薬および酵素活性を奏する各酵素を用いればよく
、寸だ用いられる酵素としては、動物由来のものでも、
微生物由来のものでも使用でき、捷だこれらは市販の酵
素を用いてもよく、捷だ酵素含有組織から単離したもの
でもよい。アシル−ＣｏＡ・ノンセターゼ活性を奏する
酵素としては、例えばモルモット肝臓由来のもの〔Ｊｌ
ｌｉｏｌ。In order to carry out each of these reaction steps, it is sufficient to use the reagents required for each reaction and each enzyme that exhibits enzymatic activity, and the enzymes that can be used include animal-derived enzymes,
Enzymes derived from microorganisms can also be used, and commercially available enzymes may be used, or enzymes isolated from tissues containing the enzyme may be used. Examples of enzymes that exhibit acyl-CoA noncetase activity include those derived from guinea pig liver [Jl
liol.

Ｃｈｅｍ、、ｌＢ、３２９　（１９５３）　〕、ラット
、マウス、ウシ、ブタなどの肝臓由来のもの（特開昭５
５−７４、７９１号公報）、工・／エリヒア・コリー（
Ｅｓｃｈｅ　ｒ　ｉ　ｃｈ　ｉ　ａｃｏｌｉ）由来のも
の（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１２゜５
７６（１９７０）Ｌバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｍｅｇａＩｅｒｉｕｍ）由来のもの（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ上（１）、８５　（１９６５））、そ
の他、アエロバクタ−（Ａｅｒｏｂａｃｔｏｒ）属に属
する生産菌（Ａ。Chem, IB, 329 (1953)], those derived from the liver of rats, mice, cows, pigs, etc.
5-74, Publication No. 791), Eng./Elihia Collie (
Escherichia coli) (Eur, J. Biochem, 12°5
76 (1970) L. Bacillus megaterium
llusmegaIerium) (Bioc
hemistry (1), 85 (1965)), and other producing bacteria belonging to the genus Aerobacter (A.

ａｅｒｏｇｅｎｃｓ　　ＪＦＯ３３］、８Ｌセラチア（
Ｓｅｒａｔｉａ）属に属する生産菌（Ｓｅｒａｔ　ｉａ
　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　Ｉ　Ｆｏ　３０５４、　）、
プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属に属する生産菌（Ｐｒ
ｏｔｅｕｓｍｉ　ｒａｂ口ｉｓ　ＩＦ　Ｆ　０８８４９
）、スタフィロコッカス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ　）属に属する生産菌（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ　ａｕｒｅｕｓ　　ＴＦＯ３０６０）、シュー　トモ
ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する生産菌（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＩＦＯ３
９］９）、フザリウム（Ｆｕｓａｒ　ｉｕｍ）属に属す
る生産菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　　
Ｉ　Ｆ　０５９４・２）、キベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌ
　ｌａ）属に属する生産菌（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａｆｕ
ｊｉｋｕｒｏｉ　　ＩＦＯ６６０４）、キャンシタ（Ｃ
ａｎｄｉｄａ）属に属する生産菌（Ｃａｎｄｉｄａｌｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａ”ｉ　Ｆ　Ｏ０７１７）などの微生物
由来のもの［Ｊ、　Ｂａｃｌｅｒｉｏｌ、、　１０５　
（３）１２１６（１９７１）、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、、］　１４　（１）２４９　（１９７８）、特開昭５
５−７４．７９０号公報、特開昭５５−９９１８７号公
報〕などが挙られる。さらに脂肪酸をアンルーＣｏＡと
する反応を触媒する酵素としてはＧ　Ｔ　ＰＸＣｏＡＳ
Ｈの存在下に脂肪酸をアシル−ＣｏＡとなし、Ｇ□ＤＴ
およびオルトリン酸を生成するアシル−ＣｏＡ・ンンセ
タービが挙られ、このアンルーＣｏＡ・ゾノセターセを
用いてもよい。（Ｊ、Ｂｉｏｌ、ＣＣ１１ｅ、　、２３
９゜（６）１６９４．（１９６４，）ウソ肝臓由来）。aerogens JFO33], 8L Serratia (
Producer bacteria (Seratia) belonging to the genus Seratia
marcescens I Fo 3054, ),
Producer bacteria (Pr) belonging to the genus Proteus
oteusmi rab mouth is IF F 08849
), Staphylococcus (5taphylococcus)
Producer bacteria (5taphylococcu) belonging to the genus
s aureus TFO3060), production bacteria belonging to the genus Pseudomonas (P
seudomonas aeruginosa IFO3
9] 9), a production bacterium (Fusarium oxysporum) belonging to the genus Fusarium
IF 0594・2), Gibberel
The producing bacteria (Gibberellafu) belonging to the genus La)
jikuroi IFO6604), Cancita (C
Producer bacteria (Candidali) belonging to the genus
those derived from microorganisms such as P. polytica”i FO0717) [J, Bacleriol, 105
(3) 1216 (1971), J. Bacteriol.
,,] 14 (1) 249 (1978), Japanese Patent Publication No. 5
5-74.790, JP-A-55-99187], and the like. Furthermore, G T PXCoAS is an enzyme that catalyzes the reaction that converts fatty acids into unruly-CoA.
Fatty acid is converted into acyl-CoA in the presence of H, G□DT
and acyl-CoA zonosetase which produces orthophosphoric acid, and this unruly CoA zonosetase may also be used. (J, Biol, CC11e, , 23
9゜(6)1694. (1964,) derived from bovine liver).

寸たアンルーＣｏ　Ａ・オキ／ダーゼ活性を奏する酵素
としては、例えばラット肝臓由来のもの（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍＢｉｏｐｈｙ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　、　８
３　（２）　４７９　（１９７８）〕、キャノジダ属に
属する生産菌（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ。Examples of enzymes that exhibit oxidase activity include those derived from rat liver (Bioche
mBiophy, Res, Commun, , 8
3 (2) 479 (1978)], a producing bacterium belonging to the genus Canodida (Candida utilis).

Ｃａｎｄ　ｉｄａ　　Ｉ　１ｐｏｌｙ　（ｉｃａ　　Ｉ
　Ｆ　Ｏ１５４８、Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉ
ｓ　Ｔ　ＦＯ０５８９）、サッカ０マイセス（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する生産菌（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　　Ｉ　Ｆ　Ｏ０
２１３，５ａｃｃｈａ　ｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ　Ｙ　００８６　（Ｆ　Ｅ　ＲＭ　−ＰＡ　５１
７４）、オイペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕ
ｍ）属に属する生産菌（Ｅｕｐｅｎｉｃｉ　Ｉｆ　ｉｕ
ｍ　ｊａｖａｎｉｃｕｍ　ＩＦＯ７９９２）、モナスカ
ス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ　）属に属する生産菌（Ｍｏｎａ
ｓｃｕｓ　　ｓｐ、Ｍ−４８００（Ｆ　Ｅ　ＲＭ　−Ｐ
Ａ５２２５）：Ｌアスペルギ＃　ス（Ａｓｐｅｒｇｉ　
ｌ　１ｕｓ）属に属する生産菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ　ｃａｎｄｉｄｕｓＭ−４８１５（ＦＥＲＭ−、Ｐ扁
５２２６））、アースロバフタ−（Ａｒ１ｈｒｏｂａｃ
ｔｅｒ　）属に属する生産菌（Ａｒ１ｈｒｏｂａｃｉｅ
ｒ　　ｓｐ、Ｂ−０７２０（ＦＥＲＭ　−Ｐ　Ａ　５２
２４　）　）、マクロフオミナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍ　
ｉ　ｎａ）属に属する生産菌（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎ
ａ　ｐｈａｓｅｏｌ　ｉ　ＡＴＣＣ１４，３８３）、ク
ラドスポリウム（Ｃ１ａｄｏｓｐｏｒ　ｉｕｍ　　）属
に属する生産菌（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｒｅｓｉ
ｎａｅ　ＩＦＯ６３６７）などの微生物由来のもの（Ａ
ｒｃｈ、　Ｂｉ　ｏｃｈｅｍ。Candida I 1poly (ica I
F O1548, Candida tropicali
s T FO0589), Sacc 0 Myces (Sacc
Producer bacteria (Saccha) belonging to the genus haromyces
romycescerevisiae I F O0
213,5accha romycescerevis
iae Y 0086 (FE RM-PA 51
74), Eupenicilliu
m) Production bacteria belonging to the genus Eupenici If iu
m javanicum IFO7992), production bacteria belonging to the genus Monascus (Monascus)
scus sp, M-4800 (FE RM-P
A5225): L Aspergi
Production bacteria (Aspergillus) belonging to the genus Aspergillus
s candidus M-4815 (FERM-, P 5226)), Ar1hrobac
ter) production bacteria (Ar1hrobacie) belonging to the genus
r sp, B-0720 (FERM-P A 52
24) ), Macrophomina
Producer bacteria (Macrophomin) belonging to the genus i na
a phaseol i ATCC 14,383), production bacteria belonging to the genus Cladosporium (Cladosporium resi
Those derived from microorganisms such as nae IFO6367) (A
rch, Biochem.

Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　１７６．５９１　（１９７６）、
特開昭５５−１１８３９１号公報、特開昭５６−８６８
３号公報、特開昭５６−６１９９１号公報〕などが挙ら
れる。Biophys, 176.591 (1976),
JP-A-55-118391, JP-A-56-868
No. 3, JP-A No. 56-61991], and the like.

捷だこのアシル−ＣｏＡ・オキ／ダーゼ活性の代すにア
シル−Ｃｏ　Ａ・デヒドロゲナーゼ（Ａｃｙｌ−ＣｏＡ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、　Ｅ＋Ｃ，１，８，９９
，３、Ａｃｙｌ−ＣｏＡ：　（ａｃｃｅｐｔｏｒ）ｏｘ
ｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）活性を奏する酵素、例えば
ブタ、ウソやヒツジの肝臓由来のもの（Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、、２１８．７１７（１９５６）、Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｅｍ、、　２１８．７０１　（１９５６）、Ｊ
、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ。、７５　２７８７（１９５
８）、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、
、　２２．４７５　（１９５６））を用いて、アンルー
ＣｏＡをデヒドロアノルーＣｏＡとなしてもよい。この
際、電子受容体、例えば鷲２．６−シクロロフエノール
インドフエノール、２−（Ｐ−ヨードフェニル）−３−
（Ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラ
ゾリウム・クロライド（ＩＮＴ）　、３−　（４，，５
−ジメチル）−２−チアゾリル−２，５−ジフェニル−
２Ｈ−テトラゾリウム・プロマイ）’（ＭＴＴ）、３．
３ｉ（４゜４．′−ビフエニリレン）−ビス（２，５−
ジフエニル−２Ｔ−（−テトラゾリウム・クロライＭ　
）　（Ｎｅ。Acyl-CoA dehydrogenase (Acyl-CoA
dehydrogenase, E+C, 1, 8, 99
,3, Acyl-CoA: (acceptor)ox
Enzymes exhibiting idoreductase activity, such as those derived from pig, bull and sheep liver (J, Biol,
Chem,, 218.717 (1956), J.Bio.
l, Chem, 218.701 (1956), J
, Am, Chem, Soc. , 75 2787 (195
8), Biochim, Biophys, Acta,
, 22.475 (1956)) may be used to convert unruh-CoA to dehydroanoru-CoA. In this case, electron acceptors such as 2,6-cyclophenol indophenol, 2-(P-iodophenyl)-3-
(P-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride (INT), 3- (4,,5
-dimethyl)-2-thiazolyl-2,5-diphenyl-
2H-tetrazolium promy)' (MTT), 3.
3i(4゜4.'-biphenylylene)-bis(2,5-
Diphenyl-2T-(-tetrazolium chloride M
) (Ne.

−ＴＢ　　ｉ　　、　　３．３　−　　（３，３−ン　
メ　ト　キ　／−４゜４−ビフエニリレン）−ビス〔２
−（Ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２）１−テ
トラゾリウム・クロライド１　（ＮＴＢ）、３．３”　
　（３゜３′−ジメトキン＝４゜４−ヒス〔２゜５−ビ
ス（Ｐ−二ｌ・ロフェニル）　−２１−１−テトラシリ
ラム・クロライド）（ＴＮ　Ｔ　ｒ’ｉ　）、３．３′
−（３３′−／メトキシー４．４７−ビフェニレン）−
ビス（２，５−ジフェニル−２１−１−テトラシリラム
・クロライド）（ＴＢ）などを、好ましくはフェナジン
メトザルフェトとともに用いて反応を行なわせればよい
。さらにエノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性を奏する
酵素、３−ヒドロキンアシル−Ｃ（ｌ　Ａ・デヒドロゲ
ナーゼ活性を奏する酵素や３−りトアンルーＣｏＡ・チ
オラーゼ活性を奏する酵素としては適宜それらの酵素活
性含有組織から単離してもよイ（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、　、　２１８．９７１　（１９５６）、Ａｎｇｅｕ
、＋、　Ｃｈｅｍ。、址、６８７（１９５２）、Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。、２０７　６３１．（１９５４
）、Ｂｉｏｃｈ　ｉｎ、ＢｉｎｐｈｙｓｏＡｃ　ｌａ１
圧４．４８　（１９５７１、Ｊ、　Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｍ
、、　２０８．３４．５　（１９５４，）　）］ｏｔだ
これらのエノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性、３−ヒ
トロキシアシル−ＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性および
３−ケＩ・アシル−ＣｏＡ・チオラーゼ活性において、
各酵素活性を同一蛋白上に有してなる複合活性酵素の酵
素活性を用いることが好捷しい。-TB i , 3.3 - (3,3-n
Metoki /-4゜4-biphenylylene)-bis[2
-(P-nitrophenyl)-5-phenyl-2)1-tetrazolium chloride 1 (NTB), 3.3”
(3゜3'-dimethquine = 4゜4-his[2゜5-bis(P-2l-lophenyl)-21-1-tetrasilylam chloride) (TN T r'i ), 3.3'
-(33'-/methoxy4.47-biphenylene)-
The reaction may be carried out using bis(2,5-diphenyl-21-1-tetrasilylam chloride) (TB), preferably together with phenazine methosulfate. Furthermore, enzymes that exhibit enoyl-CoA hydratase activity, enzymes that exhibit 3-hydroquinacyl-C (lA) dehydrogenase activity, and enzymes that exhibit 3-retoan-CoA thiolase activity are isolated from tissues containing these enzyme activities as appropriate. You can let go (J, Biol, Che)
m, , 218.971 (1956), Angeu
, +, Chem. , 687 (1952), J.
Biol, Chem. , 207 631. (1954
), Bioch in, BinphysoAc la1
Pressure 4.48 (19571, J, Blol, Chem
, 208.34.5 (1954,)] in these enoyl-CoA hydratase activities, 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase activities and 3-key acyl-CoA thiolase activities,
It is preferable to use the enzyme activity of a multi-active enzyme having each enzyme activity on the same protein.

この複合活性酵素生産菌としては、例えばエンエリヒア
属に属する生産菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
；Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　１．　Ａｃｏｄ、　Ｓｃ　ｉ
、　、　Ｌ４（２）　４９２　（１９７７））、／ニー
トモナス属に属する生産菌（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＦ
ｒａｇｉ　Ｂ−０７７１（Ｆ　Ｅ　ＲＭ−Ｐ＆　５７０
１）　；特願昭５６−９９３１．４．号明細書〕が挙ら
れる。特にこのシュードモナス属に属する生産菌Ｂ−０
７７１およびこの生産菌から得られた複合活性酵素につ
いて述べれば、次の通りである。捷ず本菌Ｂ−０７７１
は山梨県北巨摩郡須玉町の架剤の土壌より分離したもの
で、その肉眼的および顕微鏡的観察などに基く各種培地
上における培養の所見はり下に述べる通りである。Examples of the multi-active enzyme-producing bacteria include Escherichia coli, which belongs to the genus Escherichia.
;Proc, Nat 1. Acod, Sci
, , L4(2) 492 (1977)), / Producer bacteria belonging to the genus Nietomonas (Pseudomonas F
ragi B-0771 (FE RM-P & 570
1) ;Patent application 1984-9931.4. No. Specification]. In particular, the producing bacterium B-0 belonging to the genus Pseudomonas
771 and the multi-active enzyme obtained from this producing strain are as follows. Kasezumoto Bacterium B-0771
was isolated from the soil of Sutama-cho, Kitakoma-gun, Yamanashi Prefecture, and the findings of cultivation on various media based on macroscopic and microscopic observations are as described below.

（Ｎ肉眼的特徴 （１）普通寒天平板培地 丘状、円形で、周囲はなめらかな集落を形成し、半光沢
で、灰白色〜淡黄色を呈する。可溶性色素は産生じない
。(N Macroscopic characteristics (1) Ordinary agar plate medium It is mound-like, circular, and forms a smooth colony around the periphery. It is semi-glossy and exhibits a grayish-white to pale yellow color. No soluble pigment is produced.

（２）普通寒天斜面培地 線状に良好に生育する。半光沢で、灰白色〜淡黄色を呈
する。可溶性色素は産生じないっ（３）液体培地 一様に混濁し、沈澱も生ずる。菌膜は形成しない。(2) Ordinary agar slant medium Grows well in a linear pattern. It is semi-gloss and has a grayish-white to pale yellow color. Soluble pigments are not produced (3) The liquid medium becomes uniformly cloudy and precipitates also form. No bacterial membrane is formed.

