JPS5832597B2 - Glucose -6- Linsan no Seihou - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はグルコース−６−リン酸の製法に関し、更に詳
しくは微生物を用いてグルコースとメタリン酸またはポ
リリン酸とからグルコース−６−リン酸を製造する方法
に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for producing glucose-6-phosphate, and more particularly to a method for producing glucose-6-phosphate from glucose and metaphosphoric acid or polyphosphoric acid using microorganisms.

本来、解糖系の中間体であるグルコース−６−リン酸は
、ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼの触媒作用によ
りグルコースとアデノシンニリン酸とから生合成される
物質であり、低血圧患者の急性出血治療剤としであるい
はアデノシンニリン酸などの合成原料として有用な物質
である。Glucose-6-phosphate, which is originally an intermediate in the glycolytic system, is a substance that is biosynthesized from glucose and adenosine diphosphate through the catalytic action of hexokinase or glucokinase, and is used as an acute bleeding treatment agent for hypotensive patients. It is also a useful substance as a raw material for the synthesis of adenosine diphosphoric acid, etc.

従来、グルコース−６−リン酸の製造法としては、酵母
からの抽出法あるいは合成法が用いられてきたが、本発
明はこれら従来法とは異なり、安価に供給できるメタリ
ン酸またはポリリン酸を利用し、ポＩＪ ＩＪン酸グル
コキナーゼの作用でグルコース−６−リン酸を製造する
ものである。Conventionally, extraction methods from yeast or synthesis methods have been used to produce glucose-6-phosphate, but the present invention differs from these conventional methods by utilizing metaphosphoric acid or polyphosphoric acid, which can be supplied at low cost. Glucose-6-phosphate is then produced by the action of poIJIJ acid glucokinase.

ポリリン酸グルコキナーゼに関しては、既にミコバクテ
フウム・フレイ、コリネバクテリウム・ジフテリア、コ
リネバクテリウム・キセロシスなどにおいて見出されて
おり、報告されている（Ｂｕｌｌ。Polyphosphate glucokinase has already been found and reported in Mycobacterium freyi, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium xerosis, etc. (Bull.

Ａｃａｄ、Ｐｏ１ｏｎ、Ｓｃｉ、Ｓｅｒ、Ｓｃｉ、Ｂｉ
ｏｌ、、５゜３７９（１９５７）、同誌、９．３７１ （１９６１）、Ｃｏｍｐ、Ｒｅｎｄ 、 、 ２５４
。Acad, Po1on, Sci, Ser, Sci, Bi
ol, 5゜379 (1957), same magazine, 9.371 (1961), Comp, Rend, 254
.

２８５０（１９６２））。2850 (1962)).

本発明者らは本酵素を用いることによってグルコース−
６−リン酸を安価に製造すべく種々研究を重ねた結果、
アクロモバククー属、アニロバククー属、アルカリ土類
金属、ミクロコツカス属、アセトバクター属およびブレ
ビバクテリウム属に属するある種の微生物がグルコース
とメタリン酸またはポリリン酸とからグルコース−６−
リン酸を生産しうる能力を有していることを見出すと共
に、酵素源を基質に作用させるに当って二価金属イオン
を共存させておけばグルコース−６−リン酸の生成量が
著るしく高まることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。By using this enzyme, the present inventors have demonstrated that glucose-
As a result of various research to produce 6-phosphoric acid at low cost,
Certain microorganisms belonging to the genera Achromobactus, Anilobactus, alkaline earth metals, Micrococcus, Acetobacter, and Brevibacterium produce glucose-6-
It was discovered that the enzyme has the ability to produce phosphoric acid, and if divalent metal ions are allowed to coexist when the enzyme source acts on the substrate, the amount of glucose-6-phosphate produced can be significantly increased. The present invention was completed based on this finding.

