JPS61260889A - Production of calcium malate - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To produce readily and efficiently the titled substance, by treating a suspension of calcium fumarate with an immobilized microorganism in producing the calcium L-malate by the microbiological method. CONSTITUTION:A strain, e.g. Brevibacterium ammoniagenes, having fumarase activity is cultivated to recover clutivated microbial cells, which are than made highly permeable. The above-mentioned microbial cells are suspended in a sodium alginate solution, stirred and dropped into a calcium chloride solution to give beadlike gel, in which the microorganism having the fumarate activity is immobilized. The beads are washed and stirred with a calcium fumarate suspension to afford the aimed calcium L-malate.

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物学的方法による１−リンゴ酸カルシウム
の製造方法ζこ関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Field of Application] The present invention relates to a method for producing calcium 1-malate by microbiological methods.

〔従来の技術〕[Conventional technology]

Ｌ−リンゴ酸は医薬としては、アミノ醗輸液の成分とし
て、あるいは肝機能不全や高アンモニア血症の治療に利
用されている。更に、本発明者らが先に提出したところ
の「補酵素再生系を利用した有用物質の製造方法」に関
する特許出願（特願昭５９−２４９０９１号）の中で詳
しく述べている如く、Ｌ−アラニン生産の製造原料とし
てＬ−ＩＪンゴ酸は非常ζこ有用な物質である。L-malic acid is used as a medicine as a component of amino acid infusions or for the treatment of liver dysfunction and hyperammonemia. Furthermore, as described in detail in the patent application (Japanese Patent Application No. 59-249091) related to "Method for producing useful substances using coenzyme regeneration system" previously submitted by the present inventors, L- L-IJ malic acid is a very useful substance as a raw material for alanine production.

従来、Ｌ−リンゴ酸カルシウムの製造方法としては、乳
酸菌の菌体を用いて、下記の反応式でフマル酸カルシウ
ム懸濁液からＬ−リンゴ酸カルシウム懸濁液を生産する
方法が良く知られている〔ジャーナル拳オブ・ジェネラ
ル・アプライド・マイクロバイオロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ
、　Ａｐｐｌ。Conventionally, a well-known method for producing calcium L-malate is a method of producing a calcium L-malate suspension from a calcium fumarate suspension using lactic acid bacteria cells using the following reaction formula. [Journal of General Applied Microbiology (J, Gen
, Appl.

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）第６巻、第１０８頁、１９６０
ｆｆ。Microbiol, Volume 6, Page 108, 1960
ff.

フマル酸カルシウム；ミフマル酸カルシウム≠Ｌ−（固
体）　　　　　　（溶液） リンゴ酸カルシウム−ｃ−Ｌ−リンゴ酸カルシウム（溶
液）　　　　　　　　（固体） すなわち、フマル酸カルシウムの溶解度はｐＨ５，８，
３０℃で７．８ＸＩＦ’Ｍであり、懸濁液中で溶解状態
のフマル酸カルシウムは非常にわずかであるが、それが
乳酸菌菌体中のフマラーゼによってＬ　＋　ＩＪンゴ酸
カルシウムに酵素交換される。ところが、Ｌ−リンゴ酸
カルシウムの溶解度も同条件では５．２Ｘ１０−”Ｍと
フマル酸カルシウ又ヨりも更に小さいためにＬ−リンゴ
酸カルシウムの殆んどは、直ちに結晶状態となって析出
する。その結果、結晶状態のフマル酸カルシウムからフ
マラーゼ作用によって結晶状態のＬ−リンゴ満カルシウ
ムが生成する。フマラーゼの酵素反応の平衡が１−リン
ゴ酸の生成方法に傾いていることも一−リンゴ酸カルシ
ウム製造に非常に好都合であり、これらの理由から効果
的にＬ−リンゴ酸カルシウムの結晶を生育し得ることが
知られている。Calcium fumarate; Calcium mifumarate≠L-(solid) (solution) Calcium malate-c-L-calcium malate (solution) (solid) That is, the solubility of calcium fumarate is pH 5, 8,
It is 7.8XIF'M at 30°C, and very little calcium fumarate is dissolved in the suspension, but it is enzymatically exchanged to L + IJ calcium nate by fumarase in the lactic acid bacteria cells. . However, under the same conditions, the solubility of calcium L-malate is 5.2 x 10-''M, which is even smaller than that of calcium fumarate, so most of the calcium L-malate immediately turns into a crystalline state and precipitates. As a result, crystalline calcium fumarate generates crystalline calcium fumarate through the action of fumarase.The fact that the equilibrium of the enzymatic reaction of fumarase is tilted toward the production of 1-malic acid It is very convenient for calcium production, and for these reasons it is known that calcium L-malate crystals can be grown effectively.

