JPS5818077B2 - Method and reagent for measuring glycerin - Google Patents
Method and reagent for measuring glycerinInfo
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- JPS5818077B2 JPS5818077B2 JP56145640A JP14564081A JPS5818077B2 JP S5818077 B2 JPS5818077 B2 JP S5818077B2 JP 56145640 A JP56145640 A JP 56145640A JP 14564081 A JP14564081 A JP 14564081A JP S5818077 B2 JPS5818077 B2 JP S5818077B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はグリセリンの酵素測定法及びこの方法を実施す
るための試薬に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for enzymatically measuring glycerin and reagents for implementing this method.
トリグリセリド（−長鎖状脂肪酸のグリセリンエステル
）の測定は医学の診断に極めて重要である。The measurement of triglycerides (-glycerol esters of long-chain fatty acids) is extremely important for medical diagnosis.
高いトリグリセリドの血中濃度は動脈硬化に関する重要
な危険要因である。High blood triglyceride levels are an important risk factor for arteriosclerosis.
トリグリセリド値が高い、従って高トリグリセリド血液
症の場合、冠状機能不全及び心臓硬塞が低いトリグリセ
リド値の場合よりも頻発する。With high triglyceride levels and thus hypertriglyceridemia, coronary insufficiency and cardiac infarction occur more frequently than with low triglyceride levels.
高トリグリセリド血液症は動脈硬化及び冠状疾病の発生
を促すので、適正な時期に治療を開始し得るようにそれ
を早期発見しなければならない。Since hypertriglyceridemia promotes the development of arteriosclerosis and coronary diseases, it must be detected early so that treatment can be started at an appropriate time.
それ故、トリグリセリドもしくはグリセリンの迅速なか
つ信頼して実施できる測定方法は重要である。Therefore, a rapid and reliable method for measuring triglycerides or glycerin is important.
周知でありかつ利用可能であるトリグリセリトンの測定
法は、トリグリセリドをリパーゼ／エステラーゼを用い
て酵素により加水分解しかつ遊離したグリセリンをグリ
セロキナーゼ／ピルバートキナーゼ／ラフタートデヒド
ロゲナーゼを用いて測定することをベースとする（ Ａ
、 Ｗ 、 Ｗａｈｌｅｆ−； ｅｌｄ著、 ” Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔ ｉｃ Ａｎａ
１ｙ−ｓｉｓ”、■巻、１８３１〜１８３５頁、Ｈ，Ｕ
。A well-known and available method for measuring triglyceritone is enzymatic hydrolysis of triglycerides using lipase/esterase and measurement of the liberated glycerin using glycerokinase/pyruvert kinase/raftate dehydrogenase. Based on (A
, W. Wahlef-; eld, “M.
methods of Enzymatic Ana
1y-sis”, volume ■, pages 1831-1835, H, U
.
Ｂｅｒｇｍｅｙｃｒ ｔ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ社編集ツニューヨーク及びロンドン在、１９７４年）
。Bergmeycr t Academic Pres.
(edited by S Corporation, New York and London, 1974)
.
しかしこの公的方法は重大な欠点を有している。However, this official method has serious drawbacks.
；血清（ビリルビン、ヘモグロビン）の固有色並びに混
濁による妨害を除くために、試料の空値測定を常に実施
しなけれはならず、これは分析１回当りの必要時間並び
に試薬の消費量、従って経費を高める。; in order to eliminate interferences due to the inherent color of serum (bilirubin, hemoglobin) and turbidity, a blank measurement of the sample must always be carried out, which reduces the time required and the consumption of reagents per analysis and therefore costs. Increase.
更に、多数の敏感な補酵素及び酵素が存・在する結果使
用溶液の耐久性は比較的低い。Furthermore, the durability of the use solution is relatively low as a result of the presence of a large number of sensitive coenzymes and enzymes.
このＵＶ−試験と並んでホルマザン形成をベースとする
呈色試験も知られている。In addition to this UV test, color tests based on formazan formation are also known.
この試験法は試薬空値に対する測定を許容するが、比較
的煩雑に構成されておりかつ妨害を受は易い。Although this test method allows measurement of reagent blank values, it is relatively complex and susceptible to interference.
・ 最後に、測定することのできるＨ２０□及びグリセ
リンアルデヒドを形成するグリセリンオキシダーゼを使
用する方法が知られている。- Finally, methods are known that use glycerol oxidase, which forms H20□ and glycerol aldehyde, which can be measured.
しかしこの酵素はペスト菌のような高病原性微生物から
得られるか或いは他の微生物から全く僅少な収率で得ら
れるに過ぎない。However, this enzyme can only be obtained from highly pathogenic microorganisms such as Yersinia pestis or from other microorganisms in very small yields.
それ故、前記の欠点を有していない方法及び試薬に対す
る必要が生じる。A need therefore arises for methods and reagents that do not have the above-mentioned drawbacks.
特に、良好な収率で簡単に得られる酵素により実施可能
でありかつ試料空値の測定なしに十分に正確な結果が得
られる方法に対する要求が生じる。In particular, a need arises for a method which can be carried out with easily obtained enzymes in good yields and which gives sufficiently accurate results without sample blank measurements.