即ち、本発明はアクロモバクタ−属、アエロバクタ−属
、アルカリ土類金属、ミクロコツカス属、アセトバクク
ー属またはブレビバクテリウム属に属し、グルコースと
メタリン酸またはポリリン酸とからグルコース−６−リ
ン酸を生産しうる能力を有する微生物の培養液、該培養
液から得た菌体もしくは菌体処理物を、二価金属イオン
の存在下または非存在下に、グルコースとメタリン酸ま
たはポリリン酸とに作用させることからなるグルコース
−６−リン酸の製法である。That is, the present invention belongs to the genus Achromobacter, Aerobacter, Alkaline Earth Metal, Micrococcus, Acetobaccus, or Brevibacterium, and is capable of producing glucose-6-phosphate from glucose and metaphosphoric acid or polyphosphoric acid. It consists of allowing a culture solution of a competent microorganism, cells obtained from the culture solution, or a processed product of the cells to act on glucose and metaphosphoric acid or polyphosphoric acid in the presence or absence of divalent metal ions. This is a method for producing glucose-6-phosphate.

本発明に使用される微生物としては、上記の属に属し、
グルコースとメタリン酸またはポリリン酸とからグルコ
ース−６−リン酸を生産する能力を有する微生物であれ
ばいづれも使用でき、たとえばアクロモバククー・ブチ
リ０ＵＴ８００４（微工研菌寄第６９７９号）、アエロ
バクタ−・アエロバクタ０ＵＴ８０１７、アルカリゲネ
ス・フェカリス０ＵＴ８０２５、ミクロコツカス・フラ
バス０ＵＴ８２７６、アセトバクター・キシリナム０Ｕ
Ｔ８３０２（微工研菌寄第６９８１号）ブレビバクテリ
ウム・アンモニアゲネス■ＡＭ１６４５などが好適に使
用される。The microorganisms used in the present invention belong to the above genera,
Any microorganism can be used as long as it has the ability to produce glucose-6-phosphate from glucose and metaphosphoric acid or polyphosphoric acid. 0UT8017, Alcaligenes faecalis 0UT8025, Micrococcus flavus 0UT8276, Acetobacter xylinum 0U
Brevibacterium ammoniagenes AM1645 and the like are preferably used.

上記微生物を培養するに当っては、通常使用される培地
が用いられ、たとえば炭素源としてグルコース、グリセ
ロールなどを用い、窒素源としてペプトン、肉エキス、
酵母エキス、尿素の如き有機態窒素源あるいはアンモニ
ア、硫酸アンモニアの如き無機窒素源を用い、更にリン
酸第−カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウ
ムの如き無機塩、菌株の生育に必要な化合物などを適当
量添加した培地が好適に使用される。In culturing the above-mentioned microorganisms, a commonly used medium is used, for example, glucose, glycerol, etc. are used as a carbon source, and peptone, meat extract, etc. are used as a nitrogen source.
Using organic nitrogen sources such as yeast extract, urea, or inorganic nitrogen sources such as ammonia and ammonium sulfate, as well as inorganic salts such as dipotassium phosphate, dipotassium phosphate, and magnesium sulfate, and compounds necessary for the growth of the bacterial strain. A medium to which an appropriate amount of the following is added is preferably used.

更に上記の如き培地組成を有する培地のリン酸塩をメタ
リン酸またはポリリン酸に代えることにより、該微生物
のグルコース−６−リン酸生産能を顕著に高めることが
できる。Furthermore, by replacing phosphate in a medium having the above-mentioned medium composition with metaphosphoric acid or polyphosphoric acid, the ability of the microorganism to produce glucose-6-phosphate can be significantly increased.

培養は通気かく拌培養の如き好気的条件下に行なうのが
好ましい。The culture is preferably carried out under aerobic conditions such as aerated culture.

また培養温度は２０〜４０°Ｃ程度が好ましく、培養時
間は通常１０〜７０時間で充分である。Further, the culture temperature is preferably about 20 to 40°C, and the culture time is usually sufficient for 10 to 70 hours.

本発明に使用される酵素源としては、上記の如くして得
られた培養液、この培養液から分離した菌体、更には該
菌体の処理物などが使用され、とりわけ菌体処理物が好
適に使用される。As the enzyme source used in the present invention, the culture solution obtained as described above, the bacterial cells isolated from this culture solution, and the processed product of the bacterial cells are used. In particular, the processed product of the bacterial cells is used. Preferably used.

