JP2827002B2 - Method for measuring acylcarnitine - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、臨床生化学検査、
食品検査などにおけるアシル−Ｌ−カルニチンの測定に
有用なアシルカルニチンエステラーゼを用いたアシル−
Ｌ−カルニチンの測定法に関する。The present invention relates to a clinical biochemical test,
Acyl-carnitine esterase useful for measurement of acyl-L-carnitine in food inspection and the like.
The present invention relates to a method for measuring L-carnitine.

【０００２】[0002]

【従来の技術】Ｌ−カルニチンは、ビタミンB_Tとも呼ば
れており、生体内において、脂肪酸のミトコンドリア膜
内への輸送に必須の物質である。一方、生体内にはＬ−
カルニチンのアシル体であるアシル−Ｌ−カルニチンも
存在しており、血液中のアシル−Ｌ−カルニチン量を測
定することは生体内筋肉のエネルギー障害の判定のため
のミトコンドリアの機能障害のモニタリングなどに極め
て重要であり、また尿中にもアシル−Ｌ−カルニチンは
排出されている。2. Description of the Related Art L-carnitine, also called vitamin B _T , is a substance essential for the transport of fatty acids into the mitochondrial membrane in vivo. On the other hand, L-
Acyl-L-carnitine, which is an acyl form of carnitine, is also present, and measuring the amount of acyl-L-carnitine in the blood is useful for monitoring dysfunction of mitochondria for determining energy injuries of muscles in vivo. It is extremely important, and acyl-L-carnitine is excreted in urine.

【０００３】従来、アシル−Ｌ−カルニチンは、被検液
中のアシル−Ｌ−カルニチンをアルカリを用いて加水分
解し、生成するＬ−カルニチンを定量することにより測
定されていた。このときの加水分解の条件としてはPear
son らの方法〔Methods in Enzymology, Vol.14, 621(1
969)〕、Bieberらの方法〔Methods in Enzymology, Vo
l. 72, 276 (1981）〕、Paceらの方法〔Clin. Chem., 2
4, 32(1978)〕などがある。[0003] Conventionally, acyl-L-carnitine has been measured by hydrolyzing acyl-L-carnitine in a test solution using an alkali and quantifying the L-carnitine produced. The hydrolysis conditions at this time are Pear
sons et al. [Methods in Enzymology, Vol. 14 , 621 (1
969)) and the method of Bieber et al. (Methods in Enzymology, Vo
l. 72 , 276 (1981)], and the method of Pace et al. [Clin. Chem., 2
4 , 32 (1978)].

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の加水分解条件は、すべて高濃度のアルカリ溶液（水酸
化カリウム溶液）を加え30分間以上加水分解した後に酸
で中和して被検液としているために、危険である上に時
間がかかりサンプルが希釈されてしまうという大きな欠
点を有していた。However, in all of these hydrolysis conditions, a test solution is prepared by adding a high-concentration alkaline solution (potassium hydroxide solution), hydrolyzing for 30 minutes or more, and then neutralizing with an acid. Therefore, the method has a serious disadvantage that it is dangerous and takes a long time to dilute the sample.

【０００５】かかる欠点を克服するためには、酵素法、
すなわちアシルカルニチンエステラーゼの利用が考えら
れる。アシルカルニチンエステラーゼとしてはラットの
肝臓由来のものが知られている〔S. Mahadevan & F. Sa
uer, J. Biol. Chem., 244,4448-4453(1969)〕。しか
し、当該アシルカルニチンエステラーゼは、ヒト血清中
に多量に存在するアセチル−Ｌ−カルニチンおよびプロ
ピオニル−Ｌ−カルニチンに対して全く活性を示さない
ばかりか、例えばデカノイル−Ｌ−カルニチンに対して
3.2×10^-3Ｍ、パルミトイル−Ｌ−カルニチンに対して
５×10^-3Ｍと長鎖アシル−Ｌ−カルニチンに対しても高
いKm値を示しているために完全に加水分解するには多量
の酵素が必要であった。さらにこのように多量の酵素が
必要であるにもかかわらずラットの肝臓50ｇ（約１匹
分）からは、たかだか3.7Uの酵素が採取できたにすぎな
いものであった。In order to overcome such disadvantages, an enzymatic method,
That is, the use of acylcarnitine esterase can be considered. Known acylcarnitine esterases are derived from rat liver [S. Mahadevan & F. Sa
uer, J. Biol. Chem., 244, 4448-4453 (1969)]. However, the acylcarnitine esterase has no activity against acetyl-L-carnitine and propionyl-L-carnitine which are present in human serum in large amounts, and also has no activity against decanoyl-L-carnitine.
3.2 × 10 ⁻³ M, 5 × 10 ⁻³ M for palmitoyl-L-carnitine, and a high Km value for long-chain acyl-L-carnitine. Enzyme was required. Furthermore, despite the need for such a large amount of enzyme, only 3.7 U of enzyme could be collected from 50 g (about one rat) of rat liver.

【０００６】従って、低級アシル−Ｌ−カルニチンに対
して活性を示し、基質に対するKm値の低い、充分な安定
性を有するアシルカルニチンエステラーゼおよび生体中
のアシル−Ｌ−カルニチンの感度の高い定量法の開発が
望まれていた。Accordingly, an acylcarnitine esterase having activity against lower acyl-L-carnitine, having a low Km value for a substrate and having sufficient stability, and a highly sensitive method for quantitatively determining acyl-L-carnitine in a living body are disclosed. Development was desired.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
上記要件を満たすアシルカルニチンエステラーゼを、種
々の微生物培養物中からスクリーニングすることに着目
して種々研究を続けた結果、アルカリゲネス属に属する
微生物が、低級アシル−Ｌ−カルニチン並びに長鎖アシ
ル−Ｌ−カルニチンであるパルミトイル−Ｌ−カルニチ
ンに対して活性を示し、活性の高いアシルカルニチンエ
ステラーゼを生産すること、さらにこれを用いれば検体
中のアシル−Ｌ−カルニチンの高感度定量が可能となる
ことを見出し、本発明を完成した。Means for Solving the Problems Accordingly, the present inventors have:
As a result of continuing various studies focused on screening acylcarnitine esterases satisfying the above requirements from various microorganism cultures, microorganisms belonging to the genus Alcaligenes were found to have lower acyl-L-carnitine and long-chain acyl-L- It has been found that it shows activity to produce carnitine, palmitoyl-L-carnitine, and produces highly active acylcarnitine esterase, and furthermore, it can be used for highly sensitive quantification of acyl-L-carnitine in a sample. Thus, the present invention has been completed.

【０００８】すなわち、本発明は少なくともアセチル−
Ｌ−カルニチンおよびプロピオニル−Ｌ−カルニチンか
らなる群より選ばれた低級アシル−Ｌ−カルニチン並び
に長鎖アシル−Ｌ−カルニチンであるパルミトイル−Ｌ
−カルニチンに基質特異性を有し、当該低級乃至長鎖ア
シル−Ｌ−カルニチンの１モルと水分子の１モルから１
モルの脂肪酸と１モルのＬ−カルニチンを生成する反応
を触媒するアシルカルニチンエステラーゼを提供すると
ともに、このアシルカルニチンエステラーゼを用いて被
検液中のアシル−Ｌ−カルニチンを加水分解することに
より被検液中のアシル−Ｌ−カルニチンを測定する方法
を提供するものである。That is, the present invention provides at least acetyl-
Palmitoyl-L, a lower acyl-L-carnitine and a long-chain acyl-L-carnitine selected from the group consisting of L-carnitine and propionyl-L-carnitine
Has a substrate specificity to carnitine, from 1 mole of the lower to long chain acyl-L-carnitine and 1 mole of water molecule to 1 mole
The present invention provides an acylcarnitine esterase which catalyzes a reaction for producing one mole of L-carnitine with one mole of a fatty acid, and further comprises hydrolyzing an acyl-L-carnitine in a test solution using the acylcarnitine esterase to test a sample. It is intended to provide a method for measuring acyl-L-carnitine in a liquid.

【０００９】[0009]

【発明の実施の形態】本発明に用いるアシルカルニチン
エステラーゼ生産菌としては、アルカリゲネス属に属
し、アシルカルニチンエステラーゼ生産能を有するもの
であれば特に限定されないが、例えば本発明者らが分離
したNo.981菌株が挙げられ、この菌株は本発明に最も有
効に使用される菌株の一例であって、本菌株の菌学的性
質を示すと次の通りである。尚、本菌株の同定に当たっ
ては、同定実験は医学細菌同定の手引き（第２版）、Mi
crobiological Methods （３巻）に準じて行い、実験結
果をBergey's Manual of Determinative Bacteriology
（８版）、Bergey's Manual of SystematicBacteriolog
y Vol. 1(1984) 、同誌，Vol. 2(1986)などと対比して
同定を行った。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The acylcarnitine esterase-producing bacterium used in the present invention is not particularly limited as long as it belongs to the genus Alcaligenes and has an acylcarnitine esterase-producing ability. 981 strain, and this strain is one of the strains most effectively used in the present invention. The bacterial properties of the strain are as follows. In the identification of this strain, the identification experiment was conducted using the guide for the identification of medical bacteria (second edition).
Performed in accordance with crobiological Methods (volume 3) and provided experimental results in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology
(8th edition), Bergey's Manual of SystematicBacteriolog
y Vol. 1 (1984), the same magazine, Vol. 2 (1986), etc.

【００１０】（ａ）形態的特徴 普通寒天培地上、18〜24時間、28〜30℃で培養し、観察
した所見は次の通りである。端の丸いまっすぐまたはや
や曲がった桿状細菌で、単独、二連たまに短連鎖にな
る。芽胞は形成せず。大きさは0.4〜0.6×1.2〜2.5μｍ
で周毛で運動する。多形性なし。(A) Morphological characteristics The cells were cultured on a normal agar medium for 18 to 24 hours at 28 to 30 ° C., and the observations were as follows. A straight or slightly bent rod-shaped bacterium with a rounded edge, which forms a short chain, singly or in duplicate. No spores formed. The size is 0.4-0.6 × 1.2-2.5μm
Exercise with perihair. No polymorphism.

【００１１】（ｂ）各培地における生育状態 各種培地上で、18〜24時間、28〜30℃で培養し、観察し
た所見は次の通りである。(B) Growth state in each medium The culture was cultured on various mediums for 18 to 24 hours at 28 to 30 ° C., and the observations were as follows.

【００１２】（１）普通寒天斜面培地 生育良好で線状(filiform)に生育する。湿潤で光沢を有
する。黄土色を呈するが、可溶性色素は産生しない。(1) Ordinary agar slant medium It grows well and grows linearly (filiform). Wet and glossy. It has an ocher color but does not produce soluble pigments.

【００１３】（２）普通寒天平面培地 円型、丘状(convex)、全縁の集落を形成する。表面は滑
らかで湿潤。黄土色ないし淡黄土色を呈する。可溶性色
素は産生しない。(2) Ordinary agar plate medium A round, hill-shaped (convex), whole-edge colony is formed. The surface is smooth and moist. Ocher to pale ocher. No soluble pigment is produced.

【００１４】（３）液体培地（ペプトン水） 生育良好で一様に混濁する。長時間（40時間以上）培養
では菌膜を形成する。(3) Liquid medium (peptone water) It grows well and is uniformly turbid. Long-term (more than 40 hours) culture forms a pellicle.

【００１５】（４）BCPミルク培地 ４〜５日後、アルカリになる。(4) BCP milk medium After 4-5 days, it becomes alkaline.

【００１６】（ｃ）生理的性質〔＋；陽性、（＋）；弱
陽性；−；陰性〕(C) Physiological properties [+; positive; (+); weakly positive;-; negative]

【００１７】[0017]

【表１】 [Table 1]

【００１８】[0018]

【表２】 ゼラチンの分解 − 澱粉の分解 − カゼインの分解 − エスクリンの分解 − セルロースの分解 − チロシンの分解 − カタラーゼ産生 ＋ オキシダーゼ産生 ＋ LV反応 − ウレアーゼ産生(SSR) − ウレアーゼ産生(Chris) − インドール産生 − 硫化水素産生（酢酸鉛紙で検出） − アセトイン産生(K₂HPO₄) − アセトイン産生(NaCl) − MRテスト −[Table 2] Gelatin degradation-Starch degradation-Casein degradation-Esculin degradation-Cellulose degradation-Tyrosine degradation-Catalase production + Oxidase production + LV reaction-Urease production (SSR)-Urease production (Chris)-Indole production - sulfide production (detected by lead acetate paper) - acetoin production (K ₂ HPO ₄₎ - acetoin production (NaCl) - MR test -

【００１９】[0019]

【表３】硝酸塩還元テスト ガス検出 ＋ NO₂ ^-の検出 − NO₃ ^-の検出 − シモンズ培地での利用性 クエン酸塩 ＋ リンゴ酸塩 ＋ マレイン酸塩 − マロン酸塩 （＋） プロピオン酸塩 − グルコン酸塩 − コハク酸塩 ＋TABLE 3 nitrate reduction test gas detection + NO ₂ ^- Detection of - NO ₃ ^- detection - availability citrate + malate + maleate in Simmons media - malonate (+) propionate - Gluconate-succinate +

【００２０】[0020]

【表４】クリステンセン培地での利用性 クエン酸塩 ＋ リンゴ酸塩 ＋ マレイン酸塩 ＋ マロン酸塩 ＋ プロピオン酸塩 − グルコン酸塩 ＋ コハク酸塩 ＋ グルコースよりガスの産生 −Table 4 Availability in Christensen medium Citrate + Malate + Maleate + Malonate + Propionate-Gluconate + Succinate + Production of gas from glucose-

【００２１】[0021]

【表５】各種糖類より酸の産生 アドニトール − L(＋）アラビノース （＋） セロビオース − ヅルシトール − メソ・エリスリトール − フラクトース − ガラクトース ＋ グルコース ＋ グリセリン （＋） イノシトール − イヌリン − ラクトース − マルトース − マンニトール − マンノース ＋ メレジトース − メリビオース − ラフィノース − L(＋）ラムノース − D−リボース − サリシン − L−ソルボース − ソルビトール − 澱粉 − サッカロース − トレハロース ＋ キシロース − ポリ−β−ヒドロキシブチレートの蓄積 −Table 5: Production of acid from various saccharides Adonitol-L (+) arabinose (+) cellobiose-percitol-meso-erythritol-fructose-galactose + glucose + glycerin (+) inositol-inulin-lactose-maltose-mannitol-mannose + Melezitose-melibiose-raffinose-L (+) rhamnose-D-ribose-salicin-L-sorbose-sorbitol-starch-saccharose-trehalose + xylose-accumulation of poly-β-hydroxybutyrate-

【００２２】[0022]

【表６】（ｄ）炭素源の利用性 炭素源５ｇ、NaCl５ｇ、MgSO₄・7H₂O 0.2ｇ、NH₄H₂PO₄
1.0ｇ、蒸留水１ｌを含む液体培地（pH7.0)での各炭素
源の利用性を試験した結果は次の通りである。 グルコース ＋ L(＋）アラビノース − フラクトース ＋ マンニトール − マンノース ＋ グルコネート ＋ アセテート ＋ アジペート − ピメレート ＋ スベレート ＋ タートレート ＋TABLE 6 (d) The use of carbon sources 5g carbon _{source, NaCl5g, MgSO 4 · 7H 2} O 0.2g, NH 4 H 2 PO 4
The results of testing the availability of each carbon source in a liquid medium (pH 7.0) containing 1.0 g and 1 liter of distilled water are as follows. Glucose + L (+) arabinose-fructose + mannitol-mannose + gluconate + acetate + adipate-pimerate + suberate + tartrate +

【００２３】以上の通り、本菌株の主性状は、グラム陰
性の桿状細菌で、周毛で運動、カタラーゼ、オキシダー
ゼを産生し、ペプトンを含む培地(Hugh-Leifson)ではグ
ルコースより酸を産生しないが、グルコースを酸化的に
分解し、酸を産生する。芽胞は形成せず、多形性なし。
好気性である。As described above, this strain is mainly a gram-negative rod-shaped bacterium that produces motility, catalase, and oxidase in its hair, and does not produce acid from glucose in a medium containing peptone (Hugh-Leifson). Oxidatively degrades glucose to produce acids. No spores formed, no polymorphism.
Aerobic.

【００２４】グラム陰性桿菌で好気性、周毛で運動する
菌属は、アルカリゲネス属、クロモバクテリウム属およ
びフラボバクテリウム属の３属である。クロモバクテリ
ウム属は紫色、フラボバクテリウム属は黄色の色素を産
生するが、本菌株は色素を産生しないことから判断して
アルカリゲネス属に属する菌株であることは明らかであ
る。The genus of Gram-negative bacilli, which is aerobic and moves around the hair, are three genera of the genera Alcaligenes, Chromobacterium and Flavobacterium. Although the genus Chromobacterium produces a purple pigment and the genus Flavobacterium produces a yellow pigment, it is clear that this strain belongs to the genus Alcaligenes, judging from the fact that it does not produce the pigment.

