JPS58216687A - Production of alpha-glycerophosphate- oxidase - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はα−グリセロホスフェートオキシダーゼの製法
に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for producing α-glycerophosphate oxidase.

α−グリセロホスフェートオキシダーゼ並びに廟用な、
その調製及び抽出技術は、Ｋｏｄ％ｔｓｅｈ＠ｋ　。alpha-glycerophosphate oxidase as well as
Its preparation and extraction technique is Kod%tseh@k.

Ｌ、に、およびＵｍｂｒｅ　ｉ　ｔ　、Ｗ、Ｗ、の１ス
トレプトコカス７エイチウムＦ２４のα−グリセロホス
７エートオキシダーゼ“、ジャーナル　オブ　パクテリ
オロ・ノー、９８巻、３号、１０６３−１０６８頁（１
９６９年）並びにＪａａｏｂｇ、Ｎ、Ｊ、およびＶａｎ
ＤｅｍａｒｋｓＰ、Ｊ、の１ストレプトコ力ス　フヱカ
リ乙のα−グリセロホスフェート酸化酵素の精製及び性
質”、アーカイプズ　オブ　バイオケミストリー　アン
ド　バイオフィシ、クス、８８巻、２５０−２５５頁に
記載されている。との酵素は酸累の存在下にα−グリセ
ロホスフェートを酸化してジヒドロキシアセトンホスフ
ェート及び過酸化水素を生成するのに有用である。"α-glycerophos7ate oxidase of Streptococcus hetium F24", Journal of Pacteriolo no., Vol. 98, No. 3, pp. 1063-1068 (1).
969) and Jaaobg, N. J., and Van
"Purification and properties of α-glycerophosphate oxidase from Streptococcus faecalis," Demarks P, J., Archives of Biochemistry and Biophysics, Volume 88, pp. 250-255. The enzyme is useful for oxidizing alpha-glycerophosphate in the presence of acidic acid to produce dihydroxyacetone phosphate and hydrogen peroxide.

止揚のＫｏｄｉｔｓｅｈｅｋ及びＵｍｂｒａｉｔは、検
圧検定法を含む様々な効力検定技術を用いて研究した乙
トレグトコカス　フェイチウムＦ２４のα−グリセロホ
ス７エートオキシダーゼの諸性質を説明している。スト
レプトコカス　フェイチウムの培養はｌチトリグトン、
１％酵母エキス、０．５％に２ＨＰＯ４，０，１％グル
コース及び１．５％アガールから成るＡＣアガール（以
下ＡＣ媒質と呼ぶことがある）の穿刺（ｓｔａｂ）に保
持した。これらの細胞は媒質から分離し、酵素生成物を
検定のため抽出した。Koditsehek and Umbrait describe the properties of the α-glycerophos7ate oxidase of Otoregtococus faitium F24 studied using various potency assay techniques, including manometry assays. The culture of Streptococcus faitium is carried out using l titrigton,
It was maintained in a stab of AC agar (hereinafter sometimes referred to as AC medium) consisting of 1% yeast extract, 0.5% 2HPO4, 0.1% glucose and 1.5% agar. These cells were separated from the medium and the enzyme products were extracted for assay.

前述のＪａａｏｂｌＩ及びＶａｎ　Ｄ＠ｍａｒｋは、彼
等もその研究において検圧検定法を用いて、ストレグト
コカス　フェ′カリス１０ｃｔのα−グリセロホスフェ
ートオキシダーゼのｓ台性質について記載している。彼
等は上述のＡＣ媒質（但しグルコース０．２％）中でス
トレグトコカス　７エカリスを生長させた。彼叫はスト
レグトコカス　フェカリスからの酵素は受媒質としてＬ
−α−グリセロホスフェートに対しては高度な特異性を
示し、β−グリセロホスフェート、グリセロール、ジヒ
ドロキシア七トンホスフェートもしくは１，２−グロパ
ンジオールホスフエートに対しては認識できるような活
性を示さない旨報じている。Jaaobl I and Van D@mark, supra, have also described the s-order properties of α-glycerophosphate oxidase from Stregutococcus faecalis 10 ct using a manometry assay in their work. They grew Stregutococcus 7 ecalis in the AC medium described above but with 0.2% glucose. The enzyme from Stregutococcus faecalis is L as a receiving medium.
- Highly specific for α-glycerophosphate, with no appreciable activity for β-glycerophosphate, glycerol, dihydroxya heptatone phosphate or 1,2-glopanediol phosphate It is reported that.

Ｊａａｏｂ、Ｎ、Ｊ、およびＶａｎ　Ｄｅｍａｒｋ、Ｐ
、Ｊ、は、ジャーナル　オブ　パクテリオロジー、７９
巻、５３２−５３８頁（１９６０年）の雑文１好気的及
び嫌気的に生長させたストレグトコカス　フェカリスに
おけるグ２リセロール酸化根構の比較”に］−−一− おいてストレグトコカス　７エカリスからの好気的及び
嫌気的生長細胞を用いた分類学的研究におけるグリセロ
ールの代謝について論じている。このストレグ）　Ｆ　
ｆｙ　７．　７　ｘ　ｆＪ↓そは前述のＡＣ媒質で生長
させている。Jaaob, N. J., and Van Demark, P.
, J., Journal of Pacteriology, 79
Vol., pp. 532-538 (1960) Miscellaneous Papers 1 "Comparison of Glycerol Oxidation Root Structure in Stregutococcus faecalis grown aerobically and anaerobically" Discusses glycerol metabolism in taxonomic studies using anaerobic and anaerobically grown cells.
fy7. 7 x fJ↓It is grown in the AC medium mentioned above.

Ｇｕｎｓａｌｕａ、１．Ｃ，及びＵｍｂ　ｒ　＠ｉ　ｔ
　ｓＷ、Ｗ−の１ストレプトコカス　７エカリスによる
グリセロールの酸化”、ジャーナル　オツ　バクテリオ
ルジー、４９＠、３４７−３５７頁（１９４５年）はス
トレグトコカス　フェカリスの活性細胞懸濁物によるグ
リセロールの酸化の検定研究結果を報告している。彼等
は検定にピルビン酸塩を添加することによって、ピルビ
ン酸塩がＨ２Ｏ２のスカベンジャーとして作用するので
、グリセルール酸化レベルを高くすることを見出した。Gunsalua, 1. C, and Umb r @i t
sW, W-1 ``Oxidation of glycerol by Streptococcus faecalis'', Journal Otsu Bacteriology, 49@, pp. 347-357 (1945) is an assay study of the oxidation of glycerol by an active cell suspension of Streptococcus faecalis. reported results. They found that adding pyruvate to the assay increased the level of glycerol oxidation as pyruvate acts as a scavenger for H2O2.

α−グリセロホス７エートオキシダーゼの活性線記載さ
れていない。The active line of α-glycerophos-7ate oxidase is not described.

Ｇｕｎｓａｌｕ＠、１．Ｃ，の１ストレグトコカス　７
：Ｌ九入？による嫌気的グリセロール発酵生成物”（ジ
ャーナル　オブ　）々クテリオロジー、５４巻、２３９
−２４４頁（１９４７年））は、グリセロールと１多ま
での酵母エキスを含む媒質中での４トレゾトコカス　７
エカリスの生長について報告している。Ｇｕｎｓａｌｕ
ｇはグリセロールによる灸」＋４４−！−己−久２　７
　ｘ　ｌｚ　Ｉ７２の生長は僅か（好気的生長）か殆ん
ど認められない（嫌気的生長）旨報告している。Gunsalu@, 1. C, 1 stregtococcus 7
:L9 entry? "Anaerobic Glycerol Fermentation Products" (Journal of ) Cterology, Vol. 54, 239
- p. 244 (1947)), 4 Tresotococcus in a medium containing glycerol and up to 100% yeast extract 7
Reports on the growth of Ekaris. Gunsalu
g is moxibustion with glycerol” +44-! -Self-Kyu 2 7
It has been reported that the growth of x lz I72 is slight (aerobic growth) or almost non-existent (anaerobic growth).

Ｃｌａｒｌｄｇｓ＋Ｃ，Ａ、及びＨｅｎｄｌ　ｌｒ＠Ｄ
、＋の　６ストレグトコカス　フェカリスによるグリセ
ロールの酸化＃（ジャーナル　オプ　バクテリオルジー
、８４巻、１１８１−１１８６頁（１９６２年））は一
般的なワルブルグ検定を用いて行なつたストレグトコカ
ス　フェカリスによるダリセｐ−ルの利用に関する研究
を報告している。彼等は、彼等の検定においてグリセロ
ールを素早く酸化する細胞を得るために、１％のグリセ
ロール（１０ｇ／ｌ）を補充した、１　ｇ　／　１のグ
ルコースを含む媒質中でストレグトコカス　フェカリス
を生長させることを示唆している。α−グリセロホスフ
ェートオキシダーゼ活性は記載されていない◎ 前述のいくつかの文献はグリセロールの酸化についての
研究を一般的に報じている。これらの文献のうちの最初
の二つ、即ち、′″Ｋｏｄｌｔｓａｈ＠ｋ及びυｍｂｒ
ｅｉｔ′並びに”　Ｊａｏｏｂｍ及びＶａｎ　Ｉ）ｅｍ
ａｒｋ’のみが彼岬の検定でα−グリセロホスフェート
オキシダーぜの存在を示している。しかし、いずれの文
献もペディオコカス属に属する微生物がα−グリセロホ
スフェートオキシダーゼを生産することは示唆していな
い。Clarldgs+C, A, and Hendl lr@D
, + 6 oxidation of glycerol by Stregutococcus faecalis (Journal of Bacteriology, Vol. 84, pp. 1181-1186 (1962)) was performed using the general Warburg test. Reports research on usage. They grew Stregutococus faecalis in a medium containing 1 g/1 glucose supplemented with 1% glycerol (10 g/l) to obtain cells that rapidly oxidize glycerol in their assay. It suggests. α-Glycerophosphate oxidase activity is not described. Some of the above-mentioned publications generally report studies on the oxidation of glycerol. The first two of these documents, namely '''Kodltsah@k and υmbr
eit' and "Jaoobm and Van I)em
Only ark' shows the presence of α-glycerophosphate oxidase in the Cape test. However, none of the literature suggests that microorganisms belonging to the genus Pediococus produce α-glycerophosphate oxidase.