菌体の処理物としては、たとえは菌体を生理食塩水で洗
浄したもの、界面活性剤で処理したもの、音波処理した
もの、あるいはアクリル酸アミド系ポリマーのゲルで包
括した固定化菌体などが挙げられる。Examples of treated bacterial cells include bacterial cells washed with physiological saline, treated with a surfactant, treated with sonication, or immobilized bacterial cells wrapped in an acrylamide polymer gel. can be mentioned.

本発明によれば、上記の如き酵素源をグルコースとメタ
リン酸またはポリリン酸とに作用させることによりグル
コース−６−リン酸を製造することができる。According to the present invention, glucose-6-phosphate can be produced by allowing the enzyme source as described above to act on glucose and metaphosphoric acid or polyphosphoric acid.

本酵素反応はｐＨ４〜８、とりわけｐＨ４〜６．温度２
０〜６０℃、とりわけ３５〜５０℃で行なうのが好まし
い。This enzyme reaction is carried out at a pH of 4 to 8, particularly at a pH of 4 to 6. temperature 2
Preferably, the temperature is 0 to 60°C, especially 35 to 50°C.

また本酵素反応に際し、反応系中に二価金属イオンを共
存させておけはグルコース−６−リン酸の生成量を著る
しく高めることができる。In addition, during this enzymatic reaction, if divalent metal ions are allowed to coexist in the reaction system, the amount of glucose-6-phosphate produced can be significantly increased.

ここに用いられる二価金属イオンとしては、たとえばマ
グネシウムイオン、マンガンイオン、コバルトイオン、
ニッケルイオン、カルシウムイオン、銅イオンなどが挙
げられ、これら二価金属イオンの添加濃度は５Ｘ１０−
３Ｍ〜５×１０−２Ｍ程度が好ましい。Examples of divalent metal ions used here include magnesium ions, manganese ions, cobalt ions,
Examples include nickel ions, calcium ions, copper ions, etc., and the concentration of these divalent metal ions is 5X10-
Approximately 3M to 5×10 −2M is preferable.

反応終了後、生成したグルコース−６−リン酸はイオン
交換樹脂を用いるクロマトグラフィーの如き一般的精製
手段を用いることにより容易に単離精製することができ
る。After completion of the reaction, the produced glucose-6-phosphoric acid can be easily isolated and purified using a common purification means such as chromatography using an ion exchange resin.

以下実施例を挙げて本発明方法を具体的に説明する。The method of the present invention will be specifically explained below with reference to Examples.

実施例 １ グルコース２係、グルタミン酸２係、硫酸マグネシウム
０．１％、リン酸第−カリウム０．５％、酵母エキス０
．１ ％から成る組成の培地（ｐＨ７，０）３０ｙｄに
アクロモバククー・ブチＩＪＯＵＴ８００４（微工研菌
寄第６９７９号）を植菌し、３０℃で２０時時間上う培
養する。Example 1 Glucose 2 parts, glutamic acid 2 parts, magnesium sulfate 0.1%, potassium phosphate 0.5%, yeast extract 0
．． Achromobactus buchi IJOUT8004 (Feikoken Bacteria No. 6979) was inoculated into 30 yd of a medium (pH 7.0) with a composition of 1% and cultured at 30° C. for 20 hours.

得られた培養液から菌体を集め、生理食塩水で２回洗浄
し酵素源とする。Bacterial cells are collected from the obtained culture solution, washed twice with physiological saline, and used as an enzyme source.

かくして調製した菌体を１０■／−（乾燥菌体として）
となるように０．１ Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）にけ
ん濁させる。The bacterial cells thus prepared were 10/- (as dry bacterial cells).
Suspend in 0.1 M acetate buffer (pH 5.0) so that

この菌体けん濁液にグルコース５０ｍ９７１１１１！、
メタリン酸（片山化学工業株式会社製、以下同様）２％
、およびマグネシウムイオン１０−２Ｍとなるように各
取分を添加し、３７°Ｃで１０時間反応させる。Glucose 50m971111 in this bacterial cell suspension! ,
Metaphosphoric acid (manufactured by Katayama Chemical Industry Co., Ltd., hereinafter the same) 2%
, and 10 −2 M of magnesium ion, and reacted at 37° C. for 10 hours.