従来、固定化フマラーゼを用いてＬ−リンゴ酸化合物を
製造する方法としては、ポリアクリルアミドおよびカラ
ジーナンゲルにフマラーゼまたはそれを含む菌体等を固
定化して、フマル酸ナトリウム溶液からＬ−リンゴ酸ナ
トリウムを１！ｌ！ｍ的に製造する方法が良く知られて
いるが、固定化菌体または固定化酵素によってフマル醗
カルシウムからＬ−リンゴ酸カルシウムを製造した報告
はない。さらに、フマラーゼの固定化にアルギン酸カル
シウムゲルを使用した例は報告されていない。その理由
はアルギン酸カルシウムゲルビーズに反応の基質である
フマル酸す）　ＩＪウムを接触させるとアルギン酸カル
シウムがアルギン酸ナトリウムに変換し、ゲルビーズが
崩壊してしまうため、ｌ　＋　ＩＪンゴ酸化合物の生産
にはアルギン酸ゲルの使用は不可能と考えられてきたこ
とによる。Conventionally, as a method for producing an L-malic acid compound using immobilized fumarase, fumarase or bacterial cells containing it are immobilized on polyacrylamide and carrageenan gel, and sodium L-malate is extracted from a sodium fumarate solution by 1 ml. ! l! Although a method for producing it manually is well known, there is no report on producing calcium L-malate from calcium fumarate using immobilized bacterial cells or immobilized enzymes. Furthermore, there have been no reports of using calcium alginate gel to immobilize fumarase. The reason for this is that when calcium alginate gel beads are brought into contact with fumaric acid, which is a reaction substrate, calcium alginate converts to sodium alginate and the gel beads disintegrate. This is because the use of gels was thought to be impossible.

〔発明が解決しようとする問題点〕[Problem that the invention seeks to solve]

従来の乳酸菌の菌体を用いる方法では、反応液中のＩ、
　＋　ＩＪンゴ酸カルシウムの結晶と乳酸菌の菌体を完
全に分離することは、両物質がともに微小であるｔめ非
常に困難であった。また、一度使用した菌体を再度酵素
反応に使用する場合には高速回転での遠心分離処理等の
非常に経費、労力および時間を要することが問題であっ
た。本発明の目的は、従来の方法に替り得る、容易で効
率的なＬ−リンゴ酸カルシウム製造法を提供することに
ある。In the conventional method using lactic acid bacteria cells, I,
+IJ It was extremely difficult to completely separate the crystals of calcium malate and the cells of lactic acid bacteria because both substances were minute. Another problem is that when the once-used bacterial cells are used again for an enzyme reaction, it requires a lot of expense, labor, and time, such as centrifugation treatment at high speed. An object of the present invention is to provide an easy and efficient method for producing calcium L-malate, which can replace conventional methods.

〔問題点を解決するための手段〕[Means for solving problems]

本発明を概説すれば、本発明はＬ−リンゴ酸カルシウム
の製造方法に関する発明であって、フマル酸カルシウム
懸濁曖を、フマラーゼ活性を有する微生物をアルギン酸
カルシウムゲルに固定化したビーズ状ゲルで処理するこ
とを特徴とする。To summarize the present invention, the present invention relates to a method for producing calcium L-malate, in which a calcium fumarate suspension is treated with a bead-shaped gel in which microorganisms having fumarase activity are immobilized on a calcium alginate gel. It is characterized by

本発明者らは、Ｌ−リンゴ酸カルシウムの効率的かつ簡
便な製造方法について詳しく検討した結果、フマラーゼ
活性を有する微生物を直径３ｍ１ｊｆ度の大きさのアル
ギン酸カルシウムゲルで固定化することにより、生産物
であるＬ−リンゴ酸カルシウムの微小結晶と酵素源であ
る菌体を固定化したビーズを簡単に分離することが出来
ると共に、ビーズ状の固定化菌体を７マラーゼ源として
何回もＬ−リンゴ酸カルシウムの生産に使用出来ること
を見い出した。As a result of detailed studies on an efficient and simple production method for calcium L-malate, the present inventors found that the product could be produced by immobilizing microorganisms with fumarase activity in calcium alginate gel with a diameter of 3 m1jf. It is possible to easily separate microcrystals of L-calcium malate, which is an enzyme source, and beads on which bacteria cells, which are an enzyme source, are immobilized. It was discovered that it can be used for the production of calcium acid.