発明の目的及び構成 本発明の目的紘番−ヂ」→」制縣−７−ｔ−−）−ｎ”
キ憧史生緊・を媒質中で生長させることによりてα−グ
リセロホス７エートオキシダーゼを製造する仁とにある
。Object and Structure of the Invention Object of the Invention
The present invention relates to the production of α-glycerophos 7ate oxidase by growing the plant in a medium.

本発明に従ったα−グリセロホス７エートオ中シダーゼ
の製造方法は、ペディオコカス属の一員を生長媒質中に
おいて生長せしめ、次いで生成α−グリセロホス７エー
トオキシダーゼを抽出することを特徴とする。　　　　
　　　　　　以下余白発明の構成及び効果の具体的説明 本発明の実施に際し使用できる微生物ペディオコカス属
の代表的な種は４デイオコカス　セリヴイジイエ（Ｐ＊
ｄｌｏｅｏｃｅｕｓ　ｃｅｒｅｖｉ−量ｍｓ）である・
特に好ましいのは一！！ディオコカスセリヴイジイエＡ
ＴＣＣ８０４２及び８０８１である。The method for producing alpha-glycerophos-7ate oxidase according to the present invention is characterized in that a member of the genus Pediococcus is grown in a growth medium and the produced alpha-glycerophos-7ate oxidase is then extracted.
Detailed explanation of the structure and effects of the invention in the following margin Representative species of the microorganism Pediococus genus that can be used in carrying out the present invention are 4 Deiococus seriviae (P*
dloeoceus cerevi-amount ms).
Particularly preferred is one! ! Diococcus cerevisiae A
TCC8042 and 8081.

ストレグトコチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｅｅ　ｌ）はＷｏ
ｏｄ、Ａ、Ｊ。Streptocoee l is Wo
od, A, J.

及びＧｕｎｓａｌｕｓ、１．Ｃ，の”ストレゾトコチの
活性休止細胞の製造”（ジャーナル　オツ　パクテリオ
ロジー、４４巻、３３３−３４１頁（１９４２年））に
記載されている、「ｓ’ｒｐｌ質」と呼ｄれる媒質中で
普通生長する。以下に述べるように、ＳＴＰ媒質中でス
トレグトコカス　７エカリスＡＴＣＣ１２７５５を生長
させると、６Ｏ−８０Ｕμのα−グリセロホス７エート
オキシダーゼが製造される。and Gunsalus, 1. In a medium called ``s'rpl'' described in ``Manufacture of active resting cells of Strezotokochi'' by C. Grows normally. As described below, growth of Stregutococcus 7 ecaris ATCC 12755 in STP medium produces 60-80 Uμ of α-glycerophos7ate oxidase.

本明細書に記載するストレグトコカス°７エカリスＡＴ
ＣＣ１２７５５なる名称の微生物は、最初ＡＴＣＣ（Ａ
ｍｅｒｌｃａｎ　ＴＦＰ＠　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１
＊ｅｔｌｏｎ）にストレグトコカス　７エカリスＡＴＣ
Ｃ１２７５５として寄託されたもので、ＡＴＣＣのカタ
ログ（１９７４年、のは前記カタログの第１２版でスト
レグトコヵスフェイチウムＡＴＣＣ１２７５５と名称変
更されている。Stregutococcus °7 Echaris AT as described herein
The microorganism named CC12755 was first developed by ATCC (A
merlcan TFP @ Culture Co11
*etlon) Stregtococus 7 Ekaris ATC
C12755, which was renamed as Stregutococcus faitium ATCC 12755 in the ATCC catalog (1974, 12th edition of said catalog).

本発明に従えは、２クトパシラチエ工科の微生物、特に
ストレグトコカス　フェカリスを炭素源としてのピルビ
ン酸塩、そして好ましくはグルコースの添加及びα−グ
リセｐホス７エートオキシダーゼ用誘導質の添加によっ
て修正した８ＴＰ媒質中で生長させることによってα−
グリセ−ホス７ヱートオキシポーゼが高収量で取得され
る。紳導質としてグリセロール奢添加することによって
α−グリセロホス７エートオキシダーゼの収量がグリ七
ｐ−ルを添加しない場合に比較して３倍以上も増加した
。その他の有用なα−グリセロホス７ヱートオキシダー
ゼ誘導質はグリセロールの同族体、例えば、３−メチル
−１，２−グロノ４ンジオール、１　＋　３−　ｆ　ａ
パンジオニル、１．２−７６０）やンジオール、２．３
−ブタｙジオール、ｌ、２゜４−ブタントリオール、モ
ノアセチン、ｌ−モノゾロピオニン、１−モノブチリン
、モノステアリン、モノオレイン及びトリラウリンなど
である。According to the invention, a microorganism of the 2nd chopasillachie family, in particular Stregutococcus faecalis, is used in an 8TP medium amended with pyruvate as a carbon source and preferably with the addition of glucose and an inducer for α-glycep phos-7ate oxidase. α−
Glycephos 7-ethoxypose is obtained in high yield. By adding a generous amount of glycerol as a stimulant, the yield of α-glycerophos-7ate oxidase was increased by more than three times compared to the case where glycerol was not added. Other useful α-glycerophos-7ethoxidase inducers are the homologs of glycerol, such as 3-methyl-1,2-gulonodiol, 1 + 3-fa
pandiol, 1.2-760) and pandiol, 2.3
-butydiol, 1,2-4-butanetriol, monoacetin, 1-monozolopionine, 1-monobutyrin, monostearin, monoolein and trilaurin.

訪導質の４１用なｌは、一般に、＃、質リすトル描υ約
１．０〜約１０１１の範囲内であることを見出しまた。It has also been found that the value of 41 for the conductive quality is generally within the range of about 1.0 to about 1011.

好ましい媒質の使用ｉは媒質リットル邑シ約２．０〜約
５．ＯＩでらる・ Ｗｏｏｄ及びＧｕｎｓａｌｕｓによって、呼称された５
ＴＰｉｆｉ、！ルコースー１．０ｇ／Ｌ　酵母エキス−
１０ｇ／ｌ、）リグトンｔｏｇ／ｌ及びに２ＨＰＯ４−
５、！；Ｉ／ｌを含む。これらの成分の有用な範囲は、
グルコース約０．１〜３．０ｇ／１１酵母エキス約１．
０〜２０ｇ／ｌ、好ましくは約２．０〜ｌｌｌ／ｌ、　
　トリプトン約５〜２０９／１及びに２ＨＰＯ４少なく
とも約３．０ｇ／ｌ、好ましくは約３０〜約５．０．９
／１でおることを確認した。The preferred medium used is about 2.0 to about 5.0 liters of medium. 5 named by Wood and Gunsalus
TPifi,! Lucose 1.0g/L yeast extract
10g/l,) Rigton tog/l and 2HPO4-
5,! ; Contains I/l. The useful range of these ingredients is
Glucose: approx. 0.1-3.0g/11 yeast extract: approx. 1.
0 to 20 g/l, preferably about 2.0 to lll/l,
Tryptone from about 5 to about 209/1 and 2HPO4 at least about 3.0 g/l, preferably from about 30 to about 5.0.9
I confirmed that it was /1.

生長媒質においてトリプトンに代えて使用することがで
きる他の蛋白氷解物としては、例えは、５ｈｅｆｆｉｅ
ｌｄ　Ｃｈｓｍｌａａｌ　Ｄｌｖ、　ｏｆ　Ｋｒａｆｔ
ｅｅ　Ｃｏｒｐ。Other protein melts that can be used in place of tryptone in the growth medium include, for example, 5heffie
ld Chsmlaal Dlv, of Kraft
ee corp.

（ユニオン、ニューシャーシー）から市販のソイペグト
ン　タイプＴ　（Ｂｏｙ　Ｐｅｐｔｏｎｅ　Ｔｙｐ＠Ｔ
　）。(Boy Peptone Type@T commercially available from Union, New Chassis)
).