かくして反応液中に生成したグルコース−６−リン酸は
５．２Ｔｎ９／ＴｒＬｌでアミノ。Glucose-6-phosphate thus produced in the reaction solution has an amino acid content of 5.2Tn9/TrLl.

実施例 ２ 実施例１と同様にして得られた培養液から菌体を集め、
生理食塩水で２回洗浄後、０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５
，０）に菌体を１ｏｏｙｎ９／ｒｒＬｌ（乾燥菌体とし
て）になるようにけん濁する。Example 2 Bacterial cells were collected from the culture solution obtained in the same manner as in Example 1,
After washing twice with physiological saline, 0.2M acetate buffer (pH 5)
, 0) to a ratio of 1ooyn9/rrLl (as dry cells).

このけん濁液に界面活性剤カチオン−８を２ｍ９／ＴＬ
ｌになるように添加し、３７℃で３０分間振とうする。Add 2 m9/TL of surfactant cation-8 to this suspension.
1 and shaken at 37°C for 30 minutes.

かくして調製したものを酵素源とし、これにグルコース
５０１ｒＩ９／ｙｍ、メタリン酸２係、およびマグネシ
ウムイオン１０−２Ｍとなるように各成分を添加し、３
７°Ｃで１時間反応させる。The product thus prepared was used as an enzyme source, and to this were added glucose 501rI9/ym, metaphosphoric acid 2, and magnesium ions so that the concentration was 10-2M.
Incubate for 1 hour at 7°C.

かくして反応液中に生成したグルコース−６−リン酸は
１７．２■／ｍｌ！であった。The amount of glucose-6-phosphoric acid thus produced in the reaction solution was 17.2 μ/ml! Met.

実施例 ３ 実施例１と同様にして得られた菌体けん濁液を９０００
サイクルで１０分間音波処理する。Example 3 A bacterial cell suspension obtained in the same manner as in Example 1 was
Sonicate on cycle for 10 minutes.

この音波処理物を酵素源（タンパク質１０ｍｇ／ｍのと
し、これにグルコース５０ｍ９／１ｎ１１メタリン酸２
係、および下記第１表に示す二価金属イオン１０−２Ｍ
となるように各成分を添加し、３７℃で１時間反応させ
る。This sonicated product was used as an enzyme source (protein 10mg/m), glucose 50m9/1n11 metaphosphoric acid 2
and divalent metal ion 10-2M shown in Table 1 below.
Add each component so that

かくして反応液中に生成したグルコース−６−リン酸の
量は下記第１表に示す通りであった。The amount of glucose-6-phosphoric acid thus produced in the reaction solution was as shown in Table 1 below.

実施例 ４ 実施例３と同様にして得られた酵素源（タンパク質１０
ｍｙ ７ｍｌ ）にグルコース５０７７に９／ｍＡ’
、ポリリン酸（片山化学工業株式会社製）０．５％、お
よびマグネシウムイオン１０−２Ｍとなるように各成分
を添加し、３７°Ｃで１時間反応させる。Example 4 Enzyme source obtained in the same manner as Example 3 (protein 10
my 7ml) to glucose 5077 to 9/mA'
, 0.5% of polyphosphoric acid (manufactured by Katayama Chemical Industry Co., Ltd.), and each component were added so that the concentration of magnesium ions was 10 −2 M, and the mixture was reacted at 37° C. for 1 hour.

かくして反応液中に生成したグルコース−６−リン酸は
３．９■／ｙｄであった。The amount of glucose-6-phosphoric acid thus produced in the reaction solution was 3.9 .mu./yd.

実施例 ５ 実施例３と同様にして得られた酵素源（タンパク質１０
１ｎＩｌ／ｒＩＬｌ）にグルコース１００ ｍ９ ／ｒ
ａｌ、メタリン酸２係、およびマグネシウムイオン５×
１０−２Ｍとなるように各成分を添加し、３７８Ｃで１
時間反応させる。Example 5 An enzyme source obtained in the same manner as in Example 3 (protein 10
1nIl/rILl) to glucose 100 m9/r
al, metaphosphoric acid 2, and magnesium ion 5×
Each component was added to give a concentration of 10-2M, and the mixture was heated to 1 at 378C.
Allow time to react.