特に、指示薬反応としてのこの種の方法は形成された色
素の十分に大きな吸光係数（ε＞ １８ ｃｉｔ／μモ
ル）を伴う呈色反応を適用することができる。In particular, this type of method as an indicator reaction can be applied to color reactions with sufficiently large extinction coefficients (ε>18 cit/μmol) of the dyes formed.
本発明によりこの課題は、グリセリンを水性媒体中でガ
ラクトースオキシダーゼと共に恒温保持しかつ酸素消費
量か又は形成されたＨ２０□又はグリセリンアルデヒド
を測定することを特徴とするグリセリンの測定法により
解決される。According to the invention, this object is achieved by a method for the determination of glycerin, which is characterized in that glycerin is incubated with galactose oxidase in an aqueous medium and the oxygen consumption or the H20□ or glyceraldehyde formed is determined.
ガラクトースオキシダーゼＥＣ１，１，３，９は、酸素
の存在においてＤ−ガラクトースをＤ−ガラクトースへ
キソジアルドースとＨ２Ｏ２に酸化する公知の酵素であ
る。Galactose oxidase EC1,1,3,9 is a known enzyme that oxidizes D-galactose to D-galactose xodialdose and H2O2 in the presence of oxygen.
銅含有酵素に関する。本発明は、この酵素がグリセリン
の定量測定に良好に使用し得るという意想外の確認をベ
ースとする。Concerning copper-containing enzymes. The invention is based on the unexpected confirmation that this enzyme can be successfully used for the quantitative determination of glycerin.
このことは予想することができなかった。This could not have been predicted.
それというのもガラクトースオキシダーゼ（以下Ｇａ１
−ＯＤと記載）のグリセリンに対する最小活性は知られ
ていたが、ハミルトン（Ｈａｍｉ ｌ ｔｏｎ ）及び
その他共著、゛オキシデーシス・エンド・リレイテツド
・レドックス・システムズ（Ｏｘ’１ｄａｓｅｓａｎｄ
ｒｅｌａｔｅｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｙｓｔｅｍｓ ）
” ｅ第１巻（Ｅｄ、Ｋｉｎｇ、１９７１年）により変
換率がＨ−ｙりｈ−スに対して僅かに１７１５０だから
である。This is because galactose oxidase (hereinafter referred to as Ga1)
-OD) was known to have minimal activity toward glycerin, but the minimal activity of Ox'1dasesand Redox Systems, written by Hamilton et al.
Related Redox Systems)
” e Volume 1 (Ed. King, 1971), the conversion rate is only 17150 for H-y-h-s.
公知の所見によりグリセリンの定量的反応が予測し得な
かったことを別にして、グリセリン測定を行おうとする
体液中にガラクトースもまた遊離又は結合形で存在し得
るので、ガラクトースによる著しい妨害が予想された。Apart from the fact that a quantitative response for glycerin could not be predicted due to known observations, significant interference by galactose could be expected since galactose can also be present in free or bound form in the body fluid in which glycerin measurements are to be carried out. Ta.
しかし、体液中、特に血清中で懸念された妨害が起らな
いことが判明し驚異的であった。However, it was surprising to find that the feared interference did not occur in body fluids, especially in serum.
本発明方法はトリグリセリドを予め又は同時に酵素的に
けん化してグリセリンを遊離する際にもしくはトリグリ
セリドを予め化学的にけん化する際にも実施することが
できる。The process of the invention can also be carried out when triglycerides are saponified enzymatically or simultaneously to liberate glycerin, or when triglycerides are previously saponified chemically.
化学的なけん化には例えばアルコール性カセイカリ、酵
素けん化にはリパーゼとエステラーゼ又はエステラーゼ
単独が好適である。For chemical saponification, for example, alcoholic caustic potash is suitable, and for enzymatic saponification, lipase and esterase or esterase alone is suitable.
酸素消費量、Ｈ２Ｏ２形成又はグリセリンアルデヒド形
成の測定はこれらに関して公知の方法により行なうこと
ができる。The measurement of oxygen consumption, H2O2 formation or glyceraldehyde formation can be carried out by methods known in this regard.
例えば、酸素消費量の好適な測定法はガスクロストグラ
フィ及び復極法である。For example, suitable methods for measuring oxygen consumption are gas crostography and depolarization.
酸素電極を用いるポーラロメトリ測定は、特に測定を自
動的に実施することかできるので優れている。Polarometric measurements using oxygen electrodes are particularly advantageous because the measurements can be carried out automatically.
この種の測定法は公知である。Measurement methods of this type are known.
特に、西ドイツ国特許公開第２１３０３４０号明細書及
び同第２１３０３０８号明細書中に記載されている方法
が水性媒体中の酸素消費量をポーラロメトリにより測定
するのに好適であることが明らかになった。In particular, the methods described in DE 2130340 and DE 2130308 have been found to be suitable for measuring oxygen consumption in aqueous media by polarometry.
形成された過酸化水素を滴定法かつまた電位差測定法、
ポーラログラフイ及び比色測定法により並びに酵素的に
測定することができる。The hydrogen peroxide formed can be determined titrimetrically and also potentiometrically,
It can be determined polarographically and colorimetrically as well as enzymatically.