前述した如く、ｐ−リンゴ酸化合物の生産にアルギン酸
カルシウムゲルを使用した例はこれまでに報告されてい
ない。As mentioned above, there have been no reports of using calcium alginate gel for the production of p-malic acid compounds.

本発明はこの新知見を基にするものであり、フマラーゼ
活性を有する微生物をアルギン酸カルシウムゲルで固定
化し、得られたビーズ状ゲルをフマラーゼ源とすること
を特徴とするものである。The present invention is based on this new knowledge and is characterized by immobilizing microorganisms having fumarase activity with calcium alginate gel and using the resulting bead-like gel as a fumarase source.

次に本発明を更に詳しく説明する。Next, the present invention will be explained in more detail.

酵素源としては、たとえばブレビバクテリウム・アンモ
ニアジェネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ＆ｍｍｏ
ｎｉａｇｅｎｅａ　）　ＡＴＯＯ−６８７２を使用しう
るが、これに限定されるものでなく、他のフマラーゼ活
性を有する菌株はいずれでも使用可能である。As an enzyme source, for example, Brevibacterium ammoniagenes (Brevibacterium&mmo
niagenea) ATOO-6872 can be used, but is not limited thereto, and any other strain having fumarase activity can be used.

培地組成は、窒素源としては肉エキス、ペプトン、ポリ
ペプトン、脱脂粉乳、アスパラギン酸、グルタミン酸等
の有機物および硫安、尿素、アンモニア等を用いる。炭
素源としてはコーン・ステープ・リカー、グルコース、
シュクロース、フマル酸、クエン酸、リンゴ酸等の糖質
および有機酸が使用可能である。更にりん酸第−カリ、
りん酸第二カリ等のりん酸塩、ｔｉｔ酸マグネシウム、
塩化マグネシウム等のマグネシウム塩、および亜鉛、カ
ルシウム、マンガン、鉄等の金属イオンおよび各々の使
用菌株の生育に必須の微量物質を適当量添加した培地が
使用できる。The medium composition uses meat extract, peptone, polypeptone, skim milk powder, organic substances such as aspartic acid and glutamic acid, and ammonium sulfate, urea, ammonia, etc. as nitrogen sources. Carbon sources include corn staple liquor, glucose,
Carbohydrates and organic acids such as sucrose, fumaric acid, citric acid, and malic acid can be used. Furthermore, potassium phosphate,
Phosphates such as dipotassium phosphate, magnesium titate,
A medium to which appropriate amounts of magnesium salts such as magnesium chloride, metal ions such as zinc, calcium, manganese, iron, etc., and trace substances essential for the growth of each strain used can be used.

培養はフラスコの場合は振盪培養、タンク培養の場合は
通気攪拌培養で実施できる。培養温度は通常２０〜４５
℃、好ましくは２５〜３７°Ｃ１一般にｐＨは５．０〜
９．０、好ましくは７．０〜８．０で行なう。タンク培
養の場合、培養時間は通常６〜７２時間である。上記方
法で培養した菌体中に大部分のフマラーゼが、また培養
液中にわずかのフマラーゼが生成されている。Culture can be carried out by shaking culture in a flask, or by aeration agitation culture in a tank culture. Culture temperature is usually 20-45
°C, preferably 25-37 °C1 Generally pH is 5.0-37 °C
9.0, preferably 7.0 to 8.0. In the case of tank culture, the culture time is usually 6 to 72 hours. Most fumarase is produced in the bacterial cells cultured by the above method, and a small amount of fumarase is produced in the culture solution.

フマラーゼ活性の測定はフマル酸溶液に溶液状態または
固定化フマラーゼを添加して一定時間反応させ、生成し
たＬ−リンゴ酸を定量すること番こより行なった。Ｌ−
リンゴ酸の定量はべ一リンガー・マンハイム・山之内社
のＬ−リンゴ酸定量用キット（ＦキットＬ−リンゴ酸、
カタログ４１３９０６８）を使用した。The fumarase activity was measured by adding solution or immobilized fumarase to a fumaric acid solution, reacting for a certain period of time, and quantifying the produced L-malic acid. L-
For the determination of malic acid, use the L-malic acid determination kit (F kit L-malic acid,
Catalog 4139068) was used.