かくして反応液中に生成したグルコース−６−リン酸は
６３■／ｒＩＬｌであった。The amount of glucose-6-phosphoric acid thus produced in the reaction solution was 63 μ/rILl.

実施例 ６ 実施例１と同様にして得られた培養液から菌体を集め、
生理食塩水で２回洗浄後、再び生理食塩水にけん濁する
。Example 6 Cells were collected from the culture solution obtained in the same manner as in Example 1,
After washing twice with physiological saline, suspend in physiological saline again.

この菌体けん濁液４ｒｎｌ（湿菌体約１ｇを含有）にア
クリル酸アミド５０ｒｆＬｌ、Ｎ。To 4rnl of this bacterial cell suspension (containing about 1g of wet bacterial cells) was added 50rfLl of acrylamide, N.

Ｎ′−メチレン−ビス−アクリル酸アミド４０■、５係
β−（ジメチルアミノ）プロピオニトリル０．５ｍｌお
よび２．５係過硫酸カリウム０．５ＴＩＬｌを添加し、
室温で２０分間反応させる。Add 40 μl of N'-methylene-bis-acrylic acid amide, 0.5 ml of 5-functional β-(dimethylamino)propionitrile, and 0.5 TIL of 2.5-functional potassium persulfate,
Let react for 20 minutes at room temperature.

反応終了後、生成したゲル１．０ｇを粉砕する。After the reaction is completed, 1.0 g of the gel produced is crushed.

かくして調製した固定化菌体を０．２ Ｍ酢酸緩衝液（
ｐＨ５，０） ２．５ｍｌにとり、これにグルコース１
０１ｎ９／ＴＬｌ、メタリン酸２係、およびマグネシウ
ムイオン１０−２Ｍとなるように各成分を添加し、３７
°Ｃで２時間反応させる。The thus prepared immobilized bacterial cells were added to 0.2 M acetate buffer (
pH 5,0) Add 1 ml of glucose to 2.5 ml.
01n9/TLl, metaphosphoric acid 2, and magnesium ions were added so that the concentration was 10-2M, and 37
Incubate for 2 hours at °C.

かくして反応液中に生成したグルコース−６−リン酸は
８．２■／ｍｌであった。The amount of glucose-6-phosphoric acid thus produced in the reaction solution was 8.2 .mu./ml.

実施例 ７ グルコース２ｆ０、グルタミン酸２係、硫酸マグネシウ
ム０．１’％、脱リン酸化した酵母エキス０．１係、お
よびメタリン酸Ｏ，Ｏ５係（無菌口過して添加）から成
る培地３０ｍ１にアクロモバクタ−・ブチリ０ＵＴ８０
０４（微工研菌寄第６９７９号）を植菌し、３０°Ｃで
２０時間振とう培養する。Example 7 Achromobacter was added to 30 ml of a medium consisting of 2f0 glucose, 2 parts glutamic acid, 0.1'% magnesium sulfate, 0.1 part dephosphorylated yeast extract, and 0 and 5 parts metaphosphoric acid (added via sterile sieve). -・Butiri 0UT80
04 (Feikoken Bibori No. 6979) and cultured with shaking at 30°C for 20 hours.

得られた培養液から菌体を集め、生理食塩水で２回洗浄
する。Bacterial cells are collected from the resulting culture solution and washed twice with physiological saline.

かくして調製した菌体を１０ｍ９／ｒＬｌ（乾燥菌体と
して）になるように０．１ Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０
）にけん濁する。The thus prepared bacterial cells were added to 0.1 M acetate buffer (pH 5,0
).

この菌体けん濁液を９０００サイクルで１０分間音波処
理する。This bacterial cell suspension is sonicated for 10 minutes at 9000 cycles.

この音波処理液を酵素源（タンパク質１０■／就）とし
、これにグルコース１００Ｔｎ９／ｍｌ、メタリン酸２
係、およびマグネシウムイオン１０−２Ｍとなるように
各成分を添加し、３７°Ｃで１時間反応させる。This sonicated solution was used as an enzyme source (protein 10μ/ml), glucose 100Tn9/ml, metaphosphoric acid 2
Components were added so that the concentration of hydrogen and magnesium ions was 10 −2 M, and the mixture was reacted at 37° C. for 1 hour.