カタラーゼ又はペルオキシダーゼの使用下に行なう酵素
法は著しく特異的かつ信頼性が高いばかりでなく、該方
法を過酸化水素の形成下に主要反応とも極めて簡単に組
合せることができる。The enzymatic method carried out using catalase or peroxidase is not only extremely specific and reliable, but it can also be very simply combined with the main reaction with the formation of hydrogen peroxide.
β−ジケトン、例えばアセチルアセトン及びメタノール
もしくはエタノール又はメチレングリコールの存在にお
いてカタラーゼを用いて行なう測定並びに色原体１種以
上の存在においてペルオキシダーゼを用いて行なう測定
もまた好適であることが明らかになった。Measurements carried out with catalase in the presence of β-diketones, such as acetylacetone and methanol or ethanol or methylene glycol, and measurements carried out with peroxidase in the presence of one or more chromogens have also proven suitable.
カタラーゼ、アセチルアセトン及びメタノールを用いる
測定ではメタノールがホルムアルデヒドに酸化され、こ
れがアセチルアセトンと呈色反応を開始し、この反応を
測定することができる。In measurements using catalase, acetylacetone and methanol, methanol is oxidized to formaldehyde, which initiates a color reaction with acetylacetone, and this reaction can be measured.
ペルオキシダーゼによる測定では発色団として反応後に
光度測定法により測定することのできる化合物を使用す
る。In the determination with peroxidase, a compound is used as chromophore that can be determined photometrically after the reaction.
好適な発色団の例は２，２′−アミノベンゾチアゾリン
−スルホン酸（ＡＢＴＳ ）である。An example of a suitable chromophore is 2,2'-aminobenzothiazoline-sulfonic acid (ABTS).
他の例はトリンダ−（Ｔｒｉｎｄｅｒ著ｙ”Ａｎｎ、Ｃ
−１ｉｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ” ＋第６巻、２４〜２
７頁（１９６９年）〕による指示薬系であり、この場合
フェノール及び４−アミノアンチピリン（４−Ａ−ＡＰ
）がＰＯＤの存在においてかつＩ−（，０□の作用下に
酸化的に結合して色素に変換される。Another example is Trinder (by “Ann, C.
-1in, Biochem, ”+Volume 6, 24-2
7 (1969)], in this case phenol and 4-aminoantipyrine (4-A-AP
) is oxidatively combined in the presence of POD and under the action of I-(,0□) and converted into a dye.
フェノールの代りに他の芳香族アルコール、例えばｐ−
クロルフェノール、アニリン誘導体、ナフトール、ナフ
トール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体
、アミンキノリン、ヒドロキシキノリン、ジヒドロキシ
フェニル酢酸及び同様に反応する物質を使用することが
できる。Instead of phenol, other aromatic alcohols, such as p-
Chlorphenol, aniline derivatives, naphthol, naphthol derivatives, naphthylamine, naphthylamine derivatives, aminequinoline, hydroxyquinoline, dihydroxyphenylacetic acid and similarly reactive substances can be used.
４−アミノアンチピリンの代りに４−アミンアンチピリ
ン−誘導体、例えば４−アミンアンチピリンアミド、フ
ェニレンジアミンスルホン酸、ＭＢＴＨ（、メチルベン
ゾチアゾロンヒドラゾン）、ＭＢＴＨ−及びＳ−ＭＢＴ
Ｉ−Ｔ−誘導体並びに同様に反応する化合物を使用する
ことができる。Instead of 4-aminoantipyrine, 4-amineantipyrine derivatives, such as 4-amineantipyrinamide, phenylenediaminesulfonic acid, MBTH (methylbenzothiazolone hydrazone), MBTH- and S-MBT
IT-derivatives as well as similarly reactive compounds can be used.
グリセリンアルデヒドの測定はアルデヒド試薬、殊にア
ルデヒド基とヒドラゾン形成下に反応するヒドラジン誘
導体、例えば２，４−ジニトロフェニルヒドラジンを用
いて行なう。Glyceraldehyde is determined using aldehyde reagents, in particular hydrazine derivatives, such as 2,4-dinitrophenylhydrazine, which react with aldehyde groups to form hydrazones.
形成されたヒドラゾンは比色測定法により測定すること
ができる。The hydrazone formed can be measured colorimetrically.
ペルオキシダーゼ及びＡＢＴＳのような色原体の存在に
おける反応が特に好適であり、それ数本発明の範囲で優
れている。Reactions in the presence of chromogens, such as peroxidase and ABTS, are particularly preferred and are within the scope of the present invention.
この場合、短い反応時間でも吸光度差とグリセリン濃度
との間の直線的関係が確認されたので、本発明方法のこ
の実施形は特に動力学的測定に好適であるが、終点測定
にも使用することができる。In this case, a linear relationship between the absorbance difference and the glycerin concentration was confirmed even with short reaction times, so that this embodiment of the method of the invention is particularly suitable for kinetic measurements, but can also be used for endpoint measurements. be able to.
吸光度とグリセリン含量との間の得られる比例関係は添
付図面の第１図に図示されている。The resulting proportional relationship between absorbance and glycerin content is illustrated in FIG. 1 of the accompanying drawings.
本発明の優れた実施形では測定をグリセリンデヒドロゲ
ナーゼ及びその補酵素ＮＡＤの存在において行なう。In an advantageous embodiment of the invention, the measurement is carried out in the presence of glycerol dehydrogenase and its coenzyme NAD.
