JPS5822200B2 - How to measure serum components - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血清成分の測定に酵素反応系を用い生成する過
酸化水素をペルオキシダーゼの存在下比色定量する場合
、血清に共存するビリルビンの干渉をＥＤＴＡ−鉄錯体
を予め加えて置くことによって回避捷たは軽減する方法
に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION When the present invention uses an enzymatic reaction system to measure serum components and colorimetrically quantitates generated hydrogen peroxide in the presence of peroxidase, the interference of bilirubin coexisting in serum can be eliminated by pre-containing EDTA-iron complex. Concerning how to avoid or reduce by adding additional information.

血清中には常にビリルビンが存在し、正常人では総ビリ
ルビンとして約０．５Ｔｖｄｉ以下が普通であるが病的
には著しく増加し２０Ｔｎ９／ｄｌに達することもある
。Bilirubin is always present in serum, and in a normal person, total bilirubin is normally less than about 0.5 Tvdi, but in pathological conditions it increases markedly and can reach 20 Tn9/dl.

これらのビリルビンは血清成分の比色法による測定に種
々の干渉を行ない測定値に誤差を与える原因となる。These bilirubins cause various interferences in the colorimetric measurement of serum components, causing errors in the measured values.

特に最近では酵素を用いる生体成分の渭淀か繁用されて
いるが、その中でも過酸化水素−ペルオキシダーゼ−水
素供与体反応系（過酸化水素系）を用いる方法か数多く
使用されている。Particularly recently, biological components using enzymes have been frequently used, and among these methods, many methods using hydrogen peroxide-peroxidase-hydrogen donor reaction system (hydrogen peroxide system) have been used.

この系においてビリルビンは水素供与体と競合し測定値
に負の影響を与える（臨床化学第８巻、第１号６３〜７
２（１９７９））。In this system, bilirubin competes with the hydrogen donor and has a negative effect on the measured values (Clinical Chemistry Vol. 8, No. 1, 63-7
2 (1979)).

このようなビリルビンの干渉は測定する成分が血清中に
少量しか存在しない場合特に問題となる。Such bilirubin interference is particularly problematic when the component to be measured is present in only a small amount in serum.

たとえば尿酸、クレアチニン、遊離脂肪酸、スフィンゴ
ミエリン、リゾレシチンの場合がそわであり、さらに微
量成分の場合は問題は深刻で過酸化水素系測定法の適用
が困難という隘路があった。For example, it is difficult to measure uric acid, creatinine, free fatty acids, sphingomyelin, and lysolecithin, and the problem is even more serious when it comes to trace components, making it difficult to apply hydrogen peroxide-based measurement methods.

従って過酸化水素系においてビリルビンの一干渉を受け
ない方法の開発が強く望まれていた。Therefore, there has been a strong desire to develop a method that does not suffer from the interference of bilirubin in hydrogen peroxide systems.

これらの問題に関する先行技術としてはすでにフェロシ
アン化合物を用いる方法が示されている。As a prior art related to these problems, a method using a ferrocyan compound has already been shown.

たとえば特許公報昭５５−２５８４０号あるいはＰ。For example, Patent Publication No. 55-25840 or P.

Ｆｏｓｓａｔｉ他、クリニカルケミストリー２６／２．
２２７−２３１．（１９８０）の中でフェロシアン化合
物によるビリルビンの干渉回避を次のように説明してい
る。Fossati et al., Clinical Chemistry 26/2.
227-231. (1980) explains the avoidance of bilirubin interference by ferrocyanide compounds as follows.

すなわち■フェロシアン化合物が過酸化水素−ペルオキ
シダーゼにより酸化されてフェリシアン化合物となる。That is, (1) a ferrocyan compound is oxidized by hydrogen peroxide-peroxidase to become a ferricyan compound;

■フェリシアン化合物はビリルビンよりも発色性水素供
与体を選択的に酸化し発色させ自身はフェロシアン化合
物に戻る。■Ferrocyanide compounds selectively oxidize color-forming hydrogen donors than bilirubin, develop color, and return to ferrocyanide compounds.

このほかフェロシアン化合物による効果についてはＰ、
Ｆｏｓｓａｔｉ等により詳しく述べられているが、欠点
としてフェロシアン化合物あるいはフェリシアン化合物
はそれ自体毒性はないとされているか光または酸処理で
分解しシアン化合物を遊離するとされているので排水の
水質保全上問題がある。In addition, regarding the effects of ferrocyanide compounds, see P.
As described in detail by Fossati et al., the disadvantage is that ferrocyanic compounds or ferricyanide compounds are said to be either not toxic in themselves or to decompose with light or acid treatment to liberate cyanide compounds, so they cannot be used to preserve the water quality of wastewater. There's a problem.