培養終了後、遠心分離によって菌体を回収詔よび洗浄し
た後高透過性菌体にしたものをアルギン酸カルシウムゲ
ルで菌体を固定化する。菌体を高透過性にする方法とし
ては、トライトンＸ−１００（米国ロームアンドハース
社製）を０．０１〜０．１％程度共存させて凍結処理す
る方法、酢酸エチル、トルエン、アセトン等の有機溶媒
で処理する方法、または菌体を乾燥する方法等がある。After the culture is completed, the bacterial cells are collected by centrifugation, washed, and made into highly permeable bacterial cells, which are then immobilized with calcium alginate gel. Methods for making bacterial cells highly permeable include freezing treatment in the coexistence of 0.01 to 0.1% Triton There are methods such as treating with an organic solvent or drying the bacterial cells.

いずれにしても細胞膜の透過性を高めて菌体内のフマラ
ーゼが自由に基質のフマル酸と接触し得る状態の菌体が
得られれば良い。In any case, it is sufficient to obtain a bacterial cell in which the permeability of the cell membrane is increased so that fumarase within the bacterial cell can freely contact the substrate fumaric acid.

ついで、高透過性菌体を０．５〜５％程度のアルギン酸
ナトリウム溶液中に懸濁する。菌体の添加量はアルギン
酸ナトリウム溶液１００−当り１〜３０ｔ（湿菌体）が
適当である。充分攪拌混合した後ゲルを０．０１〜１％
の塩化カルシウム溶液中に滴下することによりフマラー
ゼ活性を有する微生物が固定化されたアルギン酸カルシ
ウムゲルビーズを作ることが出来る。Next, the highly permeable bacterial cells are suspended in a 0.5 to 5% sodium alginate solution. The appropriate amount of bacterial cells to be added is 1 to 30 t (wet bacterial cells) per 100 kg of sodium alginate solution. After stirring and mixing thoroughly, add 0.01 to 1% gel.
Calcium alginate gel beads on which microorganisms having fumarase activity are immobilized can be prepared by dropping the gel beads into a calcium chloride solution.

別の固定化ビーズの作り方としては、高透過性に処理し
ていない生菌体をアルギン酸カルシウムゲルビーズに固
定化した後、界面活性剤、胆汁末、またはデオキシコー
ル酸で処理することｔこより、固定化後ｔこ菌体を高透
過性にして、フマラーゼ活性を有するゲルビーズを作る
ことも可能である。ざらに生菌体を固定化した後栄養培
地で１〜２日振盪培養あるいは通気攪拌培養をすること
で固定化増殖菌体を調製した後、前記した如く、高透過
性菌体を作ることも出来る。Another way to make immobilized beads is to immobilize live bacterial cells that have not been treated to make them highly permeable to calcium alginate gel beads, and then treat them with a surfactant, bile powder, or deoxycholic acid. It is also possible to make gel beads with fumarase activity by making the bacterial cells highly permeable after fermentation. After immobilizing viable bacterial cells on a sieve and then culturing them with shaking or aeration for 1 to 2 days in a nutrient medium to prepare immobilized proliferating bacterial cells, highly permeable bacterial cells can be produced as described above. I can do it.