グリセリンデヒドロゲナーゼＥＣＩ。１、１．６は公知
でありかつ例えばエンテロバクタ・エロゲネス（Ｅｎｔ
ｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ ）のような
微生物から得られかつ市販されている。Glycerin dehydrogenase ECI. 1, 1.6 are known and, for example, Enterobacter erogenes (Ent.
erobacter aerogenes) and are commercially available.
グリセリンデヒドロゲナーゼ（Ｇｌｙｃ−ＤＨ）の存在
において測定法の感度及び特異性は更に改良される。In the presence of glycerol dehydrogenase (Glyc-DH) the sensitivity and specificity of the assay are further improved.
本発明のこの優れた実施形ではＮＡＤを化学量論的に必
要な量を上回る過剰量で添加することができるが、単に
触媒量のＮＡＤ及びＮＡＤ−再生系を添加すると有利で
ある。Although in this preferred embodiment of the invention NAD can be added in excess over the stoichiometrically required amount, it is advantageous to simply add a catalytic amount of NAD and the NAD-regeneration system.
例えば、好適なＮＡＤ−再生系は西ドイツ国特許公開第
２８３４７０５号明細書に記載されている。For example, a suitable NAD-regeneration system is described in DE 28 34 705 A1.
本発明範囲で使用する優れているＮＡ、Ｄ＝再再生はラ
フフートデヒドロゲナーゼとその基質ピルバートより成
る。The preferred NA, D=regeneration used within the scope of the invention consists of rough foot dehydrogenase and its substrate pyruvate.
ＮＡＤを過剰量で添加する場合、Ｈ２Ｏ２の代りに還元
ＮＡＤを光学的に測定することもできる。If NAD is added in excess, reduced NAD can also be measured optically instead of H2O2.
本発明のこの実施形ではｐＨ値を７．０〜９．０に調節
すべきである。In this embodiment of the invention the pH value should be adjusted between 7.0 and 9.0.
それというのもこの範囲において関与する全酵素、つま
りガラクトースオキシダーゼ（Ｇａ１− ＯＤ ）、Ｇ
ｌｙｃ−ＤＨ及び場合によりペルオキシダーゼ（ＰＯＤ
）が本方法に十分に好適な活性を有するからである。This is because all the enzymes involved in this range, namely galactose oxidase (Ga1-OD), G
lyc-DH and optionally peroxidase (POD
) has an activity sufficiently suitable for this method.
意外にもこの実施形の反応は、両方の酵素Ｇ−ａｌ−Ｏ
Ｄ及びＧｌｙｃ−ＤＨがグリセリンについて競合しかつ
Ｇｌｙｃ−ＤＨが酸素も消費せずかつＨ２０□も形成し
ないにもかかわらず、スムーズにかつ定量的に分子状酸
素の消費及びＨ２Ｏ。Surprisingly, this embodiment of the reaction allows both enzymes G-al-O
Consumption of molecular oxygen and H2O smoothly and quantitatively, even though D and Glyc-DH compete for glycerin and Glyc-DH neither consumes oxygen nor forms H20□.
の形成下に進行する。It progresses under the formation of.
Ｇａ１−ＯＤ及びＧｌｙｃ−ＤＨの優れた組合せの適用
により感度範囲は少なくとも０．００１モル／ｌまで拡
大される。By applying the superior combination of Ga1-OD and Glyc-DH, the sensitivity range is extended to at least 0.001 mol/l.
試薬空値に対する最終値法によりかつまた動力学的方法
により測定を実施することができる。Measurements can be carried out by the final value method for reagent blank values and also by kinetic methods.
添付図面の第３図は、この実施形でもグリセリン淵度と
吸光度差との間の直線関係が下限で少なく己もグリセリ
ン濃度０．０００５モル／ｌまで得らすることを示す。FIG. 3 of the accompanying drawings shows that even in this embodiment, the linear relationship between the glycerin depth and the absorbance difference is small at the lower limit, and even glycerin concentrations up to 0.0005 mol/l can be obtained.
本発明方法のこの実施形もまたトリグリセＩＪ ｌ−を
同時に酵素的にけん化しながら実施すること力でき、そ
の際にグリセリンが遊離しかつこれをオ発明により測定
する。This embodiment of the process according to the invention can also be carried out with simultaneous enzymatic saponification of triglyceride IJl-, in which case glycerin is liberated and this is measured according to the invention.
それ故、この方法は特に自動分析装置にも好運である。This method is therefore particularly amenable to automatic analyzers.
それというのも唯一の標準との検定にＪリグリセリン濃
度を正確に測定することができイからである。This is because J-liglycerin concentration can be accurately measured using only one standard.
更に、本発明の目的はガラクトースオキシダーゼ及びＨ
２０□測定系又はグリセリンアルデヒド？Ｊ１１定系よ
り成るグリセリンの測定用試薬である。Furthermore, it is an object of the present invention that galactose oxidase and H
20□Measurement system or glycerin aldehyde? This is a glycerin measurement reagent consisting of J11 standard system.