エグミン（Ｅｄａｍｌｎ）タイプＴ１ファームアミン（
Ｆｅｒｍ　Ａｍ１ｎｅ）タイプ１．ｎ、Ｉ［［及びＩＶ
　、Ｎ　−Ｚアミン（Ａｍｅｎｄ）タイプＡＴ　、　Ｂ
Ｔ　、　ＥＴ及びＹＴＴ　：Ｃｕｄａｈｙ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ　（オマハ、ネプラスカ）から市販のカ
ゼイン　ヒドロリセー）　（ＣａｓｅｌｎＨｙｄｒｏｌ
ｙｓａｔｅ）　、アナトン（Ａｎａｔｏｎ＊）　、ミク
ロバイオトン（Ｍｉｃｒｏｂｌｏｔｏｎ＊）及びファー
マトン（Ｐｈａｒｍａｔｏｎ＠）　’、　Ｔｒａｄ＠ｒ
ｓ　Ｐｒｏｔｌｎ　Ｄｉｖ、　Ｔｒａ−ｄ＠ｒｓ　Ｏ口
Ｍｌｌｌ　Ｃｏ、　（７＃　　）　　ワース、テキサス
）から市販の７７−　ｚメディア（Ｐｈａｒｍａｍｓｄ
ｌｇ）並ひに硫酸アンモニウムがあげられる。Edamln Type T1 Firmamine (
Ferm Am1ne) Type 1. n, I [[ and IV
, N-Z amine (Amend) type AT, B
T, ET and YTT: Cudahy Labor
Casein Hydrol (commercially available from Casein Hydrolysate, Neplaska, Omaha)
ysate), Anaton*, Microbloton* and Pharmaton@', Trad@r
77-z media (Pharmamsd.
lg) Ammonium sulfate is also mentioned.

しかしながら、前記生長媒質中のトリプトンに代えて上
述の蛋白氷解物の一つを使用した場合には、その蛋白氷
解物の最適量はトリプトンの最適量と多少変動すること
がある。特に有用な、トリプトンの代替物は、ソイ　ペ
プトン　タイプＴで、これはトリプトンを用いた場合に
比較してα−グリセロホス７エートオキシダーゼの４５
［ｔ−５倍以上を増加させる。However, if one of the protein lysates described above is used in place of tryptone in the growth medium, the optimum amount of the protein lysate may vary somewhat from the optimum amount of tryptone. A particularly useful alternative to tryptone is soy peptone type T, which provides 45
[Increase by t-5 times or more.

前記生長媒質中においてグルコースに代えて使用できる
、その他の有用な炭素源は、例えば、クエン酸、乳酸、
酢酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、アスノクラキン
酸、グルタミン酸、コーンシロップ、糖蜜、フラクトー
ス、ラクトース、ｉルトースおよびシュクローズである
。Other useful carbon sources that can be used in place of glucose in the growth medium include, for example, citric acid, lactic acid,
Sodium acetate, sodium succinate, asnocratic acid, glutamic acid, corn syrup, molasses, fructose, lactose, i-lutose, and sucrose.

本発明の最も好ましい態様では、生長媒質中にグルコー
ス約０．５〜約３．０，９／ｌ及びピルビン酸ナトリウ
ム約０．５〜約２．０９／ｌを添加する。生長媒質中で
のグルコースとピルビン酸ナトリウムの組合せはα−グ
リセロホスフェートオキシダーゼの生成に相剰効果を呈
するようである。炭素源のこの組合せを用いる場合には
、酵素収量は、炭素源としてグルコース１ｇ／Ｌ　　を
用いた場合に比較して、実に８倍も増加した。In the most preferred embodiment of the invention, about 0.5 to about 3.0.9 glucose/l and about 0.5 to about 2.09 sodium pyruvate/l are added to the growth medium. The combination of glucose and sodium pyruvate in the growth medium appears to have a complementary effect on the production of alpha-glycerophosphate oxidase. When using this combination of carbon sources, the enzyme yield increased by a factor of as much as 8 times compared to when using 1 g/L glucose as the carbon source.

前記生長媒質中に有効量の無機塩類およびビタミン類を
添加するのが有利でおることも見出した。It has also been found to be advantageous to add effective amounts of inorganic salts and vitamins to the growth medium.

ここにいう「有効量」なる語は、生長媒質中に加えて酵
素の収量を増加させるのに十分な量の無機塩類及びビタ
ミン類の量をいう。このような無機塩及びビタミンの添
加量は塩及びピタ建ンの種類によって変動する。この量
は一般に少量で、当業者であれば通常の実験によシ極め
て容易に定めることができる。As used herein, the term "effective amount" refers to an amount of inorganic salts and vitamins sufficient to increase enzyme yield when added to the growth medium. The amounts of such inorganic salts and vitamins added vary depending on the type of salt and pita. This amount is generally small and can be determined quite easily by one skilled in the art by routine experimentation.

大規模な発酵器中でストレゾトコカス　フェカリスのよ
うな微生物を生長させて高収量の酵素を取得する場合に
、しばしば発泡が生ずる。この泡立ちを制御するために
、特に酵素を大パ、チで製造する場合に泡制御剤を使用
するのが好ましい。Foaming often occurs when growing microorganisms such as Strezotococus faecalis in large scale fermenters to obtain high yields of enzymes. In order to control this foaming, it is preferred to use a foam control agent, especially when the enzyme is produced in large batches.

本発明の実施に際して有用な泡制御剤の一例は、ダウケ
ミカル社（ミツドランド、ミシガン）から市販のポリグ
リコール（Ｐｏｌｙｇｌｙｅｏｌ）Ｐ　−２０００であ
る。この消泡剤は酵素の生成を妨害することなく生長＃
：質的中０．５．９／１　までの量で使用できる。しか
し、一般には約０．１ｇ／ｌで泡を制掬Ｉするのに十分
である。その他の泡制御剤（消泡剤）も使用できる。そ
の選定及び使用基準は発泡を制御する（押える）ような
濃度水準で酵素合成を抑制しないことである。One example of a foam control agent useful in the practice of this invention is Polyglyeol P-2000, available from The Dow Chemical Company (Midland, Mich.). This antifoam agent grows without interfering with enzyme production.
: Can be used in quantities up to 0.5.9/1 in quality. However, generally about 0.1 g/l is sufficient to control foam. Other foam control agents (defoamers) can also be used. The criteria for its selection and use is that it does not inhibit enzyme synthesis at concentration levels that would control foaming.

本発明において使用する微生物社合理的な温度範囲で生
長させてα−グリセロホスフェートオキシダーゼを製造
することがで鰺る。良好な結果は２５〜４２℃の温度範
囲で得ることができる。最良の結果は約３０℃の温度で
達せられる。細胞を生長させた稜グリセロホスフェート
オキシダーゼは常法に従って抽出することができる。The microorganisms used in the present invention can be grown in a reasonable temperature range to produce α-glycerophosphate oxidase. Good results can be obtained in a temperature range of 25-42°C. Best results are achieved at a temperature of about 30°C. Glycerophosphate oxidase from grown cells can be extracted according to a conventional method.

本発明の実施を例示する、以下の例において次の条件を
使用した。The following conditions were used in the following examples to illustrate the practice of the invention.

１、培養 以下の例１−１１においてストレゾトコカス　フェカリ
スＡＴＣＣ１２７５５を用いた。1. Culture Strezotococus faecalis ATCC12755 was used in Example 1-11 below.

２、＃、質 ａ）培養保存媒質。2, #, quality a) Culture preservation medium.

培養保存には０，２チのグリセロールを含ませた、きり
筒検定培養アガール（Ｍｌｅｒｏ　Ａｓ５ａｙＣｕｌｔ
ｕｒ＠ａｇａｒ）　（Ｄｉｆｅｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅ＋ｓ、デトロイト、ミシガン）を用いた。For culture preservation, Mlero As5ay Cult containing 0.2 T of glycerol was used.
ur@agar) (Difeo Laborator
ie+s, Detroit, Michigan).