このようにして得られたフマラーゼ活性を有するアルギ
ン酸カルシウムゲルビーズは蒸留水または適当な中性領
域のｐＨの緩衝液で充分洗浄したのち、フマル酸カルシ
ウム懸濁液と攪拌することにより、効果的にＬ−リンゴ
酸カルシウムを製造することが出来る。この際に、ゲル
ビーズを充分洗浄して菌体持ち込みのアンモニウム塩、
補酵素等を完全に除去することは、フマル酸からアズパ
ラギン酸、Ｌ−リンゴ酸からオキザロ酢酸の副生を抑え
て、フマル酸からＬ−リンゴ酸への転換収率を上げる点
で非常に重要である。基質のフマル酸カルシウムは、そ
のものを直接使用しても良いが、フマル酸を原料とする
場合には、フマル酸懸濁液に炭酸カルシウムを攪拌しつ
つ、徐々に添加し、懸濁液のｐＨが５〜７になったとこ
ろで添加を止める。このようにして得られた懸濁液を基
質として使用すれば良い。The thus obtained calcium alginate gel beads having fumarase activity are thoroughly washed with distilled water or an appropriate buffer with a pH in the neutral range, and then stirred with a calcium fumarate suspension to effectively L - Calcium malate can be produced. At this time, wash the gel beads thoroughly and remove ammonium salt from the bacterial cells.
Complete removal of coenzymes, etc. is very important in terms of suppressing the by-products of aspartic acid from fumaric acid and oxaloacetic acid from L-malic acid and increasing the conversion yield of fumaric acid to L-malic acid. It is. Calcium fumarate as a substrate may be used directly as it is, but when fumaric acid is used as a raw material, calcium carbonate is gradually added to the fumaric acid suspension while stirring to adjust the pH of the suspension. Stop adding when the value reaches 5 to 7. The suspension thus obtained may be used as a substrate.

酵素反応液中のフマル酸カルシウムの量は２％〜４０％
（ｗ／ｖ　）が適当である。７マラーゼ（菌体）が固定
化されたところのアルギン酸カルシウムゲルビーズの添
加ＨＬｔ反応液１０〇−当り、１０〜５０ｆ（温血ｆｆ
１）が適当である。The amount of calcium fumarate in the enzyme reaction solution is 2% to 40%.
(w/v) is appropriate. 7. Addition of calcium alginate gel beads on which marase (bacterial cells) has been immobilized. 10 to 50 f (warm blood ff
1) is appropriate.

反応液ｐＨは５〜９、温度は２０〜４５°Ｃが適当であ
り、この条件で５〜７２時間攪拌混合することにより反
応液中のフマル酸カルシウムを殆んどＬ−リンゴ酸カル
シウムにすることができる。The appropriate pH of the reaction solution is 5 to 9 and the temperature is 20 to 45°C. By stirring and mixing under these conditions for 5 to 72 hours, most of the calcium fumarate in the reaction solution is converted to calcium L-malate. be able to.

〔作　用〕[For production]

本発明によれば、カルシウムイオン共存下での反応であ
るため、アルギン酸カルシウムゲルのビーズは非常５こ
高い強度を示し、転換反応中のゲルビーズの物理的破損
は殆んど見られない。According to the present invention, since the reaction is carried out in the presence of calcium ions, the calcium alginate gel beads exhibit extremely high strength, and almost no physical damage to the gel beads is observed during the conversion reaction.

更に、反応終了後は適当な口径を有する濾過面を装置し
たバスケットタイプ等の連続遠心機または簡単には適当
な篩を用いることで非常に簡単番こ、Ｌ−リンゴ酸カル
シウムの結晶とフマラーゼ源であるアルギン酸カルシウ
ムゲルビーズを分層することが可能である。ついで、遠
心分離によってＬ　＋　ＩＪンゴ酸カルシウムの結晶を
回収し、乾燥させれば粗製品が得られる。目的に応じて
洗浄、溶媒沈殿処理等の操作によって高純度のＬ−リン
ゴ酸カルシウムを得ることも可能である。Furthermore, after the reaction is completed, the crystals of calcium L-malate and the source of fumarase can be separated very easily by using a continuous centrifuge such as a basket type equipped with a filtration surface of an appropriate diameter or simply by using an appropriate sieve. It is possible to separate layers of calcium alginate gel beads. Then, crystals of L + IJ calcium malate are collected by centrifugation and dried to obtain a crude product. It is also possible to obtain highly pure calcium L-malate by operations such as washing and solvent precipitation depending on the purpose.

また得られたリンゴ酸カルシウムは、この懸濁液にほぼ
等モルの硫安を添加して適当時間攪拌することで、リン
ゴ省アンモニウムとＩｉｉ！酸カルシウムにすることが
できる。この際生成する硫酸カルシウムの結晶を遠心分
難等で除去することによりＬ−リンゴ酸アンモニウムの
溶液を得ることが出来る。Ｌ−リンゴ酸アンモニウムは
、先ｌこ本発明者らが特願昭５９−２４９０９１号で詳
しく述べている如く、これｌこリンゴ酸脱水素酵素とア
ラニン脱水素酵素を作用させて、両酵素の補酵素である
ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドを酸化型と還
元型に再生循環利用することにより、Ｌ−アラニンを生
産する際の出発原料として使用することが出来る。In addition, the obtained calcium malate can be converted into apple-saving ammonium by adding approximately equal moles of ammonium sulfate to this suspension and stirring for a suitable period of time. Can be made into calcium acid. A solution of ammonium L-malate can be obtained by removing the calcium sulfate crystals generated at this time by centrifugation or the like. As previously described in detail by the present inventors in Japanese Patent Application No. 59-249091, ammonium L-malate is produced by the action of malate dehydrogenase and alanine dehydrogenase. By recycling and recycling nicotinamide adenine dinucleotide, which is a coenzyme, into an oxidized form and a reduced form, it can be used as a starting material for producing L-alanine.