（ト）顕微鏡的特徴 １つすぐ、１だはやや曲った桿菌で、単独または二連で
、た１に長連鎖になる。大きさはＯ０４〜０、６　ｘ　
Ｏ，５〜３゜Ｑ／１ｍで、極手で運動する。芽胞は形成
しない。(G) Microscopic features: They are straight, slightly curved rods, singly or in pairs, and in long chains. Size is O04~0,6x
Exercise at poles at O, 5-3°Q/1m. Does not form spores.

（Ｑ生理的・生化学的特徴 ダラム染色　　　　　　　　　　　　　　　−〇・Ｆテ
スト　　　　　　　　　　　　　　　Ｏカタラ−セ　　
　　　　　　　　　　　　　　＋オキンダーゼ　　　　
　　　　　　　　　　士しンチナーゼ　　　　　　　　
　　　　　　−ウレアーヒ ＳＳＲ培地　　　　　　　　　　　　−クリステンゼン
培地　　　　　　　　０−）ゲラチンの加水分解　　　
　　　　　　　　−テンプンの加水分解　　　　　　　
　　　　−力セインの加水分解　　　　　　　　　　　
−エスクリンの加水分解　　　　　　　　　　　−アル
ギニンの加水分解　　　　　　　　　　十ポリーβ−ハ
イドロキ／ブチレイ１−（ＰＨＢ）の糸種　　−インド
ールの産生　　　　　　　　　　　　−硫化水素の産生
　　　　　　　　　　　　　−アセトインの産生　　　
　　　　　　　　　−Ｍ　Ｒテスト　　　　　　　　　
　　　　　　　−硝酸塩の還元　　　　　　　　　　　
　　　−クエン酸の利用　　　　　　　　　　　　　十
糖より酸の産生性 酸産生、ガス非産生：Ｌ（ト）アラビノース、セロビオ
ース、フラクト−ス、フコース、ガラクト−ス、グルコ
ース、クリセリン、ラクト−ス、マルトース、マンノー
ス、ノリヒオース、ラムノース、／ユクロース、トレハ
ロース、キンロース、酸非産生、ガス非産生：アドニト
一ル、ヅルンｉ・−ル、メノーエリスリト−ル、イノ／
トールイヌリン、マンニトール、メレジトース、ラフイ
ノ−、ｚ、、ｆｌ）’ｙン、ノルボース、ソルビトール
、スターチ、 上記の通り、本菌Ｂ−０７７１は、ダラム陰性で、鞭毛
で運動し、カタラービ、オキシダーセ陽性であり、さら
にグリコースを酸化的に分解する好菌件の細菌である特
徴を有していることから、／ニードモナス属に属する菌
株と認められた。(Q Physiological and biochemical characteristics Durham staining -〇・F test O catalase
+Okindase
shishinase
- Ureahi SSR medium - Christensen medium 0-) Hydrolysis of gelatin
-Hydrolysis of starch
−Hydrolysis of force sein
-Hydrolysis of esculin -Hydrolysis of arginine -Production of indole -Production of hydrogen sulfide -Production of acetoin
-MR test
- Reduction of nitrates
- Utilization of citric acid Acid production from decasaccharide Non-gas production: L(t)arabinose, cellobiose, fructose, fucose, galactose, glucose, chrycerin, lactose, maltose, mannose, norihiose , rhamnose, /ucrose, trehalose, quinlose, non-acid production, non-gas production: adonitol, durunil, menoerythritol, inno/
Toll inulin, mannitol, melezitose, ruffino, z, fl)'yn, norbose, sorbitol, starch It was recognized as a strain belonging to the genus Niedomonas, as it has the characteristics of a bacteriophilic bacterium that oxidatively decomposes glycose.

さらに、ザ・ジャーナル・オブ・ジェネラル・ミクロバ
イオロジー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ
ｒａｌＭｉｃｒｏｌ）ｉｏｌｏｇｙ　）ム臥３７９〜４
．０８　（１９６１）に記載のシュードモナス−７ラキ
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｒａｇｉ）と対比した結果
、よく一致した。In addition, The Journal of Gene
ralMicrol)iology)mu 379-4
．． As a result of comparison with Pseudomonas fragi described in 08 (1961), there was good agreement.

−ｑへ　− さらに本菌Ｂ−０７７１を、標準法である／ニードモナ
ス・フライ・ＡＴＣＣ４９７３と比較実験を行なった。-q - Further, an experiment was conducted to compare the present bacterium B-0771 with the standard method Needomonas fly ATCC4973.

その結果、第１表に示す通りであった。The results were as shown in Table 1.

第　　１　　表 　３６− 以上の通り、本菌Ｂ−０７７１は、標準株であるシュー
ドモナス・フライ・ＡＴＣＣ４，９７３とよく一致した
。よって本菌をシュードモナス・フライ・Ｂ−０７７１
と命名した（微生物受託番号通知書、微生物受託番号［
微工研菌寄第５７０１号、Ｐ　Ｅ　ＲＭ−Ｐ　Ａ　５７
０１　ｉ）。さらに、本菌を培養しで単離、精製された
複合活性酵素の活性測定法、その理化学的性質について
述べる。Table 1 36- As mentioned above, this bacterium B-0771 was in good agreement with the standard strain Pseudomonas fly ATCC4,973. Therefore, this bacterium is Pseudomonas fly B-0771.
(Microorganism accession number notification, Microorganism accession number [
Microtechnology Research Institute No. 5701, P E RM-P A 57
01 i). Furthermore, we will discuss the method for measuring the activity of a multi-active enzyme isolated and purified by culturing this bacterium, as well as its physicochemical properties.

（１）活性測定法 （ａ）エノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性測定法０−
２Ｍ−）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ９−０）　　　０−４
．　ｍ１１　Ｍ　−ＫＣｌ０．１　ｍ１ ４０ｍＭ−ＮＡＤ　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，
１ｍ１１５ｍＭ・パルミトエノイル−ＣｏＡ　　　　　
　　　　Ｑ−ｌ　ｍ１１％牛血清アルブミン　　　　　
　　　　　　　　　０．０５ｍ１０２５％ニトロテトラ
ゾリウムブルー　　　　　　０．１　ｍｅ３０Ｕ／ｍｅ
−ジアホラーセ（東洋醸造社製）　　　　０．１　ｍｅ
ｌ、　２５　Ｕ／ｍｌ　・３−ヒ）’ｏキノアアシーＣ
ｏＡ・テヒトロゲナーゼ（ベーリンガー社製）　　　　
　　　　０．０１＋＋＋ｌ計１．００ｍ１ 上記の組成を有する反応液を３７℃、２分間予備加温し
、これに、酵素液５０μｌを加えて３７℃、１０分間反
応せしめる。反応後これに、０．５％トチ／ル硫酸すト
リウム２．Ｏｍｅを加えて反応を停止せしめ、次いで波
長５５０ｎｍにて吸光度（△Ａ１５ｏ）を測定する。測
定において、１分間に１μｍｏｌｅの還元型ＮＡＤを生
成する酵素量を１単位（Ｉ　Ｕ　）とする。−１だ酵素
活性は、次式に従う。(1) Activity measurement method (a) Enoyl-CoA hydratase activity measurement method 0-
2M-) Lis-HCl buffer (pH 9-0) 0-4
．． m11 M-KCl0.1 m1 40mM-NADO,
1ml 115mM Palmitoenoyl-CoA
Q-l m11% bovine serum albumin
0.05m1025% Nitrotetrazolium Blue 0.1me30U/me
-Diaphorase (manufactured by Toyo Jozo Co., Ltd.) 0.1 me
l, 25 U/ml ・3-hi)'o Quinoa Acy C
oA-techtrogenase (manufactured by Boehringer)
0.01+++l total 1.00ml The reaction solution having the above composition is prewarmed at 37°C for 2 minutes, and 50μl of the enzyme solution is added thereto and reacted at 37°C for 10 minutes. After the reaction, add 0.5% sodium chloride/sulfur 2. The reaction is stopped by adding Ome, and then the absorbance (ΔA15o) is measured at a wavelength of 550 nm. In the measurement, the amount of enzyme that produces 1 μmole of reduced NAD per minute is defined as 1 unit (I U ). -1 enzyme activity follows the following formula.

（１））　３−ヒドロキシアンルーＣｏＡ・テヒドロゲ
ナーゼ活性測定法 ０．２Ｍ−トリス−塩酸緩衝液（ｐＩ（８，５）　　　
　０．５　　ｍｔ！］、　Ｍ　−ＫＣＩ　　　　　　　
　　　　　　０．０５ｍｅ４０ｍ〜！・ＮＡＤ　　　　
　　　　　　　０．１ｍ１１５ｍＭ・３−ヒドロキシバ
ルミトイル−ＣｏＡ　　　Ｏ，１ｍ１１％律血清アルブ
ミン　　　　　　　　０．０５ｍｅ０．２５％ニトロテ
トラゾリウムブルー　　　　　　０．１．　　ｍｅ３０
ＴＪ／ｍｌ−ジアホラーセ０．１　ｍｌ計　　１，００
ｍｆｆ 上記の組成を有する反応液を３７℃、２分間予備加温し
、これに、酵素１５０μｅを加えて３７°Ｃ５，１０分
間反応せしめる。反応後これに、０．５％ドデシル硫酸
すトリウム２．Ｏｍｌを加えて反応を停止せしめ、次い
で波長５５０ｎｍにて吸光度（△Ａ５ｙｏ）を測定する
。測定において、１分間に１μｍｏ　ｌ　ｅの還元型Ｎ
ＡＤを生成する酵素量を１単位（Ｉ　Ｕ　）とする。ま
た酵素活性は、次式に従う。(1)) 3-Hydroxyanru-CoA/tehydrogenase activity measurement method 0.2M-Tris-HCl buffer (pI (8,5)
0.5 mt! ], M-KCI
0.05me40m~!・NAD
0.1ml 115mM 3-hydroxybalmitoyl-CoA O, 1ml 11% serum albumin 0.05me 0.25% nitrotetrazolium blue 0.1. me30
TJ/ml-diaphorase 0.1 ml total 1,00
mff The reaction solution having the above composition is prewarmed at 37°C for 2 minutes, 150 μe of enzyme is added thereto, and the mixture is allowed to react at 37°C for 5 minutes. After the reaction, add 0.5% sodium dodecyl sulfate 2. The reaction is stopped by adding Oml, and then the absorbance (ΔA5yo) is measured at a wavelength of 550 nm. In the measurement, 1 μmol e of reduced N per minute
The amount of enzyme that produces AD is defined as 1 unit (I U ). Furthermore, the enzyme activity follows the following formula.

（ｃ）８−ケトアフルーＣｏＡ・チオラーセ活性測定法
０．２Ｍ−１−ｌＪス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　　　
　　０．２　　ｍｅｌ　０　ｍＭＣｏＡ　Ｓ　Ｈ０，０
５ｍ１０．２ｍＭ・３−ケトバルミトイル−ＣｏＡ　　
　　　　０．　１　　ｍ１１００ｍＭ−ＭｇＣ１２ｏ、
１．ｍ１ １ｍＭ・ジチオスライド−ｆｉｖ　　　　　　　　　　
　　０．１　　ｍｌ計　　１．ｏｏｍｌ 上記の組成を有する反応液を１．Ｏｍｅ容石英セルに加
えて３７℃とし、これに酵素液２０μｌを加えて３７℃
にて反応せしめ、反応によって消費される３−ゲトハル
ミトイルーＣｏＡの減少を波長３０３ｎｍにて経時的に
吸光度（ＯＤ３ｏ３）測定する。測定において、１分間
に１μｍｏｌｅの３−’ｙｒバルミトイルーＣｏＡを消
費する酵素量を１単位（１［Ｊ）とする。また酵素活性
は、次式に従う。(c) 8-ketoaflu CoA/thiolase activity measurement method 0.2M-1-1J hydrochloric acid buffer (pH 8,0)
0.2 mel 0 mMCoA S H0,0
5m10.2mM 3-ketobalmitoyl-CoA
0. 1 m1100mM-MgC12o,
1. m1 1mM dithioslide-fiv
0.1 ml meter 1. ooml A reaction solution having the above composition is prepared in 1. Add to Ome size quartz cell and bring to 37°C, add 20 μl of enzyme solution and bring to 37°C.
The absorbance (OD3o3) is measured over time at a wavelength of 303 nm to determine the decrease in 3-getohalumitoyl-CoA consumed by the reaction. In the measurement, the amount of enzyme that consumes 1 μmole of 3-'yr valmitoyl-CoA per minute is defined as 1 unit (1 [J). In addition, the enzyme activity follows the following formula.

（２）酵素作用 １モルのデヒドロアンルーＣｏＡおよび１モルの水から
１モルのヒドロキシアンルーＣｏＡを生成する反応を触
媒するエノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性、１モルの
ヒドロキシアンルーＣｏＡおよび１モルのＮＡＤから１
モルのケトアシル−ＣｏＡおよび１モルの還元型Ｎ　Ａ
、　Ｄを生成する反応を触媒する３−ヒドロキシアンル
ーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性、１モルのケトアンル
ーＣｏＡおよび１モルのＣｏ　Ａ　Ｓ　Ｈから１モルの
ア／ルＣｏＡおよび１モルのアセチル−ＣｏＡを生成す
る反応を触媒する３−ケトアンルーＣｏＡ・チオラーゼ
活性の各酵素活性を示す。。(2) Enzymatic action Enoyl-CoA hydratase activity, which catalyzes the reaction of producing 1 mole of hydroxyan-CoA from 1 mole of dehydroan-CoA and 1 mole of water, 1 from NAD
mol of ketoacyl-CoA and 1 mol of reduced NA
, 3-hydroxyanru-CoA dehydrogenase activity that catalyzes the reaction to produce D, producing 1 mol of aryl-CoA and 1 mol of acetyl-CoA from 1 mol of ketoanru-CoA and 1 mol of CoA SH Each enzyme activity of 3-ketoan-CoA/thiolase activity that catalyzes the reaction is shown. .

（３）三種の酵素活性が同−蛋白上にあることの証明、
／ニードモナス・フライ・Ｂ−０７７１の培養物からの
菌体より得られだ粗酵素から、数段の精製工程にて精製
酵素を得るもので（後述の複合活性酵素の製造側参照）
、この工程において三種類の酵素活性を前記の活性測定
衣に基いて測定した。(3) Proof that the three enzyme activities are on the same protein;
A purified enzyme is obtained through several purification steps from the crude enzyme obtained from bacterial cells from a culture of Nidomonas fly B-0771 (see below for production of multi-active enzyme).
In this step, three types of enzyme activities were measured based on the above-mentioned activity measuring cloth.

その結果第２表に示す通りであった。The results were as shown in Table 2.

第　　２　　表 （なお、酵素活性測定値は、その酵素含有液中の蛋白量
を求めて換算した値である） その結果、各酵素活性は、その粗酵素からの各精製工程
での活性の比率にてよく一致しているもので、かつ精製
された酵素もその三種の酵素活性　４３− を有していることから、この三種の酵素活性は同−蛋白
上にあるものと認められる。Table 2 (The enzyme activity measurement value is a value calculated by calculating the amount of protein in the enzyme-containing solution.) As a result, each enzyme activity is the ratio of the activity in each purification step from the crude enzyme. Since these three types of enzyme activities are in good agreement and the purified enzyme also has the three types of enzyme activities, it is recognized that these three types of enzyme activities are located on the same protein.

さらに後述の製造例のトヨパールＩ−ＩＷ−６０カラム
クロマトグラフィーにて得られた精製酵素２．０ｍ夕を
、キャリア・アンホライトを用いる等電点電気泳動にか
けた後三種の酵素活性を、その活性測定法に基いて測定
した結果、ｐｌ（４，，９のフラク／ヨンに三種の酵素
活性とも単一ピーク上に検出された。Furthermore, 2.0 m of the purified enzyme obtained by Toyopearl I-IW-60 column chromatography in the production example described below was subjected to isoelectric focusing using carrier amphorite, and the activities of the three enzymes were measured. As a result of measurement based on the method, all three types of enzyme activities were detected on a single peak in the fraction/ion of pl(4, 9).

（４）基質特異性 下記の種々の炭素数を有する３−ヒドロキンアンルーＣ
ｏＡヲ基質として用い、３−ヒドロキシアンルーＣｏＡ
・デヒドロゲナーゼ活性測定法に従ってその活性を測定
した。(4) Substrate specificity 3-hydroquine unruly C having various carbon numbers as shown below
Using oA as a substrate, 3-hydroxyanru-CoA
・The activity was measured according to the dehydrogenase activity assay method.

基　質　　　　　　　　　　相対活性％）３−ヒドロキ
ンオレイル−ＣｏＡ　　　　　　　　　　　　５６．５
３−ヒドロキンラウリルーＣｏＡ　　　　　　　　　　
　　８１１１３−ヒドロキン力グリル−ＣｏＡ　　　　
　　　　　　　　　９Ｌ　０３−ヒドロキ／ラウリル−
ＣｏＡ　　　　　　　　　　　　　１００．０３−ヒド
ロキシリルニルーＣｏＡ　　　　　　　　　　　９８．
０Ｉｉ　− ３−ヒドロキンバルミトイル−ＣｏＡ　　　　　　　　
　　７５．５３−ヒドロキンステアリル−ＣｏＡ、　　
　　　　　　　　　　３０．５３−ヒドロキンラウリル
ーＣｏＡ、　　　　　　　　　　　９．５３−ヒドロキ
ンオレイル−ＣｏＡ　　　　　　　　　　　　５７．５
３−ヒドロキシリルニル−ＣｏＡ　　　　　　　　　　
　　９９．０さらに本複合活性酵素は、少なくともパル
ミトエノイル−ＣｏＡ、８−ケトバルミトイル−ＣｏＡ
に基質特異性を有する。Substrate Relative activity %) 3-hydroquinoleyl-CoA 56.5
3-hydroquine lauryl-CoA
81113-Hydroquine Power Grill-CoA
9L 03-Hydroxy/Lauryl-
CoA 100.03-hydroxylylny-CoA 98.
0Ii-3-hydroquinbalmitoyl-CoA
75.53-hydroquine stearyl-CoA,
30.53-hydroquinoleyl-CoA, 9.53-hydroquinoleyl-CoA 57.5
3-hydroxylylnyl-CoA
99.0 Furthermore, the present multi-active enzyme contains at least palmitoenoyl-CoA, 8-ketobalmitoyl-CoA.
It has substrate specificity.

