JPS5832960B2 - Phosphodiestera - Zeosogaisuru - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規生理活性物質の製造法に関するものであり
、動物体内に存在するアデノシン３′、５７コ シン３’ｓ ５’−環状リン酸の分解を阻害する新規化
合物であるホスホジェステラーゼ阻害物質ＰＤＥ−Ｉｔ
たはＰＤＥ −ＩＩの製造法に関するものである。Detailed Description of the Invention The present invention relates to a method for producing a novel physiologically active substance, which is a novel compound that inhibits the decomposition of adenosine 3', 57 cosine 3's 5'-cyclic phosphate present in animal bodies. A certain phosphogesterase inhibitor PDE-It
The invention also relates to a method for producing PDE-II.

アデノシン３’，５／−環状リン酸は、現在ステロイド
ホルモンを除く他のほとんどのホルモンの第２の伝達物
質であることが明らかにされてきている。Adenosine 3',5/-cyclic phosphate has now been shown to be the second transmitter of most other hormones except steroid hormones.

したがってこのアデノシン３．’ｔ ５’−１ｌｌン酸
を分解する酵素であるアデノシン３，／， ５／ ｉ
状リン酸ホスホジェステラーゼを阻害することは、細胞
内のアデノシン３′，５′−環状リン酸のレベルを制御
することとなり、その阻害剤は各種の生理的効果が期待
される。Therefore, this adenosine 3. Adenosine 3,/, 5/i, an enzyme that decomposes 't5'-1llic acid
Inhibiting cyclic phosphate phosphogesterase controls the level of intracellular adenosine 3',5'-cyclic phosphate, and its inhibitors are expected to have various physiological effects.

たとえば肝臓における糖代謝の改善、強心作用、平滑筋
弛緩作用、気管支拡張作用、冠状動脈拡張作用、脂質代
謝の改善、精神安定作用、体液分泌促進作用、ホルモン
分泌促進作用等を有する可能性を有する。For example, it has the potential to improve glucose metabolism in the liver, cardiac inotropy, smooth muscle relaxation, bronchodilation, coronary artery dilation, lipid metabolism, mental stabilization, body fluid secretion promoting, hormone secretion promoting, etc. .

捷た、アデノシン３／，５／ｉ状リン酸の誘導体である
ジブチリルアデノシン３／，５／ｉ状リン酸は、培養動
物細胞において、ガン細胞の増殖とガン化を抑制するこ
とが知られている，（「蛋白質・核酸・酵素」１８巻厘
１３ １１９５頁、１９７咋）。Dibutyryl adenosine 3/,5/i-phosphate, which is a derivative of truncated adenosine 3/,5/i-phosphate, is known to suppress the proliferation and canceration of cancer cells in cultured animal cells. (``Proteins, Nucleic Acids, and Enzymes'' Vol. 18, 13, p. 1195, 197 K.).

このことはアデノシン３／，Ｓ／−環状リン酸ホスホジ
エステラーゼの阻害剤は抗ガン作用を有する可能性が考
えられる。This suggests that inhibitors of adenosine 3/, S/-cyclic phosphate phosphodiesterase may have anticancer effects.

更に、最近高血圧ラットの血管中にはアデノシン３％５
／ ３Ｊｊ状リン酸含量が低いことが明らかにされ（
「サイエンス」、１７９巻８０７頁１９７３年）、抗高
血圧作用や抗動脈硬化作用をアデノシン３／， ５ ／
−環状リン酸ホスホジェステラーゼの阻害剤が持つこ
とが期待される。Furthermore, adenosine 3%5 was recently found in the blood vessels of hypertensive rats.
/ It was revealed that the content of 3Jj-like phosphoric acid is low (
"Science", Vol. 179, p. 807, 1973), adenosine 3/, 5/
- Expected to be an inhibitor of cyclic phosphate phosphogesterase.

またアレルギーの発現にもアデノシン３／， ５／
ｉ状リン酸が関与していることが発見され（「バイオチ
ク」３巻厘１２、９６２頁１９７２年）、アデノシン３
７， ５／−環状リン酸ホスホジェステラーゼの阻害剤
が抗アレルギー、喘息防止作用等の効果を示すと思われ
る。Adenosine 3/, 5/ also plays a role in the development of allergies.
It was discovered that i-form phosphoric acid is involved ("Biochiku" vol. 3, p. 962, 1972), and adenosine 3
It is believed that inhibitors of 7,5/-cyclic phosphate phosphogesterase exhibit effects such as anti-allergy and anti-asthma effects.

具体的にはすでにアデノシン３′，５′−環状リン酸ホ
スホジエステラーゼの阻害作用と精神薬との密接な関係
が明らかにされている（ 「サイエンス」１７６巻４２
８頁１９７２年）。Specifically, it has already been revealed that there is a close relationship between the inhibitory effect of adenosine 3',5'-cyclic phosphate phosphodiesterase and psychiatric drugs (Science, Vol. 176, 42).
8 p. 1972).

以上の如く本発明のアテノシン３’、 ５’−ｉ状リン
酸ホスホジェステラーゼの阻害剤は医薬として広範な領
域での利用が充分期待上れる。As described above, the atenosine 3', 5'-i-phosphate phosphogesterase inhibitor of the present invention is fully expected to be used as a medicine in a wide range of fields.

また本発明の方法で製造されるホスホジェステラーゼ阻
害物質ＰＤＥ −ＩｔたはＰＤＥ−ｎは、天然から発見
された新規骨格を持つ化合物であり、化学的な興味と共
に生理活性物質の新規な母核を与えるという意味は大き
いと思われる。In addition, the phosphogesterase inhibitor PDE-It or PDE-n produced by the method of the present invention is a compound with a novel skeleton discovered in nature, and is of chemical interest as well as a novel mother nucleus for physiologically active substances. It seems to have a great meaning in giving.

本発明の方法で製造される前記の物質ＰＤＥ−■または
物質ＰＤＥ−ｎは次の一般式 〔式中、Ｒは物質ＰＤＥ−Ｉではア□）基（−ＮＨ３）
を表わし、物質ＰＤＥ−Ｉ［ではメチル基（−ＣＨ３）
を表わす〕で示される化合物である。The substance PDE-■ or the substance PDE-n produced by the method of the present invention has the following general formula [wherein R is a □ in the substance PDE-I] group (-NH3)
and in the substance PDE-I [methyl group (-CH3)
This is a compound represented by

本発明によると、ストレプト□セス属に属するホスホジ
ェステラーゼ阻害物質ＰＤＥ−ｍ生産菌又はホスホジェ
ステラーゼ阻害物質ＰＤＥ−ｍ生産菌を好気的に培養し
、その培養物より物質ＰＤＥ−■又は物質ＰＤＥ −Ｉ
Ｉを採取することを特徴トスる、ホスホジェステラーゼ
阻害物質ＰＤＥ−Ｉ又はＰＤＥ−Ｉ［の製造方法が提供
される。According to the present invention, a phosphogesterase inhibitor PDE-m-producing bacterium or a phosphogesterase inhibitor PDE-m-producing bacterium belonging to the genus Streptocysts is cultured aerobically, and from the culture, the substance PDE-■ or the substance PDE-I
Provided is a method for producing a phosphogesterase inhibitor PDE-I or PDE-I[, which comprises collecting PDE-I.