【００２５】そこで、本菌株がアルカリゲネス属のどの
種に属するか否かを同定するため、Bergey's Manual of
Systematic Bacteriology, Vol. 1(1984)に記載されて
いる３菌種、即ちAlcaligenes faecalis（以下、「Ｆ」
と略記することがある）、Alcaligenes denitrificans
subsp. denitrificans（以下、「Ｄ」と略記することが
ある）およびAlcaligenes denitrificans subsp.xyloso
xidans( 以下「Ｘ」と略記することがある）と対比した
結果は、次の通りである。尚、Ｆ、ＤおよびＸで示され
る「＋」は90％以上の陽性率、「−」は90％以上が陰性
率、「ｄ」は「＋」でも「−」でもどちらでもないこと
を示す。Therefore, in order to identify which species of the genus Alcaligenes belongs to this strain, Bergey's Manual of
Three strains described in Systematic Bacteriology, Vol. 1 (1984), namely, Alcaligenes faecalis (hereinafter, "F")
May be abbreviated), Alcaligenes denitrificans
subsp. denitrificans (hereinafter sometimes abbreviated as "D") and Alcaligenes denitrificans subsp. xyloso
Results compared with xidans (hereinafter sometimes abbreviated as “X”) are as follows. In addition, "+" indicated by F, D and X indicates a positive rate of 90% or more, "-" indicates a negative rate of 90% or more, and "d" indicates neither "+" nor "-". .

【００２６】[0026]

【表７】 [Table 7]

【００２７】以上対比した結果によれば、本菌株No.981
の諸性状はAlcarigenes subsp. xylosoxidans と一致し
た点が多いが、OF培地での酸産生能およびキシロースよ
り酸を産生しない点での性状が異なる。よって、本菌株
を公知のものと区別するため、アルカリゲネス・エスピ
ー(Alcaligenes sp.) No.981と命名し、工業技術院微生
物工業技術研究所に受託番号微工研条寄第2570号(FERM
BP-2570)として寄託した。According to the results of the comparison, the strain No. 981
Xylosoxidans has many characteristics that are similar to those of Alcarigenes subsp. Xylosoxidans, but differs in the acid production ability in OF medium and in that it does not produce acid from xylose. Therefore, in order to distinguish this strain from known strains, the strain was named Alcaligenes sp. (Alcaligenes sp.) No. 981, and was deposited with the Institute of Microbial Industry and Technology of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the accession number No. 2570 (FERM).
BP-2570).

【００２８】アシルカルニチンエステラーゼを製造する
には、先ずアルカリゲネス属に属するアシルカルニチン
エステラーゼ生産菌を適当な培地にて培養する。In order to produce acylcarnitine esterase, first, an acylcarnitine esterase-producing bacterium belonging to the genus Alcaligenes is cultured in an appropriate medium.

【００２９】上記のアシルカルニチンエステラーゼ生産
菌としては、前述のアルカリゲネス・エスピーNo.981が
挙げられるが、細菌の一般的性状として菌学上の性質は
変異し得るものであるから、自然的にあるいは通常行わ
れる紫外線照射、放射線照射または変異誘導剤、例えば
Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エ
チルメタンスルホネートなどを用いる人工的変異手段に
より変異し得る人工変異株は勿論、自然変異株も含め、
アルカリゲネス属に属し、アシルカルニチンエステラー
ゼを生産する能力を有する菌株は、すべて本発明に使用
することができる。Examples of the above-mentioned acylcarnitine esterase-producing bacteria include the aforementioned Alcaligenes sp. No. 981, but as a general property of the bacterium, the mycological properties can be mutated. Natural mutants as well as artificial mutants which can be mutated by commonly used ultraviolet irradiation, irradiation or mutagenic agents such as N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine, ethyl methanesulfonate, etc. Including
All strains belonging to the genus Alcaligenes and capable of producing acylcarnitine esterase can be used in the present invention.

【００３０】上記の培養は、細菌の培養に一般に用いら
れる条件によって行うことができるが、本菌株の培養に
あたっては、アシルカルニチンエステラーゼがアシル−
Ｌ−カルニチンによって誘導的に生成される誘導酵素で
あることから、アシル−Ｌ−カルニチンを含む培地で培
養することが好ましい。当該アシル−Ｌ−カルニチンと
しては、例えば安価なオクタノイル−Ｌ−カルニチン
（培地に対して0.1〜１％）を用いるのが好ましい。The above culture can be performed under the conditions generally used for culturing bacteria. In culturing this strain, acylcarnitine esterase is converted to acyl-
Since it is an inducible enzyme produced by L-carnitine, it is preferable to culture in a medium containing acyl-L-carnitine. As the acyl-L-carnitine, for example, it is preferable to use inexpensive octanoyl-L-carnitine (0.1 to 1% based on the medium).

【００３１】培地としては、アシル−Ｌ−カルニチンを
添加する以外に微生物が同化し得る炭素源、消化し得る
窒素源、さらには必要に応じ、無機塩などを含有させた
栄養培地が使用される。As a medium, a nutrient medium containing a carbon source that can be assimilated by microorganisms, a nitrogen source that can be digested, and, if necessary, an inorganic salt, etc., in addition to acyl-L-carnitine, is used. .

【００３２】同化し得る炭素源としては、グルコース、
フラクトース、サッカロース、シュクロース、糖蜜など
が単独または組み合わせて用いられる。消化し得る窒素
源としては、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、
コーン・スチープ・リカーなどが単独または組み合わせ
て用いられる。その他必要に応じてリン酸塩、マグネシ
ウム塩、カルシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、そ
の他、鉄、マンガンなどの種々の重金属塩などが使用さ
れる。上記以外に公知の同化し得る炭素源、消化し得る
窒素源が使用できることはいうまでもない。The carbon sources that can be assimilated include glucose,
Fructose, saccharose, sucrose, molasses and the like are used alone or in combination. As a digestible nitrogen source, for example, peptone, meat extract, yeast extract,
Corn, steep, liquor and the like are used alone or in combination. In addition, phosphates, magnesium salts, calcium salts, potassium salts, sodium salts, and various other heavy metal salts such as iron and manganese are used as needed. It goes without saying that other known assimilable carbon sources and digestible nitrogen sources can be used.

【００３３】培養は、通常振とうまたは通気攪拌培養な
どの好気的条件下で行うのがよく、工業的には深部通気
攪拌培養が好ましい。培養温度はアシルカルニチンエス
テラーゼ生産菌が発育し、本酵素を生産する範囲内で適
宜変更し得るが、通常は15〜37℃、特に28℃付近が好ま
しい。培養時間は培養条件によって異なるが、本酵素が
最高力価に達する時期を見計らって適当な時期に培養を
停止すればよいが、通常は１〜３日間程度である。The cultivation is usually carried out under aerobic conditions such as shaking or aeration and agitation culture, and industrially, a deep aeration and agitation culture is preferred. The culture temperature can be appropriately changed within a range in which the acylcarnitine esterase-producing bacterium grows and produces the present enzyme. The culturing time varies depending on the culturing conditions. The culturing may be stopped at an appropriate time in consideration of the timing at which the present enzyme reaches the highest titer, but it is usually about 1 to 3 days.

【００３４】これらの培地組成、培地の液性、培養温
度、攪拌速度、通気量などの培養条件は使用する菌株の
種類や外部の条件などに応じて好ましい結果が得られる
ように適宜調節、選択されることは言うまでもない。液
体培養において発泡があるときは、シリコン油、植物油
などの消泡剤が適宜使用される。The culture conditions such as the composition of the medium, the liquid properties of the medium, the culture temperature, the agitation speed, and the aeration rate are appropriately adjusted and selected so as to obtain preferable results according to the type of the strain used and the external conditions. Needless to say. When foaming occurs in the liquid culture, an antifoaming agent such as silicone oil or vegetable oil is appropriately used.

【００３５】このようにして得られたアシルカルニチン
エステラーゼは、主として菌体内に含有されるので、得
られた培養物から濾過または遠心分離等の手段により集
菌し、この菌体を超音波処理、フレンチプレス処理、ガ
ラスビーズ処理、凍結破砕処理等の機械的破壊手段やリ
ゾチーム等の酵素的破壊手段等の種々の菌体処理手段を
適宜組み合わせて、粗製のアシルカルニチンエステラー
ゼ含有液が得られる。The acylcarnitine esterase thus obtained is mainly contained in the cells, and the cells are collected from the obtained culture by filtration or centrifugation, and the cells are subjected to ultrasonic treatment, A crude acylcarnitine esterase-containing liquid can be obtained by appropriately combining various cell treatment means such as mechanical destruction means such as French press treatment, glass bead treatment and freeze-crushing treatment, and enzymatic destruction means such as lysozyme.

【００３６】この粗製のアシルカルニチンエステラーゼ
含有液から公知の蛋白質、酵素等の単離・精製手段を用
いることによりさらに精製されたアシルカルニチンエス
テラーゼを得ることができる。例えば粗製のアシルカル
ニチンエステラーゼ含有液に硫安、硫酸ナトリウム、リ
ン酸カリウム、アルミニウム等を添加する塩析沈澱法に
より本酵素を回収すればよい。さらにこの沈澱物は、分
子篩、各種のクロマトグラフィー法、電気泳動法あるい
は超遠心分析法を適宜組み合わせ用いて、必要に応じて
精製すればよく、その精製手段としては、目的とするア
シルカルニチンエステラーゼの性質を利用した手段を用
いればよく、例えば上記の沈澱物を水または緩衝液に溶
解した後、必要に応じて半透膜にて透析し、さらにDEAE
−セルロース、DEAE−セファセル、DEAE−セファロー
ス、DEAE−セファデックスA-50（ファルマシア社製）、
DEAE−トヨパール（東洋曹達社製）等のイオン交換樹脂
や、セファデックスG-100 、G-75、セファクリルS-200
等のゲル濾過剤による分子篩クロマトを行えばよく、ま
たこれらの手段を適宜組み合わせて用いて精製すればよ
く、その後必要に応じて糖類、例えばマンニトール、サ
ッカロース、ソルビトール等、アミノ酸、例えばグルタ
ミン酸、グリシン等、ペプタイドまたは蛋白質として牛
血清アルブミン等の安定剤を添加し、凍結乾燥等の処理
により精製されたアシルカルニチンエステラーゼの粉体
を得ることができる。From this crude acylcarnitine esterase-containing solution, further purified acylcarnitine esterase can be obtained by using known protein and enzyme isolation / purification means. For example, the enzyme may be recovered by a salting-out precipitation method in which ammonium sulfate, sodium sulfate, potassium phosphate, aluminum or the like is added to a crude acylcarnitine esterase-containing solution. Further, the precipitate may be purified as necessary by appropriately using a molecular sieve, various types of chromatography, electrophoresis, or ultracentrifugation, and as a purification means, the target acylcarnitine esterase may be used. Means utilizing the properties may be used.For example, after dissolving the above precipitate in water or a buffer, dialyzing is performed with a semi-permeable membrane as necessary, and then DEAE
Cellulose, DEAE-Sephacel, DEAE-Sepharose, DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia),
Ion exchange resins such as DEAE-Toyopearl (Toyo Soda Co., Ltd.), Sephadex G-100, G-75, Sephacryl S-200
It is sufficient to carry out molecular sieve chromatography using a gel filtration agent such as, and purification may be performed using an appropriate combination of these means, and then, if necessary, saccharides such as mannitol, saccharose, sorbitol, etc., and amino acids such as glutamic acid, glycine, etc. A powder of acylcarnitine esterase can be obtained by adding a stabilizer such as bovine serum albumin as a peptide or protein and subjecting it to a treatment such as freeze-drying.

【００３７】以上の如くして得られたアシルカルニチン
エステラーゼの性状は以下の通りである。The properties of the acylcarnitine esterase obtained as described above are as follows.

【００３８】（１）酵素作用 下記式に示すように、アシル−Ｌ−カルニチンを加水分
解してＬ−カルニチンと遊離脂肪酸を生成する反応を触
媒する。アシル−Ｌ−カルニチン＋H₂O → 脂肪酸＋Ｌ
−カルニチン(1) Enzyme action As shown in the following formula, it catalyzes a reaction for hydrolyzing acyl-L-carnitine to produce L-carnitine and free fatty acids. Acyl-L-carnitine + H ₂ O → fatty acid + L
-Carnitine

【００３９】（２）分子量 63,000±7,000 トーソー社製TSKゲルG3000SW(0.75×60cm）による値、
溶出液；0.2M NaCl含有0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0)、標
準品はオリエンタル酵母社製の次の分子量マーカーを使
用した。(2) Molecular weight 63,000 ± 7,000 Value measured by TSK gel G3000SW (0.75 × 60 cm) manufactured by Tosoh Corporation
Eluent: 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.2 M NaCl, and the following standard molecular weight markers manufactured by Oriental Yeast Co. were used.

【００４０】[0040]

【表８】 M.W. 12,400 シトクロムC M.W. 32,000 アデニレートキナーゼ M.W. 67,000 エノラーゼ M.W. 142,000 ラクテートデヒドロゲナーゼ M.W. 290,000 グルタメートデヒドロゲナーゼTable 8: M.W. 12,400 cytochrome C M.W. 32,000 adenylate kinase M.W. 67,000 enolase M.W. 142,000 lactate dehydrogenase M.W. 290,000 glutamate dehydrogenase

【００４１】（３）等電点 pH5.1±0.5 キャリアアンフォライトを用いる焦点電気泳動により４
℃、700Vの定電圧で40時間通電した後、分画し、各画分
の酵素活性を測定した。(3) Isoelectric point pH 5.1 ± 0.5 Focused electrophoresis using carrier ampholite
After applying electricity at a constant voltage of 700 V and a constant voltage of 700 V for 40 hours, fractionation was performed, and the enzyme activity of each fraction was measured.

【００４２】（４）Km値 100mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0)中で以下に示した各ア
シルカルニチンをそれぞれ１×10^-5Ｍ、２×10^-5Ｍ、３
×10^-5Ｍ、５×10^-5Ｍ、10×10^-5Ｍ、20×10^-5Ｍ、40×
10^-5Ｍになるように調製し、それぞれのアシルカルニチ
ンに対するKm値を測定した。なお、それぞれのアシルカ
ルニチンは市販のものを用いるか、Ｌ−カルニチン（シ
グマ社製）を用いてBohmer & Bremer の方法〔Biochim.
Biophys.Acta, 152, 559-567(1968）〕を用いて自家調
製した。(4) Km value In the 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), each of the following acylcarnitines was added to 1 × 10 ⁻⁵ M, 2 × 10 ⁻⁵ M,
× 10 ^-5 M, 5 × 10 ^-5 M, 10 × 10 ^-5 M, 20 × 10 ^-5 M, 40 ×
It was adjusted to 10 ^-5 M, and the Km value for each acylcarnitine was measured. Each acylcarnitine is commercially available, or L-carnitine (manufactured by Sigma) according to the method of Bohmer & Bremer [Biochim.
Biophys. Acta, 152, 559-567 (1968)].

【００４３】[0043]

【表９】 アセチル−Ｌ−カルニチン 約４×10^-5Ｍ プロピオニル−Ｌ−カルニチン 約３×10^-5Ｍ ヘキサノイル−Ｌ−カルニチン 約２×10^-5Ｍ オクタノイル−Ｌ−カルニチン 約２×10^-5Ｍ デカノイル−Ｌ−カルニチン 約２×10^-5Ｍ ラウロイル−Ｌ−カルニチン 約２×10^-5Ｍ ミリストイル−Ｌ−カルニチン 約２×10^-5Ｍ パルミトイル−Ｌ−カルニチン 約３×10^-5Ｍ ステアロイル−Ｌ−カルニチン 約５×10^-5ＭTable 9 Acetyl -L- carnitine about 4 × 10 ^-5 M propionyl -L- carnitine about 3 × 10 ^-5 M hexanoyl -L- carnitine about 2 × 10 ^-5 M octanoyl -L- carnitine about 2 × 10 ^{- 5} M decanoyl-L-carnitine about 2 × 10 ⁻⁵ M lauroyl-L-carnitine about 2 × 10 ⁻⁵ M myristoyl-L-carnitine about 2 × 10 ⁻⁵ M Palmitoyl-L-carnitine about 3 × 10 ⁻⁵ M Stearoyl-L-carnitine About 5 × 10 ^-5 M

【００４４】（５）基質特異性 100mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0)中で各々のアシルカル
ニチンが0.5mMになるように調製し、37℃、10分間の反
応で生成されるＬ−カルニチン量を後述のＬ−カルニチ
ン測定法を用いて測定し、比較した。その結果、オクタ
ノイル−Ｌ−カルニチンに対して最も高い活性を示し
た。また、ラットの肝臓由来のアシルカルニチンエステ
ラーゼはアセチル−Ｌ−カルニチンとプロピオニル−Ｌ
−カルニチンに対して活性を示さないが本発明の酵素は
充分な活性を示した。(5) Substrate specificity In a 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), each acylcarnitine was prepared to have a concentration of 0.5 mM, and the amount of L-carnitine produced in the reaction at 37 ° C. for 10 minutes. Was measured using the L-carnitine measurement method described below and compared. As a result, it showed the highest activity against octanoyl-L-carnitine. Acylcarnitine esterase derived from rat liver is composed of acetyl-L-carnitine and propionyl-L.
-No activity against carnitine, but the enzyme of the present invention showed sufficient activity.