（５）至適ｐ　Ｈ 基質として３−ヒドロキンバルミトイル−Ｃ１ＯＡを用
い、３−ヒドロキシアンルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ
活性測定法におけるｐ　Ｈをトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７
，５〜９．５にて変化せしめて活性を求めた。その結果
、第１図に示す通り、その至適ｐ　Ｈはｐ　Ｈ９付近で
あった。(5) Optimal pH Using 3-hydroquinbalmitoyl-C1OA as a substrate, the pH in the 3-hydroxyanru-CoA dehydrogenase activity measurement method was adjusted to pH 7 in Tris-HCl buffer.
, 5 to 9.5 to determine the activity. As a result, as shown in FIG. 1, the optimum pH was around pH9.

（６）　ｐ　Ｈ安定性 １０ｍＭの各種緩衝液（ｐ　Ｈ４〜７　ジメチルグルタ
ル酸−水酸すトリウム緩衝液、ｐ１４７．５〜９゛トリ
ス塩酸緩衝液）に溶解した酵素液（１５Ｕ　／　ｍｌ　
）を３７°Ｃ１６０分間放置した後その残存活性を、３
−ヒドロキノアンルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性測
定法に基いて測定した。(6) Enzyme solution (15U/ml) dissolved in various buffers with pH stability of 10mM (pH4-7 dimethylglutaric acid-strium hydroxide buffer, p147.5-9 Tris-HCl buffer)
) was left at 37°C for 160 minutes, and its residual activity was determined by
- Hydroquinoan-Measured based on the CoA/dehydrogenase activity assay method.

その結果、第２図に示す通りで、ｐ■■５〜８の範囲で
安定であった。As shown in FIG. 2, the results were stable in the range of p■■5 to 8.

（７）熱安定性 １０ｍＭジメチルグルタル酸−水酸化す）　ＩＪウム緩
衝液（ｐＩ（７，０）に溶解した酵素液（１５Ｕ　／　
ｍ７りを各温度で１０分間処理した後その残存活性を３
−ヒドロキノアンル〜ＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性測
定法に基いて測定した。(7) Thermostable 10mM dimethylglutaric acid-hydroxide) Enzyme solution (15U /
After treating m7ri at each temperature for 10 minutes, its residual activity was
-Hydroquinoane-Measured based on the CoA/dehydrogenase activity assay method.

その結果、第３図に示す通りで、はぼ５０°Ｃまでの温
度に対して安定であった。As shown in FIG. 3, the results were stable at temperatures up to approximately 50°C.

（８）等　電　点 キャリア・アンホライトを用いた焦点電気泳動法により
測定した結果、等電点けｐＨ４，９にあった。(8) Isoelectric focusing As a result of measurement by focusing electrophoresis using a carrier amphorite, the isoelectric focusing pH was 4.9.

（９）金属イオンの影響 ３−ヒドロキンアノルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性
についてその影響を測定した。(9) Effect of metal ions The effect on 3-hydroquine anol-CoA dehydrogenase activity was measured.

００界面活性剤の影響 ３−ヒドロキ／アシル−ＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性
についてその影響を測定した。Effect of 00 surfactant The effect on 3-hydroxy/acyl-CoA dehydrogenase activity was determined.

以上の通り、この複合活性酵素はエノイル−ＣｏＡ・ヒ
ドラターゼ活性、３−ヒドロキノアンル−Ｃｏ　Ａ・デ
ヒドロゲナーゼ活性および３−ケトアノルーＣｏＡ・チ
オラーゼ活性を同一蛋白上に有するものである。As mentioned above, this multi-active enzyme has enoyl-CoA hydratase activity, 3-hydroquinoanl-CoA dehydrogenase activity and 3-ketoanol-CoA thiolase activity on the same protein.

さらにこれらの各酵素活性において、用いられる酵素の
活性測定法については、以下の通りである。Furthermore, the enzyme activity measuring method used for each of these enzyme activities is as follows.

・アノルーＣｏＡ・ンンセターゼ活性測定法０．２Ｍ　
リン酸緩衝１ｌ（ｐＨ７５）　　　　　　　　０．２　
　ｍｅｌ　０ｍＭ　　Ａ、ＴＰ　　　　　　　　　　　
　　Ｏ，１ｍ１１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　　　　　　　
　　　　　０．１　ｍ１１０　ｍ　Ｍ　　ＣｏＡＳＨＯ
，０５ｍＪ５％トリトンＸ−１００含有１ｍＭパルミチ
ン酸溶液０．２　　ｍｌ 蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　０．８５ｍ１計
　　１．００ｍ１ 上記の組成を有する第１反応液を調整する。・Anol-CoA・Nensetase activity measurement method 0.2M
1 liter of phosphate buffer (pH 75) 0.2
mel 0mM A,TP
O, 1m110mM MgCl2
0.1 m110 m M CoASHO
, 05mJ 1mM palmitic acid solution containing 5% Triton X-100 0.2ml Distilled water 0.85ml Total 1.00ml A first reaction solution having the above composition is prepared.

また第２反応液として、下記組成の反応液を調整する。In addition, a reaction solution having the following composition is prepared as the second reaction solution.

０．２Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　　　　　　　
　０．５　ｍ１２０ｍＭ　　Ｎ−エチル・マレイミド　
　　　　　　　　０．１　　ｍ１１５ｍＭ４−７ミノア
ンチピリ７　　　　　　　　　０．３ｍ１Ｏ１３％　３
−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキンエチル）
アニリ７　　　　　　　　　　　　　　　　０．２５ｍ
ｅベルオキ／ダーゼ（１００ＰＰＵ／Ｍ）　　　　　　
　　　０．１　　ｍ１０．５％　ナトリウムアジド　　
　　　　　　　　　　０．１＋＋＋Ａ！アンルーＣＯＡ
・オキ７ダーゼ（１，２０Ｕ／ｍｌ）　　　　　０．１
　　ｍｌ計　　２．００ｍ１ 上記組成を有する第１反応液に酵素液５０μｌを加えて
３７℃、１０分間反応せしめる３１反応後これを第２反
応液に加えて３７℃、５分間反応せしめ、次いで波長５
５０ｍｍにて吸光度（△Ａ３５ｏ）を測定する。壕だ酵
素活性は、次式に従う。0.2M phosphate buffer (pH 7.5)
0.5 ml 120mM N-ethyl maleimide
0.1 ml 115mM 4-7 minoantipyri 7 0.3 ml O13% 3
-Methyl-N-ethyl-N-(β-hydroquinethyl)
Aniri 7 0.25m
e Beruoki/Dase (100PPU/M)
0.1 m10.5% sodium azide
0.1+++A! UNRU COA
・Oki7dase (1,20U/ml) 0.1
ml total: 2.00 ml Add 50 μl of the enzyme solution to the first reaction solution having the above composition and let it react at 37°C for 10 minutes.After the 31 reaction, add this to the second reaction solution and let it react at 37°C for 5 minutes.
Measure the absorbance (ΔA35o) at 50 mm. The enzyme activity follows the following formula.

（たたし、Ｃは酵素液中のアシル−ＣｏＡ・シンセター
ゼの濃度（ｍ９／ｍｌ）を示す。）・アノルーＣｏＡ・
オキ／ダーゼ活性測定法０．２Ｍ＋−リス塩酸緩衝１（
ｐＨ８，０）　　　　　　Ｏ，１ｍ１５ｍＭ４−アミノ
アンチピリン　　　　　　　　　　０．０５ｍ６３ｍＭ
　　ジエチルメタトルイジン　　　　　　　　　　０．
０５ｍ１Ｏ，５ｍｑ／ｍｅベルオキ７ダーゼ　　　　　
　　　　　　０．０５ｍｇ２５ｍＭ　　バルミトイル−
Ｃｏ　Ａ　　　　　　　　　　　０．０２ｍｌ計　　０
．５０ｍ１ 上記組成を有する反応液に、酵素液１０μｌを加えて、
３７°Ｃ１１０分間反応させた後Ｑ　、　５　ｍｌの４
Ｍ尿素を加えて反応を停止せしめ、次いでこれに１％ｉ
・すｌ、ンＸ−１００の２　ｍｌを加え、波長５４５ｍ
ｍにて比色し、生成した過酸化水素の量を求める。酵素
活性は、１分間に１μｍｏｌｅの過酸化水素を生成する
酵素量を１単位（ＩＵ）とする。(C indicates the concentration of acyl-CoA synthetase in the enzyme solution (m9/ml).)・Anoru-CoA・
Oxidase activity measurement method 0.2M+-Lis-HCl buffer 1 (
pH 8,0) O, 1ml 15mM 4-aminoantipyrine 0.05m 63mM
Diethyl metatoluidine 0.
05m1O, 5mq/me Veruoxidase
0.05mg25mM Valmitoyl-
Co A 0.02ml total 0
．． 50ml Add 10μl of enzyme solution to the reaction solution having the above composition,
After reacting at 37 °C for 110 min, 4 ml of Q.
The reaction was stopped by adding M urea, which was then added with 1% i
・Add 2 ml of Sl, NX-100, wavelength 545m
The amount of hydrogen peroxide produced is determined by comparing the colors at m. For enzyme activity, 1 unit (IU) is the amount of enzyme that produces 1 μmole of hydrogen peroxide per minute.

寸だエノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性測定法３−ヒ
ドロキシアシル−ＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性測定法
、３−ケトアンルーＣｏＡ・チオラーゼ活性測定法は、
前記複合活性酵素における各活性測定法にて述べた方法
と同一方法によるものである。Sundaenoyl-CoA/hydratase activity measurement method 3-hydroxyacyl-CoA/dehydrogenase activity measurement method, 3-ketoanru-CoA/thiolase activity measurement method are as follows:
The method was the same as that described for each activity measurement method for the multi-active enzyme.

さらに各反応工程を遂行せしめるに当って、使用される
各酵素活性の量としては反応せしめるに充分な酵素活性
を有していればよく、被検液中の脂肪酸の量および炭素
数や反応条件などに応じて適宜変更すればよく、特に限
定されるものではない。例えば０．００５〜０．０５Ａ
ｍｏｌｅの炭素数１８のオレイン酸を含有する被検液に
ついて３７℃、５〜１０分間反応せしめる場合には、ア
ノルーＣｏＡ・ノンセターセ活性は通常０．ｌＴＪ以上
、好１しくは０．５〜ＩＵ程度の酵素活性を奏する酵素
の量を用いればよく、１だアシル−ＣｏＡ・オキ／ダー
ゼ活性は通常１０以上、好捷しくは５〜１５（Ｊ程度の
酵素活性を奏する酵素の量を用いればよい。さらに、エ
ノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性、３−ヒドロキシア
シル−ＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性、３−ケトアシル
−ＣｏＡ・チオラーゼ活性、またはそれらの各酵素活性
を同一蛋白上に有する複合活性酵素の酵素活性は通常０
−１０以上、好ましくは１〜２５程度の酵素活性を奏す
る酵素の量を用いればよい。さらに反応に要する試薬、
例えば＠反応工程に要せるＡＴＰまたはＧＴＰおよびＣ
ｏＡＳＨ１■反応工程に要するＮＡＤ、■反応工程に要
するＣ　ｏ　Ａ　Ｓ　Ｈの各試薬の量としては、被検液
中に存在する脂肪酸の量とその脂肪酸の炭素数に基いて
行なわれるβ酸化サイクル数との積に値する量以上の充
分々量にて用いればよく、例えばオレイン酸０，０１μ
ｍｏｌｅの場合にはＡＴＰまたはＧＴＰは通常０．１μ
ｍｏｌｅ程度以上、好ましくは０．５１ｉｍｏｌｅ程度
以上、Ｃｏ　Ａ　Ｓ　Ｉ−１’ｄ、０６１１ｉｍｏｌｅ
程度以上、好捷しくは０　５μｍｏｌｅ程度以上、ＮＡ
Ｄは０．１μｍｏｌｅ程度以ト、好捷しくけ０５μｍｏ
ｌｅ以上を用いればよい。さらに■反応工程において、
アシル−ＣｏＡ・オキシダーゼ活性に基つく反応を行な
わせしめるに当っては、反応系に存在する酸素、即ち溶
存酸素を利用すればよく、捷だ■反応工程に要する水と
しても反応系に存在する水を利用すればよい。さらにア
シル−ＣｏＡ・シンセターゼ活性を良好にせしめるため
に、マグネ／ラムイオンを放出できる水溶性マグネシウ
ム塩、好１しくは塩化マグネシウムを用いればよい。ま
た■反応工程において、アシル−ＣｏＡ・オキソダーゼ
活性に基いて生成される過酸化水素を消去することが好
ましく、通常カタラーゼを用いて過酸化水素を分解、消
去せしめればよい。このようにして、少なくとも、ＡＴ
ＰまたはＧＴＰ−ケトアンルーＣｏＡ・チオラーゼ活性
の各活性を含有する測定用組成物を調整すればよい。捷
たこの測定用組成物において前記複合活性酵素を、エノ
イル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性、３−ヒドロキンアシ
ル−ＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性、および３−ケトア
シル−ＣｏＡ・チオラーゼ活性の代りに用いることが好
捷しく、さらに水溶性マグネ／ラム塩を含有せしめるこ
とが好ましい。さらにこの測定用組成物にカタラーゼを
含有せしめることが好ましく、その他、非イオン系界面
活性剤、例えばトリトンＸ−１００（商品名）を含有せ
しめて測定用組成物となしてもよく、また一般に中性な
いし弱アルカリ性の水または緩衝液を用いて溶液となし
てもよい。さらにこの測定用組成物を脂肪酸エステルか
ら酵素活性に基いて遊離される脂肪酸の測定のために用
いる場合には、脂肪酸エステル捷たは脂肪酸エステルに
作用して脂肪酸を遊離せしめる酵素活性を有する成分を
脂肪酸遊離のだめの試薬として、あらかじめこの測定用
組成物に加えておいてもよい。例えばリパーゼ活性測定
用組成物においては、前記の測定用組成物にグリセライ
ド、好ましくはモノグリセライド捷だはジグリセライド
、さらに好甘しくにアルブミンをも添加したものとして
調整すればよい。１だトリグリセライド測定用組成物と
しては、例えばリパーゼ活性を含有する成分を前記の測
定用組成物に添加して調整すればよい。さらに例示すれ
ば、レノチ／である脂肪酸エステルの含有物を前記測定
用組成物に添加してなるホスホリパーゼＡ　＋　活性、
＊スホＩＪ　ハーゼＡ２活性またはホスホリパーゼＤ活
性測定用組成物、リゾレノチンである脂肪酸エステルの
含有物を前記測定用組成物に添加してｈるリゾホスホリ
パーゼ活性測定用組成物、ホスファチジン酸である脂肪
酸エステル含有物およびリパーゼ活性を有する酵素の含
有物を前記測定用組成物に添加してなるホスファターゼ
活性測定用組成物、レシチンである脂肪酸エステルおよ
ヒリパーゼ活性を有する酵素の含有物を前記測定用組成
物に添加してなるホスホリパーゼＣ活性測定用組成物、
し／チンである脂肪酸エステルおよびホスファチジン酸
ホスファターゼ活性とリパーゼ活性を有する酵素の含有
物を前記測定用組成物に添加してなるホスホリパーゼＤ
活性測定用組成物、アシルコリンである脂肪酸エステル
の含有物を前記測定用組成物に添加してなるコリンエス
テラーゼ活性測定用組成物、ステロールエステルである
脂肪酸エステルの含有物を前記測定用組成物に添加しテ
ナルコレステロールエステラーゼ活性測定用組成物、ホ
スホリパーゼＡ１活性、ホスホリパーゼＡ２活性、ホス
ホリパーゼＢ活性、ホスホリパーゼＣ活性とリパーゼ活
性、または、ホスホリパーゼＢ活性とホスファチジン酸
、ホスファターゼ活性とリパーゼ活性を有する酵素の含
有物を前記測定用組成物に添加してなるレシチン測定用
組成物、リゾホスホリパーゼ活性を有する酵素の含有物
を前記測定用組成物に添加してなるリゾレンチ／測定用
組成物、コレステロールエステラーゼ活性を有する酵素
の含有物を添加してなるコレステロールエステル測定用
組成物、コレステロールおよびレシチンを含有する脂肪
酸エステルとコレステロールエステラーゼ活性捷だはり
ゾホスホリパーゼ活性を有する酵素の含有物とを前記測
定用組成物ニ添加してなるし／チンコレステロールアツ
ルトランスフェラーゼ活性測定用組成物、レシチンであ
る脂肪酸エステルとレシチンコレステロ−ルアノルトラ
ンスフェラーゼ活性トコレスチロールエステラーゼ活性
捷だはりゾホスホリパーゼ活性を有する酵素の含有物と
を前記測定用組成物に添加してなるコレステロール測定
用組成物などが挙られる。Furthermore, in carrying out each reaction step, the amount of each enzyme activity used only needs to have sufficient enzyme activity to cause the reaction, and the amount of fatty acids in the test solution, the number of carbon atoms, and the reaction conditions. It may be changed as appropriate depending on the situation, and is not particularly limited. For example 0.005~0.05A
When a test solution containing a mole of oleic acid having 18 carbon atoms is reacted at 37°C for 5 to 10 minutes, the anol-CoA noncetase activity is usually 0. It is sufficient to use an amount of enzyme that exhibits an enzymatic activity of 1 TJ or more, preferably about 0.5 to IU. What is necessary is to use an amount of enzyme that exhibits a certain level of enzymatic activity.Furthermore, enoyl-CoA hydratase activity, 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase activity, 3-ketoacyl-CoA thiolase activity, or each of these enzyme activities may be the same. The enzymatic activity of multi-active enzymes on proteins is usually 0.
An amount of enzyme that exhibits an enzymatic activity of -10 or more, preferably about 1 to 25 may be used. Furthermore, reagents required for the reaction,
For example, @ATP or GTP and C required for the reaction process.
oASH1 The amount of each reagent NAD required for the reaction process and C o A S H required for the reaction process is based on the amount of fatty acid present in the test solution and the number of carbon atoms in the fatty acid. It may be used in an amount equal to or more than the product of oleic acid, for example 0.01μ of oleic acid.
In the case of mole, ATP or GTP is usually 0.1μ
About mole or more, preferably about 0.51 imole or more, Co AS I-1'd, 0611 imole
NA
D is about 0.1μmole or more, preferably 05μmole
It is sufficient to use le or more. Furthermore, in the reaction process,
In carrying out a reaction based on acyl-CoA oxidase activity, it is sufficient to use the oxygen present in the reaction system, that is, dissolved oxygen. You can use . Furthermore, in order to improve the acyl-CoA synthetase activity, a water-soluble magnesium salt capable of releasing magne/lum ions, preferably magnesium chloride, may be used. In addition, in the reaction step (2), it is preferable to eliminate hydrogen peroxide produced based on acyl-CoA oxodase activity, and usually catalase may be used to decompose and eliminate hydrogen peroxide. In this way, at least
A measurement composition containing P or GTP-ketoanru-CoA/thiolase activity may be prepared. It is preferable to use the multi-active enzyme in place of the enoyl-CoA hydratase activity, 3-hydroquinacyl-CoA dehydrogenase activity, and 3-ketoacyl-CoA thiolase activity in the composition for measuring strained fish. It is preferable to further contain water-soluble magne/rum salt. Furthermore, it is preferable that this measurement composition contains catalase, and may also contain a nonionic surfactant such as Triton X-100 (trade name). A solution may be prepared using alkaline to slightly alkaline water or a buffer solution. Furthermore, when this measuring composition is used for measuring fatty acids released from fatty acid esters based on enzymatic activity, a component having an enzymatic activity that acts on fatty acid esters or on fatty acid esters to release fatty acids is added. It may be added in advance to this measurement composition as a reagent for fatty acid release. For example, a composition for measuring lipase activity may be prepared by adding glyceride, preferably monoglyceride or diglyceride, and more preferably albumin to the aforementioned composition for measurement. A composition for measuring triglyceride may be prepared by adding, for example, a component containing lipase activity to the above-mentioned composition for measuring. To further illustrate, phospholipase A + activity obtained by adding a fatty acid ester-containing substance to the measurement composition,
*Suho IJ Composition for measuring Hase A2 activity or phospholipase D activity, composition for measuring lysophospholipase activity by adding a substance containing a fatty acid ester that is lysolenotin to the measurement composition, containing a fatty acid ester that is phosphatidic acid. A composition for measuring phosphatase activity is obtained by adding a substance containing a substance and an enzyme having lipase activity to the measurement composition, and a composition containing a fatty acid ester that is lecithin and an enzyme having lipase activity is added to the measurement composition. A composition for measuring phospholipase C activity,
Phospholipase D, which is obtained by adding to the composition for measurement a substance containing a fatty acid ester of phosphorus/tin and an enzyme having phosphatidic acid phosphatase activity and lipase activity.
A composition for measuring cholinesterase activity, a composition for measuring cholinesterase activity obtained by adding a substance containing a fatty acid ester, which is an acylcholine, to the measurement composition, and a composition for measuring cholinesterase activity, which comprises adding a substance containing a fatty acid ester, which is a sterol ester, to the measurement composition. A composition for measuring tenal cholesterol esterase activity, containing an enzyme having phospholipase A1 activity, phospholipase A2 activity, phospholipase B activity, phospholipase C activity and lipase activity, or phospholipase B activity and phosphatidic acid, phosphatase activity and lipase activity. A composition for measuring lecithin obtained by adding a composition for measuring lecithin, a composition for measuring lecithin obtained by adding a substance containing an enzyme having lysophospholipase activity to the composition for measuring, and a composition for measuring lecithin containing an enzyme having cholesterol esterase activity. A fatty acid ester containing cholesterol and lecithin and a substance containing an enzyme having cholesterol esterase activity or zophospholipase activity are added to the measurement composition. / composition for measuring cholesterol atultransferase activity, a composition containing a fatty acid ester which is lecithin and an enzyme having lecithin cholesterol anoltransferase activity tocholestyol esterase activity and zophospholipase activity is added to the composition for measurement. Examples include compositions for measuring cholesterol.