本発明の方法で使用されるホスホジェステラーゼ阻害物
質ＰＤＥ−ｍ生産菌又はホスホジェステラーゼ阻害物質
ＰＤＥ−ｍ生産菌の一例としては、本発明者らによって
初めて昭和４８年２月微生物化学研究所の構内の土壌よ
り分離された放線菌でＭＤ７６９−Ｃ６の番号が付され
た菌株がある。As an example of the phosphogesterase inhibitor PDE-m-producing bacteria used in the method of the present invention or the phosphogesterase inhibitor PDE-m-producing bacteria, the present inventors first established the Institute of Microbial Chemistry in February 1971. There is an actinomycete strain numbered MD769-C6 that was isolated from the soil on the campus.

このＭＤ７６９−Ｃ６株は下記のような性状を有する。This MD769-C6 strain has the following properties.

１形態 ＭＤ７６９−Ｃ６株は顕微鏡下で分枝した基中菌糸より
気菌糸を伸長し、その先端はループ状、かぎ状、螺旋状
である。One form of the MD769-C6 strain was observed under a microscope to extend aerial hyphae from branched basal hyphae, and the tips were loop-shaped, hook-shaped, or spiral-shaped.

輪生分枝を示さず、菌核等の特殊器官を形成しない。It does not show whorled branches and does not form special organs such as sclerotia.

気菌糸の先端に形成される成熟した胞子鎖は１０個以上
の胞子の連鎖をみとめ、胞子の形は惰円形で、大きさは
０．８〜１．２ミクロン位、胞子の表面はとげ状である
。The mature spore chain formed at the tip of the aerial hyphae is a chain of 10 or more spores, the shape of the spore is circular, the size is about 0.8 to 1.2 microns, and the surface of the spore is thorn-like. It is.

２ 各種培地における生育状態 色の記載について０内に示す標準はコンティナコーポレ
ーション・オブ・アメリカのカラー〇／）−モニー０マ
ニュアル（Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ Ｃａｒｐ −ｏｒａｔ
ｉｎｎ ｏｆ ＡｍｅｒｉｃａのＣｏ１ｏｒ ｈａｒｍ
ｏｎｙ ｍａｎｕａｌ）によるものである。2 Regarding the description of the growth state color in various media, the standard shown in 0 is Container Corporation of America's Color 0/)-Mony 0 Manual (Container Carp-orat
inn of America's Co1or harm
(one manual).

（１）シュークローズ・硝酸塩寒天培地（２７℃培養） 黄味灰色（Ｉ Ｖ２ ｄｐ ＃ Ｐａｒｃｈｍｅｎｔ
）の発育上で気菌糸はほとんど着生せず々わずかに白い
気菌糸をつけ、溶解性色素は認められない。(1) Sucrose/nitrate agar medium (cultured at 27°C) Yellowish gray (I V2 dp # Parchment
), almost no aerial hyphae are attached, only a few white aerial hyphae are attached, and no soluble pigment is observed.

（２）グルコース・アスパラギン寒天培地（２７℃培養
） 黄味灰色ＣＩ Ｖ２ ｄｐｔ Ｐａｒｃｈｍｅｎｔ 〜
ｌｉｄ １ｃｙＬ Ｌ Ａｎｔｉｑｕｓ Ｇｏｌｄ 、
ｌの発育上に白色（３ｂａＰｅａｒｌ ５ｈｅｌｌ Ｔ
ｉｎｔ 、ｌ〜明るい灰色〔５ｄ ｃ ｔＰｕｓｓｙ
ｗｉｌｌｏｗ Ｇｒａｙｌの気菌糸をわずかに着生し、
溶解性色素は認められない。(2) Glucose-asparagine agar medium (cultured at 27°C) Yellowish gray CI V2 dpt Parchment ~
lid 1cyL L Antiqus Gold,
White on the growth of l (3baPearl 5hell T
int, l ~ light gray [5d c tPussy
Willow Grayl aerial mycelia are slightly attached,
No soluble dyes are observed.

（３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ培地
−５，２７℃培地） うす黄茶色（３１ｅｔ Ｃａｍｅｌ Ｍａｐｌｅ Ｓｕ
ｇａｒＴａｎ〕〜明るい茶灰色（３ｇ（＋ Ｂａｍｂｏ
ｏ Ｃｈａ −ｍｏｉｓ）の発育上に白〜明るい灰色（
１０ｆｅ。(3) Glycerin-asparagine agar medium (ISP medium-5, 27°C medium) Light yellow brown (31et Camel Maple Su
garTan] ~ Light brownish gray (3g (+ Bambo
o Cha-mois) on the development of white to light gray (
10fe.

Ｄｕｓｋ、ｌの気菌糸を着生し、溶解性色素はわずかに
黄茶色を呈する。The aerial mycelia of Dusk, L are attached, and the soluble pigment is slightly yellow-brown.

（４）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＰＳ培地−４，２
７℃培養） 明るいオリーブ色（２１ｅｙ Ｍｕｓｔａｒｄ ０１ｄ
Ｇｏｌｄ）の発育上に白色（３ｂａｔ Ｐａａｒｌ ５
ｈｅｌｌＴｉｎｔ〕〜明るい灰色（１３ｆｅｙ Ｄｕｓ
ｋ Ｐｅｗｔｅｒ）の気菌糸を着生し、溶解性色素は認
められない。(4) Starch/inorganic salt agar medium (IPS medium-4, 2
7℃ culture) Bright olive color (21ey Mustard 01d
White (3bat Paarl 5) on the growth of Gold)
hellTint]~Light gray (13fey Dus
K Pewter), and no soluble pigments are observed.

（５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ培地７．２７℃培養）
にぶ黄色（２ｇｅｔ Ｂａｍｂｏｏ Ｃｈａｍｏｉｓ
〜２ｐｇｙＭｕｓｔａｒｄ Ｇｏｌｄ）の発育上に白〜
明るい灰色〔１３ｄｅ ｙ Ｐｓａｒｌ Ｇｒａｙ Ｓ
ｍｏｋｅ）の気菌糸を着生し、溶解性色素は、わずかに
うす黄茶色を呈する。(5) Tyrosine agar medium (ISP medium 7.27°C culture)
2get Bamboo Chamois
~White on the growth of 2pgyMustard Gold)~
Light gray [13de y Psarl Gray S
The soluble pigment is slightly yellow-brown in color.

（６）栄養寒天培地（２７℃培養） 発育は黄味灰色Ｃ１ｙ２ｄ ｂ ＋ Ｐ ａｒｃｈｍｅ
ｎｔ 、］を呈し、気菌糸は着生しない。(6) Nutrient agar medium (cultured at 27°C) Growth is yellowish gray C1y2d b + P archme
nt, ], and no aerial mycelium is attached.

溶解性色素はみとめられない。No soluble pigments are observed.

（７）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ培地−２，２７
℃培養） うす黄茶色（３ｎｇ＊ Ｙｅｌｌｏｗ Ｍａｐｌｃ）の
発育上に白色（１５ｂａ＊ Ｂｌｕｅ Ｔｉｎｔ）〜明
るい灰色（５ｆ ｅ、 Ａｓｈｅｅ 、ｌの気菌糸を着
生し、溶解性色素はみとめられない。(7) Yeast/malt agar medium (ISP medium-2, 27
℃ culture) Aerial mycelium of white (15ba* Blue Tint) to light gray (5fe, Ashee, L) was grown on the growth of pale yellow-brown (3ng* Yellow Maplc), and no soluble pigment was observed.