【００４５】[0045]

【表１０】 アセチル−Ｌ−カルニチン 17％ プロピオニル−Ｌ−カルニチン 46％ ヘキサノイル−Ｌ−カルニチン 85％ オクタノイル−Ｌ−カルニチン 100％ デカノイル−Ｌ−カルニチン 72％ ラウロイル−Ｌ−カルニチン 60％ ミリストイル−Ｌ−カルニチン 61％ パルミトイル−Ｌ−カルニチン 41％ ステアロイル−Ｌ−カルニチン 11％Table 10 Acetyl-L-carnitine 17% Propionyl-L-carnitine 46% Hexanoyl-L-carnitine 85% Octanoyl-L-carnitine 100% Decanoyl-L-carnitine 72% Lauroyl-L-carnitine 60% Myristoyl-L- Carnitine 61% Palmitoyl-L-carnitine 41% Stearoyl-L-carnitine 11%

【００４６】（６）至適pH 100mM 酢酸緩衝液（pH4.5〜6.0)、100mMリン酸緩衝液
（pH6.5〜8.0)、100mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0〜9.
0)、100mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH9.0〜1
0.0）の各緩衝液中で0.5mMになるようにオクタノイル−
Ｌ−カルニチンを調製し、37℃、10分間の反応の後に生
成されたＬ−カルニチンを測定した。測定した結果は図
１に示す通りであって、pH8.0付近が至適pHであるが、p
H6.5〜9.5までの広い範囲にわたって90％以上の活性を
示した。(6) Optimum pH 100 mM acetate buffer (pH 4.5-6.0), 100 mM phosphate buffer (pH 6.5-8.0), 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0-9.
0), 100 mM glycine sodium hydroxide buffer (pH 9.0-1
0.0) in each buffer to 0.5 mM in each buffer.
L-carnitine was prepared, and L-carnitine produced after the reaction at 37 ° C. for 10 minutes was measured. The measured results are as shown in FIG. 1 and the optimum pH is around pH 8.0.
It showed more than 90% activity over a wide range from H6.5 to 9.5.

【００４７】[0047]

【表１１】 図１中の説明 酢酸緩衝液 −△− リン酸緩衝液 −○− トリス塩酸緩衝液 −●− グリシン水酸化ナトリウム緩衝液 −□−[Table 11] Description in FIG. 1 Acetate buffer-△-Phosphate buffer-○-Tris-HCl buffer-●-Glycine sodium hydroxide buffer-□-

【００４８】（７）pH安定性 本酵素を100mM酢酸緩衝液（pH4.5〜6.0)、100mMリン酸
緩衝液（pH6.5〜8.0)、100mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0
〜9.0)、100mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH9.0
〜10.0）を用いて0.1U／mlに調製し、60℃、30分間加熱
処理した後の残存活性を測定した。測定した結果は図２
に示す通りであって、pH7.5のリン酸緩衝液からpH8.5の
トリス塩酸緩衝液中で安定であった。また、pH5.5の酢
酸緩衝液からpH10.0のグリシン水酸化ナトリウム緩衝液
までのpHの広い範囲にわたって90％以上の活性を保持し
ていた。(7) pH stability The present enzyme was treated with 100 mM acetate buffer (pH 4.5-6.0), 100 mM phosphate buffer (pH 6.5-8.0), 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0).
~ 9.0), 100 mM glycine sodium hydroxide buffer (pH 9.0
To 10.0 U / ml, and the remaining activity after heat treatment at 60 ° C. for 30 minutes was measured. Figure 2 shows the measurement results.
And stable in a pH 7.5 phosphate buffer to a pH 8.5 Tris-HCl buffer. Further, the activity was maintained at 90% or more over a wide range of pH from acetate buffer at pH 5.5 to sodium glycine hydroxide buffer at pH 10.0.

【００４９】[0049]

【表１２】 図２中の説明 酢酸緩衝液 −△− リン酸緩衝液 −○− トリス塩酸緩衝液 −●− グリシン水酸化ナトリウム緩衝液 −□−[Table 12] Description in FIG. 2 Acetate buffer-△-Phosphate buffer-○-Tris-HCl buffer-●-Glycine sodium hydroxide buffer-□-

【００５０】（８）至適温度 0.5mMオクタノイル−Ｌ−カルニチンを含んだpH8.0の10
0mMトリス塩酸緩衝液を用いて50℃、55℃、60℃、65
℃、70℃、75℃の各温度で10分間反応させた後に生成さ
れたＬ−カルニチン量を測定した結果は図３に示す通り
であって70℃で最大の活性を示した。(8) Optimum temperature of pH 8.0 containing 0.5 mM octanoyl-L-carnitine
50 ° C, 55 ° C, 60 ° C, 65 ° C using 0 mM Tris-HCl buffer
The amount of L-carnitine produced after reacting at each of 10 ° C., 70 ° C., and 75 ° C. for 10 minutes was measured. The result was as shown in FIG. 3 and showed the maximum activity at 70 ° C.

【００５１】（９）熱安定性 本酵素を100mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0)を用いて0.1U
／mlに調製し、55℃、60℃、65℃、70℃で30分間加熱処
理をした後の残存活性を測定した結果は図４に示す通り
であって60℃までは安定であった。(9) Thermostability The enzyme was added to 100 U of Tris-HCl buffer (pH 8.0) for 0.1 U
/ Ml and subjected to heat treatment at 55 ° C, 60 ° C, 65 ° C, and 70 ° C for 30 minutes, and the residual activity was measured. The result is shown in FIG. 4 and was stable up to 60 ° C.

【００５２】（10）アシルカルニチンエステラーゼ活性
の測定法 １）．反応液組成 100mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0) 0.5mM オクタノイル−Ｌ−カルニチン ２）．測定法(10) Method for measuring acylcarnitine esterase activity 1). Reaction solution composition 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) 0.5 mM octanoyl-L-carnitine 2). Measurement method

【００５３】上記の反応液１mlを小試験管に入れ、37℃
で５分間インキュベイトした後に、適当に希釈した酵素
液0.05mlを添加して37℃で15分間インキュベイトした後
に、直ちに沸騰水浴中で15秒間インキュベイトして反応
を停止し、被検液とする。生成されたＬ−カルニチンを
下記のＬ−カルニチンの測定法を用いて測定し、アシル
カルニチンエステラーゼの活性を求める。Put 1 ml of the above reaction solution into a small test tube,
After incubation at 37 ° C for 15 minutes, the reaction was immediately stopped by incubating for 15 seconds in a boiling water bath to stop the reaction. I do. The produced L-carnitine is measured using the following method for measuring L-carnitine, and the activity of acylcarnitine esterase is determined.

【００５４】[0054]

【数１】 (Equation 1)

【００５５】４）．Ｌ−カルニチンの測定法（以下、Ｌ
−カルニチン測定法Aと略す） イ）反応液組成4). The method for measuring L-carnitine (hereinafter referred to as L
-Abbreviation of carnitine measurement method A) a) Composition of reaction solution

【００５６】[0056]

【表１３】 100mM トリス塩酸緩衝液（pH9.0) 1mM NAD⁺ 5U ジアフォラーゼ（東洋醸造社製） 15U Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ（アルカリゲネ
ス・エスピーNo.981 由来、東洋醸造社製） 100mM KCl 0.025％ NBT(和光純薬工業社製） 0.5％ ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレ
エート（和光純薬工業社製）[Table 13] 100 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0) 1 mM NAD ⁺ 5 U diaphorase (manufactured by Toyo Brewery) 15 U L-carnitine dehydrogenase (derived from Alcaligenes SP No. 981, manufactured by Toyo Brewery) 100 mM KCl 0.025% NBT ( 0.5% polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries)

【００５７】ロ）測定法 上記の反応液１mlを小試験管に入れ、37℃で５分間イン
キュベイトした後に、被検液0.05mlを添加し、２分間イ
ンキュベイトした後に0.1N塩酸２mlを添加しA_{5 50nm}を測
定して吸光度A₁を測定する。被検液を添加しないで同様
にしてブランクA₀を求める。B) Measurement method 1 ml of the above reaction solution was placed in a small test tube, and incubated at 37 ° C. for 5 minutes, then 0.05 ml of the test solution was added, and after 2 minutes of incubation, 2 ml of 0.1N hydrochloric acid was added. and measuring absorbance a ₁ by measuring a _{5 50 nm.} Obtaining a blank A ₀ in the same manner without adding a test solution.

【００５８】[0058]

【数２】 (Equation 2)

【００５９】上記のアシルカルニチンエステラーゼは、
中鎖乃至長鎖アシル−Ｌ−カルニチンだけでなく、低級
アシル−Ｌ−カルニチンに対しても活性を有する。従っ
て、ヒト血清などのアシル−Ｌ−カルニチンを含有する
被検液に、本発明の低級、中鎖乃至長鎖のいずれのアシ
ル−Ｌ−カルニチンに対しても活性を有するアシルカル
ニチンエステラーゼを作用せしめ、次いで生成した脂肪
酸または／およびＬ−カルニチンを定量すれば、当該被
検液中のアシル−Ｌ−カルニチンを測定することができ
る。被検液中にアシル−Ｌ−カルニチン以外に遊離のＬ
−カルニチンが存在する場合、あらかじめ遊離Ｌ−カル
ニチンのみを後述する手段にて定量するか；遊離Ｌ−カ
ルニチンを還元型補酵素、例えばNADHを酸化型に変換す
る系とし、加温ないし加熱して分解消去した後アシル−
Ｌ−カルニチンのみを定量するか；あるいはアシル−Ｌ
−カルニチンを本発明アシルカルニチンエステラーゼに
てＬ−カルニチンとし、被検液に存在した遊離のＬ−カ
ルニチンとアシル−Ｌ−カルニチンとの総量として定量
してもよい。The above acylcarnitine esterase is
It has activity not only for medium to long chain acyl-L-carnitine but also for lower acyl-L-carnitine. Therefore, an acyl-carnitine esterase having an activity against any of lower, medium-chain or long-chain acyl-L-carnitine of the present invention is allowed to act on a test solution containing acyl-L-carnitine such as human serum. Then, if the produced fatty acid and / or L-carnitine is quantified, acyl-L-carnitine in the test solution can be measured. Free L besides acyl-L-carnitine in the test solution
When carnitine is present, only free L-carnitine is quantified in advance by the means described below; or a system for converting free L-carnitine to a reduced coenzyme, for example, NADH to an oxidized form, is heated or heated. Acyl-
Quantifying L-carnitine alone; or acyl-L
-Carnitine may be converted to L-carnitine by the acylcarnitine esterase of the present invention, and the amount may be quantified as the total amount of free L-carnitine and acyl-L-carnitine present in the test solution.

【００６０】このような被検液と本発明アシルカルニチ
ンエステラーゼとの反応は、被検液中のアシル−Ｌ−カ
ルニチンが充分加水分解される条件であれば特に制限さ
れないが、例えば37℃、５〜30分間インキュベイトすれ
ばよい。また反応の停止は80℃以上に加熱して行うのが
好ましい。The reaction between such a test solution and the acylcarnitine esterase of the present invention is not particularly limited as long as the acyl-L-carnitine in the test solution is sufficiently hydrolyzed. Incubate for ~ 30 minutes. The termination of the reaction is preferably carried out by heating to 80 ° C. or higher.

【００６１】かかる反応により、脂肪酸とＬ−カルニチ
ンが生成するが、当該脂肪酸の定量法としては、常法、
例えば液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィ
ー等が挙げられる。また、Ｌ−カルニチンの定量法とし
ては、カルニチンアセチルトランスフェラーゼ(CAT) 、
アセチルCoA および5,5'−ジチオビス−２−ニトロ安息
香酸(DTNB)を用いた比色定量法〔J. Biol. Chem., 238,
2509(1963), J. Lipid Research, 5, 184-187(196
4）〕；〔¹⁴C〕または〔³H〕標識アセチルCoAとCATを用
いたラジオアイソトープ法〔Clin. Chim. Acta, 37, 23
5-243(1972), J. Lipid. Research, 17, 277-281(197
6)〕；カルニチンデヒドロゲナーゼNAD⁺を用いたカルニ
チンデヒドロゲナーゼ法〔European J. Biochem., 6, 1
96-201(1968）〕およびアセチルCoA 、CAT およびＮ−
｛ｐ−（２−ベンズイミダゾリル）−フェニル｝−マレ
イミド(BIPM)を用いた蛍光法〔厚生省神経病患研61年度
研報、315-318(1986）〕などの方法が挙げられ、これら
のうち、カルニチンデヒドロゲナーゼ法が好ましい。具
体的には、反応液にＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼ、
NAD類またはチオNAD類、および必要に応じて非イオン性
界面活性剤を含有する試薬を作用せしめて、反応にて生
成する還元型NAD類または還元型チオNAD類の量を測定す
ることにより行われる。ここでNAD類としては、ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD)、アセチルピリ
ジンアデニンジヌクレオチド（アセチルNAD)、ニコチン
アミドヒポキサンチンジヌクレオチド（デアミノNAD)が
挙げられ、また、チオNAD類としてはチオニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（チオNAD)、チオニコチンア
ミドヒポキサンチンジヌクレオチドが挙げられる。[0061] The fatty acid and L-carnitine are produced by such a reaction.
For example, liquid chromatography, gas chromatography and the like can be mentioned. As a method for quantifying L-carnitine, carnitine acetyltransferase (CAT),
Colorimetric method using acetyl-CoA and 5,5′-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) [J. Biol. Chem., 238 ,
2509 (1963), J. Lipid Research, 5 , 184-187 (196
4)]; Radioisotope method using [ ¹⁴ C] or [ ³ H] -labeled acetyl-CoA and CAT [Clin. Chim. Acta, 37 , 23
5-243 (1972), J. Lipid.Research, 17 , 277-281 (197
6)]; Carnitine dehydrogenase method using carnitine dehydrogenase NAD ⁺ [European J. Biochem., 6 , 1
96-201 (1968)] and acetyl-CoA, CAT and N-
Methods such as a fluorescence method using {p- (2-benzimidazolyl) -phenyl} -maleimide (BIPM) [Ministry of Health and Welfare, Institute of Neurological Diseases, 61st year, 315-318 (1986)] and the like. The carnitine dehydrogenase method is preferred. Specifically, L-carnitine dehydrogenase is added to the reaction solution,
The reaction is carried out by reacting a reagent containing NADs or thio NADs and, if necessary, a nonionic surfactant, and measuring the amount of reduced NADs or reduced thio NADs formed in the reaction. Will be Here, NADs include nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), acetylpyridine adenine dinucleotide (acetyl NAD), nicotinamide hypoxanthine dinucleotide (deamino NAD), and thio NADs include thionicotinamide Adenine dinucleotide (thio NAD) and thionicotinamide hypoxanthine dinucleotide.

【００６２】ここで、反応にて生成する還元型NAD類ま
たは還元型チオNAD類の定量は、直接吸光度を測定する
ことにより実施してもよいが、次の反応式で示されるホ
ルマザン生成系に変換させることにより測定するのが好
ましい。Here, the quantitative determination of the reduced NADs or reduced thio NADs formed in the reaction may be carried out by directly measuring the absorbance. It is preferable to measure by conversion.

【００６３】[0063]

【化３】 Embedded image

【００６４】本発明で用いられるＬ−カルニチンデヒド
ロゲナーゼは公知の酵素であるが、細菌由来のＬ−カル
ニチンデヒドロゲナーゼ生産菌の産生する酵素が励用さ
れる。このようなＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼ生産
菌の例としては、Pseudomonas aeruginosa IFO 13130、
Pseudomonas putida B-0781(FERM P-5664)、Pseudomona
s putida IF 03738 などのシュードモナス属細菌、Xant
homonas translucensIFO 13558 などのキサントモナス
属細菌などが挙げられる。上記の細菌由来のＬ−カルニ
チンデヒドロゲナーゼはEuropean J. Biochem., 6, 196
-201(1968),同誌，10, 56-60(1969), Agric. Biol. Che
m., 52(1), 249-250(1988）などに記載の方法により上
記生産菌を培養し、該培養物から分離精製することによ
って製造される。また上記生産菌から得られたＬ−カル
ニチンデヒドロゲナーゼ遺伝子を遺伝子組み換え技術に
よって得られた宿主細胞を培養し、精製することによっ
ても製造される〔Agric. Biol. Chem., 52(3)，851-852
(1988）〕。また、アルカリゲネス エスピーNo.981も
Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼを産生する。なお、こ
のとき培地にはカルニチンを含有させて培養するのが好
ましい。The L-carnitine dehydrogenase used in the present invention is a known enzyme, but an enzyme produced by a bacterial L-carnitine dehydrogenase-producing bacterium can be used. Examples of such L-carnitine dehydrogenase producing bacteria include Pseudomonas aeruginosa IFO 13130,
Pseudomonas putida B-0781 (FERM P-5664), Pseudomona
Pseudomonas bacteria such as s putida IF 03738, Xant
Xanthomonas bacteria such as homonas translucensIFO 13558. L-carnitine dehydrogenase derived from the above bacteria is described in European J. Biochem., 6 , 196
-201 (1968), same magazine, 10 , 56-60 (1969), Agric. Biol. Che
m., 52 (1), 249-250 (1988), and the like. It can also be produced by culturing and purifying a host cell obtained by a genetic recombination technique from the L-carnitine dehydrogenase gene obtained from the above producing bacteria [Agric. Biol. Chem., 52 (3), 851- 852
(1988)]. Alkagenes SP No. 981 also produces L-carnitine dehydrogenase. In addition, at this time, it is preferable to culture the culture medium containing carnitine.