更にＬ−リンゴ酸カルシウム懸濁液に等モルの硫酸を加
えて、適当時間攪拌することでＬ−リンゴ酸と硫酸カル
シウムを生産することも可能である。遠心分離等で結晶
状態の硫酸カルシウムを除去した後、更に通常行なわれ
ているように陽イオン交換樹脂、および陰イオン交換樹
脂カラムを用いて溶解状態の硫酸カルシウムを除去する
ことで高純度のＩ、　＋　ＩＪンゴ酸を得ることが出来
る。Ｊ、、　＋　ＩＪンゴ酸は、前述した如く、アミノ
酸輸液の成分として、あるいは、肝機能不全や高アンモ
ニア血症の治療薬として有用なものである。Furthermore, it is also possible to produce L-malic acid and calcium sulfate by adding equimolar amounts of sulfuric acid to a calcium L-malate suspension and stirring for an appropriate period of time. After removing crystalline calcium sulfate by centrifugation, etc., high purity I , + IJ malic acid can be obtained. J, , + IJ As mentioned above, malic acid is useful as a component of amino acid infusions or as a therapeutic agent for liver dysfunction and hyperammonemia.

次に実験例によってブレビバクテリウム・アンモニアジ
ェネスＡＴＯＯ−６８７２のフマラーゼを用いるフマル
酸カルシウムからＬ−リンゴ酸カルシウムの製造番こつ
いて説明する。Next, the process for producing calcium L-malate from calcium fumarate using Brevibacterium ammoniagenes ATOO-6872 fumarase will be explained using an experimental example.

実験例 グルコース２１／ｄｉ、フマル酸０．５ｆ／ｄｉ、コー
ン―スチープ・リカー１．０ｆ／ｄｔ、尿素０．２ｆ／
ｄｌ、ＫＨｔＰＯ４０，２？　／　ｄｉ、　ＭｇＳＯ４
６７ＨＩＯｏ、　０５　Ｐ　／ｄｉ　（ｐＨ７，０）よ
りなる培地１００ｄをＳＯＯ＊容三角フラスコに入れ、
１２０″Ｃで１５分間殺菌する。上記培地にブレビバク
テリウム・アンモニアジェネスＡＴ○ｏ−６８７２を接
種し、３０°Ｃ１４８時間、１４０　ｒｐｍで回転振盪
培養する。培養終了液を遠心分離して菌体を得、これを
洗浄した後、トライトンＸ−１０００，０５％存在下、
凍結することにより、菌体を高透過性にする。２％アル
ギン酸ナトリウム溶液７０１Ｌｔに５％（湿）菌体懸濁
液３０−を混合した後、混合溶液を０．１Ｍの塩化カル
シウム溶液中に滴下してビーズを形成させる。このよう
にして得たビーズを充分洗浄し固定化フマラーゼとした
。Experimental example Glucose 21/di, Fumaric acid 0.5f/di, Corn-steep liquor 1.0f/dt, Urea 0.2f/di
dl, KHtPO40,2? /di, MgSO4
100 d of a medium consisting of 67 HIOo, 05 P /di (pH 7,0) was placed in a SOO* Erlenmeyer flask,
Sterilize at 120"C for 15 minutes. Brevibacterium ammoniagenes AT○o-6872 is inoculated into the above medium and cultured at 30°C for 148 hours with rotational shaking at 140 rpm. Centrifuge the cultured solution to remove bacterial cells. After washing this, in the presence of Triton X-1000.05%,
Freezing makes the bacterial cells highly permeable. After mixing 30-liter of 5% (wet) bacterial cell suspension with 701 Lt of 2% sodium alginate solution, the mixed solution is dropped into a 0.1M calcium chloride solution to form beads. The beads thus obtained were thoroughly washed to obtain immobilized fumarase.