（８）オートミール寒天培地（ＩＳＰ培地−３，２７℃
培養） にぶ黄たいたい色〔ＩＶ２ｎｃ、Ｇのｌｄ〕の発育上に
灰白色Ｃ２ｄｃｐ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｔｒｉｎｇ）
〜明るい灰色（５ｆ ｅ ＋ Ａｓｈｅｓ 〕の気菌糸
をわずかに着生し、溶解性色素はみとめられない。(8) Oatmeal agar medium (ISP medium -3, 27℃
Culture) C2dcp Natural String) is grayish white on the growth of dark yellow [IV2nc, G's ld]
A few light gray (5f e + Ashes) aerial mycelia are attached, and no soluble pigments are observed.

（９）リンゴ酸石灰寒天培地（２７℃培養）発育は灰白
色（２ｄａｙ Ｐｅａｒｌ ５ｈｅｌｌ Ｔｉｎｔ）気
菌糸は矯生じない。(9) Malate lime agar medium (27°C culture) Growth is grayish white (2 day Pearl 5 hell tint) Aerial mycelium does not appear.

溶解性色素はみとめられない。No soluble pigments are observed.

（１０）ペプトン・イースト鉄寒天培地（ＩＰＳ培地−
６，２７℃培養） 発育はうす黄たいたい色（２ｄｂｙ Ｉｖｏｒｙ）、気
菌糸は着生せず、溶解性色素はみとめられない。(10) Peptone yeast iron agar medium (IPS medium-
6.Culture at 27°C) The growth is pale yellowish (2 dby ivory), no aerial mycelia are attached, and no soluble pigment is observed.

３ 生理的性質 （１）生育温度範囲 イースト・麦芽寒天を用いて、４°Ｃ，８°Ｃ２１５°
Ｃ９２２°Ｃ９２７°Ｃ２３７°Ｃ９４５°Ｃの各温度
で試験の結果、４℃、８℃を除いてそのいずれの温度で
も生育したが、最適生育温度は２２℃〜２７℃でのった
。3 Physiological properties (1) Growth temperature range: 4°C, 8°C, 215° using yeast/malt agar
As a result of the test at each temperature of 922°C, 927°C, 237°C, and 945°C, it grew at all temperatures except 4°C and 8°C, but the optimum growth temperature was between 22°C and 27°C.

（２） ゼラチンの液化（グルコース−ペプトン−ゼ
ラチン、２２°Ｃ９２７℃培養） ２２℃では１１５程度、層状の液化がみられ、２７℃で
はほとんど液化した。(2) Liquefaction of gelatin (glucose-peptone-gelatin, cultured at 22°C and 927°C) At 22°C, about 115 layers of liquefaction were observed, and at 27°C, almost liquefaction was observed.

（３）スターチの加水分解（スターチ−無機塩寒天、２
７℃培養） スターチの氷解性がみられ、その作用は中等度である。(3) Hydrolysis of starch (starch-inorganic salt agar, 2
(Cultivated at 7℃) Starch has ice-melting properties, and its effect is moderate.

（４）脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（脱脂牛乳、３７℃
培養） 培養後１４日日日で凝固、ペプトン化はみとめられない
。(4) Coagulation and peptonization of skimmed milk (skimmed milk, 37℃
Culture) No coagulation or peptonization was observed 14 days after culture.

（５）メラニン様色素の生成（トリプトン・イーストプ
ロス、■ＰＳ培地−１；ペプトン・イースト・鉄寒天、
■ＰＳ培地−６；チロシン寒天、ＩＰＳ培地−７、いず
れも２７℃培養） トリフトン−イーストグロス、ペプトン−イースト−鉄
寒天及びチロシン寒天ともメラニン様色素の生成はみと
められない。(5) Production of melanin-like pigments (tryptone yeast prosthesis, PS medium-1; peptone yeast iron agar,
(2) PS medium-6; tyrosine agar, IPS medium-7, both cultured at 27°C) No melanin-like pigment was observed in any of the trifton-yeast gloss, peptone-yeast-iron agar, and tyrosine agar.

（６）炭素源の利用性（プリドハム・ゴＩＩ−グ寒天、
２７℃培養） Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−フラクトース、シュークロース、イノシトール、Ｌ
ラムノース、ラフィノース、Ｄ−マンニトールを利用し
てよく発育し、セルロースは利用しない。(6) Utilization of carbon sources (Pridham Go II-G agar,
27°C culture) L-arabinose, D-xylose, D-glucose,
D-fructose, sucrose, inositol, L
It grows well using rhamnose, raffinose, and D-mannitol, and does not use cellulose.

（７）リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石灰寒天、２７℃
培養） リンゴ酸石灰の溶解が、みとめられ、その作用は中等度
である。(7) Dissolution of malic acid lime (malic acid lime agar, 27℃
Culture) Dissolution of lime malate was observed and the effect was moderate.

以上の性状を要約すると、ＭＤ７６９−Ｃ６株はストレ
プトミセス属に属し、気菌糸の先端はループ状、かぎ状
、螺旋状で胞子の表面はとげ状である。To summarize the above characteristics, the MD769-C6 strain belongs to the genus Streptomyces, and the tips of the aerial hyphae are loop-shaped, hook-shaped, or spiral-shaped, and the surface of the spores is thorn-shaped.

種々の培地で黄味灰〜黄茶〜にぶ黄色の発育上に白〜灰
色の気菌糸を着生し、溶解性色素は無色〜うす黄茶色を
わずかにおびる。In various media, white to gray aerial mycelium grows on the yellowish-gray to yellowish-brown to dark yellow growth, and the soluble pigment is colorless to slightly pale yellowish-brown.

メラニン様色素はトリプトン・イーストプロス、ペプト
ン・イースト・鉄寒天培地、チロシン寒天培地とも陰性
である。Melanin-like pigments are negative on tryptone/yeast prosthesis, peptone/yeast/iron agar, and tyrosine agar.

蛋白分解力、スタンチの氷解性はともに中等度である。The proteolytic power and ice-melting ability of Stanch are both moderate.

これらの性状より既知菌種を検索すると、ＭＤ７６９−
Ｃ６株に最も近縁の種としてストレプトミセス・グリゼ
オフラヴスＳ ｔｒｅｐ ｔｏｍｙ ｓｅｓ ｇ ｒ−
ｉ ５ｅｏｆ １ａｖｕｓ （Ｋｒａｉｎｓｋｙ ）
Ｗａｋｓｍａｎ ａｎｄ Ｈｅｎｒｉ ｃｉがあげられ
る。When searching for known bacterial species based on these properties, MD769-
The species most closely related to the C6 strain is Streptomyces griseoflavus.
i 5eof 1avus (Krainsky)
Examples include Waksman and Henrici.

次にストレプトミセス・グリゼオフラヴスの原記載（Ｂ
ｅｒｇｅｙｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｖｅＢａｃｔｅｖｉｏｌｏｇｙ ｐ ６ ｔｈｅ
ｄｉｔｉｏｎ、 Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍａａｎｄ Ｗ
ｉｌｋｉｎｓ Ｃｏｔ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ ）および
ＩＰＳ菌株５４５６ （Ｓ −ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕ
ｓ ）の同時培養とＭＤ７６９−Ｃ６株を比較すると、
下記の表に示す如くである。Next, the original description of Streptomyces griseoflavus (B
manual of determination
active Bacteriology p 6 the
dition, The William and W
ilkins Cot Baltimore) and IPS strain 5456 (S-griseoflavu
Comparing the co-culture of s ) with MD769-C6 strain,
As shown in the table below.