Ｊず第一の優れている実施形においてはこの試薬Ｇす基
本的にガラクトースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、
少なくとも１種の色原体及び緩衝液から単独で又は混合
して成っている。In a preferred embodiment, this reagent G essentially contains galactose oxidase, peroxidase,
It consists of at least one chromogen and a buffer, either alone or in combination.
色原体としてＣ：ＡＢＴＳが優れている。C:ABTS is excellent as a chromogen.
他の優れている指示薬系にトリンダーによる系である。Another excellent indicator system is the Trinder system.
他の優れた実施形では基本的に試薬はガラクトースオキ
シダーゼ、カフラーゼ、アセチルアセトン、メタノール
及び緩衝剤から単独で又は混合して成る。In another advantageous embodiment, the reagents essentially consist of galactose oxidase, kafrese, acetylacetone, methanol and a buffer, alone or in combination.
他の優れた実施形では基本的に本発明による辞薬はガラ
クトースオキシダーゼ及びアルデヒド環とヒドラゾン形
成下に反応するヒドラジン誘導付並びに緩衝剤より成る
。In another advantageous embodiment, the drug according to the invention essentially consists of galactose oxidase and a hydrazine derivatizer which reacts with the aldehyde ring to form a hydrazone and a buffer.
ヒドラジン誘導体としては２，４−ジニトロフェニル−
ヒドラジンが佛れている。As a hydrazine derivative, 2,4-dinitrophenyl-
Hydrazine is famous.
前記の優れた試薬の糾合せ物は前記の必須成りと共に付
加的に常用の溶剤、安定化剤及び／又（１表面活性物質
を含有してよい。The combination of preferred reagents described above may additionally contain conventional solvents, stabilizers and/or surface-active substances along with the essential components described above.
すべてのこれらＣ添加物は当業者に公知でありかつ過酸
化水素もしくはグリセリンアルデヒドの検出系で常用で
あイ殊に付加的に本発明による試薬は脂肪分解酵素、例
えばリパーゼ／エステラーゼ又はエステラーゼを単独で
含有し、それ故トリグリセリドの形で肴在する結合グリ
セリンの測定にも使用すること力できる。All these C additives are known to the person skilled in the art and are commonly used in detection systems for hydrogen peroxide or glyceraldehyde. It can also be used to measure bound glycerin, which is present in the form of triglycerides.
前記の試薬物の組合せ物が基本成分を次の量０４割合で
含有すると有利である：
１ ガラクトースオキシダーゼ １５〜３ｏＵ／ｍ＋ペ
ルオキシダーゼ ０．５〜１００Ｕ／ｄ色原体
０．０５〜２０μモル／ｍｌ並びに場合により
表面活性剤及び ０．００１〜０．１８７ｍｌ緩衝
剤、ｐＨ６〜９
２ ガラクトースオキシダーゼ １５〜３０Ｕ／１ｒＬ
１２．４−ジニトロフエ；レヒドラジン１〜１０μモｔ
ｌｙ’ ｍｌ及び場合により ｏ、ｏｏｉ〜０．１
ｇ／ｒｎ１表面活性剤及び
緩衝液（ｐＨ６〜９）
優れた実施形では付加的に本発明による試薬はＧｌｙｃ
−ＤＨ，ＮＡＤ及び場合によりＮＡＤ−再生系を含有す
る。It is advantageous if the combination of reagents mentioned above contains the basic components in the following amounts and proportions: 1 galactose oxidase 15-3 oU/m + peroxidase 0.5-100 U/d chromogen
0.05-20 μmol/ml and optionally surfactant and 0.001-0.187 ml buffer, pH 6-9 2 Galactose oxidase 15-30 U/1 rL
12.4-dinitrophe; lehydrazine 1-10 μm
ly' ml and optionally o, ooi~0.1
g/rn1 surfactant and buffer (pH 6-9) In a preferred embodiment, the reagent according to the invention additionally contains Glyc
-DH, NAD and optionally an NAD-regeneration system.
ＮＡＤ−再生系に関しては既述のことが該当する。Regarding the NAD-regeneration system, what has already been stated applies.
優れているＮＡＤ−再生系はラフフートデヒドロゲナー
ゼ（ＬＤＨ）及びパルバートより成るＮＡＤ−再生系の
存在により、触媒量の補酵素ＮＡＤでＧｌｙｃ−ＤＨに
は十分である。A superior NAD-regenerating system consists of rough foot dehydrogenase (LDH) and parvert, so that a catalytic amount of the coenzyme NAD is sufficient for Glyc-DH.
それというのも反応の進行中に形成されるＮＡＤＨが直
ちに再生系により再びＮＡＤに酸化されるからであるそ
れ故、この種のＮＡＤ−再生系の存在においてＮＡＤ量
を０．０５μモル／ｍｌまで低減させることができる。This is because the NADH formed during the course of the reaction is immediately oxidized to NAD again by the regeneration system. Therefore, in the presence of this type of NAD-regeneration system, the amount of NAD can be reduced up to 0.05 μmol/ml. can be reduced.
本発明による試薬のこの優れた実施形ではＧ−１ｙｃ−
ＤＨの量は有利に５〜１００Ｕ／ｍｌである勿論更に多
量に添加することもできるが、それはあまり経済的では
ない。In this preferred embodiment of the reagent according to the invention G-lyc-
The amount of DH is preferably between 5 and 100 U/ml; of course, larger amounts can also be added, but this is not very economical.