本発明者等はフェロシアン化合物に替る毒性の全く心配
のない多数の化合物を検索した結果ＥＤＴＡ−鉄（Ｉ）
ま、たはＥＤＴＡ−鉄（Ｉ）の錯体に著しい効果のある
ことを見出し本発明を完成した。The present inventors searched for a large number of compounds that are completely free of toxicity as an alternative to ferrocyanide compounds, and found that EDTA-iron(I)
Furthermore, the present invention was completed by discovering that a complex of EDTA-iron(I) has a remarkable effect.

本発明によれば血清成分の測定に酵素反応系を適用し生
成する過酸化水素によりペルオキシダーゼの存在下発色
性水素供与体を酸化することによシ当該成分を比色定量
する方法においてＥＤＴＡ−鉄錯体を添加することによ
り血清に共存するビリルビンの干渉を回避または軽減す
ることを特徴とする血清成分の測定方法が提供される。According to the present invention, an enzymatic reaction system is applied to the measurement of serum components, and a chromogenic hydrogen donor is oxidized by the generated hydrogen peroxide in the presence of peroxidase. A method for measuring serum components is provided, which is characterized by adding a complex to avoid or reduce interference of bilirubin coexisting in serum.

このことはフェロシアン化合物の知見からは全く予期で
きない効果である。This is a completely unexpected effect based on the knowledge of ferrocyan compounds.

なぜならばＥＤＴＡ−鉄＠）錯体はフェリシアン化合物
のように発色剤として用いる水素供与体を酸化すること
はない。This is because the EDTA-iron@) complex does not oxidize the hydrogen donor used as a coloring agent, unlike the ferricyanide compound.

またＥＤＴＡ−鉄（ＩＩ）あるいはＥＤＴＡ−鉄＠）の
錯体の添加がビリルビンの干渉を回避しているがこの二
つの錯体の間の酸化還元反応を拌ったものとは考えられ
ず。Furthermore, although the addition of the EDTA-iron(II) or EDTA-iron@) complex avoided the interference of bilirubin, it cannot be considered that this stirred the redox reaction between these two complexes.

さらに塩化第二鉄塩または塩化第一鉄塩にこのような効
果がないことから単に鉄塩であればビリルビンの干渉を
回避できるものでもない。Furthermore, since ferric chloride salts and ferrous chloride salts do not have such effects, interference with bilirubin cannot be avoided simply by using iron salts.

現状ではＥＤＴＡ−鉄錯体の効果の機構は明らかでない
。At present, the mechanism of the effect of the EDTA-iron complex is not clear.

次に参考例および実施例によシさらに詳しく本発明を説
明する。Next, the present invention will be explained in more detail with reference to reference examples and examples.

参考例 過酸化水素系におけるビリルビンの干渉はｐＨが高い程
大きいとされている。Reference Example It is said that the higher the pH, the greater the interference of bilirubin in hydrogen peroxide systems.

ｐＨ８における過酸化水素そのもの＼発色とビリルビン
の存在する場合のＥＤＴＡ−鉄錯体の効果を示すため次
の試験を行なった。The following test was conducted to demonstrate the effect of hydrogen peroxide itself\color development at pH 8 and the EDTA-iron complex in the presence of bilirubin.

■、試薬 （１）試薬 ４−アミノアンチピリｙ０．５ｍｍｏｌ／ＩＮ−エチル
−Ｎ−スルホブ ロピル−ｍ−）ルビ２フ０．２ｍｍｏｌ／ｌペルオキシ
ダーゼ２００則旬 以上を０．１ｍｏｌ／ｌ）’）ス緩衝液に溶解しｐＨを
８，０とする。■, Reagent (1) Reagent 4-aminoantipyryy0.5mmol/IN-ethyl-N-sulfopropyl-m-)ruby2F0.2mmol/l peroxidase 200 or more in 0.1mol/l)') Dissolve in buffer solution and adjust pH to 8.0.

（２）ＥＤＴＡ−鉄錯体添加物 ０．５ｍｍｏ、ｇ／７ＥＤＴＡ− 鉄（ＩＩ）まだはＥＤＴＡ− 鉄（ＩＩＪを上記試薬に溶解 する。(2) EDTA-iron complex additive 0.5mmo, g/7EDTA- Iron (II) still EDTA- Dissolve iron (IIJ in the above reagent) do.

塩化鉄添加物０．５ｍｍｏｌ／１Ｆｅｃｔ３またばＦｅ
ｃ１３を上記 試薬に溶解する。Iron chloride additive 0.5 mmol/1Fect3 or Fe
Dissolve c13 in the above reagent.