上記のようにＭＤ７６９−Ｃ６株とストレプトミセス・
グリゼオフラヴスとは生理的性質（シュークロース、ラ
フィノースの利用性および□ルクのペプトン化）におい
て若干の差異がみとめられる。As mentioned above, MD769-C6 strain and Streptomyces
Some differences are observed in physiological properties (availability of sucrose and raffinose and peptonization of □luk) from Griseoflavus.

しかしながら両画は形態的諸性状、各種培地上の諸性状
および上記以外の生理的性質において極めて良く類似し
ている。However, both types are extremely similar in terms of morphological properties, properties on various media, and physiological properties other than those mentioned above.

したがってＭＤ７６９−Ｃ６株をストレプトミセス・グ
リゼオフラヴスＭＤ ７６９−Ｃ６株と同定した。Therefore, the MD769-C6 strain was identified as Streptomyces griseoflavus MD769-C6 strain.

なお、ＭＤ７６９−Ｃ６株を工業技術院微生物工業技術
研究所に昭和５０年７月１９日保管委託申請し、微工研
菌寄第３１７８号として寄託しである。The MD769-C6 strain was submitted to the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology for entrustment of storage on July 19, 1975, and was deposited as Microbiology Research Institute No. 3178.

ｍ菌は人工的に、また自然界で変異を起こしやすいが、
本発明にいうストレプトミセス・グリゼオフラヴスＭＤ
７６９−Ｃ６はそれらの変異菌のすべてを包括する。M bacteria are prone to mutations both artificially and naturally,
Streptomyces griseoflavus MD according to the present invention
769-C6 encompasses all of these mutant bacteria.

本発明にいうこれらの菌種は物質ＰＤＥ−ＩおよびＰＤ
Ｅ−Ｉ［を生産し、本菌種およびその変異菌と明確に区
別されないストレプトミセス属の菌はすべてこれを包含
する。These bacterial species referred to in the present invention contain the substances PDE-I and PD
This includes all strains of the genus Streptomyces that produce E-I and are not clearly distinguishable from the present strain and its mutants.

本発明の目的物質ＰＤＥ−Ｉ又はＰＤＥ −Ｉ［をその
培養液中に生産せしめる方法は通常の微生物の培養法と
して公知の培養法に準じて行うことができる。The target substance of the present invention, PDE-I or PDE-I, can be produced in its culture solution in accordance with a culture method known as a conventional culture method for microorganisms.

栄養源としては放線菌の栄養源として公知のものを使用
できる。As the nutrient source, those known as nutrient sources for actinomycetes can be used.

たとえば市販されているグリセリン、グリコース、ラク
トース、シュークロース、でんぷん、マルトース、糖蜜
などの炭水化物あるいは脂肪（動物脂肪、大豆油、綿実
油などの純植物油）などの炭素源および市販されている
ペプトン、肉エキス、コーンスチ−７”！Ｊ−カー、綿
実粉、落花生粉、大豆粉、酵母エキス、ＮＺアミン、カ
ゼイン、硝酸ソーダ、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニ
ウムなどの窒素源と、食塩、リン酸塩、炭酸カルシウム
、硫酸アグイ・シウムなどの無機塩を使用できる。Carbon sources such as commercially available carbohydrates such as glycerin, glycose, lactose, sucrose, starch, maltose, molasses or fats (animal fat, pure vegetable oils such as soybean oil, cottonseed oil) and commercially available peptones, meat extracts. Nitrogen sources such as , cornstarch 7"!J-car, cottonseed flour, peanut flour, soybean flour, yeast extract, NZ amine, casein, sodium nitrate, ammonium nitrate, and ammonium sulfate, and salt, phosphate, calcium carbonate, and sulfuric acid. Inorganic salts such as agui sium can be used.

その他必要に応じて微量の金属塩を添加する。Other trace amounts of metal salts are added as necessary.

これらのものはホスホジェステラーゼ阻害物質ＰＤＥ−
ＩおよびＰＤＥ−ＩＩ生産菌が利用し、また物質ＰＤＥ
−ＩおよびＰＤＥ−■の生産に役立つものであればよい
。These include the phosphogesterase inhibitor PDE-
I and PDE-II producing bacteria utilize the substance PDE
Any material useful for the production of -I and PDE-■ may be used.

公知の放線菌の培養材料はすべて利用できる。All known culture materials for actinomycetes can be used.

大量生産には、液体培養が好ましい。For mass production, liquid culture is preferred.

培養温度はＰＤＥ−Ｉ又はＰＤＥ −ＩＩ若しくはこれ
らの両物質を生産する微生物が発育し、ＰＤＥ−Ｉ又は
ＰＤＥ −Ｉ［若しくはこれらの両物質を生産する微生
物が発育し、ＰＤＥ−Ｔ又はＰＤＥ−１［若しくはと沌
の両物質を生産する範囲で（２０〜３５℃）適用し得る
が、殊に好ましいのは２５〜３０℃である。The culture temperature is such that microorganisms that produce PDE-I or PDE-II or both of these substances grow, microorganisms that produce PDE-I or PDE-I [or both of these substances grow, and PDE-T or PDE- It can be applied within the range (20 to 35°C) that produces both substances, but 25 to 30°C is particularly preferable.

培養は普通ＰＤＥ−丁又はＰＤＥ−１［若しくはこれら
の両物質が充分・に蓄積する昔で継続される。Cultivation is usually continued until sufficient accumulation of PDE-1 or PDE-1 [or both substances] occurs.

たとえばグルコース２優、でんぷん２％、大豆粉２％、
酵母エキス０．５％、食塩０．２５％ＣａＣＯ３０，３
２％、Ｃ１１ＳＯ４・５Ｈ２０，０，０００５％、Ｍｎ
Ｃｌ２・４Ｈ２００，０ＯＯ５％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２
００，０００５％の培地をｐ Ｈ７，４に調整し、滅菌
後ＭＤ７６９−Ｃ６株を斜面培養したものから胞子およ
び菌糸を接種し、２７℃にて好気的に振と５培養を行う
と、培養４〜１０日目に日日中にＰＤＥ−ＩおよびＰＤ
Ｅ−ｎの蓄積がみとめられた。For example, glucose 2%, starch 2%, soy flour 2%,
Yeast extract 0.5%, salt 0.25% CaCO30.3
2%, C11SO4・5H20,0,0005%, Mn
Cl2・4H200,0OO5%, ZnSO4・7H2
00,0005% medium was adjusted to pH 7.4, sterilized and inoculated with spores and hyphae from a slant culture of MD769-C6 strain, and aerobically shaken and cultured for 5 times at 27°C. PDE-I and PD during the day on days 4 to 10 of culture.
Accumulation of E-n was observed.

ＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ−ＩＩはアテノシン３′。PDE-I and PDE-II are atenosine 3'.

サー環状リン酸ホスホジェステラーゼの阻害活性の測定
で定量される。It is quantified by measuring the inhibitory activity of cyclic phosphate phosphogesterase.

すなわち市販の放射性ラベル化合物アテノシン３／、５
／−環状リン酸−８１４０アンモニウム塩がこの酵素に
より、加水分解され生成するブテノシン５′−リン酸を
、アルミナカラムにて基質ブテノシン３／、５／１３状
リン酸と分離し、未反応のブテノシン３：’、５’−項
状リン酸の放射活性を液体シンチレーションカウンター
にて測定し、阻害活性を知る。That is, commercially available radiolabeled compounds atenosine 3/, 5
/-Cyclic phosphate-8140 ammonium salt is hydrolyzed by this enzyme, and the produced butenosine 5'-phosphate is separated from the substrate butenosine 3/, 5/13-type phosphate using an alumina column, and unreacted butenosine 3: Measure the radioactivity of the ',5'-terminal phosphoric acid using a liquid scintillation counter to determine the inhibitory activity.

ＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ−ｎは生産菌ＭＤ ７６９−Ｃ
６株を液体培養した時、液体部分と菌体を含む固形部分
に存在する。PDE-I and PDE-n are produced by the producing strain MD 769-C.
When the 6 strains are cultured in liquid, they exist in the liquid part and the solid part containing the bacterial cells.

液体部分のＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ −ＩＩは水と混和
しない適当な溶媒たとえばｎ−ブタノールや酢酸ブチル
にて酸性側にて振とう抽出できる。The liquid portions of PDE-I and PDE-II can be extracted with a suitable water-immiscible solvent such as n-butanol or butyl acetate by shaking on the acidic side.

また活性炭などの吸矯斉１］にて液体部分よりＰＤＥ−
ＩおよびＰＤＥ−Ｉ［を吸着せしめ、メタノールや含水
アセトン（ｐＨ８）の如き適当な溶剤にて溶出できる。In addition, PDE-
I and PDE-I can be adsorbed and eluted with a suitable solvent such as methanol or aqueous acetone (pH 8).

また菌体固形部分中のＰＤＩＩ、−ＩおよびＰＤＥ−Ｉ
Ｉは水と混和する。In addition, PDII, -I and PDE-I in the solid part of the bacterial body
I is miscible with water.

例えばメタノール、アセトン等にて抽出できる。For example, it can be extracted with methanol, acetone, etc.

そしてこの抽出液を減圧下濃縮し、水溶液とし、水と混
和しない溶媒たとえば酢酸エチルや酢酸ブチルにて、酸
性側にて抽出することにより、精製できる。This extract is then concentrated under reduced pressure to form an aqueous solution, and purified by extraction with a water-immiscible solvent such as ethyl acetate or butyl acetate on the acidic side.

これらの液体部分と菌体固形部分の抽出液は、減圧下濃
縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製で
きる。The liquid portion and the extract of the solid portion of the bacterial cells can be concentrated under reduced pressure and purified by silica gel column chromatography.

展開溶媒としてクロロホルム−メタノール系をもちいれ
ば、（９５：５）にてＰＤＥ−ｍは溶出され、結晶状に
得られる。When a chloroform-methanol system is used as a developing solvent, PDE-m is eluted at a ratio of (95:5) and obtained in a crystalline form.

一方ＰＤＥ−Ｉはクロロホルム−メタノール（９：１）
にて溶出され、その活性部を減圧下濃縮し、メタ／−ル
にてセファデックスＬＨ−２０のクロマトグラフィーを
行うことにより粗結晶が得られる。On the other hand, PDE-I is chloroform-methanol (9:1)
The active part is concentrated under reduced pressure, and crude crystals are obtained by chromatography on Sephadex LH-20 using methanol.

これをメタノール等の適当な溶媒にて再結すると、純粋
な結晶が得られる。When this is recrystallized with a suitable solvent such as methanol, pure crystals are obtained.

ＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ−ｎはその精製法においてその
化学的性質が利用されているように、酸性物質であり、
アルカリにはよく溶けるが各種溶剤に対する溶解性は低
い。PDE-I and PDE-n are acidic substances, as their chemical properties are utilized in their purification methods;
It dissolves well in alkalis, but has low solubility in various solvents.

そして物質ＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ−ｎはよく似ている
が、若干ＰＤＥ−■の方が、溶剤に溶解しやすい。Although the substances PDE-I and PDE-n are very similar, PDE-2 is slightly more soluble in solvents.

すなわち、ジメチルスルホキサイド、ピリジンに溶け、
メタノールには難溶であり、エタノール、アセトン、酢
酸エチル、酢酸フチル、クロロホルム、ベンゼン等には
極めて溶けにくいか不溶である。i.e. dimethyl sulfoxide, soluble in pyridine,
It is sparingly soluble in methanol, and extremely sparingly soluble or insoluble in ethanol, acetone, ethyl acetate, phtyl acetate, chloroform, benzene, etc.

定性反応はニンヒドリン、エーリツヒ、塩化第二鉄、ザ
ルコツスキー、ファンウルク反応等には陰性でリンモリ
ブデン酸アンモニウム反応にはいずれも陽性であった。Qualitative reactions were negative for ninhydrin, Ehritzg, ferric chloride, Zarkotsky, van Urk reactions, etc., and positive for ammonium phosphomolybdate reactions.

捷たライドン、ス□ス反応に対してはＰＤＥ−Ｉは陽性
で、ＰＤＥ−ＩＩは陰性であった。Regarding the separated Lydon and Sus reactions, PDE-I was positive and PDE-II was negative.

本発明にて得られた目的物質ＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ−
ＩＩの結晶は、それぞれ２３５℃、２５０’Ｃにて分解
点を与え、元素分析の結果の一例をあげるとＰＤＥ−Ｉ
はＣ：５２．５７％、Ｈ：４．８４％、Ｎ：１４．１３
優、０：２８．４０係を示し、ＰＤＥ−■はＣ：５５．
８１饅、Ｈ：４．７３咎、Ｎ：９．３５φ、０：２７．
８９％を示した。Target substances PDE-I and PDE- obtained in the present invention
The crystals of II have decomposition points at 235°C and 250'C, respectively, and an example of the elemental analysis results is PDE-I.
C: 52.57%, H: 4.84%, N: 14.13
Excellent, 0:28.40 section, PDE-■ indicates C:55.
81 buns, H: 4.73 tongs, N: 9.35φ, 0:27.
It showed 89%.

マスヌベクトルより、ＰＤＥ−Ｉはｍ／’ｅ２９１に、
ＰＤＥ−ＩＩはｍ／ｅ ２９０にそれぞれ分子イオンを
与え、高分解能マススペクトルからＰＤＥ−ＩはＣ１３
Ｂ１３Ｎ３０゜（実測値：２９１．０８５３、理論値：
２９１．０８５３）、ＰＤＥ−Ｉ［はＣ１４Ｈ１４Ｎ２
０５（実測値：２９０．０９１１、理論値：２９０．０
９０２）なる組成を有する。From the massnu vector, PDE-I is m/'e291,
PDE-II gives a molecular ion at m/e 290, and high-resolution mass spectra show that PDE-I is C13.
B13N30° (actual value: 291.0853, theoretical value:
291.0853), PDE-I[C14H14N2
05 (actual value: 290.0911, theoretical value: 290.0
902).

なお、分子式Ｃ１３Ｈ１３Ｎ３０５の理論値はＣ：５３
．６１％、Ｈ：４．５０優、Ｎ：１４．４３咎、０：２
７．４７％であり、Ｃ１４Ｈ１４Ｎ２０．の理論値はＣ
：５７．９３％％Ｈ： ４．８６％、Ｎ：９．６５俤、
０：２７．５６係である。The theoretical value of the molecular formula C13H13N305 is C:53
．． 61%, H: 4.50 yen, N: 14.43 yen, 0:2
7.47%, C14H14N20. The theoretical value of C
:57.93%%H: 4.86%, N:9.65 yen,
0:27.56 section.

ＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ−ＩＩＩの赤外線吸収スペクト
ルはそれぞれ第１図および第２図に示す。The infrared absorption spectra of PDE-I and PDE-III are shown in FIGS. 1 and 2, respectively.