【００６５】本測定法で用いられる電子伝達剤として
は、後記のテトラゾリウム塩、NADH類（またはチオNADH
類）およびH⁺からホルマザンおよびNAD⁺類（またはチオ
NAD⁺類）に変換することのできる試薬であり、例えばジ
アホラーゼ、フェナジン誘導体が挙げられる。Examples of the electron transfer agent used in this measurement method include tetrazolium salts and NADHs (or thioNADH) described below.
) And H ⁺ to formazan and NAD ⁺ (or thio
NAD ⁺ ), for example, diaphorase and phenazine derivatives.

【００６６】ジアホラーゼは公知の酵素であり、市販品
を入手することができる。フェナジン誘導体としては、
フェナジンメトサルフェート、メルドラブルー、メトキ
シフェナジンメトサルフェートなどが挙げられる。Diaphorase is a known enzyme, and a commercially available product can be obtained. As phenazine derivatives,
Phenazine methosulfate, Meldora blue, methoxyphenazine methosulfate and the like.

【００６７】本測定法で用いられるテトラゾリウム塩と
しては3,3'−（3,3'−ジメトキシ−4,4'−ビフェニレ
ン）−ビス〔２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニ
ル−テトラゾリウムクロライド〕〔別名；ニトロテトラ
ゾリウム(NTB）〕、3,3'−（3,3'−ジメトキシ−4,4'−
ビフェニレン）−ビス〔2,5−ビス（ｐ−ニトロフェニ
ル）−テトラゾリウムクロライド〕、3,3'−（3,3'−ジ
メトキシ−4,4'−ビフェニレン）−ビス(2,5−ジフェニ
ル−テトラゾリウムクロライド、２−（ｐ−ニトロフェ
ニル）−３−（ｐ−ヨードフェニル）−５−フェニル−
テトラゾリウムクロライド(INT）、３−(4,5−ジメチル
−２−チアゾリル）−2,5−ジフェニル−テトラゾリウ
ムクロライド(4,5−MTT)、３−(4,5−ジメチル−２−ト
リアゾリル）−2,4−ジフェニル−テトラゾリウムクロ
ライド(MTT）、2,2',5,5'−テトラ−（ｐ−ニトロフェ
ニル）−3,3'−（３−ジメトキシ−４−ジェフニレン）
−ジテトラゾリウムクロライド(TNBT)、2,3,5−トリフ
ェニル−テトラゾリウムクロライド(TT)、ネオテトラゾ
リウムクロライド(NT)などが挙げられる。The tetrazolium salt used in the present measurement method is 3,3 ′-(3,3′-dimethoxy-4,4′-biphenylene) -bis [2- (p-nitrophenyl) -5-phenyl-tetrazolium Chloride] [also known as nitrotetrazolium (NTB)], 3,3 '-(3,3'-dimethoxy-4,4'-
Biphenylene) -bis [2,5-bis (p-nitrophenyl) -tetrazolium chloride], 3,3 '-(3,3'-dimethoxy-4,4'-biphenylene) -bis (2,5-diphenyl- Tetrazolium chloride, 2- (p-nitrophenyl) -3- (p-iodophenyl) -5-phenyl-
Tetrazolium chloride (INT), 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-tetrazolium chloride (4,5-MTT), 3- (4,5-dimethyl-2-triazolyl)- 2,4-diphenyl-tetrazolium chloride (MTT), 2,2 ', 5,5'-tetra- (p-nitrophenyl) -3,3'-(3-dimethoxy-4-gephnylene)
-Ditetrazolium chloride (TNBT), 2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride (TT), neotetrazolium chloride (NT) and the like.

【００６８】この反応系に添加される非イオン性界面活
性剤としては、この反応系の反応を阻害するような悪影
響を与えず、且つHLB約10以上の水溶性の非イオン性界
面活性剤が用いられる。好ましくは約11〜17のHLBを有
する非イオン性界面活性剤を使用するのが望ましい。例
えば、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキ
シエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステア
リルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、
ポリオキシエチレンヘキサデシルエーテル、ポリオキシ
エチレントリデシルエーテルなどのポリオキシエチレン
アルキルエーテル；ポリオキシエチレンノニルフェニル
エーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテ
ルなどのポリオキシエチレンアルキルアリールエーテ
ル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエ
ーテルなどのポリオキシエチレンポリオキシプロピレン
エーテル；ポリオキシエチレンモノステアレート、ポリ
オキシエチレンモノラウレート、ポリオキシエチレンモ
ノオレエートなどのポリオキシエチレンアルキルエステ
ル；ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミ
テート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリ
ステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタン
セスキオレエート、ソルビタントリオレエート；グリセ
リンモノステアレート、プロピレングリコールモノステ
アレート、グリセリンモノオレエートなどのグリセリン
・プロピレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエ
チレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン
ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタ
ントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモ
ノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレ
エートなどのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エス
テル；As the nonionic surfactant to be added to the reaction system, a water-soluble nonionic surfactant having an HLB of about 10 or more without adversely affecting the reaction of the reaction system is used. Used. It is desirable to use a non-ionic surfactant having an HLB of preferably about 11-17. For example, polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene cetyl ether, polyoxyethylene stearyl ether, polyoxyethylene lauryl ether,
Polyoxyethylene alkyl ethers such as polyoxyethylene hexadecyl ether and polyoxyethylene tridecyl ether; polyoxyethylene alkyl aryl ethers such as polyoxyethylene nonylphenyl ether and polyoxyethylene octyl phenyl ether; polyoxyethylene polyoxypropylene cetyl Polyoxyethylene polyoxypropylene ether such as ether; polyoxyethylene alkyl ester such as polyoxyethylene monostearate, polyoxyethylene monolaurate, polyoxyethylene monooleate; sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate, sorbitan Monostearate, sorbitan tristearate, sorbitan monooleate, sorbitan sesquioleate, Rubitan trioleate; glycerin / propylene glycol fatty acid esters such as glycerin monostearate, propylene glycol monostearate, and glycerin monooleate; polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan mono Polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as stearate, polyoxyethylene sorbitan tristearate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyethylene sorbitan trioleate;

【００６９】ポリオキシエチレンソルビトールモノラウ
レート、ポリオキシエチレンソルビトールテトラオレエ
ート、ポリオキシエチレンソルビトールヘキサステアレ
ートなどのポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エス
テル；ポリオキシエチレングリセリンモノステアレート
などのポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；
ポリオキシエチレンステアリルアミンなどのポリオキシ
エチレンアルキルアミン；ポリオキシエチレンステアリ
ルアミドなどのポリオキシエチレンアミド；ラウリン酸
ジエタノールアミド、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド
などの脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレン
硬化ヒマシ油誘導体などのポリオキシエチレンヒマシ油
誘導体；アデカノール（旭電化工業社製）などの第１級
アルコールエトキシレート；アデカトール（旭電化工業
社製）などの第２級アルコールエトキシレート；テトロ
ニック（旭電化工業社製）などのエチレンジアミンのポ
リオキシプロピレンポリオキシエチレンエーテルなどが
挙げられるが、プロニックF-68（旭電化工業社製）など
のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンエーテル、
ニッコールTO-10(日光ケミカルズ社製）、ポリオキシエ
チレン（２０）ソルビタンモノオレエート（和光純薬社
製）などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステ
ル、ソルビタン脂肪酸エステル、アデカトール（旭電化
工業社製）などの第２級アルコールエトキシレートが好
ましい一例である。上記の非イオン性界面活性剤は１種
単独で使用してもよいし、また２種以上を組み合わせて
使用してもよい。Polyoxyethylene sorbitol fatty acid esters such as polyoxyethylene sorbitol monolaurate, polyoxyethylene sorbitol tetraoleate and polyoxyethylene sorbitol hexastearate; polyoxyethylene glycerin fatty acid esters such as polyoxyethylene glycerin monostearate ;
Polyoxyethylene alkylamines such as polyoxyethylene stearylamine; polyoxyethylene amides such as polyoxyethylene stearylamide; fatty acid alkanolamides such as lauric acid diethanolamide and coconut oil fatty acid diethanolamide; and polyoxyethylene hydrogenated castor oil derivatives. Polyoxyethylene castor oil derivatives; primary alcohol ethoxylates such as ADEKANOL (manufactured by Asahi Denka Kogyo); secondary alcohol ethoxylates such as ADEKATOL (manufactured by Asahi Denka Kogyo); Tetronic (manufactured by Asahi Denka Kogyo) And polyoxypropylene polyoxyethylene ethers of ethylenediamine, such as polyoxyethylene polyoxypropylene ethers such as Pronic F-68 (manufactured by Asahi Denka Kogyo).
Polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as Nikkor TO-10 (Nikko Chemicals), polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate (Wako Pure Chemical Industries), sorbitan fatty acid esters, ADEKATOL (Asahi Denka Kogyo) Is a preferable example. The above nonionic surfactants may be used alone or in combination of two or more.

【００７０】反応液中のＬ−カルニチン量の測定を実施
するための酵素および必要な試薬の濃度は、一般的に
は、次の濃度の範囲で適宜決定し、本反応系の反応を行
わせるのが望ましい。The concentration of the enzyme and the necessary reagent for measuring the amount of L-carnitine in the reaction solution is generally determined appropriately in the following range, and the reaction of the present reaction system is carried out. It is desirable.

【００７１】[0071]

【表１４】 緩衝剤 Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ 1〜30U／ml NAD⁺類（またはチオNAD⁺類） 0.1 〜５mM ジアホラーゼ 0.5 〜50U／ml テトラゾリウム塩 0.01〜0.1％ 非イオン性界面活性剤 0.1 〜５％Table 14 Buffer L-carnitine dehydrogenase 1-30 U / ml NAD ⁺ (or thioNAD ⁺ ) 0.1-5 mM diaphorase 0.5-50 U / ml tetrazolium salt 0.01-0.1% Nonionic surfactant 0.1-5%

【００７２】上記の酵素および必要な試薬は、同一系ま
たは２以上からなる系として、水溶液状に保存してもよ
いし、また乾燥した粉末状に保存してもよい。特に凍結
乾燥により乾燥保存することが有利である。上記の酵素
および必要な試薬を安定に保存するためには、安定性に
悪影響を与えないような成分と共に保存するのが好まし
い。例えばＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼと非イオン
性界面活性剤、NAD⁺類またはチオNAD⁺類とテトラゾリウ
ム塩、電子伝達剤とテトラゾリウム塩、非イオン性界面
活性剤とテトラゾリウム塩は互いにできるだけ同一系で
長期保存しない方が望ましい。The above enzyme and necessary reagents may be stored in the form of an identical system or a system of two or more in the form of an aqueous solution or in the form of a dry powder. In particular, it is advantageous to dry-store by freeze-drying. In order to stably store the above enzymes and necessary reagents, it is preferable to store them together with components that do not adversely affect stability. For example, L-carnitine dehydrogenase and a non-ionic surfactant, NAD ⁺ or thio NAD ⁺ and a tetrazolium salt, an electron transfer agent and a tetrazolium salt, a non-ionic surfactant and a tetrazolium salt can be kept in the same system as long as possible and not stored for a long time. Is more desirable.

【００７３】本反応系の反応を行うに当っては、通常37
℃付近で１分以上反応させればよい。上記反応におい
て、にごりが生じる場合には、反応液のにごりを除去す
る目的でKCl 、NaClなどの添加物を適宜添加して反応を
行ってもよい。In carrying out the reaction of the present reaction system, usually 37
What is necessary is just to make it react at about 1 degreeC for 1 minute or more. In the above reaction, in the case where dust is generated, the reaction may be carried out by appropriately adding an additive such as KCl 3 or NaCl for the purpose of removing the dust from the reaction solution.

【００７４】上記反応系におけるＬ−カルニチンの測定
は、反応によって生じたホルマザンの特異的吸収波長で
ある吸収波長域、例えば500〜550nm付近における極大吸
収波長域に基いて比色定量することにより求められる。The measurement of L-carnitine in the above reaction system is obtained by colorimetric determination based on an absorption wavelength range which is a specific absorption wavelength of formazan generated by the reaction, for example, a maximum absorption wavelength range around 500 to 550 nm. Can be

【００７５】また、Ｌ−カルニチンの測定は、Ｌ−カル
ニチン含有反応液に、Ｌ−カルニチンデヒドロゲナー
ゼ、A₁およびB₁を含有する試薬を作用せしめて、次の反
応式、[0075] The measurement of L- carnitine, L- carnitine-containing reaction solution, L- carnitine dehydrogenase and allowed action of a reagent containing A ₁ and B _1, the following reaction scheme,

【００７６】[0076]

【化４】 Embedded image

【００７７】（式中、A₁はチオNAD類またはNAD類を示
し、A₂はA₁の還元型生成物を示し、B₁はA₁がチオNAD類
のときは還元型NAD類を、A₁がNAD類のときは還元型チオ
NAD類を示し、B₂はB₁の酸化型生成物を示す）で表わさ
れるサイクリング反応を形成せしめ、該反応によって変
化するA₂またはB₁の量を測定することによっても行うこ
とができる。この反応系は感度が極めて高く、特に好ま
しい。[0077] (wherein, A ₁ represents a thio-NAD or NAD compound, A ₂ is a reduced product of A _1, the B ₁ represents when A ₁ is a thio-NAD compound and a reduced NAD, When A ₁ is a NAD, reduced thio
Shows the NAD compound, B ₂ is allowed to form a cycling reaction represented by showing the oxidized product of B _1), can also be carried out by measuring the amount of A ₂ or B ₁ that varies with the reaction. This reaction system has extremely high sensitivity and is particularly preferable.

【００７８】本反応系においてはA₁がチオNAD類である
場合はB₁がNADH類であり、またA₁がNAD類である場合はB
₁がチオNADH類であり、少なくとも一方がチオ型補酵素
であることが必要である。In this reaction system, when A ₁ is a thio NAD, B ₁ is an NADH, and when A ₁ is a NAD, B ₁ is
It is necessary that _one is a thio-NADH and at least one is a thio-type coenzyme.

【００７９】A₁およびB₁の量は被検体中のＬ−カルニチ
ンの量に比較して過剰量であり、またＬ−カルニチンデ
ヒドロゲナーゼのA₁およびB₁それぞれに対するKm値に比
較しても過剰量であることが必要であり、特にＬ−カル
ニチン量の20〜10000倍モルが好ましい。[0079] A ₁ and the amount of B ₁ represents an excess compared to the amount of L- carnitine in the subject, also excess as compared to the Km value for A ₁ and B ₁ each L- carnitine dehydrogenase The amount of L-carnitine is preferably 20 to 10,000 times the molar amount of L-carnitine.

【００８０】本反応系に用いるＬ−カルニチン測定用試
薬においては、A₁およびB₁の濃度は0.02〜100mM 、特に
0.05〜30mMが好ましく、Ｌ−カルニチンデヒドロゲナー
ゼの濃度は５〜200U／ml、特に10〜150U／mlが好ましい
が、これ以上の量を用いることもできる。[0080] In the L- carnitine measuring reagent used in the present reaction system, the A ₁ and B ₁ concentrations 0.02～100MM, especially
The concentration is preferably 0.05 to 30 mM, and the concentration of L-carnitine dehydrogenase is preferably 5 to 200 U / ml, particularly preferably 10 to 150 U / ml, but higher amounts can be used.

【００８１】かかるＬ−カルニチン測定用試薬の調製に
あたって、使用できるＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼ
に関しては、例えば補酵素としてNAD類（好ましくはNAD
またはチオNAD）を用いて、基質となるＬ−カルニチン
に対する反応性を有するものであればよく、これらの補
酵素と基質とを用いることにより確認できるものであ
る。例えば、アルカリゲネス エスピー(Alcaligenes s
p.）No.981の生産するＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼ
（東洋醸造製）は、Ｌ−カルニチンを基質とした場合、
100mM トリス塩酸緩衝液（pH9.0)においては、補酵素に
チオNADを用いた時のNADを用いた時に対する相対活性は
15％程度である。また、同様の条件下でＬ−カルニチ
ン、NAD、チオNADに対するKm値はそれぞれ9.3mM 、0.14
mM、0.40mMである。In preparing such an L-carnitine measuring reagent, usable L-carnitine dehydrogenase is, for example, NADs (preferably NAD) as a coenzyme.
Or thio-NAD) as long as it has reactivity to L-carnitine as a substrate, and can be confirmed by using these coenzymes and the substrate. For example, Alcaligenes sp.
p.) L-carnitine dehydrogenase produced by No. 981 (manufactured by Toyo Brewery) uses L-carnitine as a substrate,
In 100 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0), the relative activity when using thio-NAD as the coenzyme was compared with that when using NAD.
It is about 15%. Under the same conditions, the Km values for L-carnitine, NAD and thio NAD were 9.3 mM and 0.14, respectively.
mM, 0.40 mM.