５ Ｕ ／ｍｌを下回る量を使用することができるが、
Ｇｌｙｃ−ＤＨにより達成される利点は十分には得られ
ない。Although amounts below 5 U/ml can be used,
The benefits achieved with Glyc-DH are not fully achieved.
好適な緩衝剤は簡単な予備実験により確定することがで
きる。Suitable buffers can be determined by simple preliminary experiments.
リン酸カリウム緩衝剤、グリシルグリシン緩衝剤及びビ
シン緩衝剤（Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−
クリシン）が濃度０．０５〜０．２モル／ｌで特に好適
であることが明らかになった。Potassium phosphate buffer, glycylglycine buffer and bicine buffer (N,N-bis(2-hydroxyethyl)-
It has been found that chrysin) is particularly suitable at concentrations of 0.05 to 0.2 mol/l.
前記のガラクトースオキシダーゼに関する酵素単位は基
質としてのガラクトースに対するものである〔例えばＰ
ａｚｕｒ及びその他共著、 ” Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａ
ｔｅｓ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ、Ｎｕ−ｃｌｅｏｔｉ
ｄｅｓ ” ＋ ４巻、１４７頁（１９７７年）〕。The enzymatic unit for galactose oxidase mentioned above is for galactose as substrate [e.g.
azur and others, ” Carbohydra
tes, Nucleosides, Nu-cleoti
des” + vol. 4, p. 147 (1977)].
次に本発明を実施例につき詳説する。Next, the present invention will be explained in detail with reference to examples.
例１ グリセリン水溶液の試験 試薬ニリン酸カリウム緩衝剤（０，１モル／ｌ。Example 1 Testing of glycerin aqueous solution Reagent Potassium diphosphate buffer (0.1 mol/l.
ｐＨ７，５） ペルオキシダーゼ（１２５００Ｕ／ｌ）。pH7.5) Peroxidase (12500U/l).
ガラクトースオキシダーゼ（２００００
Ｕ＃ ）、ＡＢＴＳ （２ミリモル／ｌ）試料：範囲０
．００５〜０．０６モル／ｌのグリセリン水溶液
測定バッチ
測定光線： Ｈｇ４０５ ｎｍ ：キュベットの層厚；
１ｃｆｒＬ；恒温保持温度＝２５℃
試薬２０７７１１をキュベツト中にピペット装入し、試
料０．１ ｍｌを添加しかつ混合する。Galactose oxidase (20000 U#), ABTS (2 mmol/l) sample: range 0
．． 005-0.06 mol/l glycerin aqueous solution measurement batch measurement beam: Hg405 nm: cuvette layer thickness;
1 cfrL; holding temperature = 25° C. Pipette reagent 207711 into the cuvette, add 0.1 ml of sample and mix.
２分間目から１０分間目までの吸光度変化をプロットす
る（△Ｅ２〜１０）。The change in absorbance from the 2nd minute to the 10th minute is plotted (ΔE2-10).
グリセリンの定量測定に際しこの△Ｅが標準検量線を介
してグリセリン濃度と関係づけられる。In the quantitative measurement of glycerin, this ΔE is related to the glycerin concentration via a standard calibration curve.
例２ 細潰中のグリセリンの測定 試薬ニリン酸カリウム緩衝剤（０，１モル／ｌ。Example 2 Determination of glycerin in the crush Reagent Potassium diphosphate buffer (0.1 mol/l.
ｐＨ７，５） ペルオキシダーゼ（１２５００Ｕ／ｌ）。pH7.5) Peroxidase (12500U/l).
ガラクトースオキシダーゼ（２００００，１（）７ｇ
） 、ＡＢＴＳ （２ミリ−Ｕし／１３）試料
：試料としては、範囲０．００６〜０．００７モル／ｌ
で異なる量のグリセリンを添加
した血清を使用する。Galactose oxidase (20000,1() 7g
), ABTS (2 mm-U/13) sample: As a sample, range 0.006-0.007 mol/l
Use serum supplemented with different amounts of glycerin.
測定バッチ：
測定光線：Ｈ９４０５ｎｍ；キュベツトの層厚：Ｉ Ｃ
ｆｒＬ ；恒温保持温度＝２５℃
試薬２．０ ｍｌ！をキュベツト中にピペット装入し、
試料０．１ ｍｌを添加しかつ混合する。Measurement batch: Measuring beam: H9405nm; Cuvette layer thickness: IC
frL; constant temperature holding temperature = 25°C reagent 2.0 ml! Pipette into the cuvette,
Add 0.1 ml sample and mix.
液が静置した後で２分間から１０分間までの吸光度変化
をプロットする。Plot the change in absorbance from 2 minutes to 10 minutes after the solution has stood still.
グリセリン濃度と吸光度変化との直線関係を第２図に示
す。Figure 2 shows the linear relationship between glycerin concentration and absorbance change.
