JPS582676B2 - Ｄｌ− フエニルグリシンアミドノ ブンカツホウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＤＬ−フエニルグリシンアミドの分割方法に係
る。

ラセミ型フエニルグリシンはフエニルクリシンまたはそ
の誘導体あるいはその前１駆物を酸を用いて塩を形成さ
せ、選択晶出または他の分離技術を含む従来の方法によ
り光学的に活性な対掌対に分割できる。

本発明の目的は好ましくは選択的な酵素の加水分解によ
るラセミ型フエニルグリシンアミドの分割方法である。

アミノ酸アミドが酵素によって選択的に加水分解される
ことは知られている。

フエニルアラニンアミドなどの芳香族アミノ酸 アミド
は一般にパパイン、プロメリンまたはフィシンなどの酵
素の影響下で加水分解が可能である。

しかし本発明者はこれらの酵素がフエニルグリシンアミ
ドを加水分解しないことを発見した。

右旋性フエニルグリシンアミドと左旋性フエニルグリシ
ンとはラセミ型フエニルグリシン アミドから出発して
製造しうろことは今回発見された所である。

本発明はＤＬ−フエニルグリシンアミドカ適当なアミノ
ペプチターゼにより加水分解されること、及び右旋性−
フエニルグリシンアミド及び（または）左旋性フエニル
グリシンが単離されることを特徴とするものである。

前記単離はいかなる従来の技術でも実癩できる。

与えたアミノペプチクーゼが適当か否かは実施例中に記
載した技術により確認される。

好ましい酵素は短時間でラセミ型アミドの高度立体特殊
加水分解を行うロインンーアミノペプチダーゼ（エンチ
ーム コミッションナンバー３．４．１．１）である。

反応はアミノペプチダーゼ酵素による他のラセミ型アミ
ノ酸アミド加水分解のためのジクソン・アンド・ウエツ
ブ（ Ｄｉｘｏｎ ＆Ｗｅｂｂ） 「酵素」第２４７
頁（１９６５年）に記載されたような従来の条件下で実
施できる。

温度は２０〜４０℃に保持するのが望ましく反応はｐＨ
約７〜９．５の緩衝水溶液中で行う。

たとえばマンガン塩類及びマグネシウム塩類などの活性
化合物を添加してもよい。

右旋性一フエニルグリシンアミド及び左旋性一フエニル
グリシン反応生成物の単離処理方法は遊離アミノペプ
チダーゼまたは水不溶性アミノペプチダーゼを利用する
かしないかに関係はない。

左旋性フエニルグリシンは水中に僅かに溶けるので、不
溶性酵素を使用する時は、不溶性酵素上に左旋性一グリ
シンの晶出を防ぐために薄い溶液中で行わねばならない
。

方法の両変形においては左旋性一フエニルグリシンは右
旋性−フエニルクリシンアミドから抽出、晶出または１
つまたはそれ以上のイオン交換樹脂によって分離できる
。

左旋性−フエニルグリシンはそのま５であるいはラセミ
化後除去できる。

ＤＬ−フエニルグリシンは酸とアルコールとによってフ
エニルグリシン ，アルキルエステルの塩に転化するこ
とができ、該エステルはアンモニアで処理してＤＬ−フ
エニルグリシン アミドをうろことができ、これを同じ
方法に復帰させることもできる。

この処理方法から得た右旋性一フエニルグリシ，ンアミ
ドは該アミドを硫酸、塩酸、ベンゼンスルポン酸、また
はｌ・ルエンスルホン酸などの強酸水溶液とともに加熱
することによりラセミ化せずに右旋性一グリシン塩に加
水分解することができる。

この塩はアンモニアを用いて処理すれば右旋性一グリシ
ンが遊離の形で晶出する。

このようにして本発明はまた右旋性一フエニルグリシン
の製造方法を含み、この方法ではＤ Ｌ−フエニルグリ
シンアミドを適当なアミノペプチダーゼにより選択的に
加水分解し、続いて右旋性一フエニルグリシ，ンアミド
を単離し、このアミドを右旋性一グリシンまたはその酸
附加塩に転化することができる。