【００８２】反応液組成については、使用するＬ−カル
ニチンデヒドロゲナーゼの各補酵素間の相対活性等を考
慮して２種の補酵素を適宜選択し、その後正反応と逆反
応の至適pHの間のpH条件を適宜調整して、正反応／逆反
応の反応速度比が１に近づくようにpH条件を設定すれば
よい。As for the composition of the reaction solution, two coenzymes are appropriately selected in consideration of the relative activities between the respective coenzymes of L-carnitine dehydrogenase to be used, and then the coenzyme is selected between the optimal pH for the forward reaction and the reverse reaction. PH conditions may be appropriately adjusted, and the pH conditions may be set such that the reaction rate ratio of the forward reaction / reverse reaction approaches 1.

【００８３】尚、本発明においてＬ−カルニチンデヒド
ロゲナーゼは単独でも、適宜２種以上を組み合わせて用
いてもよい。In the present invention, L-carnitine dehydrogenase may be used alone or in combination of two or more.

【００８４】斯くして、調製された本反応系のＬ−カル
ニチン測定用試薬によって反応液中のＬ−カルニチン量
を測定するには、例えば上記成分１）〜３）を含有する
試薬に反応液0.001〜0.5mlを加え、約37℃の温度にて反
応させ、反応開始一定時間後の２点間の数分ないし数十
分間、例えば３分後と４分後の１分間または３分後と８
分後の５分間における生成されたA₂の量または消費され
たB₁の量を、それぞれの吸収波長に基づく吸光度の変化
によって測定すればよい。また同様に、反応開始後、一
定時間後（例えば10分後）に酵素反応を停止させ、しか
る後に吸光度の変化を測定してもよい。例えば、A₂がチ
オNADH、B₁がNADHの場合、A₂の生成を400nmの吸光度
〔分子吸光係数：11200M^-1cm^-1(Methods in Enzymology
vol. 55 P.261 (1979) 〕の増加により測定するか、あ
るいはB₁の消費を340nmの吸光度〔分子吸光係数：6220M
^-1cm^-1〕の減少により測定し、既知濃度のＬ−カルニチ
ンを用いて測定したときの値と比較すれば、被検液中の
Ｌ−カルニチンをリアルタイムで算出することができ
る。In order to measure the amount of L-carnitine in the reaction solution using the L-carnitine measurement reagent of the present reaction system prepared as described above, for example, the reaction solution containing the above components 1) to 3) is added to the reaction solution. Add 0.001 to 0.5 ml and react at a temperature of about 37 ° C. for a few minutes to tens of minutes between two points after a certain time from the start of the reaction, for example, 1 minute or 3 minutes after 3 minutes and 4 minutes And 8
The amount or quantity of consumed B ₁ of A ₂ generated in 5 minutes after minute, may be measured by the change in absorbance based on the respective absorption wavelengths. Similarly, the enzyme reaction may be stopped after a certain time (for example, 10 minutes) after the start of the reaction, and then the change in absorbance may be measured. For example, A ₂ is thio NADH, when B ₁ is a NADH, absorbance 400nm the production of A ₂ [molecular extinction ^{coefficient: 11200M -1 cm -1 (Methods in} Enzymology
. vol 55 P.261 (1979) or measured by increased], or 340nm absorbance consumption B ₁ [molecular extinction coefficient: 6220 M
^-1 cm ^-1 ], and comparing with a value measured using a known concentration of L-carnitine, L-carnitine in the test solution can be calculated in real time.

【００８５】また、本反応系による定量法は、反応液中
のＬ−カルニチンそのものを酵素サイクリング反応に導
くものであり、反応液中の共存物質の影響を受けにくい
ため、反応液のブランク測定を省略することができ、レ
イトアッセイによる簡便な測定を成し得る。In the quantification method using this reaction system, L-carnitine itself in the reaction solution is led to the enzyme cycling reaction, and it is hard to be affected by coexisting substances in the reaction solution. It can be omitted, and a simple measurement by a late assay can be achieved.

【００８６】尚、本反応系においてはA₂またはB₁の測定
に当り、吸光度測定の代りに他の公知酵素測定法を使用
して定量を行うこともできる。また、本発明アシルカル
ニチンエステラーゼはアセチル−Ｌ−カルニチンおよび
プロピオニル−Ｌ−カルニチンの低級アシル−Ｌ−カル
ニチンに対して活性を有するので、従来のアシルカルニ
チンエステラーゼと本発明アシルカルニチンエステラー
ゼを組み合わせて用いれば、被検液中の低級アシル−Ｌ
−カルニチンのみを測定することができる。すなわち、[0086] In this reaction system per the measurement of A ₂ or B _1, it is also possible to perform quantitative instead of absorbance measured using other known enzyme assay. In addition, the acylcarnitine esterase of the present invention has an activity on lower acyl-L-carnitine of acetyl-L-carnitine and propionyl-L-carnitine, and therefore, the conventional acylcarnitine esterase can be used in combination with the acylcarnitine esterase of the present invention. , Lower acyl-L in the test solution
-Only carnitine can be measured. That is,

【００８７】（ａ）アセチル−Ｌ−カルニチンおよびプ
ロピオニル−Ｌ−カルニチンを基質とせず、中鎖乃至長
鎖アシル−Ｌ−カルニチンに基質特異性を有し、当該中
鎖乃至長鎖アシル−Ｌ−カルニチンの１モルと水分子の
１モルから１モルの脂肪酸と１モルのＬ−カルニチンを
生成する反応を触媒するアシルカルニチンエステラーゼ
（以下、長鎖アシルカルニチンエステラーゼと略す）を
被検液に作用せしめて生成した脂肪酸または／およびＬ
−カルニチンを定量する工程、および(A) A medium- to long-chain acyl-L-carnitine which does not use acetyl-L-carnitine or propionyl-L-carnitine as a substrate and has substrate specificity, An acylcarnitine esterase (hereinafter abbreviated as long-chain acylcarnitine esterase), which catalyzes a reaction for producing 1 mol of carnitine, 1 mol of fatty acid and 1 mol of L-carnitine from 1 mol of water molecule to 1 mol of water, is applied to the test solution. Fatty acids and / or L
Quantifying carnitine; and

【００８８】（ｂ）本発明アシルカルニチンエステラー
ゼを被検液に作用せしめ、次いで生成した脂肪酸または
／およびＬ−カルニチンを定量する工程を行い、（ｃ）
次いで、工程（ａ）と工程（ｂ）との定量値の差異を測
定することにより被検液中の低級アシル−Ｌ−カルニチ
ンが測定できる。(B) subjecting the acylcarnitine esterase of the present invention to a test solution, and then performing a step of quantifying the produced fatty acid and / or L-carnitine;
Next, the lower acyl-L-carnitine in the test solution can be measured by measuring the difference between the quantitative values of the step (a) and the step (b).

【００８９】本測定法の工程（ａ）で用いられる長鎖ア
シルカルニチンエステラーゼとしては、特に限定されな
いが、ラット由来のアシルカルニチンエステラーゼ等が
挙げられる。本測定法の工程（ａ）および工程（ｂ）
は、いずれも前記と同様にして行われる。工程（ａ）と
工程（ｂ）の定量値の差異を求めれば、当該差異が被検
液中の低級アシル−Ｌ−カルニチン量である。The long-chain acylcarnitine esterase used in step (a) of this assay is not particularly limited, and includes rat-derived acylcarnitine esterase and the like. Step (a) and step (b) of the measurement method
Are performed in the same manner as described above. If the difference between the quantitative values of the step (a) and the step (b) is determined, the difference is the amount of lower acyl-L-carnitine in the test solution.

【００９０】また、（α）被検液に長鎖アシルカルニチ
ンエステラーゼを作用せしめ、生成したＬ−カルニチン
にＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼおよびA₁（但しA₁は
チオNAD類またはNAD類を示す）を作用せしめてA₁をA
₂（A₂はA₁の還元型生成物を示す）となし、次いで生成
したA₂を分解せしめ、（β）得られた反応液に本発明ア
シルカルニチンエステラーゼを作用せしめ、次いで当該
反応によって生成したＬ−カルニチンを定量することに
よっても被検液中の低級アシル−Ｌ−カルニチンを測定
することができる。(Α) Long-chain acylcarnitine esterase is allowed to act on the test solution, and L-carnitine dehydrogenase and A ₁ (where A ₁ represents thio NADs or NADs) act on the produced L-carnitine. At least A ₁ to A
₂ (A ₂ represents a reduced product of A ₁ ), then decompose the produced A ₂ , (β) react the resulting reaction solution with the acylcarnitine esterase of the present invention, and then produce The lower acyl-L-carnitine in the test solution can also be measured by quantifying the L-carnitine thus obtained.

【００９１】本測定法の工程（α）の反応は、前述と同
様にして行うことができる。また工程（α）におけるA₂
の分解は、例えば酸性条件下37℃程度の加温ないしそれ
以上の加熱により行われ、これにより前処理すべきＬ−
カルニチン相当量を分解消去できる。かかるA₂の分解に
より、反応液中には、被検液中の遊離Ｌ−カルニチンお
よび中鎖乃至長鎖アシル−Ｌ−カルニチン由来のＬ−カ
ルニチンが存在せず、低級アシル−Ｌ−カルニチンのみ
が残存している。従って、当該反応液に工程（β）を行
えば、被検液中の低級アシル−Ｌ−カルニチンが測定で
きる。なお、工程（β）の反応は前記と同様に行うこと
ができる。The reaction in step (α) of the present measuring method can be carried out in the same manner as described above. In addition, A ₂ in step (α)
Is decomposed, for example, by heating at about 37 ° C. under acidic conditions or by heating at a higher temperature.
The carnitine equivalent can be decomposed and eliminated. The decomposition of such A _2, in the reaction solution, there is no free L- carnitine and medium chain or L- carnitine from long chain acyl -L- carnitine in a test fluid, a lower acyl -L- carnitine only Remains. Therefore, if step (β) is performed on the reaction solution, lower acyl-L-carnitine in the test solution can be measured. The reaction in step (β) can be performed in the same manner as described above.

【００９２】[0092]

【発明の効果】上記のアシルカルニチンエステラーゼは
ラット肝臓由来のものと比べて少なくともアセチル−Ｌ
−カルニチン及びプロピオニル−Ｌ−カルニチンからな
る群より選ばれた低級アシル−Ｌ−カルニチンに、基質
特異性を有するという特徴を有し、かつ種々のアシル−
Ｌ−カルニチンに対するKm値も低い上に安定性にも優れ
ているので、これを用いる優れたアシルカルニチン測定
法を提供することができた。The above acylcarnitine esterase is at least acetyl-L as compared with that derived from rat liver.
-A lower acyl-L-carnitine selected from the group consisting of carnitine and propionyl-L-carnitine has a feature of having substrate specificity, and various acyl-
Since the Km value for L-carnitine is low and the stability is also excellent, it was possible to provide an excellent method for measuring acylcarnitine using the same.

【００９３】[0093]

【実施例】次に、参考例および実施例を挙げて本発明を
具体的に説明するが、これにより本発明を限定するもの
ではない。EXAMPLES Next, the present invention will be described specifically with reference to Reference Examples and Examples, but the present invention is not limited thereto.

【００９４】参考例１ アルカリゲネス エスピーNo.981の培養 KH₂PO₄ 0.2
％、K₂PO₄ 0.4％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、FeSO₄・7H₂O
0.002％、MnSO₄・nH₂O 0.002％、酵母エキス（極東製薬
社製)0.1％を含む液体培地（pH7.0)100mlを500ml容三角
フラスコに分注し、120℃、20分間加熱滅菌した後に、
濾過滅菌しておいた10％オクタノイル−DL−カルニチン
（シグマ社製）を５ml無菌的に添加し、これに、アルカ
リゲネスエスピーNo.981の１白金耳を接種し28℃、120
r.p.m.の振とう培養器で72時間培養した。三角フラスコ
５本で培養し、培養物470mlを得た。Reference Example 1 Culture of Alkaligenes SP No. 981 KH ₂ PO ₄ 0.2
_{%, K 2 PO 4 0.4%} , MgSO 4 · 7H 2 O 0.05%, FeSO 4 · 7H 2 O
100 ml of a liquid medium (pH 7.0) containing 0.002%, 0.002% of MnSO ₄ .nH ₂ O, and 0.1% of yeast extract (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.) was dispensed into a 500 ml Erlenmeyer flask, and sterilized by heating at 120 ° C. for 20 minutes. later,
5 ml of 10% octanoyl-DL-carnitine (manufactured by Sigma), which was sterilized by filtration, was aseptically added thereto, and a platinum loop of Alkaline Sp.
The cells were cultured in a shaking incubator at rpm for 72 hours. The cells were cultured in five Erlenmeyer flasks to obtain 470 ml of the culture.

【００９５】参考例２ アシルカルニチンエステラーゼの分離精製 470ml分の培養液を遠心分離して、集菌し、100mMトリス
緩衝液（pH8.0)50mlに懸濁した。これを超音波破砕器
（クボタ社製）を用いてホモジネイトした後に15,000r.
p.m.で10分間遠心分離して上清45ml（0.3U／ml）を得
た。得られた粗酵素液を60℃、30分間加熱処理した後に
15,000r.p.m.で上清44ml（0.3U／ml）を得た。得られた
酵素液を50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0)で緩衝化したDE
AE−セファロース CL-6B（ファルマシア社製）20mlのカ
ラムに通し、0.1M KClを含んだ50mMトリス緩衝液（pH8.
0)100mlを流した後に、0.25M KClを含んだ50mMトリス塩
酸緩衝液（pH8.0)で溶出し、酵素液25ml(0.47U／ml）を
得た。得られた酵素液を50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0)
５ｌに対して一晩、５℃で透析し酵素液28ml(0.41U／m
l、回収率85％) を得た。次いで、その20mlを凍結乾燥
して粉末80mg（0.1U／mg）を得た。Reference Example 2 Separation and Purification of Acylcarnitine Esterase A 470 ml culture was centrifuged to collect cells, and suspended in 50 ml of 100 mM Tris buffer (pH 8.0). This was homogenized using an ultrasonic crusher (manufactured by Kubota Corporation) and then 15,000 r.
After centrifugation at pm for 10 minutes, 45 ml (0.3 U / ml) of the supernatant was obtained. After heating the resulting crude enzyme solution at 60 ° C for 30 minutes
44 ml (0.3 U / ml) of the supernatant was obtained at 15,000 rpm. DE obtained by buffering the obtained enzyme solution with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0)
AE-Sepharose CL-6B (manufactured by Pharmacia) is passed through a 20 ml column, and 50 mM Tris buffer containing 0.1 M KCl (pH 8.
0) After flowing 100 ml, elution was carried out with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.25 M KCl to obtain 25 ml (0.47 U / ml) of an enzyme solution. The obtained enzyme solution was added to a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0).
After dialysis against 5 l overnight at 5 ° C., 28 ml of enzyme solution (0.41 U / m
l, 85% recovery). Then, 20 ml thereof was freeze-dried to obtain 80 mg (0.1 U / mg) of powder.

【００９６】参考例３ Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ生産のためのアルカリ
ゲネス エスピーNo.981の培養 DL−塩化カルニチン（シグマ社製）３％、KH₂PO₄ 0.2
％、K₂HPO₄ 0.4％、MgSO ₄・7H₂O 0.05％、FeSO₄・7H₂O
0.002％、MnSO₄・nH₂O 0.001％を含む液体培地（pH7.0)
100mlを500ml容三角フラスコに分注し、120℃で20分間
加熱滅菌した後、これにアルカリゲネス エスピーNo.9
81の１白金耳を接種し、28℃で120r.p.m.の振とう培養
器で40時間培養して種母95ml（酵素活性1.2U／ml）を得
た。Reference Example 3 Alkali for L-carnitine dehydrogenase production
Culture of Genes SP No. 981 DL-carnitine chloride (Sigma) 3%, KH_TwoPO_Four 0.2
%, K_TwoHPO_Four 0.4%, MgSO _Four・ 7H_TwoO 0.05%, FeSO_Four・ 7H_TwoO
0.002%, MnSO_Four・ NH_TwoLiquid medium containing O 0.001% (pH 7.0)
Dispense 100ml into a 500ml Erlenmeyer flask, 120 ° C for 20 minutes
After heat sterilization, add this to Alkaligenes SP No. 9
Inoculate one platinum loop of 81 and shake culture at 28 ° C with 120 rpm.
Incubate for 40 hours in an incubator to obtain 95 ml of seed seed (enzyme activity 1.2 U / ml)
Was.