ｂつ　発酵媒質 グルコース　　　　　　　　　　１．０酵母エキス　　
　　　　　　　１０．０トリグトン　　　　　　　　　
　　ｌ００ＯＫ２ＨＰ０４５．０ 蒸留水　　　　　　　全量をｌ！にするぶ（１１）改良
ＳＴＰ媒質−１ｆＪ／ｌ グルコース　　　　　　　　　　　　１．０トリプトン
　　　　　　　　　　　１Ｏ５０酵母エキス　　　　　
　　　　　１０．０に２ＨＰＯ４５，０ グリセロール　　　　　　　　２．０ 蒸留水　　　　　　　全量を１！にする量ピルビン酸ナ
トリウム　　　　　２．０醇母工Ｔ！Ｐス　　　　　　
　　　　２．０トリプトン　　　　　　　　　　１０．
０に２ＨＰ０４５．０ グリセロール　　　　　　　　　２．０蒸留水　　　　
　　　全量を１！にする量（ＩＶ）　　改良８ＴＰ媒質
−３ｇ／ｌピルビン酸ナトリウム　　　　　２．０酵母
エキス　　　　　　　　　　２．０トリシト／１０．０ に２ＨＰ０４５．０ グリセロール　　　　　　　　　２．０ノルトソリュー
シ冒ンＣ５，０ ビタミン溶液　　　　　　　　　　１・０蒸留水　　　
　　　　全量を１！にする量（Ｍ　改良ＳＴＰ＠質−４
１１１ ピルビン酸ナトリウム　　　　　２．０酵母エキス　　
　　　　　　　　　２．０トリグトン　　　　　　　　
　　　１０．０に２ＨＰＯ４５・０ グリセロール　　　　　　　　　２．０ソルトソリエー
シ冒ンＰＹＳ　　　２０１Ｒ１ビタミン溶液　　　　　
　　　　　１．　Ｑ　ｍｌ蒸留水　　　　　　　　全量
をｌｌにする量（ＶＤ　改良ＳＴＰ媒質−５ｐ／１ グルコース　　　　　　　　　　　　　２，０ピルビン
酸ナトリウム　　　　　２．０酊母エキス　　　　　　
　　　　２．０トリプトン　　　　　　　　　　１０．
０に２１ＰＯ４５，０ グリセロール　　　　　　　　　２．０ソルトソリ島−
シ璽ンＰＹＳ　　　２０．ＯＭｌビタミｙ溶液　　　　
　　　　　　１．０１Ｒｔ蒸留水　　　　　　　全量を
１１にする１（Ｖｉ＋）改良ＳＴＰ　ｆｔ’Ｑ、ｌｌ　
−６１！／１ピルビ／酸ナトリウム　　　　　２，０酵
母エキス　　　　　　　　　　　２・０トリグトン　　
　　　　　　　　１０．０に２ＨＰＯ４５，０ グリセロール　　　　　　　　　２，０ソルトソリユ一
シ目ンＰＹＳ５１ｇ ビタミン溶液　　　　　　　　　　１　　ｍｌ蒸留水　
　　　　　　全量を１！にするｌ。B fermentation medium glucose 1.0 yeast extract
10.0 Trigton
l00OK2HP045.0 Distilled water Total amount l! Nishibu (11) Improved STP medium - 1 fJ/l Glucose 1.0 Tryptone 1O50 Yeast extract
10.0 to 2HPO45.0 Glycerol 2.0 Distilled water Total amount 1! Amount of sodium pyruvate 2.0 Noboko T! Ps
2.0 Tryptone 10.
0 to 2HP045.0 Glycerol 2.0 Distilled water
The whole amount is 1! Amount to make (IV) Modified 8TP medium - 3 g/l Sodium pyruvate 2.0 Yeast extract 2.0 Tricitate/10.0 to 2HP045.0 Glycerol 2.0 NortSolution C5,0 Vitamin solution 1.0 Distilled water
The whole amount is 1! Quantity (M Improved STP@Quality-4
111 Sodium pyruvate 2.0 Yeast extract
2.0 Trigton
10.0 to 2HPO45.0 Glycerol 2.0 Salt Solisietin PYS 201R1 Vitamin Solution
1. Q ml Distilled water Amount to bring the total volume to 1 liter (VD Improved STP medium-5p/1 Glucose 2.0 Sodium pyruvate 2.0 Sodium extract
2.0 Tryptone 10.
0 to 21PO45,0 Glycerol 2.0 Salt Soli Island-
Sign PYS 20. Oml vitamin y solution
1.01Rt Distilled water Increase total amount to 11 1 (Vi+) improved STP ft'Q, ll
-61! /1 Sodium pyrubi/acid 2.0 Yeast extract 2.0 Trigtone
10.0 to 2HPO 45.0 Glycerol 2.0 Salt Soil 51g PYS Vitamin solution 1ml Distilled water
The whole amount is 1! l to make it.

ｖｉｌ）改良ＳＴＰ　ｆ！４質−７ｇ／ｌピルビン酸ナ
トリウム　　　　　２．０酵母エキス　　　　　　　　
　　２．０トリグトン　　　　　　　　　　１Ｏ０ＯＫ
２ＨＰＯ４５，０ グリセロール　　　　　　　２，０ ノルドソリエージ叢ンＰＹＳ　　　２．５　ｗ１１ビタ
ミン溶液　　　　　　　　　ｌ　耐水道水　　　　　　
全１をｌＩ／にするＩＣ）ンルトンリューシ冒ン 申　クルトンリヱーシロンＡ 下記ノψ−トｌとノや一ト２を等容積で混合してソルト
ソリューシ冒ンＡをＨ８製した。vil) Improved STP f! 4-7g/l sodium pyruvate 2.0 yeast extract
2.0 Trigton 1O0OK
2HPO45.0 Glycerol 2.0 Nordsoliege PYS 2.5 w11 vitamin solution l Tap water resistant
Converting all 1 to lI/IC) Crouton Resilon A Salt solution formula A was prepared by mixing equal volumes of the following No. ψ and No. 2.

ノ９−　ト　’　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　ｇ／ｌ　　（ｏ、ＩＮＨｃｚ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０
１００，０ ＦｓＳＯ４”７Ｈ２０１０，０ ＭｎＳＯ４”Ｈ２Ｏ１，Ｏ ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２００，５ ０、ＩＮＨＣｔ　　　　　　　全量をｉｚにするｌ。ノ 9- ト '
g/l (o, INHcz) MgSO4・7H20
100,0 FsSO4"7H2010,0 MnSO4"H2O1,O NaMoO4.2H200,5 0, INHCt Make the total amount to iz l.

ノや−ト　２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　ｙ／ｌＣａＣ１ｚ　　　　　　　　　　　ｌ　ｏ、　
０蒸留水　　　　　　　全量をｌｌにする量（１１）　
　ンルトンリューシ嘗ンＣ９／１　（０，ＩＮＨＣｔ）
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０２５，Ｏ Ｃ＊Ｃ１２’２Ｈ２００，Ｌ Ｆｅ８０４’　７ＴＩ２０　　　　　　　　２．８λｆ
ｆｎ５ｏ４’Ｈ２０１，７ ＺｎＳＯ４”７Ｈ２００，０６ Ｎ＆Ｃｔ０・６ ＭｎＣ４・４）Ｉ　２０　　　　　　　　３．０ＺｎＣ
１２，０ Ｆ＠　ＣＩＢ・６Ｈ２０２，０ ＭｇＣ１２１６Ｈ２０５０，０ ＣｕＣｔ２１２１（２００，２ Ｃ＊Ｃｔ２・２）Ｉ２０　　　　　　　０．７５ＣｏＣ
１２・２）（２００−２ ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２００−ｌ Ｎａ２Ｂ４Ｏ７’　ｌ０Ｈ２００，１ 蒸留水　　　　　　　全量を１．＃にする量ｄ）　ビタ
ミン溶液　　　　　　　　ｍ９／１チアミン・１（Ｃ１
２００ ｐ−アミノ安息香酸　　　　２００ ピリドキシン・ＨＣｌ２００ リがフラビン　　　　　　　２００ Ｄ−パントテン酸（カルシウム１）２００ホール酸　　
　　　　　　　　　　２．０ビオチン　　　　　　　　
　　　２．０リボフラビ／は加温して溶液中に溶解させ
る。Note 2
y/lCaC1z l o,
0 Distilled water Amount to make total volume (11)
C9/1 (0,INHCt)
MgSO4・7H2025, OC*C12'2H200, L Fe804' 7TI20 2.8λf
fn5o4'H201,7 ZnSO4"7H200,06 N&Ct0・6 MnC4・4) I 20 3.0ZnC
12,0 F@CIB・6H202,0 MgC1216H2050,0 CuCt2121(200,2 C*Ct2・2)I20 0.75CoC
12・2) (200-2 NaMoO4・2H200-l Na2B4O7' l0H200,1 Distilled water Amount to make the total amount 1.# d) Vitamin solution m9/1 Thiamine・1 (C1
200 p-aminobenzoic acid 200 Pyridoxine/HCl200 Rigaflavin 200 D-pantothenic acid (calcium 1) 200 Pholic acid
2.0 biotin
2.0 riboflavi/is dissolved in the solution by heating.

このビタミン溶液は殺菌濾過し、そして殺菌後砂質に加
えた。This vitamin solution was sterile filtered and added to the sand after sterilization.

・）すべての大規模発酵において媒質には消泡剤として
０．０１％ポリグリコールＰ−２０００をも含まぜた。-) In all large-scale fermentations the medium also contained 0.01% polyglycol P-2000 as an antifoaming agent.

３　培養物の保存 培養物は０．２チのグリセロールを含まぜたミクロ検定
培養アガールの穿刺上に保存した。培養物は少なくとも
週に一度新鮮な穿刺上に移した。3 Preservation of Cultures Cultures were preserved on microassay culture agar punctures containing 0.2 t of glycerol. Cultures were transferred onto fresh punctures at least once a week.

３０℃で４８時間温簡、の後穿刺を４℃で保存した。After incubation at 30°C for 48 hours, the punctures were stored at 4°C.

生物体の保存用の別の方法は液体窒累中での貯蔵である
。この目的のため培養物は８ＴＰ媒質中で２０時間生長
させた。次に細胞を分離し、アレン（Ａｌｉｅｎ）のソ
ルトソリニーシ質ン（Ａ　１１　ａ　ｎ　ｍ　Ｍ　、Ｂ
　ｒアーカイプス　オブ　マイクロバイオロジー、３２
巻、２７０−２７７頁、１９５９年）を含む無菌の１０
チグリセロール水溶液中に再懸濁させた。この懸濁物の
少量を殺菌ガラスアングルに院加し、次に密封し、液室
中に貯蔵した。Another method for preserving living organisms is storage in liquid nitrogen. For this purpose, cultures were grown for 20 hours in 8TP medium. The cells were then isolated and treated with Alien's salt sorine cytoplasm (A 11 a n m M , B
r Archives of Microbiology, 32
Vol. 270-277, 1959).
Resuspended in aqueous tiglycerol solution. A small amount of this suspension was added to a sterile glass angle, which was then sealed and stored in a liquid chamber.