対照上記試薬のみで添加物 なし。Control above reagents only with additives none.

（３）ビリルビン ビリルビンコントロール （ディト社製品）２０ｍ９７ｄｌ （４）過酸化水素 １ｍｍｏｂ／を過酸化水素溶液 ２、操作 試薬３ｒ／１１にビリルビン５０μｔまたは水５０μｔ
を加えさらに過酸化水素５０μ２−または水５０μｌを
加え３７℃５分間加温する。(3) Bilirubin Bilirubin Control (Dito product) 20 m 97 dl (4) 1 mmob of hydrogen peroxide/2 hydrogen peroxide solution, 3 r/11 operating reagents and 50 μt of bilirubin or 50 μt of water
Add 50 μl of hydrogen peroxide or 50 μl of water, and heat at 37° C. for 5 minutes.

同様のことを試薬の替りにＥＤＴＡ−鉄錯体添加物、塩
化鉄添加物及び対照について行ない、全て波長５５０ｎ
ｍで吸光度を測定した。The same thing was done with EDTA-iron complex additive, iron chloride additive and control instead of reagent, all at wavelength 550n.
Absorbance was measured at m.

その結果を表１に示す。表１からＥＤＴＡ−鉄錯体の添
加（本発明方法）により過酸化水素の発色へのビリルビ
ンの干渉は殆ど無視できる程回避できることまたＦｅｃ
１３．Ｆｅｃ１２の添加は若干の効果は認められるが充
分でないことか明らかである。The results are shown in Table 1. Table 1 shows that by adding the EDTA-iron complex (method of the present invention), the interference of bilirubin with the color development of hydrogen peroxide can be avoided to an almost negligible extent.
13. Although the addition of Fec12 has some effect, it is clear that it is not sufficient.

実施例１ 尿酸測定 （１）試薬 Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロ ピルーｍ−トルイジ７０．５ｍｍｏｌ／１４−アミノア
ンチピリン０．２ｍｍｏｌ、／１ウリカーゼ０．ＩＵ／
７！ ペルオキシダーゼ２０００Ｕ／ｒｎｌ ＥＤＴＡ−鉄（Ｉ）０．５ｍｍｏｌＬ／１以上を０．１
ｍｏｌ／ｌ！Ｊン酸ホウ砂緩衝液に溶解しｐＨ７，０と
する。Example 1 Uric acid measurement (1) Reagent N-ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidi 70.5 mmol/14-aminoantipyrine 0.2 mmol/1 uricase 0. IU/
7! Peroxidase 2000U/rnl EDTA-Iron(I) 0.5mmolL/1 or more at 0.1
mol/l! Dissolve in J-phosphate borax buffer and adjust to pH 7.0.

たソし後述の対照の場合りはＥＤＴＡ−鉄＠）を含まな
いものを用いる。For the control described below, use one that does not contain EDTA-iron.

（２）操作 検体血清５０μｔをとり試薬３ｍを加え３７０Ｇ、１０
分１間加温後、波長５５０ｎｍで吸光度を測定し、別に
濃度既知の尿酸を用い同様の操作により作成した検量線
を用い検体中の尿酸の量を算出する。(2) Take 50 μt of operation specimen serum, add 3 m of reagent, and add 370 G.
After heating for 1 minute, the absorbance is measured at a wavelength of 550 nm, and the amount of uric acid in the sample is calculated using a calibration curve prepared in a similar manner using uric acid of known concentration.

次に本発明の詳細な説明するために次の試験を行なった
。Next, the following tests were conducted to explain the present invention in detail.

すなわち試薬および対照の３−に夫々２０ｍ９７ｄｌビ
リルビン溶液５０μｔまたは水５０μｔを加えさらに２
０Ｔｖｄｌ尿酸水溶液５０μｔまたは水５０μｔを加え
それぞれ３７℃、１０分間加温したものについて波長５
５０ｎｍで吸光度を測定した。That is, 50 μt of 20 m 97 dl bilirubin solution or 50 μt of water was added to the reagent and control 3-2, respectively.
0 Tvdl uric acid aqueous solution 50 μt or water 50 μt was added and heated at 37°C for 10 minutes.
Absorbance was measured at 50 nm.

その結果を表２に示す。The results are shown in Table 2.

この表より本発明の効果が明らかである。The effect of the present invention is clear from this table.