【００９７】一方、DL−塩化カルニチン（シグマ社製）
３％、酵母エキス（極東製薬社製）0.1％、K₂HPO₄ 0.05
4％、KH₂PO₄ 0.746％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、CaCl₂・2H
₂O 0.002％、FeSO₄・7H₂O 0.002％、MnSO₄・nH₂O 0.002
％およびディスフォームCB442(日本油脂社製）１ml／ｌ
を含む液体培地（pH7.0)20ｌを、30ｌ容ジャーファーメ
ンターに仕込み、加熱滅菌した後、これに前記で得た種
母90mlを移植し、培養温度28℃、通気量20ｌ／分、内圧
0.4kg／cm² 、攪拌速度200r.p.m. 、培養時間27時間の
培養条件で通気攪拌培養し、培養物19ｌ（酵素活性3.0U
／ml）を得た。On the other hand, DL-carnitine chloride (manufactured by Sigma)
3%, yeast extract (manufactured by Far East Pharmaceutical Co., Ltd.) 0.1%, K ₂ HPO ₄ 0.05
_{4%, KH 2 PO 4 0.746} %, MgSO 4 · 7H 2 O 0.05%, CaCl 2 · 2H
_{2 O 0.002%, FeSO 4 ·} 7H 2 O 0.002%, MnSO 4 · nH 2 O 0.002
% And Deform CB442 (manufactured by NOF Corporation) 1 ml / l
20 l of a liquid medium (pH 7.0) containing the above was charged into a 30 l jar fermenter, and sterilized by heating. Then, 90 ml of the seed mother obtained above was transplanted into the jar fermenter. The culture temperature was 28 ° C., the aeration rate was 20 l / min, and the internal pressure was
Culture under aeration and agitation under a culture condition of 0.4 kg / cm ² , a stirring speed of 200 rpm and a culturing time of 27 hours, and a culture of 19 l (enzyme activity 3.0 U
/ Ml).

【００９８】参考例４ Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼの分離精製 参考例３で得た培養物19ｌを遠心分離で集菌し、これに
0.1％リゾチームおよび15mMエチレンジアミン四酢酸ジ
ナトリウム塩（EDTA・2Na)を含む40mMトリス塩酸緩衝液
（pH8.0)５ｌを加え、37℃で１時間可溶化処理した。処
理液を遠心分離して沈澱物を除去し、上清4500ml（比活
性10.3U／ml）を得た。この上清に硫安1100ｇを溶解
し、生じた沈澱物を遠心分離して除去し、得られた上清
に再び硫安700gを溶解した。この処理液を遠心分離して
得た沈澱物40mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0)500mlで溶解
した溶液（比活性84.1U／ml）を40mMトリス塩酸緩衝液
（pH8.0)10ｌに対して透析した。透析して得た酵素液を
40mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0)で緩衝化したDEAE−セフ
ァロースCL-6B(ファルマシア社製)200mlのカラムに通
し、0.1M KClを含む40mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0)１ｌ
を流した後、次いで0.3M KClを含む40mMトリス塩酸緩衝
液（pH8.0)で溶出し、酵素液300ml（比活性120.5U／m
l）を得た。得られた酵素液を40mMトリス塩酸緩衝液（p
H8.0)10ｌに対して透析した。透析して得た酵素液を40m
Mトリス塩酸緩衝液で緩衝化したハイドロキシルアパタ
イト(KOKEN社製)100mlのカラムに通し、40mMトリス塩酸
緩衝液（pH8.0)200mlを流した後、２mMリン酸緩衝液（p
H7.0)100mlで溶出し、酵素液100ml（比活性331U／ml）
を得た。得られた酵素液を20mMリン酸緩衝液（pH7.5)５
ｌに対して透析し、酵素液95ml（比活性331U／ml、回収
率67.8％）を得た。Reference Example 4 Separation and Purification of L-Carnitine Dehydrogenase 19 l of the culture obtained in Reference Example 3 was collected by centrifugation, and
5 l of 40 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.1% lysozyme and 15 mM disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA · 2Na) was added, and the mixture was solubilized at 37 ° C. for 1 hour. The treated solution was centrifuged to remove the precipitate, thereby obtaining 4500 ml of the supernatant (specific activity: 10.3 U / ml). 1100 g of ammonium sulfate was dissolved in the supernatant, the resulting precipitate was removed by centrifugation, and 700 g of ammonium sulfate was again dissolved in the obtained supernatant. A solution (specific activity: 84.1 U / ml) of the precipitate obtained by centrifuging the treated solution dissolved in 500 ml of 40 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) was added to 10 l of 40 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). Dialyzed. Enzyme solution obtained by dialysis
Pass through a 200 ml column of DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia) buffered with 40 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), and 1 l of 40 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.1 M KCl.
Followed by elution with 40 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.3 M KCl, and 300 ml of enzyme solution (specific activity 120.5 U / m
l) got. The obtained enzyme solution was added to a 40 mM Tris-HCl buffer (p
H8.0) dialyzed against 10 l. 40m of enzyme solution obtained by dialysis
After passing through a 100 ml column of hydroxyapatite (manufactured by KOKEN) buffered with M Tris-HCl buffer and flowing 200 ml of 40 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), the solution was treated with 2 mM phosphate buffer (p
H7.0) Elution with 100 ml, enzyme solution 100 ml (specific activity 331 U / ml)
I got The obtained enzyme solution was added to a 20 mM phosphate buffer (pH 7.5) 5
This was dialyzed to obtain 95 ml of an enzyme solution (specific activity: 331 U / ml, recovery: 67.8%).

【００９９】本精製Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ中
のNADHオキシダーゼ活性は0.0001U／ml以下であった。
以上の如くして得られたＬ−カルニチンデヒドロゲナー
ゼの性状は以下の通りである。The NADH oxidase activity in the purified L-carnitine dehydrogenase was 0.0001 U / ml or less.
The properties of the L-carnitine dehydrogenase obtained as described above are as follows.

【０１００】（１）酵素作用 下記式に示すように、少なくともＬ−カルニチンおよび
NADから３−デヒドロカルニチンおよびNADHを生成する
反応を触媒する。(1) Enzyme action As shown in the following formula, at least L-carnitine and
It catalyzes the reaction that produces 3-dehydrocarnitine and NADH from NAD.

【０１０１】[0101]

【化５】 Embedded image

【０１０２】[0102]

【表１５】（２）基質特異性 Ｌ−カルニチン 100％ コリン 0 グリシンベタイン 0 グルコース 0 リジン 0[Table 15] (2) Substrate specificity L-carnitine 100% choline 0 glycine betaine 0 glucose 0 lysine 0

【０１０３】（３）分子量 51000±6000 トーソー社製TSKゲルG3000SW(0.75×60cm）による値、
溶出液；0.2M NaCl含有0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0)、標
準品はオリエンタル酵母社製の次の分子量マーカーを使
用。(3) Molecular weight 51000 ± 6000 Value measured by TSK gel G3000SW (0.75 × 60 cm) manufactured by Tosoh Corporation
Eluent: 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.2 M NaCl, standard product uses the following molecular weight marker manufactured by Oriental Yeast Co.

【０１０４】[0104]

【表１６】 M.W. 12,400 シトクロムC M.W. 32,000 アデニレイトキナーゼ M.W. 67,000 エノラーゼ M.W. 142,000 ラクテートデヒドロゲナーゼ M.W. 290,000 グルタメートデヒドロゲナーゼ[Table 16] M.W. 12,400 cytochrome C M.W. 32,000 adenylate kinase M.W. 67,000 enolase M.W. 142,000 lactate dehydrogenase M.W. 290,000 glutamate dehydrogenase

【０１０５】（４）等電点 pH5.3±0.6 キャリアアンフォライトを用いる焦点電気泳動法により
４℃、700Vの定電圧で40時間通電した後、分画し、各画
分の酵素活性を測定した。(4) Isoelectric point pH 5.3 ± 0.6 After energizing for 40 hours at 4 ° C. and a constant voltage of 700 V by a focal electrophoresis method using carrier ampholite, fractionation was performed, and enzyme activity of each fraction was measured. did.

【０１０６】（５）Km値 100mM トリス塩酸緩衝液（pH9.0)、 ５Ｕジアフォラーゼ（東洋醸造社製）、 0.025％NBT(和光純薬工業社製）、 １％ Tween80（和光純薬工業社製）、 50mM Ｌ−カルニチン(5) Km value 100 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0), 5 U Diaphorase (manufactured by Toyo Brewery), 0.025% NBT (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 1% Tween80 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) ), 50 mM L-carnitine

【０１０７】を含む反応液中でNAD⁺の濃度を変化させ
て、NAD⁺に対するKm値を測定した結果では、0.141mMと
いう値を示した。The Km value for NAD ⁺ was measured by changing the concentration of NAD ^{+ in} the reaction solution containing 0.141 mM.

【０１０８】一方、前記反応液中で50mM Ｌ−カルニチ
ンの代わりに１mM NAD⁺を添加し、Ｌ−カルニチンの濃
度を変化させてＬ−カルニチンに対するKm値を測定した
結果では、9.3mMという値を示した。On the other hand, when the Km value for L-carnitine was measured by adding 1 mM NAD ⁺ instead of 50 mM L-carnitine in the reaction solution and changing the concentration of L-carnitine, the value of 9.3 mM was found to be 9.3 mM. Indicated.

【０１０９】（６）熱安定性 本酵素液(1.00U／ml）を20mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0)
で調製し、１時間の加熱処理後、その残存活性を後記の
酵素活性測定法に従って測定した結果、酵素活性は少な
くとも45℃までは安定であった。(6) Thermostability The enzyme solution (1.00 U / ml) was added to a 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0).
After the heat treatment for 1 hour, the residual activity was measured according to the enzyme activity measurement method described later. As a result, the enzyme activity was stable at least up to 45 ° C.

【０１１０】（７）至適温度 100mM トリス塩酸緩衝液（pH9.0)を用い、５℃における
２週間の保存安定性を測定した。その結果、前記３株の
Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ産生公知属菌より得ら
れたＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼは、１週間後の残
存活性が53〜40％、２週間後には残存活性が45％以下に
なっている。特にシュードモナス アエルギノーサIFO
13130 由来の酵素は21％と特に安定性が悪いものであっ
た。これに対し、本発明のＬ−カルニチンデヒドロゲナ
ーゼは、１週間後の残存活性が96％で、２週間後の残存
活性は82％であり、Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ産
生公知属菌由来の酵素より格段に安定性の良い性質を有
している。また、この保存安定性試験において0.05mM
のNAD⁺を共存させた時には、その残存活性が１週間後で
は99.7％、２週間後では95.1％とより安定性が良くなっ
ており、NAD⁺の安定性効果があることが分かった。(7) Optimum temperature The storage stability at 5 ° C. for 2 weeks was measured using 100 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0). As a result, L-carnitine dehydrogenase obtained from the three strains known to produce L-carnitine dehydrogenase has a residual activity of 53 to 40% after one week and a residual activity of 45% or less after two weeks. I have. Especially Pseudomonas aeruginosa IFO
The enzyme derived from 13130 had a particularly low stability of 21%. In contrast, the L-carnitine dehydrogenase of the present invention has a residual activity after one week of 96% and a residual activity after two weeks of 82%, which is much higher than the enzyme derived from a known genus of L-carnitine dehydrogenase. It has good stability properties. In this storage stability test, 0.05 mM
When NAD ⁺ was allowed to coexist, the residual activity was 99.7% after one week and 95.1% after two weeks, indicating a better stability, indicating that NAD ^{+ had} a stability effect.

【０１１１】（８）Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼの
酵素活性測定法 １）反応液組成 50mMトリス塩酸緩衝液（pH9.0)、 １mM NAD⁺ 、 ５Ｕジアフォラーゼ（東洋醸造社製）、 0.025％NBT (和光純薬工業社製）、 100mM 塩化カリウム、 0.5％ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエー
ト（和光純薬工業社製）、 100mM Ｌ−カルニチン（シグマ社製）、(8) Method for measuring enzyme activity of L-carnitine dehydrogenase 1) Composition of reaction solution 50 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0), 1 mM NAD ⁺ , 5 U diaphorase (manufactured by Toyo Brewery), 0.025% NBT (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mM potassium chloride, 0.5% polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 100 mM L-carnitine (manufactured by Sigma),

【０１１２】２）酵素活性測定 上記の反応液１mlを小試験管に入れ、37℃で５分間イン
キュベートした後に、適当に希釈した酵素液0.02mlを添
加して攪拌し、反応を開始する。正確に10分間反応の後
に、0.1N 塩酸2.0mlを添加して攪拌し、反応を停止し
て、A_550nmを測定して吸光度A₁を求める。上記反応液よ
りＬ−カルニチンを除いた反応液を用いて同様の測定を
行い、その吸光度A₀を求める。2) Enzyme activity measurement 1 ml of the above reaction solution was placed in a small test tube, and incubated at 37 ° C. for 5 minutes. Then, 0.02 ml of an appropriately diluted enzyme solution was added and stirred to start the reaction. After exactly 10 minutes of reaction, and stirred with the addition of 0.1N hydrochloric acid 2.0 ml, to stop the reaction, obtaining the absorbance A ₁ by measuring A _{550 nm.} Perform similar measurements using the reaction solution excluding the L- carnitine from the reaction liquid, determined the absorbance A _0.

【０１１３】[0113]

【数３】 (Equation 3)

【０１１４】実施例１ 本発明アシルカルニチンエステラーゼを用いたオクタノ
イル−Ｌ−カルニチンの加水分解と水酸化カリウム溶液
を用いた加水分解の比較。0.1mM 、0.2mM 、0.3mM 、0.
4mM 、0.5mM になるように50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.
0)でオクタノイル−Ｌ−カルニチンを調製し、それぞれ
１mlを小試験管に分注し、37℃、５分間インキュベイト
した後に実施例２の酵素液(0.41U／ml）を0.1 ml添加し
15分間インキュベイトした後に予め１mlを小試験管で37
℃にインキュベイトしておいたＬ−カルニチンの測定法
A の反応液に0.05mlずつ添加し２分間インキュベイトし
た後に0.1N塩酸溶液２mlを添加し、A_550nmを測定した。
また同様のオクタノイル−Ｌ−カルニチン溶液１mlに10
N の水酸化カリウム１mlを添加し、37℃、２時間インキ
ュベイトした後に、10N の塩酸１mlを添加して中和し、
その0.15mlをＬ−カルニチンの測定法A の反応液１mlに
添加し、同様にしてA_{5 50nm}を測定した。その結果を図５
に示した。本酵素によって、オクタノイル−Ｌ−カルニ
チンが完全に加水分解されているのがわかる。Example 1 Comparison of hydrolysis of octanoyl-L-carnitine using the acylcarnitine esterase of the present invention and hydrolysis using a potassium hydroxide solution. 0.1mM, 0.2mM, 0.3mM, 0.
50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.
In step (0), octanoyl-L-carnitine was prepared, 1 ml of each was dispensed into a small test tube, and incubated at 37 ° C. for 5 minutes. Then, 0.1 ml of the enzyme solution of Example 2 (0.41 U / ml) was added.
After incubating for 15 minutes, add 1 ml in a small tube beforehand.
Of L-carnitine incubated at ℃
After adding 0.05 ml each to the reaction solution of A and incubating for 2 minutes, 2 ml of a 0.1N hydrochloric acid solution was added, and A _{550 nm} was measured.
Also, add 10 ml to the same octanoyl-L-carnitine solution.
After adding 1 ml of N 2 potassium hydroxide and incubating for 2 hours at 37 ° C., 1 ml of 10N hydrochloric acid was added for neutralization.
Was added to the 0.15ml reaction solution 1ml of measurement A of L- carnitine was measured A _{5 50 nm} in the same manner. The result is shown in FIG.
It was shown to. It can be seen that octanoyl-L-carnitine was completely hydrolyzed by this enzyme.

【０１１５】[0115]

【表１７】 図５中 本発明アシルカルニチンエステラーゼを用いた値 −○− 水酸化カリウムを用いた値 −△− 理論値 −●−In Table 5, values using the acylcarnitine esterase of the present invention − ○ − values using potassium hydroxide − △ − theoretical values − ● −

【０１１６】実施例２ 血清中のアシル−Ｌ−カルニチンの測定 まず健常人男子５名の血清の遊離のＬ−カルニチンをＬ
−カルニチンの測定法Aを用いて測定した。同様の血清
１mlに10Nの水酸化カリウム１mlを添加して、37℃、２
時間インキュベイトした後に10Nの塩酸１mlを添加して
中和し、これを用いて総カルニチン量を測定した。また
別に血清１mlに本発明アシルカルニチンエステラーゼ１
mg（0.1U／mg）を添加し37℃、15分間インキュベイトし
た後に、これを用いて総カルニチン量を測定した。これ
らの結果を表１８に示した。本発明酵素を用いること
で、高濃度の水酸化カリウムを使用したのと同様にアシ
ル−Ｌ−カルニチンが加水分解されているのがわかる。Example 2 Measurement of Acyl-L-Carnitine in Serum First, free L-carnitine in serum of 5 healthy males was converted to L
-Measured using Carnitine measurement method A. Add 1 ml of 10N potassium hydroxide to 1 ml of the same serum, and add
After incubating for 1 hour, 1 ml of 10N hydrochloric acid was added for neutralization, and the total amount of carnitine was measured using this. Separately, 1 ml of serum contains the acylcarnitine esterase 1 of the present invention.
mg (0.1 U / mg) was added and the mixture was incubated at 37 ° C. for 15 minutes, and then used to measure the total carnitine amount. Table 18 shows the results. It can be seen that the use of the enzyme of the present invention hydrolyzed acyl-L-carnitine in the same manner as when potassium hydroxide was used at a high concentration.