例３
試薬ニ
グリシルグリシン緩衝剤ｐＨ８，００，１モル／１（Ｎ
Ｈ４）２ Ｓ０４ ０．１６モル／ｌＺ ｎ Ｓ
Ｏ４・７ Ｈ２００，１ミリモル／１Ｎａ２ＣＯ３ｏ、
ｏ ７８モル／１
４−アミノ７）す１つノン−ＮＨ２０，５ミ リモル／
ｌｐ−クロルフェノール
ＰＯＤ １００ＯＯ
Ｕ／ｌＬＤＨ １０
０ＯＯＵ／Ｖピルバート ２．２５ミリモ
ル／ｌＧａｌ− ＯＤ ２ ０ ０ ０
０ Ｕ／ＡＧｌ −ＤＨ５００００Ｕ／Ａ
ＮＡ’Ｄ＋ １．５ミリモル／ｌ
試料：
範囲０．００１〜０．０１モル／ｌのグリセリン水溶液
（グリセリン水溶液の代りに血清、他の体液、例えば食
料品エキスも使用することができる）
測定バッチ：
測定光線： ５４６ ｎｍ
層厚：１ｃｆｎ
温度：２５〜３７°Ｃ
試薬１．０ミリをキュベツト中に装入しかつ試料０、０
１ ｒｒｄ！で開始する。Example 3 Reagent Niglycylglycine buffer pH 8.00, 1 mol/1 (N
H4)2 S04 0.16 mol/lZ n S
O4.7 H200, 1 mmol/1 Na2CO3o,
o 78 mol/1 4-amino 7) 1 non-NH20.5 mmol/
lp-Chlorphenol POD 100OO
U/lLDH 10
0OOU/V Pyruvate 2.25 mmol/lGal- OD 2 0 0 0
0 U/AGl -DH50000U/A NA'D+ 1.5 mmol/l
Sample: Aqueous glycerin solution in the range 0.001-0.01 mol/l (serum, other body fluids, e.g. food extracts can also be used instead of aqueous glycerin solution) Measuring batch: Measuring beam: 546 nm Layer thickness: 1cfn Temperature: 25-37°C Charge 1.0 ml of reagent into a cuvette and sample 0, 0
1 rrd! Start with.
試薬空位に対する３０分後の吸光度を測定する。Measure the absorbance after 30 minutes relative to the reagent vacancy.
定量測定するためにこの△Ｅを標準を介してグリセリン
濃度に関係ずける。For quantitative determination, this ΔE is related to the glycerin concentration via a standard.
試料空位を一緒にする必要はない。There is no need for the sample vacancies to be together.
５４６ ｎｍの吸光度に対するグリセリン濃度をプロッ
トすることにより得られた曲線は第３図に示す。The curve obtained by plotting the glycerin concentration against the absorbance at 546 nm is shown in FIG.
添付図面は本発明による方法及び試薬を用いて測定した
吸光度変化とグリセリン濃度との関係を示し、第１図は
例１によるグラフであり、第２図は例２によるグラフで
あり及び第３図は例３によるグラフである。The accompanying drawings show the relationship between absorbance change and glycerin concentration measured using the method and reagent according to the invention, FIG. 1 is a graph according to Example 1, FIG. 2 is a graph according to Example 2, and FIG. 3 is a graph according to Example 2. is a graph according to Example 3.
Claims (1)
クトースオキシダーゼさ共に恒温保持しかつ酸素消費量
もしくは形成されたＨ２０□か又はグリセリンアルデヒ
ドを測定することを特徴とするグリセリンを測定する方
法。 ２ 酸素消費量をポーラログラフイにより測定する特許
請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 形成されたＨ２０□をカタラーゼ又はぺ゛ルオキレ
ダーゼを用いて酵素測定する特許請求の範囲第１項記載
の方法。 ４ ペルオキシダーゼ及び色、原体を添加しかっ色）も
しくは吸光度変化を測定する特許請求の範囲第３項に記
載の方法。 ５ 測定を動力学的に所定の短い時間間隔
で行なう特許請求の範囲第１項〜第４項いずれか１つに
記載の方法。 ；６ 恒温保持する際にグリセリンデヒドロゲナーゼ及
びＮＡ、Ｄも添加する特許請求の範囲第１項〜第５項い
ずれか１つに記載の方法。 ７ 還元ＮＡＤを測定する特許請求の範囲第６項記載の
方法。 ’８ＮＡＤをＮＡＤ−再生系と一緒に添加する特許請求
の範囲第６項又は第７項記載の方法。 ９ ＮＡＤ−再生系としてピルバード及びラフタート
デヒドロゲナーゼを使用する特許請求の範囲第８項記載
の方法。 ＩＱｐＨ７，０〜９．Ｑで作業する特許請求の範囲第１
項〜第９項いずれか１つに記載の方法。 １１形成されたグリセリンアルデヒドをヒドラジン誘導
体と反応させて相応するヒドラゾンに変換しかつこのヒ
ドラゾンを測定する特許請求の範囲第１項記載の方法。 １２ガラクトースオキシダーゼ及びＨ２Ｏ２の測定系又
はグリセリンアルデヒドの測定系より成るグリセリンを
測定する試薬。 １３付加的に、エステル化されたグリセリンをけん化す
るための薬剤を含有する特許請求の範囲第１２項記載の
試薬。 １４Ｔ−１２０□の測定系がペルオキシダーゼ、色原体
少なくとも１種及び緩衝剤より成る特許請求の範囲第１
２項又は第１３項記載の試薬。 １５ペルオキシダーゼ０．５〜１００Ｕ／ｒ／ｌｌ、ガ
ラクトースオキシダーゼ５〜３５Ｕ／ｍｌ、緩衝剤（ｐ
Ｈ６〜９）０．０５〜０．２ミリモル／ｍｌ及び色原体
０．０５〜２０μモル／ｄを含有する特許請求の範囲第
１４項記載の試薬。 １６付加的に、グリセリンデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ及
びＮ’ＡＤ−再生系を含有する特許請求の範囲第１２項
〜第１５項いずれか１つに記載の試薬。 １７ ＮＡＤ−再生系がピルバート及びラフフートデヒ
ドロゲナーゼより成る特許請求の範囲第１６項記載の試
薬 １８グリセリンデヒドロゲナーゼ５〜１００Ｕ／ＴＩ′
Ｌｌ及びＮＡＤ少なくとも０．０５μモル／ＴＬｌを含
有する特許請求の範囲第１５項又は第１６項記載の試薬
。 １９色原体がｐ−クロルフェノール及ｑ４−アミンアン
チピリンアミドより成る特許請求の範囲第１２項〜第１
８項いずれか１つに記載の試薬。 ２０ ｐ−クロルフェノール５〜１５μモル／ｒＩＬｌ
及び４−アミノアンチピリンアミドＱ、１〜１，０μモ
ル／ｍｌを含有する特許請求の範囲第１９項記載の試薬
。 ２１色原体が２，２′−アジノージ−（３−エチル−ベ
ンゾチアゾリンスルホン酸−６）−ジアンモニウム塩よ
り成る特許請求の範囲第１４項〜第２０項いずれか１つ
に記載の試薬。 。２２グリシルグリシン緩衝剤又はビシン緩衝剤（ｐＨ