物質ＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ−ＩＩの紫外線吸収スペク
トルはよく似たパ汐−ンを示し、水溶液にてＰＤＥ−Ｉ
は２５３ｍμ（６４１，００００）と３１０ｍμ（６１
７，０００）に極大吸収を示し、Ｇ−６は２６３ｍμ（
ε３８．０００ ）と３１０ ｍｔｔ （ｅ １２．０
００）に極大吸収を示す。The ultraviolet absorption spectra of the substances PDE-I and PDE-II show very similar patterns, and in an aqueous solution PDE-I
are 253 mμ (641,0000) and 310 mμ (61
7,000), and G-6 shows maximum absorption at 263 mμ (
ε38.000) and 310 mtt (e 12.0
00) shows maximum absorption.

また０、ＯＩＮ塩酸溶液ではＰＤＥ−Ｉは２３６ｍμ（
ε３９．０００ ）と３２０ｍμ（ε１９．０ＯＯ）に
、Ｇ−６は２６６ｍμ（ε３６．ｏｏｏ）と３２４ｍμ
（εｌ ５．０００ ）にそれぞれ極大吸収を示し、０
．０１Ｎ塩化ナトリウム溶液ではＰＤＥ−Ｉは２３４ｍ
μ（ε３３．０００ ）、２５３ｍμ（６３８，０００
）そして３３８ｍμ（５２２，０００）に、Ｇ−６は２
６６ｍμ（ε２６．ｏｏｏ）と３４４ｍμ（１８，００
０）にそれぞれ極大吸収を示す。In addition, in OIN hydrochloric acid solution, PDE-I was 236 mμ (
ε39.000) and 320mμ (ε19.0OO), and G-6 has 266mμ (ε36.ooo) and 324mμ
(εl 5.000), respectively, showing maximum absorption at 0
．． In 01N sodium chloride solution, PDE-I is 234m
μ(ε33.000), 253mμ(638,000
) and 338 mμ (522,000), G-6 is 2
66 mμ (ε26.ooo) and 344 mμ (18,00
0) shows maximum absorption.

物質ＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ−ＩＩの化学構造は、その
モノメチル体を直接法にてＸ線回折を行い、次式に決定
された。The chemical structures of the substances PDE-I and PDE-II were determined by the following formulas by subjecting their monomethyl forms to direct X-ray diffraction.

ＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ−ＩＩの生理学的性質はマウス
に対し、腹腔内投与を行うと、いずれも２５０ｍｇ／ｋ
ｇにて毒性を示さなかった。The physiological properties of PDE-I and PDE-II are as follows: When administered intraperitoneally to mice, both are administered at 250 mg/k.
It showed no toxicity at 100 g.

ブテノシン３／、３−環状リン酸ホスホジェステラーゼ
に対する阻害活性は以下の方法にて測定し、ＰＤＥ−Ｉ
のＩＤ５ｏは０．６ μｇ／ｖｄｌ、 Ｐ Ｄ Ｅ−Ｉ
ＩのＩ Ｄ、ｏは３．０μｇ／ｍｌの結果を得た。The inhibitory activity against butenosine 3/,3-cyclic phosphate phosphogesterase was measured by the following method.
ID5o is 0.6 μg/vdl, P D E-I
The ID,o of I was found to be 3.0 μg/ml.

７テ／ シン３’、 ５’ −環状リン酸＝８−１４Ｃ
アンモニウム塩（２×１０伽）の１×−４モル、７ｘｌ
Ｏ”モルの硫酸マグネシウム、１×１０−３モルのブテ
ノシン５′−リン酸、８Ｘ１０−２モルのトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７，５）ホスホジェステラーゼ１０μｌ（蛋
白量は通常０．３１Ｔ１ｇ／７７１１）に、物質ＰＤＥ
−Ｉ又はＰＤＥ−ＩＩを２μｇ１１μＦ、 ０．５μ
ｆｌ、 ０．２５μ、＠、０．１２５μｇ１０μｇをそ
れぞれ合わせて蒸留水にて全容を０．１１１１１とし、
３７℃２０分間反応させた後、未反応のアデノシン３’
ｔ５’−ｉ状リン酸をアルミナにて吸着させ、１×１０
−２モルのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて溶出し
、その放射活性を測定し、阻害活性を求めた。7te/syn 3', 5'-cyclic phosphoric acid = 8-14C
1x-4 mol of ammonium salt (2x10), 7xl
O'' mol magnesium sulfate, 1 x 10-3 mol butenosine 5'-phosphate, 8 x 10-2 mol Tris-HCl buffer (pH 7.5) 10 μl phosphogesterase (protein amount usually 0.31 T1g/7711) In, the substance PDE
-I or PDE-II 2μg 11μF, 0.5μ
Fl, 0.25μ, @, 0.125μg and 10μg were combined with distilled water to make a total volume of 0.11111,
After reacting at 37°C for 20 minutes, unreacted adenosine 3'
Adsorb t5'-i-form phosphoric acid with alumina and collect 1×10
It was eluted with -2M Tris-HCl buffer (pH 7.5), and its radioactivity was measured to determine the inhibitory activity.

以下本発明によるＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ−ＩＩ製造の
実施例を示すが、本発明によりＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ
−ＩＩの性状、生産方法、抽出精製法が明らかにされ
たので、この明細書に記された知見に基いて、本明細書
に記された方法を修飾した方法が容易に設定される。Examples of the production of PDE-I and PDE-II according to the present invention will be shown below.
Since the properties, production method, and extraction and purification method of -II have been clarified, a modified method of the method described in this specification can be easily established based on the findings described in this specification.

本発明はそのすべての修飾法を包括し、実施例はその例
示で本発明は実施例に限定されるものではない。The present invention includes all modifications thereof, and the Examples are illustrative and the present invention is not limited to the Examples.

実施例 １ ブテノシン３’す５’−ｉ状リン酸ホスホジェステラー
ゼ阻害作用を有する物質を産生ずる放線菌ＭＤ７６９−
Ｃ６株（微工研菌寄第３１７８号）の斜面培養から一白
金耳量を、でんぷん２，０饅、グルコース２．０％、大
豆粉２．０％、酵母エキス０．５％、ＭａＣｌｏ、２５
％、ＣａＣＯ３０，３２％、Ｃ１１ＳＯ４，５Ｈ２Ｏ０
，０００５％、ＭｎＣｌ２４Ｈ２００，０００５％、ｚ
ｎＣ１２・７Ｈ２００，００５％を含む培地１１０ｍ１
づつを５００ｍ１容量の振とうフラスコ９０本に分注し
、１２０’Ｃ。Example 1 Streptomyces MD769- producing a substance having an inhibitory effect on butenosine 3'-5'-i-phosphate phosphogesterase
One platinum loop was obtained from a slant culture of C6 strain (Feikoken Bibori No. 3178), starch 2.0, glucose 2.0%, soybean flour 2.0%, yeast extract 0.5%, MaCl, 25
%, CaCO30,32%, C11SO4,5H2O0
,0005%,MnCl24H200,0005%,z
110ml medium containing nC12・7H200,005%
Dispense each into 90 shake flasks with a capacity of 500 ml and heat at 120'C.

２０分間滅菌したものに接種し、２７℃で毎分１８０回
転の振とうで６日間培養した。The cells were inoculated into cells that had been sterilized for 20 minutes, and cultured for 6 days at 27° C. with shaking at 180 revolutions per minute.