【０１１７】[0117]

【表１８】 [Table 18]

【０１１８】参考例５ ラット肝臓からのアシルカルニチンエステラーゼの精製 アルカリゲネス属細菌由来の本発明アシルカルニチンエ
ステラーゼと比較するために、S. Mahadevan & F. Saue
r らの方法〔J. Biol. Chem., 244 No.16, 4448-4453
(1969 ）〕によりラットの肝臓より酵素の精製を行っ
た。50ｇの肝臓からホモジネイト、DEAE−セルロース(W
hatman DE-52)、セファデックスG-200(ファルマシア社
製）を用いて精製し、凍結乾燥品101.6mg(0.0364U／m
g）を得た。Reference Example 5 Purification of acylcarnitine esterase from rat liver For comparison with the acylcarnitine esterase of the present invention derived from a bacterium belonging to the genus Alcaligenes, S. Mahadevan & F. Saue
r et al. (J. Biol. Chem., 244 No. 16, 4448-4453).
(1969)], the enzyme was purified from rat liver. Homogenate, DEAE-cellulose (W
hatman DE-52), purified using Sephadex G-200 (Pharmacia), and freeze-dried 101.6 mg (0.0364 U / m
g) was obtained.

【０１１９】参考例６ 参考例５の酵素を用いてアセチル−Ｌ−カルニチン、プ
ロピオニル−Ｌ−カルニチン、オクタノイル−Ｌ−カル
ニチン、デカノイル−Ｌ−カルニチン、パルミトイル−
Ｌ−カルニチンに対する相対活性比とKm値を測定した結
果を表１９に示した。アセチル−Ｌ−カルニチンおよび
プロピオニル−Ｌ−カルニチンの低級アシル−Ｌ−カル
ニチンには活性を示さず、他の中鎖乃至長鎖アシル−Ｌ
−カルニチンに対して作用し、そのKm値はすべて文献通
りに10^-3Ｍ台の大きな値を示した。Reference Example 6 Using the enzyme of Reference Example 5, acetyl-L-carnitine, propionyl-L-carnitine, octanoyl-L-carnitine, decanoyl-L-carnitine, palmitoyl-
Table 19 shows the results of the measurement of the relative activity ratio and the Km value for L-carnitine. It has no activity on the lower acyl-L-carnitine of acetyl-L-carnitine and propionyl-L-carnitine.
-It acts on carnitine, and all its Km values show large values of the order of 10 ^-3 M as described in the literature.

【０１２０】[0120]

【表１９】 [Table 19]

【０１２１】実施例３ 参考例５の酵素を用いて熱安定性の検討を行った。100m
M トリス塩酸緩衝液（pH8.0)を用いて0.1U／mlに調製
し、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃で30分間加熱
処理をした後の残存活性を測定した結果は図６に示した
通りであって、50℃ですでに61％まで活性は低下してい
る。Example 3 The heat stability was examined using the enzyme of Reference Example 5. 100m
M Tris-HCl buffer (pH 8.0) was adjusted to 0.1 U / ml, and the remaining activity after heat treatment at 45 ° C, 50 ° C, 55 ° C, 60 ° C, 65 ° C, and 70 ° C for 30 minutes was measured. The measured results are as shown in FIG. 6, and the activity has already been reduced to 61% at 50 ° C.

【０１２２】[0122]

【表２０】 図６中 ラット肝臓由来 −●− 本発明酵素 −○−[Table 20] In Fig. 6, derived from rat liver---enzyme of the present invention--

【０１２３】実施例４ 参考例２の本発明酵素と参考例５のラット肝臓由来の酵
素の添加量を変えて0.02mMのオクタノイル−Ｌ−カルニ
チンを含んだ100mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0)１mlを37
℃、15分間の反応で加水分解したときの生成されるＬ−
カルニチン量を測定した結果は図７に示した通りで本発
明酵素は0.01U／mlでほぼ反応は完了しているが、ラッ
ト肝臓由来の酵素は0.6U／mlでも反応は完了していな
い。Example 4 A 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.02 mM octanoyl-L-carnitine was prepared by changing the amounts of the enzyme of the present invention of Reference Example 2 and the enzyme derived from rat liver of Reference Example 5. 1 ml to 37
L- formed when hydrolyzed by a reaction at 15 ° C for 15 minutes.
The results of measuring the amount of carnitine are shown in FIG. 7, and the enzyme of the present invention was almost completely reacted at 0.01 U / ml, whereas the enzyme derived from rat liver was not completely reacted at 0.6 U / ml.

【０１２４】実施例５ 本発明酵素とラットの肝臓より精製した酵素を用いてア
シル−Ｌ−カルニチンの分別定量を試みた。アセチル
−、プロピオニル−、ヘキサノイル−、オクタノイル
−、デカノイル−、ラウロイル−、ミリストイル−、パ
ルミトイル−、ステアロイル−の各アシル−Ｌ−カルニ
チン１mMを含有する 100mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0)
１mlに本発明酵素を0.1U（１mg）添加し、37℃、30分間
インキュベイトした。また別にラットの肝臓より精製し
た酵素を1U（27.5mg）添加し37℃、30分間インキュベイ
トした。それぞれの反応液0.01mlを予め37℃、５分間イ
ンキュベイトしておいたＬ−カルニチンの測定法A の反
応液１mlに添加し37℃、２分間インキュベイトの後に0.
1N塩酸２mlを添加し、A_550nmを測定し生成されたＬ−カ
ルニチンを測定した。次にこのときラットの肝臓の酵素
で処理した反応液に続けて本発明酵素を0.1U添加し37
℃、30分間インキュベイトした後にその反応液0.01mlを
用いて前述と同様にしてA_550nmを測定し生成されたＬ−
カルニチンを測定した結果を表２１に示した。その結
果、本発明酵素を用いて全てのアシル−Ｌ−カルニチン
が理論量完全に加水分解されていると考えられる。ま
た、ラットの肝臓より精製した酵素を用いた結果は特異
性通りにアセチル−、プロピオニル−以外のアシル−Ｌ
−カルニチンは完全に加水分解していると考えられ、次
に本発明酵素を添加することによって残されたアセチル
−、プロピオニル−Ｌ−カルニチンが完全に加水分解さ
れていると考えられた。Example 5 Differential determination of acyl-L-carnitine was attempted using the enzyme of the present invention and an enzyme purified from rat liver. Acetyl-, propionyl-, hexanoyl-, octanoyl-, decanoyl-, lauroyl-, myristoyl-, palmitoyl-, stearoyl-acyl-L-carnitine 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 1 mM
0.1 U (1 mg) of the enzyme of the present invention was added to 1 ml, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Separately, 1 U (27.5 mg) of an enzyme purified from rat liver was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. 0.01 ml of each reaction solution was added to 1 ml of the reaction solution A for L-carnitine measurement method A previously incubated at 37 ° C. for 5 minutes, and incubated at 37 ° C. for 2 minutes.
2 ml of 1N hydrochloric acid was added, A _{550 nm} was measured, and L-carnitine produced was measured. Next, at this time, 0.1 U of the enzyme of the present invention was added following the reaction solution treated with the enzyme of rat liver,
After incubating at 30 ° C. for 30 minutes, A- _{550 nm} was measured in the same manner as described above using 0.01 ml of the reaction solution, and the L-
Table 21 shows the measurement results of carnitine. As a result, it is considered that all the acyl-L-carnitines were completely hydrolyzed in the stoichiometric amount using the enzyme of the present invention. In addition, the results obtained using the enzyme purified from rat liver show that the acyl-L other than acetyl- and propionyl-
-Carnitine was considered to be completely hydrolyzed, and acetyl-, propionyl-L-carnitine remaining after the addition of the enzyme of the present invention was considered to be completely hydrolyzed.

【０１２５】[0125]

【表２１】 [Table 21]

【０１２６】実施例６ 血清中のアシル−Ｌ−カルニチンの分別定量を本発明酵
素およびラットの肝臓の酵素を用いて試みた。健常人男
子（実施例４表中のサンプル１）の血清１mlにラットの
肝臓より精製した酵素を1U（27.5mg）添加し37℃、30分
間インキュベイトし加水分解反応液１を調製した。予め
37℃で５分間インキュベイトしておいたＬ−カルニチン
の測定法A の反応液１mlに加水分解反応液１を0.1ml添
加し37℃、５分間のインキュベイトの後にA_550nmを測定
した（A_550nm=0.121）。次に加水分解反応液１ 0.9mlに
本発明酵素0.09U(0.9mg）を添加し37℃、30分間インキ
ュベイトし加水分解反応液２を調製した。加水分解反応
液１と同様にして加水分解反応液２ 0.1mlを用いてA
_550nmを測定した（A_550nm=0.142）。この結果実験に供
した男子１の血清中のカルニチンのプロフィールは表２
２のようになると考えられる。Example 6 Differential quantification of acyl-L-carnitine in serum was attempted using the enzyme of the present invention and the enzyme of rat liver. 1 U (27.5 mg) of an enzyme purified from rat liver was added to 1 ml of serum of a healthy male (sample 1 in Table in Example 4), and the mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes to prepare a hydrolysis reaction solution 1. In advance
0.1 ml of hydrolysis reaction solution 1 was added to 1 ml of the reaction solution A for L-carnitine which had been incubated at 37 ° C. for 5 minutes, and after incubation at 37 ° C. for 5 minutes, A550 _nm was measured (A _{550 nm} = 0.121). Next, 0.09 U (0.9 mg) of the enzyme of the present invention was added to 1 0.9 ml of the hydrolysis reaction solution, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes to prepare a hydrolysis reaction solution 2. Using 0.1 ml of hydrolysis reaction solution 2 in the same manner as hydrolysis reaction solution 1
_{550 nm} was measured (A _{550 nm} = 0.142). As a result, the profile of carnitine in the serum of male 1 subjected to the experiment is shown in Table 2.
It is thought to be like 2.

【０１２７】[0127]

【表２２】 [Table 22]

【０１２８】実施例７ （反応液）Example 7 (Reaction liquid)

【０１２９】〔Ｉａ〕 20mM Tris-HCl（pH8.0) 0.2％ ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエ
ート（和光純薬工業社製）[Ia] 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.2% polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)

【０１３０】〔Ｉｂ〕 20mM Tris-HCl（pH8.0) 0.2％ ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエ
ート 0.2U／ml アシル−Ｌ−カルニチンエステラーゼ（アル
カリゲネス エスピーNo. 981;東洋醸造社製)[Ib] 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.2% polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate 0.2 U / ml acyl-L-carnitine esterase (Alkaligenes SP No. 981; manufactured by Toyo Brewery)

【０１３１】〔Ｉｃ〕 20mM Tris-HCl（pH8.0) 0.2％ ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエ
ート 1U／ml アシル−Ｌ−カルニチンエステラーゼ（ラット
肝臓由来）[Ic] 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.2% polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate 1 U / ml acyl-L-carnitine esterase (from rat liver)

【０１３２】〔II〕200mM Tris-HCl（pH9.5) 8mM チオNAD（シグマ社製） 0.2mM NADH（オリエンタル酵母社製） 370U／ml Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ（アルカリ
ゲネス エスピーNo.981; 東洋醸造社製）[II] 200 mM Tris-HCl (pH 9.5) 8 mM thio NAD (manufactured by Sigma) 0.2 mM NADH (manufactured by Oriental Yeast) 370 U / ml L-carnitine dehydrogenase (Alcaligenes SP No. 981; manufactured by Toyo Brewery) )

【０１３３】実施例６に用いたのと同じ健常人男子サン
プル１の血清25mlに予め、37℃にて予備加温してある
〔Ｉａ〕液0.5mlと〔II〕液0.5mlを加え37℃にて加温し
た。〔II〕液添加後の３分目と５分目の400nmにおける
吸光度を読み取りその差を計算した(A_(mAbs)）。同様の
操作を〔Ｉｂ〕液についても実施し、吸光度差を求めた
(B) 。血清の代わりに、それぞれ蒸留水、50μM Ｌ−カ
ルニチン標準溶液を用い〔Ｉａ〕を用いて、同様の操作
を実施し、R_B 、S を得た。以上の結果より遊離Ｌ−カ
ルニチン、総カルニチン濃度を以下の計算式により求め
た。To 25 ml of the serum of the same healthy male sample 1 used in Example 6, 0.5 ml of the [Ia] solution and 0.5 ml of the [II] solution which had been preliminarily heated at 37 ° C. were added. Heated. [II] The absorbance at 400 nm at the third and fifth minutes after the addition of the solution was read, and the difference was calculated (A _(mAbs) ). The same operation was performed for the [Ib] solution, and the absorbance difference was determined.
(B). Instead of serum, respectively distilled water, using a 50 [mu] M L-carnitine standard solution using (Ia), and performs the same operation to obtain R _B, and S. From the above results, the concentrations of free L-carnitine and total carnitine were determined by the following formula.

【０１３４】[0134]

【数４】 (Equation 4)

【０１３５】更に、アセチル−およびプロピオニル−Ｌ
−カルニチンには作用しないラット肝臓由来のアシル−
Ｌ−カルニチンエステラーゼを含む〔Ｉｃ〕液0.5mlに
前記血清25mlを添加し、37℃、30分間加温しアセチル
−、プロピオニル−Ｌ−カルニチン以外のアシル−Ｌ−
カルニチンを水解させた後、〔II〕液を0.5ml加えて37
℃に加温し、〔II〕液添加後３分目と５分目の400nmに
おける吸光度を読み取りその差を求めた(C）。アセチル
−およびプロピオニル−Ｌ−カルニチンを含まない総カ
ルニチン濃度を次式により算出した。Further, acetyl- and propionyl-L
-Acyl derived from rat liver that does not act on carnitine-
To 0.5 ml of [Ic] solution containing L-carnitine esterase, 25 ml of the above serum was added, and the mixture was heated at 37 ° C. for 30 minutes to obtain acyl-L- other than acetyl- and propionyl-L-carnitine.
After carnitine was hydrolyzed, 0.5 ml of solution (II) was added and 37
The solution was heated to 400 ° C., and the absorbance at 400 nm was read at 3 minutes and 5 minutes after the addition of the solution [II], and the difference was determined (C). The total carnitine concentration without acetyl- and propionyl-L-carnitine was calculated by the following equation.

【０１３６】[0136]

【数５】 (Equation 5)

【０１３７】それぞれの結果を下表にまとめた。この結
果、サンプル１の血清カルニチンのプロフィールは、実
施例６の結果とほぼ一致した。400nmにおける３分目と
５分目の吸光度差The results are summarized in the table below. As a result, the serum carnitine profile of Sample 1 was almost identical to the result of Example 6. Absorbance difference at 3rd and 5th minute at 400nm

【０１３８】[0138]

【表２３】 [Table 23]

【０１３９】[0139]

【表２４】 [Table 24]

【０１４０】実施例８Embodiment 8

【表２５】反応液 40mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0) 0.5％ ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエ
ート（和光純薬工業社製） ５mM NAD⁺ 50U Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ（アルカリゲネス
エスピー、No.981由来、東洋醸造社製） 0.1mM アセチル−Ｌ−カルニチン 0.1mM オクタノイル−Ｌ−カルニチン[Table 25] Reaction solution 40 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) 0.5% polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 5 mM NAD ⁺ 50 U L-carnitine dehydrogenase (Alcaligenes SP, No. 981 from Toyo Brewing Co., Ltd.) 0.1 mM acetyl-L-carnitine 0.1 mM octanoyl-L-carnitine

【０１４１】操作と結果 上記、反応液１mlを小試験管に分取し、37℃、５分間イ
ンキュベイトした後にラットの肝臓から精製したアシル
カルニチンエステラーゼを１U(27.5mg）添加し、37℃で
30分間インキュベイトした後にA_340nmを測定した(A
_340nm＝0.561)。ここに５Ｎの塩酸を0.025ml添加し、37
℃で15分間インキュベイトした後に５Ｎ水酸化カリウム
0.025mlを添加して中和しA_340nmを測定した(A_340nm＝0.
08）。この反応液に新たに500mM NAD⁺を0.01ml、5000U
／ml Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼを0.01ml、及び
本発明酵素を0.1U（１mg）添加し、37℃、30分間インキ
ュベイトした後にA_340nmを測定した（A_340nm＝0.594)。Procedure and Results 1 ml of the above reaction solution was aliquoted into a small test tube, incubated at 37 ° C. for 5 minutes, and then 1 U (27.5 mg) of acylcarnitine esterase purified from rat liver was added.
After incubating for 30 minutes, A _{340 nm} was measured (A
_{340 nm} = 0.561). 0.025 ml of 5N hydrochloric acid was added thereto, and 37
5N potassium hydroxide after incubating at 15 ° C for 15 minutes
The mixture was neutralized by adding 0.025 ml, and A _{340 nm} was measured (A _{340 nm} = 0.
08). Add 0.01 ml of 500 mM NAD ⁺ to this reaction solution, 5000 U
/ A ml L-carnitine dehydrogenase 0.01 ml, and the enzyme of the present invention 0.1 U (1 mg) was added, 37 ° C., was measured A _{340 nm} after Incubate bait 30 minutes (A _340nm = 0.594).