フマル酸５０ｔを蒸留水５００ｄに懸濁させた後、ｐＨ
メータで懸濁液のｐＨを調べながら徐々に炭酸カルシウ
ムを添加し、懸濁液のｐＨが５．８となる時点で炭酸カ
ルシウムの添加を止めた。これに前述のビーズ２００Ｆ
を加えて３０°Ｃで酵素反応を行なった。反応液中の溶
解しているＬ−リンゴ酸カルシウムおよびフマル酸カル
シウムの容量を経時的に測定した結果を第１図に示した
。すなわち第１図はＬ−’）ンゴ酸とフマル酸の容量を
反応時間（時間、横軸）と各酸濃度（１’９／ｄ、Ｍ１
軸）との関係で示したグラフである。After suspending 50 t of fumaric acid in 500 d of distilled water, the pH
Calcium carbonate was gradually added while checking the pH of the suspension with a meter, and the addition of calcium carbonate was stopped when the pH of the suspension reached 5.8. Add to this the beads 200F mentioned above.
was added and the enzymatic reaction was carried out at 30°C. Figure 1 shows the results of measuring the volumes of calcium L-malate and calcium fumarate dissolved in the reaction solution over time. In other words, in Figure 1, the capacity of malic acid and fumaric acid (L-') is expressed by the reaction time (time, horizontal axis) and each acid concentration (1'9/d, M1
This is a graph shown in relation to the axis).

第１図より明らかな如く、反応４６時間で反応液中に溶
解している状態のフマール酸が減少していることがわか
る。この結果は反応液中の殆んどのフマル酸カルシウム
塩がＬ−リンゴ醸カルシウム塩に転換したことを示して
いる。As is clear from FIG. 1, it can be seen that the amount of fumaric acid dissolved in the reaction solution decreased after 46 hours of reaction. This result shows that most of the fumaric acid calcium salt in the reaction solution was converted to L-apple calcium salt.

反応液から適当なメツシュの篩を用いることにより簡単
に固定化フマラーゼビーズを除去することが出来る。更
ζこ、デカンテーション、ｐ過または遠心分離して、Ｌ
−リンゴ酸カルシウム結晶を集め、エタノール洗浄を２
回した後真空乾燥によって乾燥粉末７８２を得た。フマ
ル酸からのモル収率は９３．３％であった。The immobilized fumarase beads can be easily removed from the reaction solution using a suitable mesh sieve. Further, decantation, filtration or centrifugation to remove L
- Collect calcium malate crystals and wash with ethanol for 2
After spinning, dry powder 782 was obtained by vacuum drying. The molar yield from fumaric acid was 93.3%.

反応液中のフマル酸カルシウムおよびＬ−リンゴ酸カル
シウムの定量結果を表−１に示す。Table 1 shows the quantitative results of calcium fumarate and calcium L-malate in the reaction solution.

ただし、両者は遊離の酸として示しである。However, both are shown as free acids.

４６時間反応液中の液体部分に１０％弱のＬ−リンゴ酸
カルシウムが含まれているが、これも反応液を濃縮する
ことにより結晶として回収することが可能である。The liquid portion of the 46-hour reaction solution contains a little less than 10% of calcium L-malate, which can also be recovered as crystals by concentrating the reaction solution.

固定化フマラーゼゲルビーズの活性は使用後も殆んど失
活は見られず、何回も繰り返えし使用可能である。The activity of the immobilized fumarase gel beads shows almost no deterioration even after use, and can be used repeatedly.

〔実施例〕〔Example〕

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが本発
明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically explained with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples in any way.