４、小規模発ｎ７ ａ）接種剤の調製 Ｚクロ検定培養アガールで４８時間生長させたＪｕｌ：
２５ｏｙエーレンマイヤーフラスコ中の５０１１４の、
ＳＴＰ媒質又り改良ＳＴＰ媒質−２中に移した。フラス
コを３０℃及び２０　Ｏｒｐｍで振とうした。２０時間
の温置彼、内容物をソーパル（Ｓｏｒｖａｌｌ）の冷凍
遠心４％（ＲＣＩＩＢ型、７’　＝Ｌ　、３＝ンインス
ツルメント社、二ｊ−タウン、コネチカット）において
４℃、１２，０００　Ｘｇで１５分間遠心分離した。上
澄液は捨て、＃４ｉＩ胞トもとと同じ容積の無菌水中に
再懸濁した。この懸濁物を接種剤として用いた。4. Small scale n7 a) Preparation of inoculum Jul grown for 48 hours in Z black assay culture agar:
50114 in a 25oy Erlenmeyer flask,
Transferred to STP medium or improved STP medium-2. The flask was shaken at 30°C and 20 Orpm. After a 20-hour incubation, the contents were centrifuged in a Sorvall cryocentrifuge (RCIIB type, 7'L, 3N Instruments, Inc., 2J-Town, CT) at 4°C, 12,000 x g. The mixture was centrifuged for 15 minutes. The supernatant was discarded and the #4iI cells were resuspended in the same volume of sterile water as the original. This suspension was used as an inoculum.

ｂ）ｉ￥紫の製造 ２５０１１１エーレンマイヤーフラスコ中の２５μの発
酵＊質に上記（４，５Ｌ）で述べたようにして訓製しだ
接憔剤１，５ｄを接種した。フラスコを３０℃で２０　
Ｏｒｐｍで振とうした。フラスコを２０時１１＋振とり
後、それぞれのフラスコからサンプル２．５Ｍを採」又
した。この−！７−ングルをンーパル冷凍遠心機におい
て１９，０００　Ｘｇで１５分間遠心した。b) Preparation of i\Purple 25μ of fermentation material in a 250111 Erlenmeyer flask was inoculated with 1.5d of pre-prepared Shida powder as described above (4.5L). Incubate the flask at 30°C for 20
It was shaken at Orpm. After shaking the flasks at 20:11, a 2.5M sample was taken from each flask. This-! The 7-ngles were centrifuged at 19,000 xg for 15 minutes in a Numpal refrigerated centrifuge.

この細胞を脱イオン水２．５ｄ中に再懸濁させた。The cells were resuspended in 2.5 d of deionized water.

この懸濁物を１０倍に希釈した。この希釈懸濁液を乾燥
細胞重量の決定及びα−グリセロホスフェート（α−Ｇ
Ｐ）オキシダーゼの検定用に用いた。This suspension was diluted 10 times. This diluted suspension was used for determination of dry cell weight and α-glycerophosphate (α-G
P) Used for oxidase assay.

５、大規模発ら）゛ ａ）接種剤の調製 １５０／−発ｒｊ′ｆ器用の接種剤を次の３通シの方法
でｖ４製し、た。5. From large-scale production) a) Preparation of inoculum A 150/-rj'f inoculum was prepared by the following three methods.

（１）５０Ｑｍ／の改良５Ｔｐｌ質−２を含む６個の２
．８！のフエルンバ、ハフ２スコに０．２％グリセロー
ルを含ませたミクロ検定培養アガールの穿刺で４８時間
生長させたストレゾトコカス　フェヵ先乙ＡＴＣＣ１２
７５５を接種した。１個の穿刺を各７エルンパツハフラ
スコの接種に用いた。フラスコを３０℃で１２５　ｒｐ
ｍで振とうし九〇２０時間温直後、７ジスコ内容物を冷
凍遠心機（ＲＣＩＩＢ型、デュポン　インスッルメント
社、二ニータウン、コネチカット〕で６０００Ｘｇで１
５分間無菌的に遠心分離した赤土澄液を捨て、細胞ぜし
、トを無菌魚留水中に丹陶Ｘ濁した。６侮１のフラスコ
からの細胞を再懸油恣ぜるのに全Ｂで５０（１１４の魚
留水を用いた。この細胞懸濁液を１５０！発ｒ４ｆ儀の
接ｆ４ｆに用いた。(1) 6 pieces of 2 including improved 5Tpl quality-2 of 50Qm/
．． 8! Strezotococus faecalis ATCC 12 grown for 48 hours by puncturing a microassay cultured agar containing 0.2% glycerol in Fuerumba and Hough 2 Sco.
755 was inoculated. One puncture was used to inoculate each 7 Ernpatsch flask. The flask was heated to 125 rp at 30°C.
Immediately after incubation for 9020 hours after shaking at
The clear red clay solution that had been aseptically centrifuged for 5 minutes was discarded, and the cell suspension was suspended in sterile fish distilled water. Total B.50 (114) fish water was used to resuspend the cells from the 6-1 flask. This cell suspension was used in the 150!R4F assay.

（２）とのＰＩ創製法、フラスコの内容物を遠心し７な
かった以外は上と同様である。６個の７２スコからの全
発酵肉汁を１５０．＃発酵器の接ｍＫ用りた。The PI creation method in (2) was the same as above, except that the contents of the flask were not centrifuged. Whole fermented gravy from 6 72scos for 150. # I used the fermenter connection mK.

（３）　　この接種剤調製法は、本明細書に記載した実
験のｌｓ、とんどの接種剤の［１＾１製に使用した。５
０ｗｅの改良８ＴＰ媒質−２を含む２５０ｍのエーレン
マイヤーフラスコＫ、０．２％グリセロールｔ　７ＪＩ
Ｉ　ｋたｉクロ検定培養ア〃−ルの穿刺で４８時間ケ長
させた己りどノトコヵろ−ス４左互ｉ　ＡＴＣＣ１２７
５５を接種した。フラスコを３０Ｃ及び２００　ｒｐｍ
で振とうした。１２時時間表ぅ彼、ン２スコ内容物を１
４７発酵発酵液種に用いた。接種前に、この発酵器に所
望の発酵媒質ｌＯ！を装入し、１時間殺菌した。媒質を
３０℃に冷却し、上述のようにして接種した。この媒質
を３枚の千羽根付のタービン型インペラを用いて１３０
０ｒｐｍで攪拌した。(3) This inoculum preparation method was used to make most of the inoculants [1^1] in the experiments described herein. 5
250m Erlenmeyer flask K containing 0we modified 8TP media-2, 0.2% glycerol t 7JI
ATCC127
55 were inoculated. Heat the flask to 30C and 200 rpm
It was shaken with 12 o'clock timetable He, N2 Scooter contents 1
47 fermentation It was used for fermentation liquid species. Before inoculation, this fermenter is charged with the desired fermentation medium lO! was charged and sterilized for 1 hour. The medium was cooled to 30°C and inoculated as described above. This medium was heated using a turbine-type impeller with three thousand blades.
Stirred at 0 rpm.

通気のためにリング状スパージャ−を用いた。空気流Ｉ
は０．２ＹＶＭ（１分間蟲シの媒質単位容積轟シの容積
）、即ち２！／ｉであった。これは我々にｓ　ｍｎ””
の物質移動係数ＫＬ−＆を与えた。１２時間後、全肉汁
を１５０！発酵器に接種するのに使用した。培養の純度
は接種の発育を通して監視した。この目的のために顕微
鏡試験及び平板培養技術を用いた。A ring sparger was used for ventilation. Air flow I
is 0.2YVM (unit volume of medium per minute), that is, 2! /i. This gives us s mn""
The mass transfer coefficient KL-& was given. After 12 hours, the whole meat juice is 150! It was used to inoculate the fermenter. Culture purity was monitored throughout the development of the inoculum. Microscopic examination and plating techniques were used for this purpose.

ｂ）α−ＧＰオキシダーゼの製造 １５０Ｊの発酵器に適肖な発酵媒質１００！を装入し、
１時間殺菌した。媒質を３０℃に冷却した。これに上述
の方法（３）のようにして調製した１４７発酵発酵液容
物を無菌状態で移すことによって接種した。この媒質ｔ
−３枚の千羽根付のタービン型イン−（うで２５　Ｏｒ
ｐｍで攪拌し、リング状スパージャ−で通気した□通気
速度はＯ，１８ＶＶＭ又は２０！空気／禦萬であった。b) Production of α-GP oxidase Fermentation medium suitable for a 150 J fermenter 100! Charge the
Sterilized for 1 hour. The medium was cooled to 30°C. This was inoculated by transferring the 147 fermentation liquid container prepared in the above-mentioned method (3) under aseptic conditions. This medium t
-Turbine type inn with 3 senbanetsuki (25 arms or
pm and aerated with a ring-shaped sparger □ Aeration rate is O, 18VVM or 20! The air was pure.