実施例２ 遊離脂肪酸測定 ■、試薬 試薬１ アシルロ一式シンセターゼ０．５Ｕ／ｌ アデノシントリホスフエイト５．１５μｍｏｌ／ｌコエ
ンザイムＡＯ，８μｍｏｌ／を 以上を０．０５ｍｏｌ／Ｌト’）ス緩衝液に溶解しｐＨ
７，８とする。Example 2 Free fatty acid measurement ■, Reagents Reagent 1 Acyllo-synthetase 0.5 U/l Adenosine triphosphate 5.15 μmol/l Coenzyme AO, 8 μmol/l Dissolve the above in 0.05 mol/L torsion buffer. pH
7, 8.

試薬２ Ｎ−エチルアレイミド 水溶液１０ｍｏｌ／１ 試薬３ Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル− ｍ−）ルイジン０．５ｍｍｏｔ／１ ４−アミノアンチピリン０．２ｍｍｏ、！／ｌアシ／１
／ニアーＡオキシダーゼ０．１２５ＴＪＡｎｌベルオキ
シダーセ２０００ＴＪＡｎｌ ＥＤＴＡ−鉄（１）ｏ、７５ｍｍｏｔ／を以上を０．０
２ｍｏｌ／ｌＮ、Ｎ−ビス（２−ハイドロキシル）−２
−アミノエタンスルホン酸緩衝液に溶解しｐＨ７，２と
する。Reagent 2 N-ethylaleimide aqueous solution 10 mol/1 Reagent 3 N-ethyl-N-sulfopropyl-m-)luidine 0.5 mmot/1 4-aminoantipyrine 0.2 mmo,! /l reed/1
/ Near A oxidase 0.125TJAnl Peroxidase 2000TJAnl EDTA-Iron (1) o, 75mmot/ or more 0.0
2mol/lN, N-bis(2-hydroxyl)-2
-Dissolve in aminoethanesulfonic acid buffer to pH 7.2.

たソし後述の対照の場合はＥＤＴＡ−鉄（１）を含まな
いものを用いる。In the case of a control described later, a sample containing no EDTA-iron (1) is used.

２、樽作 検体血清５０μｔＫ試薬１の０．５ゴを加え３７℃、１
５分間加温後試薬２の０．５ｍｌを加え、さらに試薬３
の２−を加え３７℃、１０分間加温後波長５５０ｎｍで
吸光度を測定し、別に濃度既知の脂肪酸を用いて同様の
操作により作成した検量線を用い検体中の遊離脂肪酸の
量を算出する。2. Add 50μt of barrel sample serum and 0.5g of K reagent 1 and heat at 37°C.
After heating for 5 minutes, add 0.5 ml of reagent 2, and then add reagent 3.
After heating at 37° C. for 10 minutes, the absorbance is measured at a wavelength of 550 nm, and the amount of free fatty acid in the sample is calculated using a calibration curve prepared in the same manner using fatty acids of known concentration.

次に本発明の詳細な説明するために次の試験を行なった
。Next, the following tests were conducted to explain the present invention in detail.

すなわち試薬および対照の夫々３ｒｎｌに２０ｍ９７ｄ
ｌビリルビン溶液５０μｔまたは水５０μｔを加え、さ
らに１ｍｍｏｌ／１オレイン酸ナトリウム酸浴トリウム
水溶液５０μｔμｔを加え３７℃、１５分間加温後試薬
２の０．５７ｎｌを加えさらに試薬３０２ｍ１を加え３
７℃、１０分間加温したものについて波長５５０ｎｍで
吸光度を測定した。i.e. 20m97d in 3rnl each of reagent and control.
Add 50 μt of bilirubin solution or 50 μt of water, then add 50 μt μt of 1 mmol/1 sodium oleate acid bath thorium aqueous solution, heat at 37°C for 15 minutes, add 0.57 nl of reagent 2, and add 302 ml of reagent 3.
The absorbance was measured at a wavelength of 550 nm after heating at 7°C for 10 minutes.

その結果を表３に示す。The results are shown in Table 3.

この表より本発明の効果が明らかである。The effect of the present invention is clear from this table.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] １血清成分の測定に酵素反応系を適用し生成する過酸化
水素によりペルオキシダーゼの存在下発色性水素供与体
を酸化することにより当該成分を比色定量する方法にお
いてＥＤＴＡ−鉄錯体を添加することにより血清に共存
するビリルビンの干渉を回避捷だは軽減することを特徴
とする血清成分の測定力法。1. By adding an EDTA-iron complex in a method of colorimetrically quantifying serum components by applying an enzymatic reaction system to the measurement of serum components and oxidizing a chromogenic hydrogen donor in the presence of peroxidase with the generated hydrogen peroxide. A method for measuring serum components that is characterized by avoiding or reducing the interference of bilirubin coexisting in serum.