実施例　１ １００２のフマル酸を蒸留水１ｔに懸濁、攪拌しながら
炭酸カルシウムを添加してｐＨを６．０に調整する。こ
れに実験例と同様の方法で得た固定化フマラーゼビーズ
４００２を添加して、３０°Ｃで３日間攪拌した。反応
液を適当に希釈した後、フマル酸分子の二重結合に由来
する２５０ｎｍでの特異的吸収を測定することで、反応
液中正こ溶解状態のフマル酸カルシウムが殆んどないこ
とを確認した。次いで１０メツシユの篩でビーズを除去
した後、Ｌ　＋　ＩＪンゴ酸カルシウムの結晶を遠心分
離で回収し、５００ｄのエタノールで２回洗った後、乾
燥した。乾燥粉末１７０２が得られた。粉末中のＩ、　
＋　ＩＪンゴ酸を定量した結果、フマル酸からのモル収
率は９４％であった。Example 1 1002 fumaric acid was suspended in 1 t of distilled water, and calcium carbonate was added while stirring to adjust the pH to 6.0. Immobilized fumarase beads 4002 obtained in the same manner as in the experimental example were added to this, and the mixture was stirred at 30°C for 3 days. After appropriately diluting the reaction solution, it was confirmed that there was almost no calcium fumarate in a normally dissolved state in the reaction solution by measuring the specific absorption at 250 nm derived from the double bond of the fumaric acid molecule. . The beads were then removed using a 10-mesh sieve, and the L + IJ calcium malate crystals were collected by centrifugation, washed twice with 500 d of ethanol, and then dried. Dry powder 1702 was obtained. I in powder,
+ IJ The molar yield from fumaric acid was 94% as a result of quantitative determination of malic acid.

実施例　２ １　Ｋｑのフマル酸を蒸留水１０ｔに懸濁し、攪拌しつ
つ、炭酸カルシウムを徐々に添加してｐＨを５．８に調
整する。これに実験例と同様の方法で得た固定化フマラ
ーゼビーズ４に４を添加して３０°Ｃで３日間攪拌した
。反応液の２５０ｎｍにおける吸光度を調べて、反応液
中に溶解状態のフマル酸カルシウムが殆んどなくなって
いることを確認した。次いで１０メツシユの篩でビーズ
を除去した後１．Ｉ、　＋　ＩＪンゴ酸カルシウムの結
晶を遠心分離で回収した。集めた結晶は６Ｌのエタノー
ルで２回洗った後乾燥した。粉末１．７紛が得られ、粉
末中のＬ−リンゴ酸を定量した結果、フマル酸からのモ
ル収率は９３．５％であった。Example 2 1 Kq of fumaric acid is suspended in 10 t of distilled water, and while stirring, calcium carbonate is gradually added to adjust the pH to 5.8. 4 was added to the immobilized fumarase beads 4 obtained in the same manner as in the experimental example, and the mixture was stirred at 30°C for 3 days. The absorbance of the reaction solution at 250 nm was examined, and it was confirmed that almost no dissolved calcium fumarate was present in the reaction solution. Then, after removing the beads with a 10-mesh sieve, 1. I, + IJ calcium malate crystals were collected by centrifugation. The collected crystals were washed twice with 6 L of ethanol and then dried. Powder 1.7 powder was obtained, and as a result of quantifying L-malic acid in the powder, the molar yield from fumaric acid was 93.5%.

〔発明の効果〕〔Effect of the invention〕

以上詳細に説明したとおり、本発明によって、Ｌ−リン
ゴ酸カルシウムを効率良く簡便な方法で製造することが
できた。本発明は従来法と比較して、工業的に優れたＬ
−ＩＪンゴ酸カルシウムの製造技術を開発した点で効果
を有する。As explained in detail above, according to the present invention, calcium L-malate could be produced efficiently and by a simple method. The present invention provides industrially superior L compared to conventional methods.
- It has an effect in that it has developed a manufacturing technology for IJ calcium malate.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第１図は固定化フマラーゼ（菌体）によってフマル酸カ
ルシウムからＬ−リンゴ酸カルシウムを生産する酵素反
応中の反応液中に溶解しているフマル酸カルシウムとＬ
−リンゴ酸カルシウムの各型の経時変化を反応時間と各
酸濃度との関係で示したグラフである。Figure 1 shows calcium fumarate and L-calcium dissolved in the reaction solution during an enzymatic reaction to produce calcium L-malate from calcium fumarate using immobilized fumarase (microbial cells).
- It is a graph showing the change over time of each type of calcium malate in relation to reaction time and each acid concentration.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] １、フマル酸カルシウム懸濁液を、フマラーゼ活性を有
する微生物をアルギン酸カルシウムゲルに固定化したビ
ーズ状ゲルで処理することを特徴とするＬ−リンゴ酸カ
ルシウムの製造方法。1. A method for producing calcium L-malate, which comprises treating a calcium fumarate suspension with a bead-like gel in which microorganisms having fumarase activity are immobilized on calcium alginate gel.