α−アミノベンジルペニシリンの製造の出発材料として
右旋性グリシンを使用する。

左旋性一アスハラキンー左旋性一フエニルグリシンメチ
ルエステル（甘味剤）の出発材料としては、例えば左旋
性一フエニル グリシンを使用する。

アミノペプチダーゼは遊離の状態または不溶性の状態、
たとえば不溶性和体に共原子価的に結合した状態で使用
できる。

本発明は次の実症例を引用して説明するがこれらにより
限定されるものではない。

実施例 Ｉ ＤＬ−フエニルグリシンアミド・塩酸塩３． ０ ７’
９モル（５６０ｍｌ？）を攪拌機を備えた反応容器内で
ｐＩ−｛９．０を有する緩衝溶液（ホウ酸一塩化力ＩＪ
一水酸化ナｌ− ＩＪウム）５２．Ｏｍｌ中に室温で溶
解した。

Ｍｇｃ Ｉ２０． １ ２ ５一モル溶液２． ２ ｒ
ｕｌ及びＭｎｃ１２０．０２５モル溶液０．１ｍｌを添
加後、約１規定の水酸化ナトリウム２．０ｍｌによって
ｐＨを８．５の価に調整する。

次にロイシン アミノペプチダーゼ０． ４ ｍｇ（豚
の腎臓からのメルク２ ５ ０ １． ０酵素懸濁液８
０〜）をこの溶液に添加して室温においてｐＨ８．５で
１時間半攪拌した。

薄層クロマトグラフ分析は左旋性一フエニルグリシンア
ミドが十分左旋性−フエニルクｌ）シ”ＡＣ加水分解さ
れたことを示す。

２０時間以上の反応時間後、反応混合物はアミノ酸分析
により次のものを含んでいた。

：左旋性一フエニルグリシン０，４０重量％（能率−１
００％）及び右旋性一フエニルグリンンアミド０．３９
重量％（収率約９ ９．５ ）実椎例 ２ 攪拌機を備えた反応容器中で水８０ｍｌ中のＤＬ一７エ
ニルグリシンアミド塩酸塩８ ２． ３ ｍ９モル（６
０グラム）と、Ｍｇｃｌ２３００ｍＩ？と、及びＭｎｃ
１２ １ｍ９との溶液を約１規定の水酸化ナトｌ）ウ
ム２５ｍｌによりｐＦ｛ ８． １に調整する。

この透明溶液にロイシンアミノペプチダーゼ（メルク２
５０１０酵素懸濁液３ ０ ０ｍｐ） １．５ｍＩ？を
添加後、溶液を室温で４時間攪拌する。

反応の間約１規定の塩酸及び自動滴定装置により反応混
合物のｐ ｝｛を８．１〜９．１の価に調節する。

この期間後、塩酸によってｐ Ｉ−｛を６．５に調整し
次に反応混合物を蒸発により（３００Ｃ；水欽１２ｍｍ
）容量５０ｍｌに濃縮する。

晶出した左旋性−フエニルグリシンを炉過により単離ず
る。

左旋性一フエニルグリシンの収量は２．０グラム（能率
−８３．３％）この左旋性一フエニルクリシンの比旋光
度ハ：（Ｊ％’ 一十１５６°（ Ｈｃ ｌ ２．６重
量％：Ｃ＝１．６）参考：バイルンユクイン１．４
１．１１ １１８８頁〔ａ２５−±１５７５°（ Ｉ
｛ｃ ｌ ２．６重量％：Ｃ＝１．６）Ｄ 選択性：％左旋性一フエニルクリシンー９９５濃塩酸５
０ｍｌを沖液に加えると右旋性−フエニ；ルグリシンア
ミド・塩酸塩が晶出し、沖過により単離される。

右旋性一フエニルグリシンアミド・塩酸塩の収量は２．
５グラム（能率８３．６％）右旋性−フエニルグリシン
アミド塩酸塩の分子旋光度は：（ Ｎ２５−−１ ８
６．５°（水：Ｃ＝０．８）参考：バイルシュタイン
１４ １１１ １１８９頁Ｎ２５−−１８８ （水
：Ｃ＝０．８） 選択性：％右旋性一フエニル グリシンアミド・塩酸塩
−９９，５ ） ６規定塩酸２０ｒｕｌ！中の生成右旋性−フエニル
グリシンアミド・塩酸塩溶液を１時間半煮沸する。