【０１４２】このように、まずラットの肝臓由来の酵素
を用いてオクタノイル−Ｌ−カルニチンを加水分解し、
生成されたＬ−カルニチンをＬ−カルニチンデヒドロゲ
ナーゼとNAD⁺を用いてデヒドロカルニチンとNADHに変換
した後に、生成されたNADHを塩酸を用いて酸分解して消
去した後に、新たにＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼと
NAD⁺、及び本発明酵素を添加することでアセチル−Ｌ−
カルニチンを良好に測定することができた。As described above, first, octanoyl-L-carnitine is hydrolyzed using an enzyme derived from rat liver.
After converting the produced L-carnitine to dehydrocarnitine and NADH using L-carnitine dehydrogenase and NAD ⁺ , the generated NADH is acid-decomposed using hydrochloric acid and eliminated, and then L-carnitine dehydrogenase is newly added.
By adding NAD ⁺ and the enzyme of the present invention, acetyl-L-
Carnitine was successfully measured.

【０１４３】実施例９Embodiment 9

【表２６】＜反応液組成＞ 50mM Glycine-NaOH（pH10.0) ５mM チオ-NAD（シグマ社製） 30U／ml Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ（アルカリ
ゲネス エスピーNo.981 由来、東洋醸造社製) 0.5％ ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエ
ート（和光純薬社製） 0.1M 塩化ナトリウム<Table 26><Composition of reaction solution> 50 mM Glycine-NaOH (pH 10.0) 5 mM thio-NAD (Sigma) 30 U / ml L-carnitine dehydrogenase (derived from Alkaligenes SP No. 981, manufactured by Toyo Brewery) 0.5% Poly Oxyethylene (20) sorbitan monooleate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.1 M sodium chloride

【０１４４】各々250μM のＬ−カルニチンとアセチル
−Ｌ−カルニチンの混合溶液を50mMトリス塩酸緩衝液
（pH8.0)で調製した。このものを同じく50mMトリス塩酸
緩衝液（pH8.0)で５段階に希釈したものをサンプルとし
た。これら、５種類のサンプルをそれぞれ２本の試験管
に0.5mlずつ分注し、37℃にて予備加温し、一方に実施
例２のアシルカルニチンエステラーゼ酵素液(0.41U／m
l）を0.05ml加え（酵素処理したもの）、他方には蒸留
水を0.05ml添加し（酵素処理しないもの）、37℃15分間
加温した。予め37℃にて予備加温してある上記組成の反
応液１mlの中に、酵素処理したもの（図８中−○−）、
酵素処理しないもの（図８中−●−）それぞれにつき0.
1mlずつを添加して37℃10分間加温したのち400nmにおけ
る吸光度を測定した。サンプルの代わりに50mMトリス塩
酸緩衝液（pH8.0)を用いたものをブランクとしてそれぞ
れの吸光度からブランクの吸光度を差し引いた値を図８
に示した。A mixed solution of 250 μM each of L-carnitine and acetyl-L-carnitine was prepared with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). This was similarly diluted in 5 steps with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) to obtain a sample. 0.5 ml of each of these five types of samples was dispensed into two test tubes and preliminarily heated at 37 ° C., while the enzyme solution of the acylcarnitine esterase of Example 2 (0.41 U / m
l) was added (enzyme-treated one) and 0.05 ml of distilled water (non-enzyme-treated one) was added to the other, and the mixture was heated at 37 ° C. for 15 minutes. One ml of a reaction solution having the above composition, which was preliminarily heated at 37 ° C., was treated with an enzyme (-○-in FIG. 8),
Each of those not treated with the enzyme (-in Fig. 8)
After adding 1 ml each and heating at 37 ° C. for 10 minutes, the absorbance at 400 nm was measured. FIG. 8 shows a value obtained by subtracting the absorbance of the blank from the absorbance of each sample using a blank using 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) instead of the sample.
It was shown to.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 本発明アシルカルニチンエステラーゼの至適
pHを示す図面である。FIG. 1 Optimum acylcarnitine esterase of the present invention
It is a drawing which shows pH.

【図２】 本発明アシルカルニチンエステラーゼのpH安
定性を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing the pH stability of the acylcarnitine esterase of the present invention.

【図３】 本発明アシルカルニチンエステラーゼの至適
温度を示す図面である。FIG. 3 is a drawing showing the optimum temperature of the acylcarnitine esterase of the present invention.

【図４】 本発明アシルカルニチンエステラーゼの熱安
定性を示す図面である。FIG. 4 is a drawing showing the thermostability of the acylcarnitine esterase of the present invention.

【図５】 本発明アシルカルニチンエステラーゼ（○）
及び水酸化カリウム（△）のオクタノイル−Ｌ−カルニ
チンの加水分解能を示す図面である。FIG. 5: Acylcarnitine esterase (○) of the present invention
3 is a drawing showing the hydrolytic capacity of octanoyl-L-carnitine with potassium hydroxide (△).

【図６】 ラット肝臓由来のアシルカルニチンエステラ
ーゼ（●）および本発明アシルカルニチンエステラーゼ
（○）の熱安定性を示す図面である。FIG. 6 is a drawing showing the thermostability of acylcarnitine esterase (●) derived from rat liver and the acylcarnitine esterase (○) of the present invention.

【図７】 ラット肝臓由来のアシルカルニチンエステラ
ーゼ（●）と本発明アシルカルニチンエステラーゼ
（○）のオクタノイル−Ｌ−カルニチンに対する活性を
示す図面である。FIG. 7 is a graph showing the activity of acylcarnitine esterase (●) derived from rat liver and the acylcarnitine esterase (ニ) of the present invention on octanoyl-L-carnitine.

【図８】 Ｌ−カルニチンとアセチル−Ｌ−カルニチン
の混合溶液における定量曲線を示す図面である。FIG. 8 is a drawing showing a quantitative curve in a mixed solution of L-carnitine and acetyl-L-carnitine.

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12Q 1/44 C12N 9/18 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)Continued on the front page (58) Fields surveyed (Int. Cl. ⁶ , DB name) C12Q 1/44 C12N 9/18 BIOSIS (DIALOG) WPI (DIALOG)

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 被検液に、少なくともアセチル−Ｌ−カ
ルニチンおよびプロピオニル−Ｌ−カルニチンからなる
群より選ばれた低級アシル−Ｌ−カルニチン並びに長鎖
アシル−Ｌ−カルニチンであるパルミトイル−Ｌ−カル
ニチンに基質特異性を有し、当該低級乃至長鎖アシル−
Ｌ−カルニチンの１モルと水分子の１モルから１モルの
脂肪酸と１モルのＬ−カルニチンを生成する反応を触媒
するアシルカルニチンエステラーゼを作用せしめ、次い
で生成した脂肪酸または／およびＬ−カルニチンを定量
することを特徴とする被検液中のアシル−Ｌ−カルニチ
ンの測定法。1. A test solution comprising: a lower acyl-L-carnitine selected from the group consisting of at least acetyl-L-carnitine and propionyl-L-carnitine; and palmitoyl-L-carnitine, which is a long-chain acyl-L-carnitine. Has a substrate specificity, the lower to long chain acyl-
Acylcarnitine esterase, which catalyzes the reaction to produce 1 mol of L-carnitine from 1 mol of L-carnitine and 1 mol of water molecule, and 1 mol of L-carnitine, and then quantifies the produced fatty acid and / or L-carnitine A method for measuring acyl-L-carnitine in a test solution. 【請求項２】 被検液中のアセチル−Ｌ−カルニチンお
よびプロピオニル−Ｌ−カルニチンからなる群より選ば
れた少なくとも１種の低級アシル−Ｌ−カルニチンの測
定において、 （ａ）アセチル−Ｌ−カルニチンおよびプロピオニル−
Ｌ−カルニチンを基質とせず、中鎖乃至長鎖アシル−Ｌ
−カルニチンに基質特異性を有し、当該中鎖乃至長鎖ア
シル−Ｌ−カルニチンの１モルと水分子の１モルから１
モルの脂肪酸と１モルのＬ−カルニチンを生成する反応
を触媒するアシルカルニチンエステラーゼを被検液に作
用せしめて生成した脂肪酸または／およびＬ−カルニチ
ンを定量する工程、および （ｂ）少なくともアセチル−Ｌ−カルニチンおよびプロ
ピオニル−Ｌ−カルニチンからなる群より選ばれた低級
アシル−Ｌ−カルニチン並びに長鎖アシル−Ｌ−カルニ
チンであるパルミトイル−Ｌ−カルニチンに基質特異性
を有し、当該低級乃至長鎖アシル−Ｌ−カルニチンの１
モルと水分子の１モルから１モルの脂肪酸と１モルのＬ
−カルニチンを生成する反応を触媒するアシルカルニチ
ンエステラーゼを被検液に作用せしめ、次いで生成した
脂肪酸または／およびＬ−カルニチンを定量する工程を
行い、 （ｃ）次いで、工程（ａ）と工程（ｂ）との定量値の差
異を測定することを特徴とする、被検液中のアセチル−
Ｌ−カルニチンおよびプロピオニル−Ｌ−カルニチンか
らなる群より選ばれた少なくとも１種の低級アシル−Ｌ
−カルニチンの測定法。2. Measurement of at least one kind of lower acyl-L-carnitine selected from the group consisting of acetyl-L-carnitine and propionyl-L-carnitine in a test solution, wherein (a) acetyl-L-carnitine And propionyl-
Medium- to long-chain acyl-L without using L-carnitine as a substrate
Has a substrate specificity to carnitine, from 1 mole of the medium to long chain acyl-L-carnitine and 1 mole of water molecule to 1 mole
Reacting an acylcarnitine esterase, which catalyzes a reaction to produce one mole of L-carnitine with one mole of fatty acid, on the test solution to quantitate the fatty acid and / or L-carnitine produced, and (b) at least acetyl-L -A lower acyl-L-carnitine selected from the group consisting of -carnitine and propionyl-L-carnitine, and palmitoyl-L-carnitine, which is a long-chain acyl-L-carnitine, having a substrate specificity; -1 of L-carnitine
Mole and 1 mole of water molecule to 1 mole of fatty acid and 1 mole of L
-Acting an acylcarnitine esterase, which catalyzes a reaction for producing carnitine, on the test solution, and then performing a step of quantifying the generated fatty acid and / or L-carnitine; (c) Then, steps (a) and (b) ) In the test solution, characterized by measuring the difference between the quantitative value
At least one lower acyl-L selected from the group consisting of L-carnitine and propionyl-L-carnitine
-Method for measuring carnitine. 【請求項３】 工程（ａ）に使用するアセチル−Ｌ−カ
ルニチンおよびプロピオニル−Ｌ−カルニチンを基質と
せず、中鎖乃至長鎖アシル−Ｌ−カルニチンに基質特異
性を有し、当該中鎖乃至長鎖アシル−Ｌ−カルニチンの
１モルと水分子の１モルから１モルの脂肪酸と１モルの
Ｌ−カルニチンを生成する反応を触媒するアシルカルニ
チンエステラーゼが、ラット由来のアシルカルニチンエ
ステラーゼである請求項２記載の測定法。3. The medium- to long-chain acyl-L-carnitine does not have acetyl-L-carnitine and propionyl-L-carnitine as substrates in the step (a) and has substrate specificity. An acylcarnitine esterase which catalyzes a reaction to produce 1 mol of long-chain acyl-L-carnitine, 1 mol of fatty acid and 1 mol of L-carnitine from 1 mol of water molecule to 1 mol of L-carnitine is a rat-derived acylcarnitine esterase. 2. The measuring method according to 2. 【請求項４】 生成したＬ−カルニチンの定量が、反応
液にＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ類または
チオＮＡＤ類、および必要に応じて非イオン性界面活性
剤を含有する試薬を作用せしめて、反応にて生成する還
元型ＮＡＤ類または還元型チオＮＡＤ類の量の測定であ
る請求項１または２記載の測定法。4. The amount of L-carnitine produced is determined by reacting the reaction solution with a reagent containing L-carnitine dehydrogenase, NADs or thioNADs and, if necessary, a nonionic surfactant. The method according to claim 1 or 2, wherein the amount of reduced NADs or reduced thioNADs produced in the step (a) is measured. 【請求項５】 生成した脂肪酸の定量が、液体クロマト
グラフィーまたはガスクロマトグラフィーにより行われ
るものである請求項１または請求項２記載の測定法。5. The method according to claim 1, wherein the amount of the produced fatty acid is determined by liquid chromatography or gas chromatography. 【請求項６】 被検液中のアセチル−Ｌ−カルニチンお
よびプロピオニル−Ｌ−カルニチンからなる群より選ば
れた少なくとも１種の低級アシル−Ｌ−カルニチンの測
定において、 （α）アセチル−Ｌ−カルニチンおよびプロピオニル−
Ｌ−カルニチンを基質とせず、中鎖乃至長鎖アシル−Ｌ
−カルニチンに基質特異性を有し、当該中鎖乃至長鎖ア
シル−Ｌ−カルニチンの１モルと水分子の１モルから１
モルの脂肪酸と１モルのＬ−カルニチンを生成する反応
を触媒するアシルカルニチンエステラーゼを被検液に作
用せしめ、生成したＬ−カルニチンにＬ−カルニチンデ
ヒドロゲナーゼおよびＡ_１（但しＡ_１はチオＮＡＤ類ま
たはＮＡＤ類を示す）を作用せしめてＡ_１をＡ_２（Ａ_２
はＡ_１の還元型生成物を示す）となし、ついで生成した
Ａを分解せしめ、 （β）得られた反応液に、少なくともアセチル−Ｌ−カ
ルニチンおよびプロピオニル−Ｌ−カルニチンからなる
群より選ばれた低級アシル−Ｌ−カルニチン並びに長鎖
アシル−Ｌ−カルニチンであるパルミトイル−Ｌ−カル
ニチンに基質特異性を有し、当該低級乃至長鎖アシル−
Ｌ−カルニチンの１モルと水分子の１モルから１モルの
脂肪酸と１モルのＬ−カルニチンを生成する反応を触媒
するアシルカルニチンエステラーゼを作用せしめ、次い
で当該反応によって生成したＬ−カルニチンを定量する
ことを特徴とする、被検液中のアセチル−Ｌ−カルニチ
ンおよびプロピオニル−Ｌ−カルニチンからなる群より
選ばれた少なくとも１種の低級アシル−Ｌ−カルニチン
の測定法。6. The method for measuring at least one kind of lower acyl-L-carnitine selected from the group consisting of acetyl-L-carnitine and propionyl-L-carnitine in a test solution, comprising: (α) acetyl-L-carnitine And propionyl-
Medium- to long-chain acyl-L without using L-carnitine as a substrate
Has a substrate specificity to carnitine, from 1 mole of the medium to long chain acyl-L-carnitine and 1 mole of water molecule to 1 mole
Acylcarnitine esterase, which catalyzes the reaction to produce 1 mol of L-carnitine with 1 mol of fatty acid, is applied to the test solution, and the produced L-carnitine is treated with L-carnitine dehydrogenase and A ₁ (where A ₁ is a thioNAD or and allowed act shows the NAD compound) and _{a 1 a 2 (a} 2
Shows a reduced product of A ₁₎ ungated, then allowed to degrade resulting A, (beta) to the resulting reaction solution, selected from the group consisting of at least acetyl -L- carnitine and propionyl -L- carnitine Lower-acyl-L-carnitine and palmitoyl-L-carnitine, which is a long-chain acyl-L-carnitine, have a substrate specificity, and the lower to long-chain acyl-
An acylcarnitine esterase which catalyzes a reaction to produce 1 mol of L-carnitine and 1 mol of L-carnitine from 1 mol of L-carnitine and 1 mol of water molecule is acted on, and then L-carnitine produced by the reaction is quantified. A method for measuring at least one kind of lower acyl-L-carnitine selected from the group consisting of acetyl-L-carnitine and propionyl-L-carnitine in a test solution. 【請求項７】 工程（β）にて生成したＬ−カルニチン
の定量が、反応液にＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼ、
ＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類、および必要に応じて非イ
オン性界面活性剤を含有する試薬を作用せしめて、反応
にて生成する還元型ＮＡＤ類または還元型チオＮＡＤ類
を測定することにより行われるものである請求項６記載
の測定法。7. A method for determining the amount of L-carnitine produced in the step (β), wherein L-carnitine dehydrogenase,
Performed by reacting NADs or thio NADs and, if necessary, a reagent containing a nonionic surfactant, and measuring reduced NADs or reduced thio NADs formed in the reaction. The measuring method according to claim 6, wherein