かかる条件下ＫＬ−ａの飴は１．１５　ｍ＋ｘ、−’で
あった。温度は３０℃に保持した。サンプルを自動サン
グラ−にュープランズウィック　サイエンティフイク社
、ニエープ２ンズクィック、ニューシャーシー）で無菌
的に毎時抜き取シ、細胞の生長度及びα−ＧＰオキシダ
ーゼの生成を測定した。溶存酸素濃度を膜電極（［。Under such conditions, the candy of KL-a was 1.15 m+x,-'. The temperature was maintained at 30°C. Samples were aseptically drawn every hour using an automatic sunglasser (Prunswick Scientific, New York, New Chassis), and the degree of cell growth and production of α-GP oxidase were measured. Dissolved oxygen concentration was measured using a membrane electrode ([.

５３０、工業的酸素測定システム、センサーラプス、デ
ィビジＮ／　オグ　インストルメンテーシ冒ン　ン＆？
）リーズ社、レキシントン、マサチ具セッツ）で監視し
た。またインゴールド電極（タイプ７６４−３１Ｂ、ド
クター、ググリュー、インゴールド社、キューリッヒ、
スイス）で〆ｌも測定した。発酵器を、酵素レベルが所
望の値に到達した時、冷水で１０℃まで冷却し、細胞を
冷凍連続遠心機（セパ遠心１！２８１Ｇ型、カールノ臂
ドウペルグ　ＧＭＢＨ、***）で採取した。平均発酵時
間社９−１θ時間てあった。530, Industrial Oxygen Measurement System, Sensor Lapse, Divisi N/OG Instrumentation &?
) Leeds Co., Lexington, Masachi Tool Sets) was monitored. In addition, Ingold electrode (type 764-31B, Dr., Gugrew, Ingold Co., Kurich,
(Switzerland). When the enzyme level reached the desired value, the fermenter was cooled to 10° C. with cold water and the cells were harvested in a refrigerated continuous centrifuge (Sepa Centrifugal Model 1!281G, Carl Neuperg GMBH, West Germany). The average fermentation time was 9-1 theta hours.

乾燥細胞重量と６６０龍における吸光度の関係を示す検
量線を調製した。スベクトロニ、り２０スペクトロ７オ
トメータ（Ｓｐｓｅｔｒｏｎｉｅ　２０Ｓｐｅｅｔｒｏ
ｐＱｏｔｏｍｓｔｓｒ　）　（パウシ具　アンド　ロー
ム、ロチニスター、二為−ローク）で吸光Ａｎ測定し、
乾燥細胞重量を検量線から計算した。A calibration curve showing the relationship between dry cell weight and absorbance in 660 Dragon was prepared. Spsetronie 20 Spectro 7 Otometer
Absorbance An was measured using pQotomstsr) (Pauci & Rohm, Rochinister, Futame-Roku),
Dry cell weight was calculated from the standard curve.

７、　α−グリセロホスフェート　オキシダーゼ活性の
検定 α−ＧＰオキシダーゼ活性は、α−ＧＰオキシｆ　−ゼ
によってα−グリセロホスフェートを酸化させるに際し
て放出されるＩ（２０２によるｐイコ染料のペルオキシ
ダーゼ接触酸化を測定することによって決定した。酸素
活性の一単位（［Ｊ）は３７℃及び声７．０で１分間尚
シに基質の１μモルを製品に転換する酸素の１で定義す
る。7. Assay of α-glycerophosphate oxidase activity α-GP oxidase activity measures the peroxidase-catalyzed oxidation of p-co dye by I(202) released upon oxidation of α-glycerophosphate by α-GP oxyf-ase. One unit of oxygen activity ([J) is defined as one unit of oxygen that converts 1 μmole of substrate to product in 1 minute at 37° C. and 7.0°C.

ａ）試箒 中　ＫＰ　バッファー：０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液
、メ１７．０ （１０基質溶液＝１００ｙｄのＫＰパ、ファーにα−グ
リセロホス７エー）１７．２８８ｇを溶解、（１１Ｄ　
　染料溶液＝１００肩ｌの脱イオン水に３，３′−ゾメ
トキシーペンチジン　ジヒドロクルリド（０−シアニジ
ン）１１を溶解、 （１ｖ）染浄剤：ＫＰノぐ、ファー１０禦ｌ中にトリト
ン（Ｔｒｌｔｃ＋ｎ）　Ｘ　−１００（Ｅ７−ム　アン
ド　ハース、クイ２デルフイア、ペンシルヴアニア、カ
ラ市販のポリエトキシエチレン界面活性剤）ｌＩを溶解
、 （ｖ）バッファー溶液：　ＫＰ　ハｙ　７７−５　Ｑｍ
中にホース９デイジ瓢　ペルオキシダーゼ　タイプ１１
３．３■を溶解し、これに染料溶液１．１１及び洗浄剤
溶液６．６Ｎを添加し、ＫＰパ、ファーで全霊を１ＱＱ
ｄにする。a) In the test broom KP buffer: 0.1M potassium phosphate buffer, 17.0 g (10 substrate solution = 100 yd of KP buffer, dissolve 17.288 g of α-glycerophos 7A), (11D
Dye solution = 3,3'-zomethoxypentidine dihydrochloride (0-cyanidine) 11 dissolved in 100 liters of deionized water, (1v) Dyeing agent: KP Nog, in 10 liters of fur Dissolve Triton (Trltc+n)
Horse 9 Daiji Gourd Peroxidase Type 11 inside
Dissolve 3.3■, add dye solution 1.11 and detergent solution 6.6N, and thoroughly wash 1QQ with KP powder and fur.
Make it d.

ｂ）方法 試験管中のバッファー溶液６ｄ及び基質溶液ｌ肩ｌを水
浴シェカーにュープランズウィ、クサイエンティフイ、
り、ニュープランズウィ、り、二ニーシャーシー）で３
７℃で１５分間で平衡状態にさせた。このサンプルをｌ
Ｉｌ尚シ５−２５　ｍＵ　（１）α−ＧＰオキシダーゼ
を含うように稀釈した。止しく希釈したザンゾルｌ　ｘ
＋ｌを平衡させた前記試験管に添加した０サングルの代
シに脱イオン水１　ｍｌでブランクを調製した。試験管
を水浴シェカー中て３７℃で振とうした。色の展間を、
スペクトロニック２０スペクトロメーターを用いて４３
０龍で５分毎に１時間測定した。b) Method: Transfer 6d of the buffer solution and 1 of the substrate solution in a test tube to a water bath shaker.
ri, new plans, ri, two chassis) and 3
Equilibration was allowed for 15 minutes at 7°C. This sample
It was diluted to contain 5-25 mU (1) α-GP oxidase. Thoroughly diluted Xanzol x
A blank was prepared with 1 ml of deionized water in place of the 0 sample added to the test tube equilibrated with +l. The test tubes were shaken at 37°C in a water bath shaker. An exhibition room of colors,
43 using a Spectronic 20 spectrometer
Measurements were taken every 5 minutes for 1 hour using 0 Dragon.

染料に対する吸光係数を求め、光学ＩＭｖを利用された
基質のｍＷに変換するのに用いた。The extinction coefficient for the dye was determined and used to convert the optical IMv to mW of the utilized substrate.

８、物質移動係数（Ｋ　Ｌ−ａ　）の決定物質移動係数
は溶存酸累濃贋と出口酸素濃度とを監視することによシ
求めた。溶存酸素濃度は前述の５．（ｂＪ項（α−ＧＰ
オキシＩ“−ゼの製造）で述べた膜霜、極を用いて求め
九〇 出ロ酸累濃度ト磁気分析計（タイプＣＡ１５０．ザー＆
メックスコントローズ　リミティド、クロラブロウ、サ
セックス、英国）を用いて測定した。8. Determination of Mass Transfer Coefficient (K L-a) The mass transfer coefficient was determined by monitoring the accumulated concentration of dissolved acid and the outlet oxygen concentration. Dissolved oxygen concentration is determined from 5. above. (bJ term (α-GP
The film frost and the cumulative concentration of oxygen obtained using a polar magnetic analyzer (type CA150.
(Mex Controls Limited, Chlorabrow, Sussex, UK).

ＫＬ−ａのｇ＋算には次の間質式を用いた。The following interstitial formula was used to calculate g+ of KL-a.

ＮＡ＝ＫＬ−ａ　（Ｃ”−ＣＬ） 式中、ＮＡ＝物賞移動速度 ＫＬ＝物質移動係数 Ｂ　＝界面私 Ｃ＊−溶肴酸集の飽和濃度 ＣＬ＝−＃＃ルｊ溶肴醗素洟度 例１−５は上述の小規模スケール技術の使用を例示する
。NA=KL-a (C''-CL) where NA=material transfer rate KL=mass transfer coefficient B=interface I C*-saturation concentration of soluble acid CL=-##ruj soluble alcohol Examples 1-5 illustrate the use of the small scale techniques described above.

例１．：グリセロールの誘導効果 グリセロールの添加社酵素の製造に画期的な効果をもつ
。グリセロール２ｉ／Ｚを含む媒質において最大の製造
効果が得られた（第り表参照）。Example 1. : Induction effect of glycerol The addition of glycerol has a revolutionary effect on the production of enzymes. The greatest production efficiency was obtained in the medium containing glycerol 2i/Z (see Table 1).