かくして反応液中に生成したグルコース−６−リン酸は
１２０ｒｎ９／−であった。The glucose-6-phosphoric acid thus produced in the reaction solution was 120rn9/-.

実施例 ８ 肉エキス０．５係、食塩０．５係、グルコース０．５係
、ペプトン１係、酵母エキス１咎から成る培地（ｐＨ７
，ｏ ） １００ｍＡに下記第２表に示す菌株を植菌し
、３０℃で２０時時間上う培養する。Example 8 A medium (pH 7) consisting of 0.5 parts meat extract, 0.5 parts salt, 0.5 parts glucose, 1 part peptone, and 1 part yeast extract.
, o) Inoculate the strains shown in Table 2 below at 100 mA and culture at 30°C for 20 hours.

培養終了後、培養液より菌体を集め、生理食塩水で２回
洗浄する。After culturing, cells are collected from the culture solution and washed twice with physiological saline.

この菌体を１０１ｎ９／１ｒＬｌ（乾燥菌体として）と
なるように０．１ Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）にけん
濁させ、９０００サイクルで１０分間音波処理する。The cells are suspended in 0.1 M acetate buffer (pH 5,0) to a ratio of 101n9/1rLl (as dry cells), and sonicated at 9000 cycles for 10 minutes.

この音波処理液を酵素源（タンパク質１０ｍｐ／ｄ）と
し、これにグルコース５０■／ｍｌ、メタリン酸２咎、
およびマグネシウムイオン１０−２Ｍとなるように各成
分を添加し、３７°Ｃで１時間反応させる。This sonicated solution was used as an enzyme source (protein 10 mp/d), and glucose 50 μ/ml, metaphosphoric acid 2 g/ml,
Then, each component was added so that the magnesium ion concentration was 10 −2 M, and the mixture was reacted at 37° C. for 1 hour.

かくして反応液中に生成したグルコース−６−リン酸の
量は下記第２表に示す通りであった。The amount of glucose-6-phosphoric acid thus produced in the reaction solution was as shown in Table 2 below.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １ アクロモバククー属、アエロバクタ−属、アルカリ
土類金属、ミクロコツカス属、アセトバクター属または
ブレビバクテリウム属に属し、グルコースとメタリン酸
またはポリリン酸とからグルコース−６−リン酸を生産
しうる能力を有する微生物の培養液、または該培養液か
ら得た菌体もしくは菌体処理物を、グルコースとメタリ
ン酸またはポリリン酸とに作用させることを特徴とする
グルコース−６−リン酸の製法。 ２ アクロモバクタ−属、アニロバククー属、アルカリ
土類金属、ミクロコツカス属、アセトバクター属または
ブレビバクテリウム属に属し、グルコースとメタリン酸
またはポリリン酸とからグルコース−６−リン酸を生産
しうる能力を有する微生物の培養液、または該培養液か
ら得た菌体もしくは菌体処理物を、二価金属イオンの存
在下にグルコースとメタリン酸またはポリリン酸とに作
用させることを特徴とするグルコース−６−リン酸の製
法。[Scope of Claims] 1. Belongs to the genus Achromobactus, Aerobacter, Alkaline Earth Metal, Micrococcus, Acetobacter, or Brevibacterium, and produces glucose-6-phosphate from glucose and metaphosphoric acid or polyphosphoric acid. A method for producing glucose-6-phosphoric acid, which comprises allowing a culture solution of a microorganism having the ability to act on glucose and metaphosphoric acid or polyphosphoric acid to react with glucose and metaphosphoric acid or polyphosphoric acid with a culture solution of a microorganism having the ability to . 2 A microorganism belonging to the genus Achromobacter, Anilobactus, alkaline earth metal, Micrococcus, Acetobacter or Brevibacterium and having the ability to produce glucose-6-phosphate from glucose and metaphosphoric acid or polyphosphoric acid. Glucose-6-phosphate, characterized in that a culture solution, or bacterial cells or a bacterial cell treatment product obtained from the culture solution is made to act on glucose and metaphosphoric acid or polyphosphoric acid in the presence of a divalent metal ion. manufacturing method.