ｐＨは植菌前７．０．１目抜６．８．２目抜５．８．３
目抜６．６．４目抜６゜８．５目抜７．４．６目抜７．
６Ｓｆｉ。pH is 7.0.1 6.8.2 5.8.3 before inoculation
Perforated 6.6.4 Perforated 6° 8.5 Perforated 7.4.6 Perforated 7.
6Sfi.

この６日間培養液７．４１を得、υ埼塩酸にてｐＨ２，
０とし、等量のｎ−ブメノールで抽出した。A 6-day culture solution of 7.41 was obtained, and the pH was adjusted to 2 with υSaic hydrochloric acid.
0 and extracted with an equal amount of n-bumenol.

これを減圧下濃縮乾固し、水６００ｍ１を加え、アンモ
ニア水にてｐＨ８とし、不溶物を除く。This was concentrated to dryness under reduced pressure, 600 ml of water was added, the pH was adjusted to 8 with aqueous ammonia, and insoluble materials were removed.

そしてこの可溶液を塩酸にてｐＨ２，０とし、６００Ｔ
Ｌｌの酢酸ブチルにて２回抽出した。Then, this soluble solution was adjusted to pH 2.0 with hydrochloric acid, and the pH was adjusted to 600T.
Extracted twice with Ll of butyl acetate.

菌体固形部はメタノール２１にて２回攪拌抽出し、これ
を減圧下濃縮し、溶媒留去抜水にて約４００ｍ１とし、
ｎ−ヘキサンにて２回洗浄した。The solid part of the bacterial cells was extracted by stirring twice with methanol 21, concentrated under reduced pressure, and the volume was reduced to about 400 ml by distilling off the solvent and removing water.
Washed twice with n-hexane.

次にこの水溶液を塩酸にてｐＨ２，０とし、酢酸ブチル
４００ｍ１にて２回抽出した。Next, this aqueous solution was adjusted to pH 2.0 with hydrochloric acid and extracted twice with 400 ml of butyl acetate.

これらの酢酸ブチル抽出液を合わせ、減圧下濃縮乾固し
、タール状物質２．２ｇを得た。These butyl acetate extracts were combined and concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 2.2 g of a tar-like substance.

このものはアデノシン３／、 ５Ｖ 、３Ｊ状リン酸ホ
スホジエステラーゼ活性に対する５０％阻害率（ＩＤ５
ｏ）は１２．８μｇＡｌであった。This product has a 50% inhibition rate (ID5
o) was 12.8 μg Al.

これをシリカゲル（マリンクロット社製シリシックアシ
ド１００メツシユ）２００ｇのカラムにてクロマトグラ
フィーを行い精製した。This was purified by chromatography using a 200 g column of silica gel (Silisic Acid 100 mesh manufactured by Mallinckrodt).

クロロホルム−メタノール（９５：５）にて溶出される
活性フラクションとクロロホルム−メタノール（１：１
）のトップに溶出される活性フラクションカ得られた。The active fraction eluted with chloroform-methanol (95:5) and the chloroform-methanol (1:1)
The active fraction eluted at the top of ) was obtained.

クロロホルム−メタノール（９５：５）にて溶出される
活性フラクショ７６５０ｒｌ１ｇは更にシリカゲル（マ
リンクロット社製シリシックアシドＣＣ−７スペシヤル
）３０．９にてカラムクロマトグラフィーを行い。1 g of the active fraction 7650 rl eluted with chloroform-methanol (95:5) was further subjected to column chromatography on 30.9 g of silica gel (Silisic Acid CC-7 Special, manufactured by Mallinckrodt).

クロロホルム−メタノール（９５：５）にて展開すると
、その活性フラクションよりＰＤＥ−Ｈの純結晶１２０
ｍｇが得られた。When developed with chloroform-methanol (95:5), pure crystals of PDE-H were obtained from the active fraction.
mg was obtained.

クロロホルム−メタノール（１：１）にて溶出される活
性フラクション３５０１１１ｇは、メタノールに溶解し
、不溶物を除去後、メタノールにて膨潤させたセファテ
ックスＬＨ−２０のカラム（径１．７ｘ５３ｃｒＩＬ）
にて精製を行った。350,111 g of the active fraction eluted with chloroform-methanol (1:1) was dissolved in methanol, and after removing insoluble matter, it was added to a Sephatex LH-20 column (diameter 1.7 x 53 crIL) swollen with methanol.
Purification was performed at.

そしてその活性部を減圧下濃縮乾固し、メタノールにて
再結しＰＤＥ−Ｉの結晶１２．３ｍｇを得た。The active portion was concentrated to dryness under reduced pressure and reconsolidated with methanol to obtain 12.3 mg of PDE-I crystals.

実施例 ２ ジャーによる培養は、実施例１のフラスコ培養の場合と
同様な培地を調製し、放線菌ＭＤ７．６９ｊＣ６株（微
工研菌寄第３１７８号）の斜面培養から一白金耳量を接
種し、２日間培養したものを第１次種母とし、同一培養
条件にて種母を２％接種し、２日間培養したものを第２
次種母とした。Example 2 For culture in a jar, a medium similar to that in the flask culture in Example 1 was prepared, and one platinum loop was inoculated from a slant culture of Actinomycetes MD7.69jC6 strain (Feikoken Bacteria No. 3178). The seedlings cultured for 2 days were used as the primary seedlings, and 2% seedlings were inoculated under the same culture conditions, and the seedlings cultured for 2 days were used as the 2nd seedlings.
It was used as the next sire.

培地１５１を３０１容のジャーに仕込み、１２′０°Ｃ
３０分間滅菌し、これに先きの種母を５％植菌し。Pour 151 medium into a 301 capacity jar and heat at 12'0°C.
Sterilize for 30 minutes, then inoculate 5% of the seed mother from above.

温度２７°Ｃ１毎分２５０回転攪拌、通気量毎分１５１
で７日間培養した。Temperature: 27°C, stirring at 250 revolutions per minute, aeration rate at 151 revolutions per minute
The cells were cultured for 7 days.

この培養液をバスケット型遠心機で１過し、６１の涙液
を得た、この涙液を６０ｇの活性炭にて処理し、活性成
分を吸着し、水洗後活性炭より５０％アセトン水（ｐＨ
８）１１にて２回溶出し′た。This culture solution was filtered once in a basket centrifuge to obtain 61 tears. This tear fluid was treated with 60 g of activated carbon to adsorb the active ingredients. After washing with water, the activated carbon was removed with 50% acetone water (pH
8) It was eluted twice at 11.

この溶出液は減圧下溶媒留去し、塩酸にてｐＨ２とし酢
酸ブチル１１で２回抽出した。The solvent of this eluate was distilled off under reduced pressure, adjusted to pH 2 with hydrochloric acid, and extracted twice with 11 butyl acetate.

菌体固形部はメタノール１１にて２回攪拌抽出後、メタ
ノールを減圧下留去し、水にて５００１ｎｌとし、塩酸
にてｐＨ２とし、酢酸ブチ／Ｌ＝５００ｍｌにて２回抽
出した。The solid portion of the bacterial cells was extracted with methanol 11 twice with stirring, then the methanol was distilled off under reduced pressure, the volume was adjusted to 5001 nl with water, the pH was adjusted to 2 with hydrochloric acid, and the mixture was extracted twice with butylacetate/L = 500 ml.

これらの酢酸ブチル抽出液を合わせ、減圧下濃縮乾固し
て、メール状物質７．０．９を得た。These butyl acetate extracts were combined and concentrated to dryness under reduced pressure to obtain a mail-like substance 7.0.9.