反応混合物を蒸発、乾涸した後蒸発残渣に水２０ｍｌを
吸収させる。

この溶液の薄層クロマトグラフ分析は右旋性−フエニル
グリシンアミドが十分に右旋性一フエニルグリシンに転
化したことを示す。

溶液のｐＨを濃アンモニアにより６．５の価に調整し、
晶出した右旋性−フエニルグリシンをガラス炉過器を通
じて沖過し、水５ｍｌを用いて沖過器上で洗う。

右旋性−フエニルグリシンの収量は０．３５グラム（能
率−８１％）で、この右旋性−グリシンの比旋光度は： （ロ）２ばー−１４７°（Ｃ＝０．６：２規定塩酸）参
考；バイルンユタイン １４ １１１ １１８７頁
元甘一−１５３°（Ｃ＝０．６：２規定塩酸）選択性：
％右旋性−フエニルグリシン＝９８実施例 ３ 水１００ｍｌ中のＤＬ−フエニルグリシンアミド塩酸塩
５．０７ｉＱモル（ ９ ３ ０■）と、ＭｇｃＩ２
５０■と、及びＭｎ ｃ ｌ ２約０．２１ｎ９との溶
液を１規定の水酸化ナトリウムによりｐＨ８．０に調整
した。

この溶液に１９７４年のビオテクノロジー・，アンド・
ビオエンジニーアリング（Ｂｉ ｏ−ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ第ＸＶＩ
巻、第２７５〜７７頁）に記載されたようにして得た０
３重量％の重さを有する３−アミノープロピルートリエ
トキシリル・ビオーグラス（Ｂｉ ｏ−Ｇｌ ａｓｓ）
に共原子価的に結合したロイシンアミノペプチダーゼ（
メルク２５０１０）２５０ｍ９を添加した後、この溶液
を室温で１８時間攪拌した。

ガラス粉末に結合されたロイシンアミノペプチターセノ
沖過後、薄層クロマトグラフィー試験に付した。

この試１験はガラスに共原子価的に結合されたロイシン
アミノペプチダーゼによってＤＬ一フエニルグリシンア
ミドが等モル量の左旋性−グリシンと右旋性一フエニル
グリシンアミドに転化されたことを示す。

Ｐ液を１規定のＮａＯＨによりｐＨ１０．０に調整した
後、Ｈ十型のアンバライト■・Ｒ−Ｃ・イオン交換器１
００グラム上に通人した。

次に１．００ｍｌの水をイオン交換装置に通人し、流出
液を真空中で容量１５ｍｌに蒸発し、左旋性一フエニル
グリンンを沖過により単離した。

薄層クロマトグラフイーによって純粋となった左旋性フ
エニルグリシンの収量は０．３４グラム（能率９０％）
である。

この左旋性一フエニルグリシンの比旋光度は次のようで
ある。

（ｃａ２，：一十１ ５ ７°（ＨＣＩ重量％：Ｃ＝１
．６）参考：バイルシュタイン １４ ＩＩＩ １
］．８８頁（ｃａ”，’一＋１５７．ｓ°（ ＨＣ ｔ
２．６重量％： Ｃ＝ １．６ ）選択性：％左旋性
一フエニル゛クリンン−９９．８％アンバーライト■・
Ｒ−Ｃ・−５０に結合された右旋性−フエニルグリシン
アミドを０．５規定の硫酸１５０ｒｎｌで抽出した。

流出液を真空中で蒸発して１０ｒＩＬｌに濃縮した後１
時間煮沸した。

冷却後濃アンモニア水溶液で中和し、晶出した右旋性−
フェニルグリシンをガラス沖過器で沖過し、沢過器上で
５ｍｌの水で洗った。

右旋性一フエニルグリシンの収量は０．３３グラム（能
率９０％）である。

見出された比旋光度は： （ｃｃＦ，，’一−１ ５ ２（ Ｃ＝０．６ ； ２
規定Ｈｃｌ）参考：バイルンユタイン １４ ＩＩＴ
１１８７頁輸”，，’一一１ ５３ （Ｃ＝０．６
： ２規定塩酸）選択性：右旋性一フエニルクリシン
％−９９．２％実施例 ４ ３５．０ｍｌの緩衝溶液（ホウ酸一塩化カリー水酸化ナ
トリウム）中のＤＬ−フエニルグリシンアミド・塩酸塩
、１．６２〜モル（０．３グラム）と、Ｍｇｃ１２ １
．２ｍ９と、及びＭｎｃ１２０．３ｍ９との溶液中に室
温において、かつｐＨ８．１で攪拌機を備えた反応容器
中で攪拌しながらロイシンアミノペプチダーゼ（ｓｅｒ
ｖａ２７ ７１ ７ ：雄牛の眼からの）０５■を添加
する。