次いでこのようにして得られた測定用組成物を用いて、
種々の被検液中の脂肪酸を測定するのであるが、捷ず用
いられる被検液の計としては通常５μ１以上を用いて、
測定用組成物の通常１　ｍ１以上の溶液に加えればより
、捷だその際の反応条件としては、例えば反応温度は通
常３７℃近辺にて行なえばよい。寸だ反応時間としては
特に限定されるものでなく、反応時間は長時間とする方
がより高感度に変化を生ずるもので、通常１分以上であ
ればよく、好捷しくけ５〜１０分間程度である。Next, using the measurement composition obtained in this way,
Fatty acids in various test liquids are measured, and the test liquid used without stirring is usually 5μ1 or more in total.
It is preferable to add it to a solution of usually 1 ml or more of the composition for measurement, and the reaction conditions at the time of shredding may be, for example, the reaction temperature is usually around 37°C. There is no particular limitation on the reaction time; a longer reaction time will produce a change in sensitivity, so it is usually 1 minute or more, and preferably 5 to 10 minutes. That's about it.

さらに反応媒体としては用いる各酵素活性の安定ｐ　Ｈ
域の媒体であればよく、通常弱酸性ないし弱アルカリ性
、例えば水分やｐＴ（ｉ５〜８のリン酸緩衝液、トリス
−Ｈ（４！緩衝液、イミ・ダシ−ルーＨＣｌ緩衝液、ジ
メチルゲルタール酸−ＮａＯＩ７緩衝液、ピペス（Ｐ　
Ｔ　ＰＥＳ　１−Ｎａ０）Ｉ緩衝液が用いられる。Furthermore, the stable pH of each enzyme activity used as a reaction medium
Any medium that is within the range of pH range may be used, and is usually weakly acidic or slightly alkaline, such as water, pT (i5-8 phosphate buffer, Tris-H (4!) buffer, Imi-Dashiru HCl buffer, dimethyl gel tar). Acid-NaOI7 buffer, Pipes (P
T PES 1-Na0) I buffer is used.

このようにして反応せしめた後反応において検出できる
変化を測定するのであるが、この検出できる変化とは、
１回のβ酸化サイクルにで少なくとも１分子の成分を消
費するか、捷たけ生成する成分の変化である。簡便には
反応に用いられるＮＡＤから反応工程によって生成され
る還゛元型ＮＡＤの量の変化を検出し、定量測定する。After reacting in this way, detectable changes in the reaction are measured, and these detectable changes are:
This is a change in a component in which at least one molecule of the component is consumed or produced during one β-oxidation cycle. Conveniently, changes in the amount of reduced NAD produced in the reaction process from NAD used in the reaction are detected and quantitatively measured.

この還元型ＮＡＤの測定手段としては、例えば用いるＮ
ＡＤに特異的吸収波長でなく、還元型ＮＡＤに特異的吸
収波長である吸収波長域の波長に基いて吸光度測定すれ
ばよい。ＮＡＤは２６０ｎｍ近辺に特異的極太吸収波長
を有し、還元型ＮＡＤは２６０ｎｍ近辺および８４０ｎ
ｍ近辺に特異的極大吸収波長を有するもので、それ故還
元型ＮＡＤの測定のだめの特異的吸収波長である吸収波
長域としては３２０ｎｍ〜３６０ｎｍ近辺であり、好１
しくは３４０ｎｍ近辺の波長である。この波長により、
生成される還元型ＮＡＤの量を検出できる変化として測
定する。さらに還元型ＮＡＤの測定手段としては、還元
型ＮＡＤの水素原子の受容能を有する水素原子伝達系色
原体の発色による方法も挙られる。この還元型ＮＡＤの
水素原子の受容能を有する水素原子伝達系色原体として
はＴＮＴ、ＭＴＴ、Ｎｅｏ　−１ザルフエ−１・を用い
てその電子伝達を良好にせしめたものを用いればよい。As a means for measuring this reduced NAD, for example, the NAD used is
The absorbance may be measured based on a wavelength in an absorption wavelength range that is an absorption wavelength specific to reduced NAD, rather than an absorption wavelength specific to AD. NAD has a specific extremely thick absorption wavelength near 260 nm, and reduced NAD has a specific absorption wavelength near 260 nm and 840 nm.
It has a specific maximum absorption wavelength around m, and therefore the absorption wavelength range that is the specific absorption wavelength for measuring reduced NAD is around 320 nm to 360 nm, which is preferable.
In other words, the wavelength is around 340 nm. With this wavelength,
The amount of reduced NAD produced is measured as a detectable change. Further, as a means for measuring reduced NAD, there is also a method using a hydrogen atom transport system chromogen having the ability to accept hydrogen atoms of reduced NAD. As the hydrogen atom transport chromogen capable of accepting hydrogen atoms of reduced NAD, those obtained by improving electron transport using TNT, MTT, or Neo-1 Zarfa-1 may be used.

この水素伝達系色原体をあらかじめ前記の測定用組成物
に添加して用いてもより、捷たは反応後に添加してもよ
く、反応後に生成する還元型Ｎ　Ａ　Ｄはこの水素原子
伝達系色原体と反応して色の変化を生せしめ、この色調
の変化をその吸光波長により吸光度を測定すればよい。This hydrogen transport system chromogen may be added to the above-mentioned composition for measurement in advance, or may be added after shaking or reaction, and the reduced N A D produced after the reaction is a hydrogen transport system. It is sufficient to react with the chromogen to cause a change in color, and measure the absorbance of this change in color tone based on the absorption wavelength.

さらに寸だこの還元型ＮＡＤの測定手段として、この還
元型ＮＡＤを基質とする酵素、例えば還元型Ｎ　Ａ　Ｄ
・オキ／ター上を用いてこの酵素反応に基いて変化する
成分を測定すればよく、好ましくは公知の固定化手段に
より固定化酵素として加工せしめ、この固定化酵素を酸
素電極などに具備せしめた還元型Ｎ　Ａ、　Ｄ・オキン
ターゼ酵素電極を用いることにより、反応系に生成した
還元型ＮＡＤに作用して消費される酸素の量を電気的に
測定することによる還元型ＮＡＤの測定方法も利用でき
る。さらにこの測定された還元型ＮＡＤの量に基いて、
脂肪酸含量が算出され、さらにこの脂肪酸含量から被検
液中の脂肪酸エステルの含量捷たは酵素活性の値が算出
される。さらに検出できる変化の測定としては、測定用
組成物に用いられる試薬における反応において消費され
るＣ０ＡＳＨの成分の量、捷たけ反応において生成され
るアセチル−ＣｏＡなとの成分の量を測定してもよい。Furthermore, as a means of measuring reduced NAD, enzymes that use this reduced NAD as a substrate, such as reduced NAD, can be used.
・It is sufficient to measure the components that change based on this enzymatic reaction using an oxygenator, and preferably the enzyme is processed as an immobilized enzyme by a known immobilization method, and this immobilized enzyme is provided on an oxygen electrode or the like. By using a reduced NAD enzyme electrode, it is also possible to use a method for measuring reduced NAD by electrically measuring the amount of oxygen consumed by acting on the reduced NAD generated in the reaction system. . Furthermore, based on the measured amount of reduced NAD,
The fatty acid content is calculated, and from this fatty acid content, the content of fatty acid ester or the value of enzyme activity in the test liquid is calculated. Further, detectable changes can be measured by measuring the amount of COASH components consumed in the reaction in the reagent used in the measurement composition, and the amount of components such as acetyl-CoA produced in the shaking reaction. good.

このようにして、本発明の測定法および測定用組成物は
、簡便かつ極めて高感度にて測定し得るもので、さらに
脂肪酸を遊離せしめる種々の被検液中の成分の測定のだ
めに利用できる良好なものであり、例えば膵臓機能の検
査の１つとしての血清リパーゼ活性の測定において、簡
便に、寸だ高感度にて正確に測定し得るものである。In this way, the measuring method and measuring composition of the present invention can be easily and extremely sensitively measured, and can be used to measure components in various test liquids that release fatty acids. For example, in measuring serum lipase activity as one of the tests for pancreatic function, it can be easily and accurately measured with extremely high sensitivity.

次いで本発明の実施例および酵素の製造例を挙げて具体
的に述べるが、本発明はこれらによって何んら限定され
るものでは々い。Next, the present invention will be specifically described with reference to Examples and enzyme production examples, but the present invention is not limited by these in any way.

実施例　１ 〔各種脂肪酸の定量〕 ・　１０ｍＭ　　ＮＡＤ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．２　　ｍｌ・　１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ
２　　　　　　　　　　　　　　０．３　　ｍｌ−１０
ｍＭ　　ＡＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　０．３　　ｍｌ・　３％トリトンＸ−１０００，１ｍ
ｌ・　１０ｍＭ　　ＣｏＡＳＨ０，２ｍｌ・アノルーＣ
ＯＡ・／ンセターゼ活性含有液（４０Ｕ／ｍｌ　；東洋
醸造社製Ｌｏ　ｔＮａ６５６　）　　　　　　　　　０
．０２．ｍｌ・アノルーＣｏＡ・オキシターゼ活性含有
液（４００Ｕ／ｍｇ；東洋醸造社製Ｌｏ　ｔＮ［１６５
４；後述のアノルーＣｏＡ・オキシターゼの製造例参照
）０．０２ｍ１・カタラーゼ（１５０Ｕ／ｍｌ：　シグ
マ社製）　　　　０．０５ｍ１・複合活性酵素活性含有
物（エノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性４００　Ｕ／
ｍｌ、　　３−ヒドロキンア受ルーＣｏＡ・デヒドロゲ
ナーゼ活性２００　Ｕ　／ｍｌ、　　８−’ｙドアシル
ーＣＱＡチオラーゼ活性１６８Ｕ／ｍｌ；東洋醸造社製
；後述の複合活性酵素の製造例参照）　　　　　　　　
　　　０．０５ｍ１計３．０ｈ＋／’ 上記の組成を有する測定用組成物を調整した。Example 1 [Quantification of various fatty acids] ・10mM NAD
0.2 ml・10mM MgCl
2 0.3 ml-10
mM ATP
0.3 ml・3% Triton X-1000, 1m
l・10mM CoASH0.2ml・Anoru C
OA・/ncetase activity-containing solution (40U/ml; Toyo Jozo Co., Ltd. LotNa656) 0
．． 02. ml Anol-CoA oxidase activity-containing solution (400 U/mg; Toyo Jozo Co., Ltd. Lo tN [165
4; Refer to the production example of anol-CoA/oxidase described below) 0.02 ml Catalase (150 U/ml: manufactured by Sigma) 0.05 ml Complex active enzyme activity content (enoyl-CoA hydratase activity 400 U/ml)
ml, 3-hydroquine-CoA dehydrogenase activity 200 U/ml, 8-'ydoacyl-CQA thiolase activity 168 U/ml; manufactured by Toyo Jozo Co., Ltd.; see the production example of a multi-active enzyme described below)
0.05m1 total 3.0h+/' A composition for measurement having the above composition was prepared.

この測定用組成物３−３−０Ｏに、２　ｍ　Ｍの各種脂
肪酸を含有する被検液２５μｌ（脂肪酸含量０．０５μ
ｍｏｌｅ）　を加えて、３７℃で５分間反応せしめた後
、生成された還元型ＮＡＤの量を波長３４０ｎｍにて吸
光度（ＯＤ　３４０１ｍ　）を測定した。This measurement composition 3-3-0O was added with 25 μl of a test solution containing 2 mM of various fatty acids (fatty acid content: 0.05 μl).
mole) and reacted at 37° C. for 5 minutes, the amount of reduced NAD produced was measured by absorbance (OD 3401m ) at a wavelength of 340 nm.

その結果、第３表に示す通りであった。The results were as shown in Table 3.

極めて良好な吸光度増加の比例関係にて測定し得たもの
であった。The measurement was possible with an extremely good proportional relationship of increase in absorbance.

実施例　２ 〔脂肪酸（オレイン酸）の定量〕 実施例１と同一組成を有する測定用組成物３．００ｍ１
を用い、これにオレイン酸０．０１μｍｏｌｅ。Example 2 [Quantification of fatty acid (oleic acid)] 3.00 ml of measurement composition having the same composition as Example 1
and 0.01 μmole of oleic acid.