このもののアテノシン３′。５′−環状リン酸ホスホジ
ェステラーゼに対する阻害活性（ＩＤ５ｏ）は１９ μ
ｇ／ｍｌであった。This atenosine 3'. Inhibitory activity against 5'-cyclic phosphate phosphogesterase (ID5o) is 19 μ
g/ml.

これをシリカゲル（マリンクロット社製シリシックアシ
ド１００メツシユ）５０ｇのカラムにてクロマトグラフ
ィーを行い、クロロホルム、クロロホルム−メタノール
（９９：１）にて展開後、クロロホルム・メタノール（
９５：５）ＩＣで溶出される活性フラクションより、Ｐ
ＤＥ−ＩＩを結晶状に５９．５ ｍｇｑ４た。This was chromatographed on a 50 g column of silica gel (Silisic Acid 100 mesh, manufactured by Mallinckrodt), developed with chloroform, chloroform-methanol (99:1), and then chloroform-methanol (
95:5) From the active fraction eluted by IC, P
59.5 mgq4 of DE-II was obtained in crystalline form.

更にクロロホルム・メタノール（９：１）にて展開し、
ＰＤＥ−Ｉを含む活性フラクション８２３ｒｒＪｇを得
、これをセファテックスＬＨ−２０のカラムクロマトグ
ラフィーにて精製し、ＰＤＥ−Ｉの結晶５９．１ｍｇを
得た。Further, develop with chloroform/methanol (9:1),
823 rrJg of an active fraction containing PDE-I was obtained, which was purified by Sephatex LH-20 column chromatography to obtain 59.1 mg of PDE-I crystals.

実施例 ３ タンクによる培養はＭＤ７６９−Ｃ６株を実施例１と同
様にして３日間培養した種母を第１次種母とし、同一培
養条件にて第１次種母を１．２５％植菌し、２４時間培
養したものを第２次種母とし、更に１３０１容汐ンクに
培地５（［を仕込み、１２００Ｃ３０分間滅菌し、第２
次種母を０．４８％植菌し、毎分２００回転、通気量１
００％、２７°Ｃ２４時間培養したものを第３次種母と
した。Example 3 For culture in a tank, MD769-C6 strain was cultured for 3 days in the same manner as in Example 1, and the primary seed was used as the primary seed, and 1.25% of the primary seed was inoculated under the same culture conditions. The 24-hour cultured material was used as the secondary seed material, and the medium 5 ([) was added to a 1301-volume tank, sterilized at 1200C for 30 minutes, and the second
Inoculated with 0.48% secondary seed mother, 200 revolutions per minute, aeration rate 1
00% and cultured at 27°C for 24 hours, which was used as the tertiary seed mother.

実施例１と同様な培地を５７ｏｌ容メンクに３００１仕
込み、消泡剤として、アテ力メール０．００５多添加し
、１２０℃３０分間滅菌し、これに第３次種母を２優植
菌し毎分２５０回転で攪拌し、２７°Ｃで１１６時間培
養した。3001 of the same medium as in Example 1 was prepared in a 57 ol capacity Menk, 0.005 of Aterikokumer was added as an antifoaming agent, sterilized at 120°C for 30 minutes, and two dominant tertiary seeds were inoculated into this. The mixture was stirred at 250 revolutions per minute and cultured at 27°C for 116 hours.

この培養液をフィル汐−プレスで１過し、１３ｏｌの培
養ｒ液と４５．０ｋｇの菌体固形部を得た。This culture solution was passed through a filter filter once to obtain 13 ol of culture solution and 45.0 kg of solid bacterial cells.

培養１液は塩酸にてｐＨ２としｎ−メタノール９０１に
て抽出し、これをアンモニア水にてｐＨ７とし減圧下濃
縮乾固し、水９１に溶解し、再び塩酸にてｐＨ２とし酢
酸ブチル９１で２回抽出し、減圧下濃縮乾固し、メール
状物質４４．７９を得た。The culture solution was adjusted to pH 2 with hydrochloric acid, extracted with n-methanol 901, adjusted to pH 7 with aqueous ammonia, concentrated to dryness under reduced pressure, dissolved in water 91, adjusted to pH 2 again with hydrochloric acid, and extracted with butyl acetate 91. The extract was extracted twice and concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 44.79 g of a mail-like substance.

このもののアテノシン３’、 ５’−Ｅｉｊ状リン酸ホ
スホジェステラーゼ活性に対するＩＤ５ｏは７．２μｇ
／ｒｎｌであった。The ID5o of this product for atenosine 3', 5'-Eij-like phosphate phosphogesterase activity is 7.2 μg.
/rnl.

菌体固形部は６０７のメタノールにて２回攪拌抽出を行
い、これを減圧下濃縮（ｓｇ）ｔ、、ｎ−ヘキサン２１
にて洗浄後、塩酸にてｐＨ２とし、酢酸ブチル８１にて
２回抽出し、この抽出液を減圧下濃縮乾固し、汐−ル状
物質５２．１ｇを得た。The solid part of the bacterial cells was extracted with stirring twice with 607 methanol, and concentrated under reduced pressure (sg) with 21 g of n-hexane.
After washing with water, the pH was adjusted to 2 with hydrochloric acid and extracted twice with 81 portions of butyl acetate. The extract was concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 52.1 g of a slag-like substance.

このもののアテノシン３’＊ ５’−ＪＪ状リン酸ホス
ホジェステラーゼに対するＩＤ５ｏは３．８μｇ／ｒＩ
ｌｌであった。The ID5o of this product against atenosine 3'* 5'-JJ phosphate phosphogesterase is 3.8 μg/rI
It was ll.

これらのメール状物質をシリカゲルカラムクロマトグラ
フィーにて精製することにより、ＰＤＥ■の結晶３４１
．４ｍｇを得た。By purifying these mail-like substances by silica gel column chromatography, PDE■ crystals 341
．． 4 mg was obtained.

またＰＤＥ−Ｉはシリカゲルカラムクロマトグラフィー
にて精製した後セファテックスＬＨ−２０にて精製し、
ＰＤＥ−■を結晶状に２３９．６ｍｇを得た。In addition, PDE-I was purified by silica gel column chromatography and then purified by Sephatex LH-20.
239.6 mg of PDE-■ was obtained in crystal form.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

参１図はＰＤＥ−Ｉの、第２図はＰＤＥ−ＩＩの臭化カ
リウム銑中で測定した赤外線吸収スペクトルを示す。Figure 1 shows the infrared absorption spectra of PDE-I, and Figure 2 shows the infrared absorption spectra of PDE-II measured in potassium bromide pig iron.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] １ ストレプトミセス属に属するホスホジェステラーゼ
阻害物質ＰＤＥ−ｎ生産菌又はホスホジェステラーゼ阻
害物質ＰＤＥ−ｎ生産菌を好気的に培養し、その培養物
より物質ＰＤＥ−Ｉ又は物質ＰＤＥ−ＩＩを採取するこ
とを特徴とする、ホスホジェステラーゼ阻害物質ＰＤＥ
−Ｉ又はＰＤＥ−ＩＩの製造方法。1. Cultivate aerobically a phosphogesterase inhibitor PDE-n-producing bacterium or a phosphogesterase inhibitor PDE-n-producing bacterium belonging to the genus Streptomyces, and collect the substance PDE-I or PDE-II from the culture. A phosphogesterase inhibitor PDE characterized by
-I or PDE-II manufacturing method.