７，０〜９．０）を含有する特許請求の範囲第１２項〜
第２１項いずれか１つに記載の試薬。 ２３付加的に、表面活性剤を含有する特許請求の範囲第
１２項〜第２２項いずれか１つに記載の薬。 ２４紙のような基材に含浸されている特許請求の範囲第
１２項〜第２３項いずれか１つに記載の試薬。[Claims] 1. Measuring glycerin in an aqueous medium, which is characterized in that it is kept at a constant temperature with galactose oxidase in the presence of oxygen, and the oxygen consumption or the H20□ formed or the glycerin aldehyde is measured. Method. 2. The method according to claim 1, wherein oxygen consumption is measured by polarography. 3. The method according to claim 1, wherein the formed H20□ is measured enzymatically using catalase or peroxyladase. 4. The method according to claim 3, which measures peroxidase and color (brown color upon addition of drug substance) or change in absorbance. 5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the measurements are performed dynamically at predetermined short time intervals. ;6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein glycerin dehydrogenase, NA, and D are also added during constant temperature maintenance. 7. The method according to claim 6 for measuring reduced NAD. 8. The method according to claim 6 or 7, wherein '8NAD is added together with an NAD-regeneration system. 9. The method according to claim 8, wherein pilvard and raftate dehydrogenases are used as the NAD-regenerating system. IQpH7.0-9. Claim 1 working on Q
9. The method according to any one of Items 9 to 9. 11. The method of claim 1, wherein the glyceraldehyde formed is converted into the corresponding hydrazone by reacting with a hydrazine derivative and this hydrazone is measured. A reagent for measuring glycerin consisting of a 12-galactose oxidase and H2O2 measurement system or a glycerin aldehyde measurement system. 13. The reagent according to claim 12, additionally containing an agent for saponifying the esterified glycerin. Claim 1: The measurement system for 14T-120□ comprises peroxidase, at least one chromogen, and a buffer.
The reagent according to item 2 or item 13. 15 peroxidase 0.5-100U/r/ll, galactose oxidase 5-35U/ml, buffer (p
15. The reagent according to claim 14, containing 0.05 to 0.2 mmol/ml of H6-9) and 0.05 to 20 μmol/d of chromogen. 16. The reagent according to any one of claims 12 to 15, additionally containing glycerin dehydrogenase, NAD and N'AD-regenerating systems. 17 Reagent according to claim 16, in which the NAD-regenerating system comprises pyruvate and rough foot dehydrogenases 18 Glycerol dehydrogenase 5-100 U/TI'
17. A reagent according to claim 15 or 16, containing at least 0.05 μmol of Ll and NAD/TLl. 19 Chromogen consists of p-chlorophenol and q4-amine antipyrinamide Claims 12 to 1
The reagent according to any one of Item 8. 20 p-chlorophenol 5-15 μmol/rILl
and 4-aminoantipyrinamide Q, 1 to 1.0 μmol/ml. 21. The reagent according to any one of claims 14 to 20, wherein the chromogen comprises a 2,2'-azinodi-(3-ethyl-benzothiazolinesulfonic acid-6)-diammonium salt. . 22 Glycylglycine buffer or Bicine buffer (pH
7.0 to 9.0)
A reagent according to any one of paragraph 21. 23. Medicament according to any one of claims 12 to 22, additionally containing a surfactant. 24. The reagent according to any one of claims 12 to 23, wherein the reagent is impregnated into a substrate such as 24 paper.
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