反応混合物のｐＨを１５分の間に８６に上げた後一定に
保つ。

薄層クロマトグラフ分析は反応混合物が４５分後及び４
時間後に等モル量の左旋性一フエニルグリシン及び右旋
性一フエニルグリシンアミドから成ることを示す。

６時間の反応後行ったアミノ酸分析は同一の結果を示し
た。

即ち：左旋性一フエニルグリシンｏ．３５重量％（収率
−１００％） 右旋性一フエニルグリシンアミド０．３４重量％（収率
−９９％） 実癩例 ５ ＤＬ−Ｈ−フエニルグリシンアミド・塩酸塩１．６ηモ
ル（０３グラム）を３０ｒｎｌの緩衝溶液（ホウ酸一塩
化カリー水酸化ナトリウム）中にｐＩ｛７。

Ｏにおいて溶解した。０．１２５モルＭｇｃ１２溶液Ｌ
Ｏｍｌ及び００２５モルＭｎｃｌ２溶液０． １ ｍｌ
の添加後、アミノペプチダーゼＭ（エンチーム コミッ
ション ナンバー３．４，１１．２シグマナンバーＡ−
７７６１から得た豚の腎臓からの「粒子状に固化したア
ミノペプチダーゼ」）ｏ． ｓ ｒｎ９を添加する。

ｐＨを７．１に調製し、混合物を２１時間攪拌した。

この時間中ｐＨは次第にｐＨ ７．４５に増加した。

反応混合物の試料を薄層クロマトグラフイーに ．より
分析した。

２時間後、アミノ酸混合物はフエニル グリシン３モル
％から、２０時間後ニハ７エニルグリシン５０モル％か
ラ成ル。

攪拌を継続する。

２４時間後アミノ酸分析はフエニル グリシンｏ．３４
ｚ量％及びフエニルグリ．シンアミド０．４０重量％を
示し、１００時間後フエニルグリシン０．４５重量％及
びフエニルクリシンアミド０，３５重量％を示した。

このようにこの酵素は不適当ではないが前の実症例で使
用したロイシンアミノペプチダーゼより劣る。

本発明の実捲の態様をとり括めで説明すると次のように
なる。

１）適当なアミノペプチダーゼ゛として、ロイシンアミ
ノペプチダーゼを使用するようにした特許請求の範囲に
記載の方法。

２）酵素加水分解を酸性度７〜９．５、温度２０〜４０
゜Ｃにおいて行う特許請求の範囲または実捲の態様１）
に記載の方法。

３）アミノペプチダーゼを不溶性の形態で使用するよう
にした特許請求の範囲及び実癩の態様１）， ２）に記
載の方法。

４）特許請求の範囲及び実柿の態様１）〜３）のいずれ
か１つの方法によって得た右旋性一フエニルグリシンア
ミド。

５）特許請求の範囲並に実癩の態様１）〜３）のいずれ
か１つの方法によって得た左旋性−フエニルグリシン。

６）明細書中で示しかつ実椎例中で説明したようにして
右旋性一フエニルグリシンアミド及び左旋性一フエニル
グリシンを製造する方法。

７）ＤＬ−フエニルグリシンアミドを特許請求の範囲及
び実椎の態様１）〜３）のいずれかの方法により酵素的
に加水分解し、右旋性−フエニルグリシンアミドを分離
し、アミドを右旋性一フエニル グリシンに転化するよ
うにした右旋性−フエニルグリシンの製造方法。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. Ｉ ＤＬ−フエニルグリシンアミドを適当なアミノペ
   プチダーゼを用いて加水分解させ、右旋性一フエニルグ
   リシンアミド及び（または）左旋性一フエニルグリシン
   を通常の方法で単離することを特徴とする右旋性一フエ
   ニルグリシンアミドと左旋性−フエニルグリシンを製造
   する方法。