０．０２μｍｏ　ｌ　ｅ、　０．０３μｍｏ　ｌ　ｅ、
　０．０４μｍｏ　ｌ　ｅ。0.02 μmol e, 0.03 μmol e,
0.04 μmol e.

および０．０５μｍｏｌｅを含有する被検液２０μｌを
加えて、３７℃で５分間反応せしめ、次いで生成された
還元型ＮＡＤの量を波長３４０．ｎｍにて吸光度測定し
た。その結果、第４図中番−１で示される定量曲線を得
た。20 μl of the test solution containing 0.05 μmole of NAD was added and allowed to react at 37°C for 5 minutes, and then the amount of reduced NAD produced was measured at a wavelength of 340. Absorbance was measured at nm. As a result, a quantitative curve indicated by number-1 in FIG. 4 was obtained.

壕だ対照として、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｙｙ。As a contrast, Analytical Bioch
emistyy.

９８．３４１　（１９７９）に記載の従来法に基いて、
オレイン酸を含有する被検液を用いて測定（たたし、吸
光度の減少値である）した結果、第４図中Ｇ−０にて示
される定量曲線を得だ。Based on the conventional method described in 98.341 (1979),
As a result of measurement (this is the decrease in absorbance) using a test solution containing oleic acid, a quantitative curve indicated by G-0 in FIG. 4 was obtained.

その結果、本発明の定量曲線は、従来法のそれに比べ高
感度にて測定され得たことが明らかである。As a result, it is clear that the quantitative curve of the present invention could be measured with higher sensitivity than that of the conventional method.

実施例　３ 〔脂肪酸（オレイン酸）の定量〕 ・　０．２Ｍ　　ピペスーＮａＯＨ緩衝液（ｐＩ（７，
３）０．５ｍ１ −１０ｍＭ　ＮＡ、Ｄ　　　　　　　　　　　０．２　
ｍｅ・］−００ｍＭＭｇＣ１２ｏ、　２　ｍｌ−１０ｍ
Ｍ　ＡＴＰ　　　　　　　　　　　０．２　ｍｌ・　１
％トリト、：／Ｘ−１００　　　　　　　　　　　　　
０．２ｍｌ・１０ｍＭ　ＣｏＡ−８Ｈ０，２ｍｌ ・アンルーＣｏＡ・シン士ターゼ活性含有物（４０Ｕ／
ｍｌ。Example 3 [Quantification of fatty acid (oleic acid)] - 0.2M Pipesu NaOH buffer (pI (7,
3) 0.5m1 -10mM NA, D 0.2
me・]-00mM MgC12o, 2ml-10m
M ATP 0.2 ml・1
%Torit, :/X-100
0.2ml・10mM CoA-8H0.2ml・Unru CoA・Synthase activity content (40U/
ml.

Ｌ　ｏ　ｕ＋ｎ６５６　）　　　　　　　　　　　　　
　　　０．０２ｍ１・アノルーＣｏＡ・オギ／タービ活
性含有物（４００Ｕ／ｍｌ。L ou+n656 )
0.02ml・Anoru-CoA・Ogi/Turbi active content (400U/ml.

Ｌｏ　ｔＮｎ６５４）　　　　　　　　　　　　　　　
　ｏ、０２ｍ１、　　・複合活性酵素活性含有物（エノ
イル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性４００　Ｕ／ｍｌ、　
　３−ヒドロキンアンルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活
性２００Ｕ／ｍｌ、　　３−ケトアノルーＣｏＡ・チオ
ラーゼ活性１６３　Ｕ／ｍｌ）　　　　　０．　Ｏ１ｍ
ｌ・　カタラーゼ（１５０Ｕ／ｍｌ）　　　　　　　　
　　　０．０５ｍ１・　ジアホラーゼ（８０Ｕ／ｍｌ：
東洋醸造社製）０，１ｍ１−　０．２５％ＮＴＢ　　　
　　　　　　　　　　　　０．２ｍｌ・蒸留水　　　　
　　　　　　　　　　ｌ。１０ｍｌ計　　８．００ｍ１ 上記組成を有する測定用組成物を調整した。この測定用
組成物３．００＋＋＋ｇを用い、これにオレイン酸０．
００５μｍｏｌ＋、０．０１μｍｏｌｅ、０．０１５μ
ｍｏ　ｌ　ｅ、　０．０２μｍｏ　ｌ　ｅ、　０．０２
５μｍｏ　ｌ　ｅを含有する被検液２０μｌを加えて、
３７℃で１０分間反応せしめ、反応によって生成した還
元型ＮＡＤＯ量に応じて生成した青紫色の発色を波長５
５０ｎｍにて吸光度（ＯＤ５６００ｍ　）を測定した。LotNn654)
o, 02ml, ・Multiple active enzyme activity content (enoyl-CoA・hydratase activity 400 U/ml,
3-Hydroquine-an-CoA dehydrogenase activity 200 U/ml, 3-ketoan-CoA thiolase activity 163 U/ml) 0. O1m
l. Catalase (150U/ml)
0.05ml Diaphorase (80U/ml:
Toyo Jozo Co., Ltd.) 0.1m1- 0.25%NTB
0.2ml/distilled water
l. 10 ml total: 8.00 ml A composition for measurement having the above composition was prepared. Using 3.00+++g of this composition for measurement, 0.0% of oleic acid was added to it.
005μmol+, 0.01μmole, 0.015μ
mol e, 0.02 μmol e, 0.02
Add 20 μl of test solution containing 5 μmol e,
The reaction was carried out at 37°C for 10 minutes, and the blue-purple color produced according to the amount of reduced NADO produced by the reaction was detected at wavelength 5.
Absorbance (OD5600m) was measured at 50 nm.

その結果、第５図中番−１で示される定量曲線を得だ。As a result, a quantitative curve shown by number-1 in Figure 5 was obtained.

捷だ対照として、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓＬｙ。As a comparison, Analytical Bioche
misLy.

１０８．６（１９８０）に゛記載の従来法に基いて、オ
レイン酸を含有する被検液を用いて測定〔たたし、波長
５０５ｎｍによる吸光度（ＯＤ５Ｑ５ｎｍ　）測定であ
る〕しだ。その結果、第５図中○−○にて示される定量
曲線を得た。108.6 (1980) using a test solution containing oleic acid [absorbance (OD5Q5nm) was measured at a wavelength of 505 nm]. As a result, a quantitative curve indicated by ○-○ in FIG. 5 was obtained.

その結果、本発明の定量曲線は、従来法のそれに比べ極
めて高感度に測定され得だことが明らかである。As a result, it is clear that the quantitative curve of the present invention can be measured with extremely high sensitivity compared to that of the conventional method.

実施例　４ 〔リパーゼ活性（血清リパーゼ活性）測定〕−０，２Ｍ
　　ピペスーＮａ０Ｉ−Ｉ緩衝１（ｐＨ７，３）０．２
ｍ１ −１０ｍＭ　　ＮＡＤ　　　　　　　　　　　　０．１
５ｍ１・１０ｍＭ　ＭｇＣ７２０，１，５ｍＪ・ｌｏｍ
Ｍ　ＡＴＰ　　　　　　　　　　　　０．１５ｍＪ・　
２％１・１月−ンＸ−１００含有１０ｍＭ１−２−ジオ
レイルグリセライド　　　　　　　　　　　　　　０．
１０ｍ１・　　１．　０ｍＭ　　　　ＣｏＡＳＩ−Ｔ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　Ｏ，１５ｍ１−　２Ｍ　　ＫＣｌ　　　　　　　
　　　　　　　　　０．１　　ｍｌ・　５％十血清アル
ブミ７　　　　　　　　　　　　　Ｑ、　ｉ　　ｍｌ・
アシル−ＣｏＡ・／ンセターゼ活性含有物（４０Ｕ／ｍ
ｌ；Ｌｏ　ｔＮ［１６５６）　　　　　　　　　　　　
　　　　０．２　　ｍｌ・アンルーＣｏＡ・オキ／ター
上活性含有物（４ｏＯＴＪ、４’；Ｌ　ｏ　ｔＮ［１６
５４）　　　　　　　　　　　　　　　　０．０２ｍ１
・複合活性酵素活性含有物（エノイル−ＣＯＡ・ヒドラ
ターゼ活性４００　Ｕ　７ｍｌ、３−ヒｌ’ｏ　キシ７
　／ｆｉＶ−ＣＯＡ　−デヒドロゲナーゼ活性２００　
Ｕ　／ｍｉ！、　　３−ケ（・アンル−ＣｏＡ・チオラ
ーゼ活性１６８１Ｊ／ｍ６）　　　　　０．０５ｍ１・
カタラーゼ（１５０ＴＪ／ｍｌ）　　　　　　　０．０
５ｍｅ・蒸留水　　　　　　　　　　　　　　０．０８
ｍ、ｇ計　　１．５ｍｊ 上記組成を有する測定用組成物を調整した。この測定用
組成物１．．５ｍｌに、人血清５０μｌを加え３７°Ｃ
にて反応せしめ、反応後逐次反応液中に生成される還元
型ＮＡＴ）の量を波長３４０　ｎ　ｍにて吸光度（ＯＤ
３４０１ｍ）の測定をしだ。Example 4 [Lipase activity (serum lipase activity) measurement] -0.2M
Pipesu Na0I-I buffer 1 (pH 7,3) 0.2
m1 -10mM NAD 0.1
5m1・10mM MgC720,1,5mJ・lom
M ATP 0.15mJ・
10mM 1-2-dioleylglyceride containing 2% 1.1-X-100 0.
10m1・1. 0mM CoASI-T

O, 15m1-2M KCl
0.1 ml 5% serum albumin 7Q, i ml
Contains acyl-CoA/ncetase activity (40U/m
l;Lo tN [1656)
0.2 ml・Unlu CoA・Oki/Tar active content (4oOTJ, 4'; L o tN[16
54) 0.02m1
・Contains complex enzyme activity (enoyl-COA/hydratase activity 400 U 7ml, 3-hyperoxy7
/fiV-COA-dehydrogenase activity 200
U/mi! , 3-ke (・Anru-CoA・Thiolase activity 1681J/m6) 0.05m1・
Catalase (150TJ/ml) 0.0
5me/distilled water 0.08
m, g total 1.5 mj A measurement composition having the above composition was prepared. This measurement composition 1. ．． Add 50 μl of human serum to 5 ml and heat at 37°C.
After the reaction, the amount of reduced NAT produced in the reaction solution was determined by absorbance (OD) at a wavelength of 340 nm.
3401m).

その結果、第４表に示す通りであった。The results were as shown in Table 4.

第　　４　　表 この測定の結果、用いたジグリセライドと血清リパーゼ
活性とに基くジグリセライドから遊離された脂肪酸が反
応する前に、血清中に存在する遊離の脂肪酸が反応した
ことが明らかであり、またとの血清中に存在する遊離の
脂肪酸は反応時間７分間の反応で終了したものと認めら
れる。この時点次後の吸光度の増加が用いたジグリセラ
イドと血清リパーゼ活性とに基くジグリセライドから遊
離された脂肪酸の反応による還元型ＮＡＤの量であり、
従って反応開始後８分から１３分の５分間の吸光度の増
加により、リパーゼ活性を求めた結果、８．４．４ＴＪ
／ｌであった。Table 4 As a result of this measurement, it is clear that the free fatty acids present in the serum reacted before the fatty acids released from the diglyceride used and the serum lipase activity reacted. It is recognized that the free fatty acids present in the serum were completed after the reaction time of 7 minutes. The increase in absorbance after this point is the amount of reduced NAD due to the reaction of the fatty acid released from the diglyceride used and the serum lipase activity,
Therefore, the lipase activity was determined from the increase in absorbance for 5 minutes from 8 minutes to 13 minutes after the start of the reaction, and the result was 8.4.4 TJ.
/l.

なおリパーゼ活性の算出式は次式に基いたものである。The calculation formula for lipase activity is based on the following formula.

１．５　　５０　　５ 寸だ血清リパーゼ活性の測定において、上記の測定用組
成物の組成中リパーゼ活性の基質であるグリセライド無
添加の組成物を調整し、これを用いて血清リパーゼ活性
測定用被検液を加えて血清中に存在する遊離の脂肪酸を
消去せしめた後、本発明の上記測定用組成物を用いるこ
とにより血清中の遊離脂肪酸による影響なく、す・ぐ−
ゼ活性の測定ができる。1.5 50 5 In the measurement of serum lipase activity, a composition without the addition of glyceride, which is a substrate for lipase activity, is prepared in the composition of the measurement composition described above, and this is used to prepare a sample for measurement of serum lipase activity. After adding liquid to eliminate free fatty acids present in the serum, by using the composition for measurement of the present invention, it is possible to quickly and quickly remove the free fatty acids present in the serum without the influence of the free fatty acids in the serum.
It is possible to measure enzyme activity.

実施例　５ 〔トリグリセライド測定用組成物〕 ・０．２Ｍ　　リン酸緩衝液（ｐＩ−Ｉ７．５）　　　
　　０．５　　ｍｌ・１０ｍＭ　　ＮＡＤ　　　　　　
　　　　　　　　　Ｏ，３ｍｌ−１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ
２　　　　　　　　　　　０．４　ｍｌ・］、　ＯｍＭ
　　ＡＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，８ｍｌ
・　３％トリト、／Ｘ−１０００，Ｌ　　ｍｌ・　１０
ｍＭ　Ｃ０ＡＳＨ０４ｍｌ ・アシル−ＣｏＡ・ンンセターゼ活性含有物（４，ＯＵ
／ｍｌＶ。Example 5 [Composition for triglyceride measurement] ・0.2M phosphate buffer (pI-I7.5)
0.5 ml・10mM NAD
O, 3ml-10mM MgCl
2 0.4 ml・], OmM
ATP O, 8ml
・3% Torito, /X-1000, L ml・10
mM C0ASH04ml・Acyl-CoA・Nensetase activity content (4,OU
/mlV.

Ｔ−、ｏ　ＩＮ［１６５６）　　　　　　　　　　　　
　　　　０．　Ｏ：３ｍｌ・アンルーＣｏＡ・オキシタ
ーゼ活性含有物（４，ＯＯＵ　７ｍｌ。T-, o IN [1656)
0. O: 3 ml, unlu CoA, oxidase activity-containing material (4, OOU 7 ml.

Ｌ　ｏ　　ｔＮＩ１６５４　）　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　０．　０８ｍｅ・複合活性
酵素活性含有物（エノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性
４００　Ｕ　７ｍｌ、　　３−ヒドロギンア／ルー〇ｏ
Ａ°テヒトロゲナーセ活性２００Ｕ／ｍＪ、３−ケトア
ンルーＣｏＡ・チオラーゼ活性１６　ａ　Ｕ／ｍｌ）　
　　　　　　　　０、Ｏ’１ｍｌ・　カタラーセ（１５
０Ｕ／ｍｅ）　　　　　　　　　　　０．０７ｍ１・　
リパーゼ活性（１０，０ＯＯＵ／ｍｅ；東洋醸造社製）
０、０８ｍ１ 泪　　３．ＯＯｍＪ 」−記組成を有する測定用組成物をトリグリセライＦ用
測定用組成物としだ。Lot NI1654)
0. 08me・Contains complex enzyme activity (enoyl-CoA・hydratase activity 400 U 7ml, 3-hydrogina/ru〇o
A°tetrogenase activity 200 U/mJ, 3-ketoanru-CoA thiolase activity 16 a U/ml)
0, O'1ml Catalase (15
0U/me) 0.07m1・
Lipase activity (10,0 OOU/me; manufactured by Toyo Jozo Co., Ltd.)
0.08m1 Tears 3. A measurement composition having the following composition was designated as a measurement composition for triglycerai F.

このトリグリセライド測定用組成物は、血清３０μｌを
前記実施例１記載の測定用組成物と同一の組成を有する
血清中の遊離脂肪酸の消去のだめの組成物に加えて３７
°ＣＸ　１０分間反応せしめた後、その１−　ｍｌ（血
清相当量１０μｌ）を分増し、これを被検液として加え
て波長８４．　Ｏｎ　ｍにて吸光度の増加を測定するか
、捷たは血清１０　ＩＩ　ｌを直接加えて反応開始１０
分以後の波長８４０ｎｍにおける吸光度の増加を測定す
るに用いられる。This composition for triglyceride measurement was prepared by adding 30 μl of serum to a composition for eliminating free fatty acids in serum having the same composition as the composition for measurement described in Example 1.
After reacting at °CX for 10 minutes, increase the volume by 1 ml (equivalent to serum: 10 μl), add this as a test solution, and adjust the wavelength to 84. Start the reaction by measuring the increase in absorbance at 10 m or directly adding 10 l of strain or serum.
It is used to measure the increase in absorbance at a wavelength of 840 nm after minutes.

実施例　６ 〔ホスホリパーゼＡ１活性、ホスポリバー上Ａ２活性１
だはオスホリパーセＢ活性測定用組成物〕実施例］記載
の測定用組成物において、蒸留水１２６ｍ１の代りに、
１０ｍＭし７チン溶液０，２ｍｌおよび蒸留水１．０６
ｍ７を用いて測定用組成物となす。Example 6 [Phospholipase A1 activity, A2 activity on phospholipase 1
Composition for Measuring Ospholipase B Activity [Example] In the measuring composition described in [Example], instead of 126 ml of distilled water,
0.2ml of 10mM 7tin solution and 1.06ml of distilled water
m7 is used to prepare a composition for measurement.