更にグリセロール濃度を増大させても酵素の収量ｔよ増
大しなかった。培養物の生長は大きく影響を受けなかっ
／ζ。即ち、乾燥細胞重量は高々２０％程度増大したの
に対し、酵素収紺の増大は３倍以上であった。Furthermore, increasing the glycerol concentration did not increase the enzyme yield by more than t. Culture growth was not significantly affected/ζ. That is, while the dry cell weight increased by about 20% at most, the increase in enzyme absorption was more than three times.

１０．０　　　　　０．３４　　　１７８　　２８７ａ
：対照 培養物は表示の濃度のグリセロールを補充したＳＴＰ媒
質中で生長させた。10.0 0.34 178 287a
: Control cultures were grown in STP medium supplemented with glycerol at the indicated concentrations.

第２表に示したように、培養物の生長はグルコースの＃
度に完全に依存した。グルコースを含まないＡＶ、質で
得られた乾燥細胞重量に比較して３１７Ｚのグルコース
を添加した場合には乾燥細胞重量が３倍増加した。グル
コース濃度もα−ＧＦオキシダーゼの生成に重大な効果
を呈し、媒質中にグルコースのない場合には３８％の生
成量低下を来した。酵素の生成量は、グルコース濃度が
１．０１７７まではグルコース濃度の増加に従って増加
シタ。グルコース濃度が更に増加させるとα−ＧＰオキ
シｆ　−’ｔの生成量は低下した・　　以−「＜・；第
２表 ０　　　　　　０．２２　　　　５２　　　　　６２０
．５　　　　　０．２９　　　　６２　　　　　７６１
．０ａ　　　　０．３２　　　　８２　　　　１００２
．０　　　　　０．５７　　　　３０　　　　　３６３
．０　　　　　０．６１　　　　３９　　　　　４７ａ
：対照 前述の如く、培養は８ＴＰ奸質中で実施した。グルコー
スの量は表示の通シ変化させた。As shown in Table 2, the growth of the culture was
completely dependent on the degree. The dry cell weight increased three times when 317Z glucose was added compared to the dry cell weight obtained with AV, quality without glucose. Glucose concentration also had a significant effect on α-GF oxidase production, resulting in a 38% reduction in production in the absence of glucose in the medium. The amount of enzyme produced increases as the glucose concentration increases until the glucose concentration is 1.0177. As the glucose concentration further increased, the production amount of α-GPoxyf-'t decreased.Table 2 0.22 52 620
．． 5 0.29 62 761
．． 0a 0.32 82 1002
．． 0 0.57 30 363
．． 0 0.61 39 47a
: Control Cultures were carried out in 8TP medium as described above. The amount of glucose was varied throughout the times indicated.

ｂ）　ピルビン酸ナトリウムの効果 第３表に示したように、グルコ・−スをピルビン酸ナト
リウムで置換することによっでα−ＧＰオキシダーゼの
生長および製造は著しく改良された。b) Effect of Sodium Pyruvate As shown in Table 3, the growth and production of α-GP oxidase was significantly improved by replacing glucose with sodium pyruvate.

しかし、３ｆｌ／ｌｂを越えるピルビン酸塩の高ｆＡ度
は酵素の製造量を低下させる。ψ良ＳＴＰ媒質−２゜３
．４においては炭素源として、２．０１／Ａの最適濃度
でグルコースに置き換えた。生物体は、媒質中のグルコ
ースを表示濃度のピルビン酸ナトリラムに筋′き換え／
ヒ以外は、前述の改良ＳＴＰ媒質−１で生長さ七に：。However, high fA degrees of pyruvate above 3 fl/lb reduce enzyme production. ψGood STP medium -2゜3
．． In No. 4, glucose was substituted as the carbon source at an optimal concentration of 2.01/A. The organism converts glucose in the medium into sodium pyruvate at the indicated concentration.
The growth rate of all species other than Hei was 7 on the improved STP medium-1 mentioned above.

第　３　嚢 なし　　０．０　　　０．１９　　１７６　　　８８グ
１″′″　１．０　　　０．３３　　１９９　　１００
−スａ ＃　　　１．０　　０．４６　　３８６　　１９３＃　
　　２．０　　０．６０　　４８４　　２４２〃５．０
　　０．５５　　３１４　　１５７ａ＝対照 第４表に示すように、グルコース２．０１７１３とピル
ビン酸ナトリウム２．Ｏｆｌ／１３を共用した場合には
培養物の生長が増大し、そして驚くべきことに同時に酵
素生成量が著しく増加することが認められた。この前記
改良８ＴＰｆｉＪ−５と呼ばれる改良縁５Ｉｔよ本発明
の好ましい媒質でおる。3rd without capsule 0.0 0.19 176 88g 1″'' 1.0 0.33 199 100
-S a # 1.0 0.46 386 193#
2.0 0.60 484 242〃5.0
0.55 314 157a = Control As shown in Table 4, glucose 2.01713 and sodium pyruvate 2. When co-using Ofl/13, it was observed that the growth of the culture was increased and, surprisingly, at the same time there was a significant increase in enzyme production. This improved edge 5It, called improved 8TPfiJ-5, is a preferred medium of the present invention.

第４テそ ０　　　０　　　　　０．３３　　　２３７　　３００
　　　０．５　　　　０．４８　　　３１４　　４００
　　　　１．０　　　　０．６３　　　３８４　　４８
０　　　２．０ａＯ，５８７９４１０００，５００，５
１２８２３６ ０，５０，５０，６８４１２５２ ０，５１，００，８０５８０７３ ０，５２，００，７４１０５２１３３ １，０００，４９１９４２４ １，００，５０，８１５００６３ １，０１，００，８１５４０６８ １，０２，００，７９１０６９１３５ ２，０００，６２４１８５３ ２，００，５０，９５４９０６２ ２，０１，００，９９６５１８２ ２，０２，０１，００１５３９１９４ ３０００，７２２７３ Ｂ、０　　　０．５　　　　１．０５　　　３１５　　
４０３．０　　　１．０　　　　１．１３　　　３６９
　　４６３．０　　　２．０　　　　１．０６　　　９
９８　１２３Ｓ　二対ＩＩ（（ 培養物は上記グルコース及びビルビル酸ナトリウム濃度
の改良ＳＴＰ媒質−４で生長させた。4th Teso 0 0 0.33 237 300
0.5 0.48 314 400
1.0 0.63 384 48
0 2.0aO,587941000,500,5
128236 0,50,50,6841252 0,51,00,8058073 0,52,00,741052133 1,000,4919424 1,00,50,8150063 1,01,00,8154068 1,02,00,791069135 2, 000,6241853 2,00,50,9549062 2,01,00,9965182 2,02,01,001539194 3000,72273 B, 0 0.5 1.05 315
403.0 1.0 1.13 369
463.0 2.0 1.06 9
98 123S Two Pairs II ((Cultures were grown in modified STP medium-4 at the above glucose and sodium birylate concentrations.

例３：ビタミンの効果 ビタミンは培養物の生長には影Ｗを与えないが、酵素の
生成を３０％以上も促進する（第５表参照）０酵累生成
量の増大はビタミン＃度の増加に比例けしていない。Example 3: Effect of vitamins Vitamins do not affect the growth of cultures, but they promote enzyme production by more than 30% (see Table 5). An increase in the cumulative production of 0 enzymes leads to an increase in vitamin # content. It's not proportionate to that.

第５表 ビタミンの効果 ０．０ａＯ，６４７６６１００ １，００，６３８０８１０６ ２，００，６６９３９１２３ ３００，６３８８２１１６ ５，００，６２９０８１１９ １０，００，６５１０１１１３３ ａ：対照 培養物は改良ＳＴＰ＠＠−３で生長させた。ビタミン溶
液の濃度は表に示すように変化させた。ビタミン溶液の
組成に関しては前述のｒ　２．（ｄ）ビタミン溶液ｊの
項参照。Table 5 Effect of vitamins 0.0aO, 64766100 1,00,63808106 2,00,66939123 300,63882116 5,00,62908119 10,00,651011133 a: Control culture grown in modified STP@@-3 . The concentration of the vitamin solution was varied as shown in the table. Regarding the composition of the vitamin solution, refer to the above-mentioned r 2. (d) See section on vitamin solution j.