実施励　７ 〔リゾホスホリパーゼ活性測定用組成物〕実施例１記載
の測定用組成物において、蒸留水１．２６ｍ１の代りに
、１０ｍＭリゾレ／チン溶液０．２ｍｌおよび蒸留水１
−０６ｍ１を用いて測定用組成物となす。Practical example 7 [Composition for measuring lysophospholipase activity] In the measuring composition described in Example 1, instead of 1.26 ml of distilled water, 0.2 ml of 10 mM Lysolet/tin solution and 1 ml of distilled water were added.
-06ml is used to prepare a composition for measurement.

実施例　８ 〔ホスファターゼ活性測定用組成物〕 実施例１記載の測定用組成物における蒸留水］、、２６
ｍ１の代りに、１０ｍＭホスファチジン酸溶液０．２ｍ
ｌ、リパーゼ（１０，０ＯＯＴＪ　７ｍｌ　）０．０５
ｍ１および蒸留水１．．０１ｍ１を用いて測定用組成物
となす。Example 8 [Composition for measuring phosphatase activity] Distilled water in the composition for measuring described in Example 1], 26
10mM phosphatidic acid solution 0.2m instead of m1
l, lipase (10,0 OOTJ 7ml) 0.05
m1 and distilled water 1. ．． A composition for measurement is prepared using 01ml.

実施例　９ 〔ホスホリパービＣ活性測定用組成物〕実施例５記載の
トリグリセライド測定用組成物における蒸留水０．７７
ｍ１の代りに、１０ｍＭレシチン溶液０．２ｍｌおよび
蒸留水０．５７ｍ１を用いて測定用組成物となす。Example 9 [Composition for measuring phospholiperby C activity] Distilled water 0.77 in the composition for measuring triglyceride described in Example 5
A composition for measurement is prepared by using 0.2 ml of 10 mM lecithin solution and 0.57 ml of distilled water instead of ml.

本測定用組成物は、グリセライドにも作用するために、
グリセライドをも含有する被検液を用いる揚台にはグリ
セライドからの脂肪酸の量との差を求める。This measurement composition also acts on glycerides, so
If a test solution containing glyceride is used, the difference between the amount of fatty acid and the amount of fatty acid from glyceride is determined.

実施例　１０ 〔ホスホリパーゼＣ活性測定用組成物〕１０ｍＭ１／ジ
チア溶液０．　２ｍ１．、　　リパーゼ活性（５，００
００７ｍｌ　）　０．０８ｍ１．０．２　Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，５）　０．５０ｍｅ、蒸留水１．２２ｍ１
を含有する脂肪酸遊離用反応組成物２．０ｍｌを調整す
る。Example 10 [Composition for measuring phospholipase C activity] 10mM1/dithia solution 0. 2m1. , lipase activity (5,00
0.07ml) 0.08ml 1.0.2M phosphate buffer (pH 7,5) 0.50me, distilled water 1.22ml
Prepare 2.0 ml of a reaction composition for fatty acid release containing .

この脂肪酸遊離用反応組成物と、前記実施例１記載の測
定用組成物とを用いてホスホリパーゼＣ活性測定用組成
物となす。A composition for measuring phospholipase C activity is prepared using this reaction composition for fatty acid release and the measuring composition described in Example 1 above.

１ず脂肪酸遊離用反応組成物２．０ｍｌに、ホスホリパ
ーゼＣ活性測定用被検０．２０μｌを加えて３７℃、１
０分間反応せしめ、次いで反応を停止せしめた後、これ
を実施例１記載の測定用組成物８．００ｍ１に加えて３
７°Ｃで５分間反応せしめ、波長３４．　Ｏｎ　ｍにて
吸光度測定をする。1. To 2.0 ml of the reaction composition for fatty acid release, 0.20 μl of the test sample for measuring phospholipase C activity was added, and the mixture was heated at 37°C for 1 hour.
After reacting for 0 minutes and then stopping the reaction, this was added to 8.00 ml of the composition for measurement described in Example 1.
Incubate for 5 minutes at 7°C, wavelength 34. Measure the absorbance at On m.

実施例１１ 〔ホスホリパーゼＤ活性測定用組成物〕１０ｍＭし／チ
ノ溶液０．２ｍｌ、ホスファチジノ酸ホスファターゼ活
性（５０Ｕ／ｍｅ　；東洋醸造社製）０−０５ｍｌ、　
　リパーゼ活性（１０、０００ＴＪ／ｍｅ）０、０５ｍ
１．　０．２１ＶＩ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）
０．６ｍｌ、蒸留水１．１ｍ、ｌを含有する脂肪酸遊離
用反応組成物２．．０ｒｎｌを調整する。Example 11 [Composition for measuring phospholipase D activity] 10mM/Chino solution 0.2ml, phosphatidinoic acid phosphatase activity (50U/me; manufactured by Toyo Jozo Co., Ltd.) 0-05ml,
Lipase activity (10,000TJ/me) 0,05m
1. 0.21VI) Lis-hydrochloric acid buffer (pH 7.5)
2. Reaction composition for fatty acid release containing 0.6 ml and 1.1 ml of distilled water. ．． Adjust 0rnl.

この脂肪酸遊離用組成物と、前記実施例１記載の測定用
組成物とを用いてホスホリパーゼＤ活性測定用組成物と
なす。A composition for measuring phospholipase D activity is prepared using this fatty acid releasing composition and the measuring composition described in Example 1 above.

実施例　１２ 〔コリノエステラーゼ活性測定用組成物〕実施例１記載
の測定用組成物における蒸留水１．２６＋＋＋／！の代
りに、２ｍＭパルミトイルーコリノエステル溶″ｏ、Ｏ
６２ｍｅおよび蒸留水１．０６ｍ１を用いて測定用組成
物となす。Example 12 [Composition for measuring corinoesterase activity] Distilled water in the measuring composition described in Example 1: 1.26+++/! Instead of 2mM palmitoyl-corinoester solution 'o, O
62me and 1.06 ml of distilled water are used to prepare a composition for measurement.

実施例　１３ 〔コレステロールエステラーゼ活性測定用組成物〕実施
例１記載の測定用組成物における蒸留水１．２６ｍ１の
代りに、５　ｍ　Ｍ　３−オレオイル−コレステロール
エステル溶に！ｉ、０．２ｍｌおよび蒸留水１−０６ｍ
／！を用いて測定用組成物となす。Example 13 [Composition for measuring cholesterol esterase activity] Instead of 1.26 ml of distilled water in the composition for measuring the activity described in Example 1, 5 mM 3-oleoyl-cholesterol ester solution was used! i, 0.2 ml and distilled water 1-06 m
/! A composition for measurement is prepared using the following.

実施例　１４ 〔し／チンコレステロールアノルトランスフエ７−セ活
性測定用組成物〕 ５　ｍ　Ｍ　コＬ／　ステロール溶液０．２ｍｌ、５ｍ
Ｍ１／ンチンｇｉ　０　、２　ｍｌ、　　リゾホスホリ
パーゼ活性（８０Ｕ　／　ｍｌ！　）含有物０．０５ｍ
１および０．３％］・リドンＸ−１００含有の０．１Ｍ
ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　１　、５５ｍｌを含有
する脂肪酸遊離用反応組成物２．Ｑｍｅを調整する。Example 14 [Composition for measuring sterol/tin cholesterol anoltransferase 7-se activity] 5 mM CoL/sterol solution 0.2 ml, 5 m
M1/Nchingi 0, 2 ml, 0.05 m containing lysophospholipase activity (80 U/ml!)
1 and 0.3%]・0.1M containing Lydon X-100
Reaction composition for fatty acid release containing 55 ml of IJ acid buffer (pH 7.5) 2. Adjust Qme.

この脂肪酸遊離用組成物と、前記実施例１記載の測定用
組成物とを用いてレンチンコレステロールアノルトラン
スフエラーゼ活性測定用組成物をなす。A composition for measuring lentin cholesterol anortransferase activity is prepared using this fatty acid releasing composition and the measuring composition described in Example 1 above.

実施例１５ 〔コレステロールエステル測定用組成分〕実施例１記載
の測定用組成物における蒸留水１　、　２６　ｍ１（Ｄ
代リニ、コレステロールエステラーゼ活性（３５０１Ｊ
　／　ｍ、ｌ　；東洋醸造社製）含有物０．２ｍ、ｌお
よび蒸留水１．．０６ｍ１を用いてコレステロールエス
テル測定用組成物となす。Example 15 [Composition for measuring cholesterol ester] Distilled water 1,26 ml (D
Cholesterol esterase activity (3501J)
/ m, l; manufactured by Toyo Jozo Co., Ltd.) Contains 0.2 m, l and distilled water 1. ．． A composition for measuring cholesterol ester is made using 06ml.

〔複合活性酵素の製造例〕[Example of production of multi-active enzyme]

５００ｍ１容三角フラスコに１００ｍ１の培地（培地組
成、ペプトン１．５％、粉末酵母エキス０．５％、ＫＣ
ｌ０．２％、ＮａＣ１０，１％、Ｋ２ＨＰＯ４０゜１％
、ＭｇＳＯ４０，０５％、オレイン酸０．７５％、ｐＩ
（７，０；１５本分）を入れ、１２０°Ｃで加圧滅菌し
だ後３０°Ｃにて、７．：ｌ−−トモナス・フライ−Ｂ
−ＯＴ’ｌｌ　（ＦＥＲ，Ｍ−ＰＮｎ５７０１）を接種
し、ロータリー７エーカーにて２０時間培養した。次い
でこの培養物を併合し、５０００ｒｐｍ、２０分間遠心
分離して培養菌体を得た。さらに得られだ菌体を１．５
０ｍ２リゾチーム含有１０　ｍ　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（
ｐ　Ｉ−１７、０）　３６０　ｍｌに加えて可溶性の和
製の複合活性酵素含有液（３−ヒドロキンアンルー　Ｃ
ｏ　Ａ・デヒドロゲナーゼ活性にて、その比活性は３．
０（Ｊ／ｍ？であった。）　３４０　ｍｌ！を得た。100 ml of medium in a 500 ml Erlenmeyer flask (medium composition, peptone 1.5%, powdered yeast extract 0.5%, KC
l0.2%, NaC10.1%, K2HPO40°1%
, MgSO40.05%, oleic acid 0.75%, pI
7. :l--Tomonas fly-B
-OT'll (FER, M-PNn5701) was inoculated and cultured in a 7-acre rotary for 20 hours. The cultures were then combined and centrifuged at 5000 rpm for 20 minutes to obtain cultured bacterial cells. Furthermore, the obtained bacterial cells were 1.5
0 m2 10 m M IJ acid buffer containing lysozyme (
p I-17, 0) 360 ml plus a soluble Japanese multi-active enzyme-containing solution (3-Hydroquine Anru C
o Regarding A. dehydrogenase activity, its specific activity is 3.
0 (J/m?) 340 ml! I got it.

得られた粗製の複合活性酵素２９０ｍ１を水槽中で冷却
後、予め一２０°Ｃに冷却したアセト７２９０ｍ１を添
加し、生じた沈澱物を回収し、これをＩＭ　Ｋ　Ｃｌ含
有１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐｉ−、Ｔ７．５）に
溶解し、さらに１２００Ｏｒｐｍ、１０分間遠心分離し
て不溶物を除去した。得られた上清液の４５ｍ１を分取
し、これに２２．５ｍｌの飽和硫安溶液（ｐＨ７，０）
を添加し、生じた沈澱物を１２００Ｏｒｐｍ、１０分間
遠心分離にて除去した。次いで得られだ上清液５７ｍ１
に、さらに飽和硫安溶液２８ｍ１を加えて沈澱せしめた
。この沈澱物を回収した後、ＩＭＫＣｌ含有１０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）の１０ｍ１に溶解し、
１０　ｍ　Ｍ　ｌ−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）２
．Ｏｌに対して４°Ｃで２０時間セルロースチューブに
て透析脱塩し、次いでこれを凍結乾燥して、複合活性酵
素粉末（３−ヒドロキンアンルーＣｏＡ・デヒドロゲナ
ーゼ活性にて、その比活性は１Ｂ、２Ｕ／ｍｙであった
）７　’１ｒｒｉを得た。After cooling 290 ml of the obtained crude composite active enzyme in a water bath, 7290 ml of acetate previously cooled to -20°C was added, the resulting precipitate was collected, and this was added to IM KCl-containing 10 mM Tris-HCl buffer. (pi-, T7.5) and further centrifuged at 1200 rpm for 10 minutes to remove insoluble matter. Collect 45 ml of the obtained supernatant liquid and add 22.5 ml of saturated ammonium sulfate solution (pH 7.0) to this.
was added, and the resulting precipitate was removed by centrifugation at 1200 rpm for 10 minutes. Then, 57ml of the supernatant liquid obtained
Further, 28 ml of saturated ammonium sulfate solution was added to cause precipitation. After collecting this precipitate, it was dissolved in 10 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing IMKCl,
10 mM l-Lis-HCl buffer (pH 7,5) 2
．． Desalination was carried out by dialysis using a cellulose tube at 4°C for 20 hours against Ol, followed by freeze-drying to obtain a complex active enzyme powder (3-hydroquine-an-CoA/dehydrogenase activity, with a specific activity of 1B). , 2 U/my) 7'1 rri was obtained.

さらに得られた複合活性酵素粉末（３−ヒドロキンアン
ルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性にて、その比活性は
１８．２Ｕ／ｍ２であった。）７７ｍ９を２０ｍ１の水
に溶解し、これを、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，５）で平衝化しだＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６
Ｂ（ファルマノア社ｆｆ）のカラム（３Ｘ１１ｃｍ）に
チャージして吸着せしめ、同一ト緩衝液にてカラムを洗
浄した。次いで５００ｍ１の同上緩衝液と０−４４４Ｋ
Ｃｌを含んだ同上緩衝液５００ｍ１にて作製した直線濃
度勾配法による溶出を行なった。５２ｍＡ／時間の流速
で、９ｍ１つつ分取し、各分画の酵素活性を測定し、そ
の活性画分（Ｎ［１７１〜８０　）　９０ｍｌを得だ（
３−ヒドロキンアンルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性
にて、その比活性は３０　、　Ｏ０７ｍ９であった）。Further, 77m9 of the obtained composite active enzyme powder (3-hydroquine-an-CoA dehydrogenase activity, the specific activity was 18.2U/m2) was dissolved in 20ml of water, and this was dissolved in 10mM Tris. - Hydrochloric acid buffer (pH
DEAE-Sepharose CL-6 was equilibrated with 7,5)
B (Pharmanoa FF) column (3 x 11 cm) was charged and adsorbed, and the column was washed with the same buffer. Then 500ml of the same buffer and 0-444K
Elution was performed using a linear concentration gradient method prepared with 500 ml of the same buffer containing Cl. At a flow rate of 52 mA/hour, 9 ml of each fraction was collected, the enzyme activity of each fraction was measured, and 90 ml of the active fraction (N[171-80) was obtained (
The specific activity of 3-hydroquine unruly CoA dehydrogenase was 30,007m9).

さらにこの活性画分を、１０　ｍ　Ｍ　リン酸緩衝液（
ｐＨｊ５）２１に対して透析した後、ハイドロキンアパ
タイトゲルを充填しだカラム（２ＸＩＯｃｍ）にチャー
ジして吸着せしめた。３００ｍ１の１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７，５）と３００ｍＪの０５Ｍ　ＩＪン酸緩衝
液（ｐｌ（７，５）とにて作製した直線濃度勾配法によ
り溶出を行なった。３３ｍ１／時間の流速で５　ｍｌつ
つ分取し、各分画の酵素活性を測定し、活性画分（Ｎα
４６〜６２）８５ｍｌを得だ（エノイルアンルーＣｏＡ
ｌ１ヒドラターゼ活性の比活性は２１０　、８Ｕ／ｍ９
．３−ヒ）口＃　’／　７　シ／ｌ／　−ＣｏＡ・デヒ
ドロゲナーゼ活性の比活性は１０５０２杓す、３−ケト
アシル−ＣｏＡ・チオラーゼ活性の比活性ハ８５．６Ｕ
／ｍ２であった）。次いでこの活性画分を、限外濾過膜
（アミコン社製ＸＭ−５０）を用いて濃縮後、これを、
トヨパールＨＷ−６０（乗洋曹達社製）を充填しだカラ
ム（１−ＩＸ９０ｃｍ）にチャージしてゲル濾過しだ（
溶媒：１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐ［（７，５，０，
５ＭＫＣｌ）。Furthermore, this active fraction was added to 10 mM phosphate buffer (
After dialyzing against pHj 5)21, a column (2XIOcm) filled with hydroquine apatite gel was charged and adsorbed. Elution was performed by a linear concentration gradient method prepared with 300 ml of 10 mM phosphate buffer (pH 7,5) and 300 mJ of 05M IJ phosphate buffer (pl(7,5). The enzyme activity of each fraction was measured, and the active fraction (Nα
46-62) 85 ml was obtained (enoyl enroux CoA
The specific activity of l1 hydratase activity is 210, 8U/m9
．． 3-hi) Mouth #'/7 /l/-The specific activity of CoA dehydrogenase activity is 10502 U, and the specific activity of 3-ketoacyl-CoA thiolase activity is 85.6 U.
/m2). Next, this active fraction was concentrated using an ultrafiltration membrane (XM-50 manufactured by Amicon), and then
Fill a column (1-IX 90 cm) with TOYOPEARL HW-60 (manufactured by Noriyo Soda Co., Ltd.) and perform gel filtration (
Solvent: 10mM Tris-HCl buffer p[(7,5,0,
5M KCl).

３．５ｍ１つつ分取し、活性画分（Ｎ［１２３〜２７）
１７．５ｍｅを得、これを凍結乾燥して精製された複合
活性酵素を得た（３−ヒドロキ／アシル−リＯＡ・デヒ
ドロゲナーゼ活性にて、その比活性は１１０Ｕ／％’で
あった。収量２０　ｍｇ　）。Aliquot 3.5ml and collect the active fraction (N[123-27)
17.5me was obtained, and this was freeze-dried to obtain a purified multi-active enzyme (3-hydroxy/acyl-lyOA dehydrogenase activity, the specific activity was 110 U/%'. Yield: 20 mg).

〔アシル−ＣｏＡ・オキンターゼの製造例〕オレイン酸
１％、酵母エキス０．２５％、ペプト　ン　１　％、　
　ＫＣｌ０．２　％、　Ｋ２ＨＰＯ４０，１免、　Ｍｇ
５Ｏ４・７Ｈ２００，０５％、消泡剤（ディスフオーム
ＢＣ−５１Ｙ）０．２％よりなる組成の培地１０ｍ１を
滅菌後試験管に入れ、これにアースロバフタ−・ニス・
ピー・Ｂ−０７２０菌株を接種し、３０°Ｃにて一晩振
盪培養して種菌を得だ。次いでこれを、上記と同一組成
の培地５１を有する８１容ジャーファーメンタ−に移植
し、３０°Ｃ１２０時間６００ｒｐｍ、５１／分の条件
下通気攪拌培養した。培養終了後、培養物を遠心分離し
てその菌体を得、これを、ｌｌの１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）、２　ｍＭＥＤＴＡ、　０．５ｍ９７ｍ
１リゾチームに懸濁し、３７℃にて６０分間攪拌し、処
理後オキシリボヌクレアーゼ５　ｍ９を添加してさらに
１０分間攪拌した後、１１００００ｒｐにて２０分間遠
心した。得られた上清液に、２００ｍ１のアセトンを加
えて遠心した後、さらに上清に、１．８１のアセトンを
加えた。次いでこれを遠心してその沈澱物を得、これを
２．００ｍ１の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ）１７．０）
に溶解し、不溶物を遠心除去し、さらに、飽和硫安を用
いて３０〜７５％の硫安分画を行ない、得られた沈澱物
を４０ｍ１の１０　ｍ　Ｍ’　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）に溶解し、これをアクリルマイトゲル（バイオゲ
ルＰ〜２；バイオラド社製）のカラムにチャージして脱
塩した。次いでこれを、リン酸カルンウムゲルのカラム
にチャージして吸着せしめ、洗浄後０．０５〜０．５Ｍ
のリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）の濃度勾配をつけたグラ
ディエンド法で溶出し、その活性画分（０，４５Ｍ付近
）を回収した。さらに、この画分を限外ｐ過膜（ダイア
フローメンブレンＰＭ−１０；アミコン？［）を用いて
脱塩濃縮し、次いで凍結乾燥して、アンルー　Ｃｏ　Ａ
・オキ７ダーゼ（比活性５．５Ｕ／ｍ９、全活性８５０
　Ｕ、収率８．５％）を得た。[Production example of acyl-CoA/okintase] Oleic acid 1%, yeast extract 0.25%, peptone 1%,
KCl0.2%, K2HPO40.1, Mg
After sterilization, 10 ml of a medium containing 50.05% of 5O4.7H20 and 0.2% of an antifoaming agent (Disform BC-51Y) was placed in a test tube, and added with Arthrobafter, varnish, etc.
P. B-0720 strain was inoculated and cultured overnight with shaking at 30°C to obtain a seed culture. This was then transferred to an 81-volume jar fermenter containing medium 51 having the same composition as above, and cultured at 30° C. for 120 hours with aeration and stirring at 600 rpm and 51 min. After culturing, the culture was centrifuged to obtain the bacterial cells, which were mixed with 1 liter of 10mM phosphate buffer (pH 7.0), 2mM EDTA, 0.5m97m
After the treatment, 5 m9 of oxyribonuclease was added and stirred for another 10 minutes, followed by centrifugation at 110,000 rpm for 20 minutes. After adding 200 ml of acetone to the obtained supernatant and centrifuging it, 1.81 ml of acetone was further added to the supernatant. This was then centrifuged to obtain the precipitate, which was added to 2.00ml of 10mM phosphate buffer (p17.0).
The insoluble matter was removed by centrifugation, and further, 30-75% ammonium sulfate fractionation was carried out using saturated ammonium sulfate.
. Next, this was charged to a column of phosphoric acid carmine gel to be adsorbed, and after washing, 0.05 to 0.5 M
Elution was performed using a gradient method using a phosphate buffer (pH 7.0) with a concentration gradient, and the active fraction (around 0.45M) was collected. Furthermore, this fraction was desalted and concentrated using an ultrapolar membrane (Diaflow Membrane PM-10; Amicon? [), and then freeze-dried to obtain Unru CoA.
・Oki7dase (specific activity 5.5U/m9, total activity 850
U, yield 8.5%) was obtained.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第１図は／ニードモナス・フライ・Ｂ−０’／７１（Ｆ
ＥＲＭ−ＰＮｎ５７０１　）から得られた複合活性酵素
の３−ヒドロキシアンル−ＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活
性の仝ｐ　ｐ　Ｈを示す曲線、第２図は該複合活性酵素
の３−ヒドロキシアンルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活
性のｐＨ安定性を示す曲線、第３図は該複合活性酵素の
３−ヒドロキシアンルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性
の熱安定性を示す曲線、第４図は脂肪酸（オレイン酸）
の定量曲線、第５図は脂肪酸（オレイン酸）の定量曲線
を示す。 特許出願人　東洋醸造株式会社 代表者伊東富士馬 第１図 ７，５　　　　８８，５　　　　９　　　　　　９．５
第　　２　　図 ５６７８９ 第　　３　図 佑４図 ０　　　　　０．０１　　　０．０２　　　０．０３　
　　０．０４　　０．０５オ′イ′酸（ｐｍｏｌｅ７３
ｍ１．） 第５図 ０　　　　０．００５　　　０．０１．　　　　Ｏ，Ｏ
］、５　　０，０２　　０．０２５オレイン酸（１＋ｍ
ｏｌ−ｅ／３ｍ１）特許庁長官　島　１）春　樹　殿 ／１事件の表示 昭和、！ｉ′６年特許願第１１１ｇ３／３号Ω＼発明の
名称 脂質関連成分の測定法および測定用組成物３Ｘ補正をす
る者 事件との関係　特許出願人 住所　静岡県田方郡大仁町三福乙３．２の／自　　発 ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　　ＩＦ’０　３０５１７−）　
Ｊを削除する。 手続補正書 昭和５７年／θ月２ｚ日 昭和Ｓ乙年特許願第１／１−ｇ３／３号、２１発明の名
称 脂質関連成分の測定１法および？ｌａ＋定用組成用組成
物３１袖正者 事件との関係　特許出願人 住所　静岡県田方郡大仁町三福乙３λの／自　　発 加入する。「上記のリノール酸およびリルン酸を基質と
しだ場合１用いた接合活性酵素活性含有物中にエピメラ
ーゼが混入していないトヨパールＨＷ−４Ｑのゲルゾ過
後の精製された複合活性酵素の凍結乾燥物を用いた結果
＼　リノール酸の場合ＯＤ３４０ｎｍ＝’１．１０＼　
リルン酸の場合ＯＤ　　　　−：０．’１０３４０　ｎ
ｍ であった。」 −ノーFigure 1 is /Needomonas fly B-0'/71 (F
Figure 2 is a curve showing the pH of 3-hydroxyanlu-CoA dehydrogenase activity of the composite active enzyme obtained from ERM-PNn5701). A curve showing the stability. Figure 3 is a curve showing the thermostability of the 3-hydroxyanru-CoA dehydrogenase activity of the multi-active enzyme. Figure 4 is a curve showing the thermal stability of the 3-hydroxyanru-CoA dehydrogenase activity of the multi-active enzyme.
FIG. 5 shows a quantitative curve for fatty acid (oleic acid). Patent applicant Toyo Jozo Co., Ltd. Representative Ito Fujima Figure 1 7, 5 88, 5 9 9.5
2nd figure 56789 3rd figure 4 figure 0 0.01 0.02 0.03
0.04 0.05 oleic acid (pmole73
m1. ) Figure 5 0 0.005 0.01. O, O
], 5 0,02 0.025 oleic acid (1+m
ol-e/3m1) Director General of the Japan Patent Office Shima 1) Haruki Tono/1 Incident Display Showa,! i'6 Patent Application No. 111g3/3 Ω\Name of the Invention Method for Measuring Lipid-Related Components and Composition for MeasurementRelationship with the Person Who Makes 3X Correction Patent Applicant Address 3, Mifukuotsu, Ohito-cho, Tagata-gun, Shizuoka Prefecture .2/spontaneous marcescens IF'0 30517-)
Delete J. Procedural amendment 1981/θ Month 2z/Showa S Year 2013 Patent Application No. 1/1-g3/3, 21 Title of Invention 1 Method for Measuring Lipid Related Components and ? LA+Relationship with the Composition for Prescription Composition 31 Sode Masashi Case Patent Applicant Address: 3λ, Sanfukuotsu, Ohito-cho, Tagata-gun, Shizuoka Prefecture / Voluntary participation. In the case of using linoleic acid and linuric acid as substrates, 1, a lyophilized product of a purified complex-active enzyme after gel filtration of Toyopearl HW-4Q, in which no epimerase is mixed in the conjugative-active enzyme activity-containing material, is used. The result was \ For linoleic acid, OD340nm = '1.10\
In the case of lylinic acid, OD −: 0. '10340n
It was m. ” -No

Claims (1)

【特許請求の範囲】 （１）被検液中の成分を定量するに当り、下記の反応工
程■、■、■、■、■ ■　脂肪酸をアゾルーＣｏＡにする反応工程、■　アゾ
ルーＣｏＡをデヒドロアシル−ＣｏＡ　Ｋ　スる反応工
程、 ■　テヒドロアシルーＣｏＡをヒドロキンアンルー〇Ｏ
Ａにする反応工程、 ■　ヒドロキンアンルーＣｏＡ　ヲケトアノル−ＣｏＡ
にする反応工程 ■　ケトアンルーＣｏＡをアンルーＣｏＡにする反応工
程、 および検出できる変化を測定する工程を有することを特
徴とする測定法。 （２）　　反応工程において、 ■　反応工程が、脂肪酸とＣｏＡ　Ｓ　ＨとＡＴＰ−ｉ
たはＯＴＰおよびアンルーＣｏＡ・ゾンセターセ活性に
基く反応工程、 ■　反応工程が、アシル−ＣｏＡ　、酸素およびアンル
ーＣｏＡ・オキシダーセ活性に基く反応工程、■　反応
工程が、デヒドロアシル　ＣｏＡ、水およびエノイル−
ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性に基く反応工程、 ■　反応工程が、ヒドロキンアンルーＣｏＡ　ＸＮＡ　
Ｄおよび３−ヒドロキンアンルーＣｏＡ・デヒドロゲナ
ーゼ活性に基〈反応工程、 ■　反応工程が、ケトアンルーＣｏＡ、ＣｏＡ　Ｓ　Ｈ
および３−ケトアンルーＣｏＡ・チオラーゼ活性に基く
反応工程である特許請求の範囲第１項記載の測定法。 （３）■、■および■反応工程が、エノイル−ＣｏＡ・
ヒドラターゼ活性、３−ヒドロキンアシル−ＣｏＡ・デ
ヒドロゲナービ活性および３−ケトアンルーＣｏＡ・チ
オラーゼ活性の各酵素活性を同一蛋白上に有してなる複
合活性酵素の酵素活性に基く反応工程である特許請求の
範囲第１項または第２項記載の測定法。 （４）　　複合活性酵素が、シュードモナス・フライに
属する複合活性酵素生産菌から得られた酵素である特許
請求の範囲第３項記載の測定法。 （５）／ニードモナス・フライに属する複合活性酵素生
産菌が、ツユ−トモナス・フライ・Ｂ−０７７１菌であ
る特許請求の範囲第４項記載の測定法。 （６）　　検出できる変化を測定する工程が、反応工程
によって生成する還元型Ｎ　Ａ、　Ｄの量を定量する工
程である特許請求の範囲第１項、第２項または第３項記
載の測定法。 （７）生成する還元型Ｎ　Ａ、　Ｄの量の定量が、ＮＡ
Ｄに特異的吸収波長でなく、還元型ＮＡＤに特異的吸収
波長である吸収波長域の波長による定量である特許請求
の範囲第６項記載の測定法。 （８）吸収波長域の波長が、３２０　ｎｍ〜３６０ｎｍ
近辺である特許請求の範囲第７項記載の測定法。 （９）吸収波長域の波長が、３４０　ｎ　ｍ近辺である
特許請求の範囲第８項記載の測定法。 Ｇｏ）　　生成する還元型ＮＡＤＯ量の定量が、還元型
ＮＡＤの水素原子の受容能を有する水素原子伝達系色原
体の発色による定量である特許請求の範囲第７項記載の
測定法。 θの　還元型ＮＡＤの水素原子の受容能を有する水素原
子伝達系が、ジアホラーゼおよび水溶性テトラゾリウム
塩を含有する水素原子伝達系である特許請求の範囲第１
０項記載の測定法。 （功　被検液中の成分が脂肪酸である特許請求の範囲第
１項ないし第１１項のいずれかの項に記載の測定法。 ｄａ　　被検液中の脂肪酸が、脂肪酸エステルの含有物
と、その脂肪酸エステルに作用して脂肪酸を遊離せしめ
る酵素活性とにより遊離される脂肪酸である特許請求の
範囲第１２項記載の測定法。 σゆ　脂肪酸エステルの測定まだは酵素活性の測定のい
ずれかの１つの成分の測定である特許請求の範囲第１３
項記載の測定法。 Ｑｏ　　脂肪酸エステルがモノグリセライド、ジグリセ
ライド捷たけトリグリセライドであり、酵素活性がリパ
ーゼ活性である特許請求の範囲第１３項寸だは第１４゛
項記載の測定法。 ＯＯアルジミンを添加してなるリパーゼ活性測定法であ
る特許請求の範囲第１５項記載の測定法。 α力　脂肪酸エステルがレシチンであり、酵素活性がホ
スホリパーゼＡ２活性、ホスホリパーゼＡ２活性まだは
ホスホリパーゼＢ活性である特許請求の範囲第１３項寸
たは第１４．項記載の測定法。 （ト）脂肪酸エステルがりゾレンチンであり、酵素活性
がリゾホスホリパーゼ活性である特許請求の範囲第１３
項寸だけ第１４項記載の測定法。 叫　脂肪酸エステルがホスファチジン酸であり、酵素活
性がホスファチジン酸ボスファターゼ活性およびリパー
ゼ活性である特許請求の範囲第１３項寸たけ第１４．項
記載の測定法。 （イ）脂肪酸エステルがし／チンであり、酵素活性がホ
スホリパーゼＣ活性およびリパーゼ活性である特許請求
の範囲第１３項１だは第１４項記載の測定法。 ■）脂肪酸エステルがレシチンであり、酵素活性がホス
ホリパーゼＤ活性、ホスファチジン酸ホスファターセ廷
性およびリパーゼ活性である特許請求の範囲第１３項ま
たは第１４項記載の測定法。 （イ）脂肪酸エステルがアシルコリンであり、酵素活性
がコリンニステラ〜ゼ活性である特許請求の範囲第１３
項または第１４項記載の測定法。 （イ）脂肪酸エステルがステロールエステルであり、酵
素活性がコレステロールエステラーゼ活性である特許請
求の範囲第１３項寸たけ第１４項記載の測定法。 ■　被検液中の脂肪酸が、レシチンとコレステロールノ
含有物ト、酵素活性がレシチンコレステロ−ルア／ルト
ランスフエラーゼ活性およびコレステロールエステラー
ゼ活性まだはりゾホスホリパーゼ活性とにより遊離され
る脂肪酸である特許請求の範囲第１項ないし第１１項の
いずれかの項に記載の測定法。 （イ）　レシチン、コレステロール、酵素活性のいずれ
かの１、つの成分の測定である特許請求の範囲第２４項
記載の測定法。 （ホ）少なくとも、下記の組成 ・ＡＴＰまたはＧＴＰ ・　ＣｏＡＳＨ −ＮＡＤ。 ｅアシル−ＣｏＡ・シンセターゼ活性ｔ　Ｉ　物、・ア
シル−ＣｏＡ・オキンダーセ活性−ｉ有物、・エノイル
−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性含有物、・３−巳ドロキシ
アンル−ＣｏＡ・テヒトロゲナーゼ活性１有物、 ・３−ケトアフル−ＣｏＡ・チオラーゼ活性＠３物を含
有することを特徴とする測定用組成物。 （イ）測定用組成物において、マグネシウムイオンを放
出する水溶性マグネシウム塩を含有し７てなる測定用組
成物である特許請求の範囲第２６項記載の測定用組成物
。 （ハ）脂肪酸測定用組成物である特許請求の範囲第２６
項１たは第２７項記載の測定用組成物。 （ト）少なくとも、脂肪酸エステル、まだはその脂肪酸
エステルに作用して脂肪酸を遊離せしめる酵素活性を含
有してなる１つの成分の測定用組成物である特許請求の
範囲第２６項または第２７項記載の測定用組成物。 （イ）脂肪酸エステルがモノグリセライド、ジグリセラ
イドまだはトリグリセライドであるリノ（−ビ活性測定
用組成物である特許請求の範囲第２９項記載の測定用組
成物。 ■）　リパーゼ活性測定用組成物がアルブミンを含有し
てなる特許請求の範囲第３０項記載の測定用組成物。 （ハ）酵素活性がリパーゼ活性である脂肪酸エステル測
定用組成物である特許請求の範囲第２９項記載の測定用
組成物。 （イ）　トリグリセライド測定用組成物である特許請求
の範囲第３２項記載の測定用組成物、。 例　脂肪酸エステルがレシチンであるホスホリノシービ
Ａ、Ｉ活性、ホスホリパービＡ２活性捷たはホスホリバ
ービーＢ活性測定用組成物である特許請求の範囲第２９
項記載の測定用組成物。 （１）脂肪酸エステルかりゾレシチンであるリゾホスホ
リパーセ活性測定用組成物である特許請求の範囲第２９
項記載の測定用組成物。 ■　脂肪酸エステルがホスファチジン酸であるホスファ
チジン酸ホスファタービ活性測定用組成物である特許請
求の範囲第２９項記載の測定用組成物。 （ハ）脂肪酸エステルがレシチンおよび酵素活性がリパ
ーゼ活性であるホスホリパーゼＣ活性測定用組成物であ
る特許請求の範囲第２９項記載の測定用組成物。 （ト）脂肪酸エステルがレシチン、および酵素活性がホ
スファチジン酸ホスファターゼ活性およびリパーゼ活性
であるホスホリパーゼＤ活性測定用組成物である特許請
求の範囲第２９項記載の測定用組成物。 ■）脂肪酸エステルがアシルコリンであるコリンエステ
ラ−セ活性測定用糾成物である特許請求の範囲第２９項
記載の測定用組成物。 ｆｉｌｌ　　脂肪酸エステルがステロ−ｌレエステルで
あるコレステ（ＩＩ−ルエステラーセ活性測定用組成物
である特許請求の範囲第２９項記載の測定用組成物。 ＋１．１）　　酵素活性がホスホリパーセＡＩ活１’ｌ
Ｅ、ホスホリバー　セＡ　２　？＆　性、ホスホリハー
セ゛Ｂ活性、ホスホリパーゼＣ活性とリパーゼ活性、ま
たは、ホスホリパーゼＤ活性とホスファチジン酸ホスフ
ァターゼ活性とリパーゼ活性であるレシチン測定用組成
物である特許請求の範囲第２９項記載の測定用組成物。 磐酵素活性がコレステロールエステラーセ活性であるス
テロールエステル測定用組成物である特許請求の範囲第
２９項記載の測定用組成物。 （！３）　　脂肪ｅエステルがコレステロールとレシチ
ンおよび酵素活性が＝ルステロ−ルエステラーゼ活性捷
だはりゾホスポリパーセ活性であるレシチンコレステロ
ールテンルトランスフエラ−ゼ活性測定用組成物である
特許請求の範囲第２９項記載の測定用組成物。 に）脂肪酸エステルがレシチン、および酵素活性がレゾ
チンコレステロー／１アシルトランスフエラーセ活性お
よびコし・ステロールエステラーゼ活性捷だはりゾホス
ホリパーセ活性であるコＩ／ステロール測定用組成物で
ある特許請求の範囲第２９項記載の測定用組成物。 ｅ５）　　エノイル−ＣｏＡ・ヒトラターセ活性、８−
ヒドロキシアシルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性およ
び３−ケトアノルーＣｏＡ・チオラーゼ活性が、各酵素
活性を同一蛋白上に有してなる複合活性酵素の活性であ
る特許請求の範囲第２６項ないし第４４項のいずれかの
項に記載の測定用組成物。 ←６）複合活性酵素がシュードモナス・フライに属する
複合活性酵素生産菌から得られた酵素である特許請求の
範囲第４．５項記載の測定用組成物。 （４，７）　　ンユードモナス・フライに属する複合活
性酵素生産菌が、シュードモナス・フライ・Ｂ−０７７
１菌である特許請求の範囲第４６項記載の測定用組成物
。 （４８）還元型ＮＡＤの水素原子の受容能を有する水素
原子伝達系色原体を含有せしめてなる特許請求の範囲第
２６項ないし第４７項のいずれかの項に記載の測定用組
成物。 （４９）還元型ＮＡＤの水素原子の受容能を有する水素
原子伝達系色原体が、ジアホラーセおよび水溶性テトラ
ゾリウム塩の含有物である特許請求の範囲第４８項記載
の測定用組成物。[Scope of Claims] (1) In quantifying the components in the test liquid, the following reaction steps ■, ■, ■, ■, ■ ■ Reaction steps for converting fatty acids into azole-CoA, ■ converting azole-CoA into dehydroacyl -CoA K reaction step, ■ Tehydroacyl-CoA is un-hydroquine
Reaction process for A, ■ Hydroquineanru-CoA Woketoanol-CoA
A measurement method characterized by comprising a reaction step for converting keto-unru CoA into unru-CoA, and a step for measuring a detectable change. (2) In the reaction step, (1) the reaction step involves fatty acids, CoA SH and ATP-i
(1) A reaction step based on acyl-CoA, oxygen and Anru-CoA/oxidase activity;
Reaction process based on CoA/hydratase activity;
Based on D and 3-hydroquine unru CoA/dehydrogenase activity (reaction step,
and a reaction step based on 3-ketoan-CoA/thiolase activity. (3) ■, ■ and ■ reaction steps are enoyl-CoA.
A claim that is a reaction process based on the enzymatic activity of a multi-active enzyme having hydratase activity, 3-hydroquinacyl-CoA/dehydrogenabi activity, and 3-ketoanru-CoA/thiolase activity on the same protein. The measuring method according to item 1 or 2. (4) The assay method according to claim 3, wherein the multiple active enzyme is an enzyme obtained from a multiple active enzyme producing bacterium belonging to Pseudomonas fly. (5)/The assay method according to claim 4, wherein the multi-active enzyme producing bacterium belonging to Niedomonas fly is Thyutomonas fly B-0771. (6) The measuring method according to claim 1, 2, or 3, wherein the step of measuring the detectable change is a step of quantifying the amount of reduced NA, D produced by the reaction step. . (7) Quantification of the amount of reduced NA, D produced is
7. The measurement method according to claim 6, wherein the determination is performed not by an absorption wavelength specific to D but by a wavelength in an absorption wavelength range that is a specific absorption wavelength for reduced NAD. (8) The wavelength of the absorption wavelength range is 320 nm to 360 nm.
A measuring method according to claim 7 which is close. (9) The measuring method according to claim 8, wherein the wavelength of the absorption wavelength range is around 340 nm. Go) The measuring method according to claim 7, wherein the amount of reduced NADO produced is determined by color development of a hydrogen atom transport system chromogen having the ability to accept hydrogen atoms of reduced NAD. Claim 1, wherein the hydrogen atom transport system having the ability to accept hydrogen atoms of reduced NAD of θ is a hydrogen atom transport system containing diaphorase and a water-soluble tetrazolium salt.
Measurement method described in item 0. (A measurement method according to any one of claims 1 to 11, wherein the component in the test liquid is a fatty acid. da) The fatty acid in the test liquid contains a fatty acid ester, The measuring method according to claim 12, wherein the fatty acid is released by an enzyme activity that acts on the fatty acid ester to release the fatty acid. Claim 13, which is a measurement of two components.
Measurement method described in section. The measuring method according to claim 13 or 14, wherein the Qo fatty acid ester is monoglyceride, diglyceride or triglyceride, and the enzyme activity is lipase activity. The measuring method according to claim 15, which is a lipase activity measuring method by adding OO aldimine. α power The fatty acid ester is lecithin, and the enzyme activity is phospholipase A2 activity, phospholipase A2 activity, or phospholipase B activity. Measurement method described in section. (g) Claim 13, wherein the fatty acid ester is zolentin, and the enzyme activity is lysophospholipase activity.
Only the item dimensions are measured using the method described in item 14. Claim 13. Claim 14. The fatty acid ester is phosphatidic acid, and the enzyme activity is phosphatidic acid bosphatase activity and lipase activity. Measurement method described in section. (a) The measuring method according to claim 13 or 14, wherein the fatty acid ester is oxidation/tin, and the enzyme activity is phospholipase C activity and lipase activity. (2) The measuring method according to claim 13 or 14, wherein the fatty acid ester is lecithin, and the enzyme activity is phospholipase D activity, phosphatidic acid phosphatase activity, and lipase activity. (a) Claim 13 in which the fatty acid ester is acylcholine and the enzyme activity is cholinisterase activity.
The measuring method according to item 1 or item 14. (a) The measuring method according to claim 13, wherein the fatty acid ester is a sterol ester and the enzyme activity is cholesterol esterase activity. ■ The fatty acid in the test solution is a fatty acid liberated by lecithin and cholesterol-containing substances, the enzyme activity is lecithin cholesterol/retransferase activity, cholesterol esterase activity, and phospholipase activity. The measuring method according to any one of the ranges 1 to 11. (a) The measuring method according to claim 24, which measures any one of lecithin, cholesterol, and enzyme activity. (e) At least the following composition: ATP or GTP. CoASH-NAD. eAcyl-CoA・Synthetase activity t I substance,・Acyl-CoA・Okindase activity-i substance,・Enoyl-CoA・Hydratase activity-containing substance,・3-Droxyanl-CoA・Techntrogenase activity 1 substance,・3- A measuring composition characterized by containing ketoaflu-CoA/thiolase activity@3. 27. The measuring composition according to claim 26, which is a measuring composition comprising (a) a water-soluble magnesium salt that releases magnesium ions. (c) Claim 26, which is a composition for fatty acid measurement.
The composition for measurement according to item 1 or item 27. (g) Claim 26 or 27, which is a composition for measuring at least a fatty acid ester, and at least one component containing an enzyme activity that acts on the fatty acid ester to liberate the fatty acid. Composition for measurement. (a) The composition for measuring lipase activity according to claim 29, which is a composition for measuring lipase activity, in which the fatty acid ester is monoglyceride, diglyceride, or triglyceride. The composition for measurement according to claim 30, comprising: (c) The measurement composition according to claim 29, which is a fatty acid ester measurement composition whose enzyme activity is lipase activity. (a) The composition for measurement according to claim 32, which is a composition for measurement of triglyceride. Example: Claim 29, which is a composition for measuring phosphorynocybi A, I activity, phosphoryperby A2 activity, or phosphoryperby B activity, in which the fatty acid ester is lecithin.
Composition for measurement as described in section. (1) Claim 29, which is a composition for measuring lysophospholipase activity which is fatty acid ester and solecithin.
Composition for measurement as described in section. (2) The measuring composition according to claim 29, which is a composition for measuring phosphatidic acid phosphaturbation activity, in which the fatty acid ester is phosphatidic acid. (c) The composition for measuring phospholipase C activity according to claim 29, wherein the fatty acid ester is lecithin and the enzyme activity is lipase activity. (g) The composition for measuring phospholipase D activity according to claim 29, wherein the fatty acid ester is lecithin, and the enzyme activity is phosphatidic acid phosphatase activity and lipase activity. 2) The measuring composition according to claim 29, which is a condensed product for measuring cholinesterase activity, in which the fatty acid ester is acylcholine. fill Cholesterol whose fatty acid ester is stero-l ester (composition for measurement according to claim 29, which is a composition for measuring II-l esterase activity. +1.1) Enzyme activity is phospholipase AI activity 1'l
E. Phosphoriber seA 2? 29. The measuring composition according to claim 29, which is a composition for measuring lecithin, which is phosphoryase B activity, phospholipase C activity, and lipase activity, or phospholipase D activity, phosphatidic acid phosphatase activity, and lipase activity. The composition for measuring sterol esters according to claim 29, wherein the enzymatic activity is cholesterol esterase activity. (!3) A composition for measuring lecithin-cholesterol tenletransferase activity, wherein the fatty e-ester is cholesterol and lecithin, and the enzyme activity is Lusterolesterase activity or Zophos polypase activity. Composition for measurement. 2) A composition for measuring co-I/sterol, wherein the fatty acid ester is lecithin, and the enzyme activity is resotin cholesterol/1 acyltransferase activity and sterol esterase activity or zophospholipase activity. The composition for measurement according to item 29. e5) Enoyl-CoA human latase activity, 8-
Any one of claims 26 to 44, wherein the hydroxyacyl-CoA dehydrogenase activity and the 3-ketoanol-CoA thiolase activity are the activities of a multi-active enzyme having each enzyme activity on the same protein. Composition for measurement as described in section. ←6) The measuring composition according to claim 4.5, wherein the multi-active enzyme is an enzyme obtained from a multi-active enzyme-producing bacterium belonging to Pseudomonas fly. (4,7) A multi-active enzyme producing bacterium belonging to Pseudomonas fly is Pseudomonas fly B-077.
47. The measuring composition according to claim 46, which contains 1 bacterium. (48) The measurement composition according to any one of claims 26 to 47, which contains a hydrogen atom transport system chromogen having the ability to accept hydrogen atoms of reduced NAD. (49) The measurement composition according to claim 48, wherein the hydrogen atom transport system chromogen capable of accepting hydrogen atoms of reduced NAD contains diaphorase and a water-soluble tetrazolium salt.
JP14831381A 1981-06-25 1981-09-18 Determination of lipid and related components and composition therefor Granted JPS5851899A (en)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP14831381A JPS5851899A (en) 1981-09-18 1981-09-18 Determination of lipid and related components and composition therefor
IT22048/82A IT1157281B (en) 1981-06-25 1982-06-24 TEST METHOD FOR A LIPID COMPONENT, TEST COMPOSITION AND PROCEDURE FOR THE PRODUCTION OF THE ENZYME USED FOR THE PURPOSE
FR8211073A FR2508487B1 (en) 1981-06-25 1982-06-24 ASSAY PROCESS FOR LIPID-LIKE COMPONENT, ASSAY COMPOSITION, AND PROCESS FOR PRODUCING ENZYME USED THEREFOR
CA000405920A CA1215903A (en) 1981-06-25 1982-06-24 Assay method for component relating to lipids, composition for assay and process for production of enzyme used therefor
US06/392,010 US4491631A (en) 1981-06-25 1982-06-25 Assay method for lipid component, assay composition, and process for production of enzyme used therefor
DE3249973A DE3249973C2 (en) 1981-06-25 1982-06-25
GB08218552A GB2105843B (en) 1981-06-25 1982-06-25 Fatty acid assay
DE19823223874 DE3223874A1 (en) 1981-06-25 1982-06-25 ANALYSIS PROCESS FOR LIPID COMPONENTS, MEANS FOR CARRYING OUT THE ANALYSIS AND METHOD FOR PRODUCING AN ENZYME USED FOR THIS
CH3917/82A CH664631A5 (en) 1981-06-25 1982-06-25 PROCEDURE FOR TESTING A LIPID COMPONENT, COMPOSITION FOR THE TEST AND PROCEDURE FOR THE PRODUCTION OF SUCH COMPOSITION.

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP14831381A JPS5851899A (en) 1981-09-18 1981-09-18 Determination of lipid and related components and composition therefor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS5851899A true JPS5851899A (en) 1983-03-26
JPS6339238B2 JPS6339238B2 (en) 1988-08-04

Family

ID=15449990

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP14831381A Granted JPS5851899A (en) 1981-06-25 1981-09-18 Determination of lipid and related components and composition therefor

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JPS5851899A (en)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS55108297A (en) * 1979-02-13 1980-08-20 Toyobo Co Ltd Determining method of free fatty acid

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS55108297A (en) * 1979-02-13 1980-08-20 Toyobo Co Ltd Determining method of free fatty acid

Also Published As

Publication number Publication date
JPS6339238B2 (en) 1988-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4491631A (en) Assay method for lipid component, assay composition, and process for production of enzyme used therefor
EP0437373B1 (en) High sensitive assay method of L-carnitine and composition for an assay
JPH0376920B2 (en)
KR960015263B1 (en) Analytical method of monoglyceride with novel monoglyceride lipase
US5173417A (en) Thermostable lipoprotein lipase, process for producing the same, and triglyceride determining reagent using the same
JPH0284178A (en) N-acetyl hexosamine dehydrogenase, its production and quantification of n-acethyl glucosamine or n-acethyl galactosamine using same and kit therefor
JPS5851899A (en) Determination of lipid and related components and composition therefor
JP2647684B2 (en) Triglyceride analysis reagent and analysis method
JP3059735B2 (en) L-carnitine dehydrogenase and method for producing the same
GB1590736A (en) Chemical assay method
US5089393A (en) Assay method for phosphatidyl ethanolamine
JP5470906B2 (en) Catalase
JP2827002B2 (en) Method for measuring acylcarnitine
JPH04126099A (en) Highly sensitive determination method of myoinositol and composition for determination
JPH0422560B2 (en)
JP2017158441A (en) Catalase
JP2929100B2 (en) Highly sensitive method for measuring acylcarnitine
JPS59130195A (en) Novel method for determination of atp
JPH04148681A (en) Acylcarnitine esterase, its production and measurement of acylcarnitine
JPS5915637B2 (en) Analytical kit and method using pyruvate oxidase
JP3251977B2 (en) Phosphatidylinositol phospholipase C-AK, production method thereof and use thereof
JP3649765B2 (en) Novel glycerol kinase and process for producing the same
JP2886846B2 (en) 1,5-anhydroglucitol dehydrogenase and method for producing the same
JPS63148998A (en) Determination of n-acetylneuraminic acid and kit therefor
JPH0127716B2 (en)