例４：焦機塩の効果 痕跡性元素の添加による酵素生成め促進は痕跡性元素が
我々の発酵媒質中において他の限定栄養素であることを
示した。痕跡性元素は培養物がＰＰＭオーダー又はそれ
以下の非常に少量、痕跡１で必俊とする元素である。培
養はトレース１．の多くの元素を心安とし、これらを多
く供給すればするほど、酵素収量は良くなる。第６Ａ、
６Ｂ及び６Ｃ表の結果は、ソルトソリエーシ冒ンＣよυ
多くの痕跡性元素を含むソルトソリニーシ璽ンＰＹＳが
α−ＧＰオ片シダーゼの生成の改良効果においてソルト
ノリューシ目ンＣよシ良好である。このンルトソリエー
シ璽ンＣは、同じ理由でソルトソリニーシ曹ンＡよりす
ぐれている。　　　以下余白第　６Ａ　表 ０．０ａ　　　　０．４９　　　４３９　　　１０００
．５　　　　　０．６２　　　６３０　　　１４３１．
０　　　　　０．５９　　　５９８　　　１３６２．５
　　　　　０．６０　　　６６９　　　１５２５．０　
　　　　０．６１　　　７２９　　　１６５１０．０　
　　　　０．６４　　　７４’ｌ　　　　１７０ａ：対
照 培養物れ１、上表に示しだ？！１度のソルトソリューシ
冒ンＣを補充した改良ＳＴＰ媒質−２で生長させたＯ第
　６Ｂ　泰 なし’　　　−０，５７５４１１００ ン１トン１ノ″　５．０　　　　　０．５７　　　１０
３７　　　　１９２−ジョンＣ ソ′トソ゛ノ”　　２．０ｂ　　　　０．６１　　　　
　８３７　　　　１５５−ジョンＡ ａ：対照 ｂ：ソルトソリエーシ冒ンＡの最適濃度との培養実験に
用いた媒質は土嚢のような補充をした改良ＳＴＰ媒質−
２である。Example 4: Effect of Jiaoji Salt The promotion of enzyme production by the addition of trace elements showed that trace elements were the other limiting nutrients in our fermentation medium. Trace elements are elements that are required by the culture in very small amounts of PPM order or less, trace 1. Culture is trace 1. The more elements you supply, the better the enzyme yield will be. 6th A,
The results in Tables 6B and 6C are similar to those of Salt Solisiece.
The salt sorine PYS containing many trace elements is better than the salt sorine C in improving effect on the production of α-GP fragment sidase. This salt solution bottle C is superior to salt solution bottle A for the same reason. Margin below 6A Table 0.0a 0.49 439 1000
．． 5 0.62 630 1431.
0 0.59 598 1362.5
0.60 669 1525.0
0.61 729 16510.0
0.64 74'l 170a: Control culture 1, as shown in the table above. ! 0.57541100 1 ton 1 inch 5.0 0.57 10
37 192-John C 2.0b 0.61
837 155-John A a: Control b: The medium used in the culture experiment with the optimal concentration of Salt Solacei Affiliate A was a modified STP medium supplemented with sandbags.
It is 2.

第６Ｃ表 添加痕跡性添加量乾燥細胞鴬９パシオキシ（＝すの生成
元累混合物皇４’ｊｉ’）ｉｔ（Ｎ／ｉ）　　（Ｕ／７
）（〆」照に約するチ）なし’　　　　−０，６２５８
２１００ソ″トソリ゛　　５．０　　　０．６３　　　
　８１１　　　１４０−シ璽ンＣ ソ１トソ１ノ゛　　５．０　　　　０．６９　　　　９
２３　　　１５８−シｗｓ　’ＩＰ　Ｙ　Ｓ ＃　　　　１０．５　　　０．７０　　１０００　　１
７１＃　　　　２０．０　　０．６７　　　９７８　　
１６８＃　　　　５０．０　　０．７５　　１１３０　
　１９４ＪＬ：対照、これらのフラスコはノルトソリメ
ーシ曹ンＣを含まなＷ改良ＳＴｐ＃ｊ、質を含む。Table 6C Addition Trace Addition Amount Dry Cell 马 9 Pashioxy (=Suno Generating Source Cumulative Mixture Emperor 4'ji') it (N/i) (U/7
) (〆〆〆〆〆〆〆) None' -0,6258
2100 sores 5.0 0.63
811 140-Sign C So1 To So1 No゛5.0 0.69 9
23 158-shi ws 'IP Y S # 10.5 0.70 1000 1
71# 20.0 0.67 978
168# 50.0 0.75 1130
194JL: Control, these flasks contain W modified STp#j, quality without Nordsolimesi Carbon C.

改良５ｒｐｌ質−３をこの実験には用いた。ソルトソリ
＾−シ冒ンＣを上表に示した濃度のシルトソリ器−ジョ
ンＰＸＳでｔ％換えた。Modified 5rpl quality-3 was used in this experiment. The salt sol ^-shiben C was exchanged by t% with silt sol John PXS at the concentrations shown in the table above.

前述の如く、媒質にビタミン混合物もしくは痕跡性元素
の様々な混合物のいずれかを補充した場合に酵素の生成
は増加する。このビタミン溶液とソルトソリ、−シ四ン
Ｃの両者を添加した場合には第７表に示すような相剰効
来が認められた。培養物の生長には著しい効果は無かっ
た。As mentioned above, enzyme production is increased when the medium is supplemented with either vitamin mixtures or various mixtures of trace elements. When both this vitamin solution and Salt Sori-C were added, a mutually beneficial effect as shown in Table 7 was observed. There was no significant effect on culture growth.

第７表 なし’　　　　　　　　０．６０　　　５３０　　　１
００ソ′トソリ゛　　　　　　０．６５　　　　５７７
　　　　１０９シ田ン５．０吟Ｊ ａ：対照 培養物は改良ＳＴＰ媒＄−２で生長させた。この媒質に
上表に示した添加物を加えた。No Table 7' 0.60 530 1
00 so'tosori 0.65 577
109 Cytan 5.0 Gin J a: Control cultures were grown in modified STP medium $-2. To this medium were added the additives shown in the table above.

以下の例６−１１は、前述の大規模発酵技術に従って１
５０４の発酵器を用いた例を示した。Examples 6-11 below show 1
An example using a No. 504 fermenter was shown.

例６：接釉剤のサイズの効果 前述の３通シのｈ種剤の訓菱、ノ法を試験した。Example 6: Effect of size of glaze The above-mentioned three methods of preparing H-type preparations were tested.

接種剤のライズ（６−１（１＃）は酵素の生成もしくは
培養物の生長には影響を与えなかったが、接１１！剤の
サイズが増大すると最大生長及び酵素生成に到達するの
に必髪な時間を３０％減少した。第８表に示す結果は、
遠心及び再懸濁した細胞に比較して全肉汁が満足な接種
剤であることを示した。Rise of the inoculant (6-1 (1#)) had no effect on enzyme production or growth of the culture, but increasing the size of the inoculum was necessary to reach maximum growth and enzyme production. The hair drying time was reduced by 30%.The results shown in Table 8 are as follows:
Whole broth was shown to be a satisfactory inoculum compared to centrifuged and resuspended cells.

第　８　表 接神剤　乾燥細胞最大に到達　平均収量最大に到達６！
速心　０．６１　　　１０．５　　　８３７　　１１．
３６！非遠心　０．６５　　　　９．２５　　７８７　
　　９．２５本実験においてＶよ改良ＳＴＰ媒質−３を
用いた。No. 8 Table of Enthusiasts Reached maximum dry cells Reached maximum average yield 6!
Speed center 0.61 10.5 837 11.
36! Non-centrifugal 0.65 9.25 787
9.25 In this experiment, V improved STP medium-3 was used.

方法のＷイ細は前述の通シである。The details of the method are as described above.

例７ニグリセロールの効果 グリセロール濃度が２ｇ／！を越えて増大しても、フラ
スコもしくは大発酵器中でのリットル尚υの酵素収量の
改良効果は認められなかった。しかしながら、大発酵器
中での細胞生長についてはグリセロール濃度が２ｇ／！
を越えて増加することによる影響が現ｉｔだ。生長に対
する影響の認められないフラスコ・実験に刻しで、第９
表に示すように発酵器におりる培養生長は４８チ増大し
た。Example 7 Effect of Niglycerol Glycerol concentration is 2g/! No improvement in the enzyme yield per liter in flasks or large fermenters was observed even when the yield was increased beyond . However, for cell growth in large fermenters, the glycerol concentration is 2 g/!
The impact of an increase beyond that is the current impact. No. 9 was chopped into flasks and experiments with no observed effect on growth.
As shown in the table, the culture growth in the fermenter increased by 48 inches.

酵素合成に対するグリセロールの！＆適濃度ね、約２ｊ
９／Ｉ、である。of glycerol for enzymatic synthesis! & Appropriate concentration, about 2J
9/I.

第９表 ２．０’　　　　　　０．６３　　　　　１０５４３．
０　　　　　０．９３　　　　１０３９畠：対照 この１５０！発酵器での実験では改′ｊＪ、、ＳＴＰ媒
質−６を用いた。グリセロール濃度ね、上表のように変
え大、。接種剤は１４Ｊ発酵器で調製した６例８：グリ
セロール同族体の効果 我汝はα−オキシダーゼが誘導性の酵素であシ、そして
グリセロールで誘導されることを示した。Table 9 2.0' 0.63 10543.
0 0.93 1039 Hatake: Contrast this 150! In experiments in a fermenter, modified 'jJ, STP medium-6 was used. Change the glycerol concentration as shown in the table above. The inoculum was prepared in a 14J fermentor.6 Example 8: Effect of Glycerol Congeners We have shown that α-oxidase is an inducible enzyme, and that it is induced with glycerol.

グリセロールは基質、α−グリセロホスフェートの前駆
物質であυ、そして容易に利用される炭素源であるので
、その濃度は発酵中に減少するに違いない。それ故、発
酵中にその濃度が減少しない誘導質、即ち無償の誘導質
を見つけることは有用である。この理由のために我々は
多くのグリセロール同族体及びモノグリセリドについて
試験した。Since glycerol is a substrate, a precursor of α-glycerophosphate, and a readily available carbon source, its concentration must decrease during fermentation. Therefore, it would be useful to find an inducer whose concentration does not decrease during fermentation, ie a free inducer. For this reason we tested a number of glycerol congeners and monoglycerides.

以下の実験は振とりフラスコ中で実施した。α−ＧＰオ
キシダーゼの誘導は、試験したすべてのグリセロール同
族体について得られた（第１１表参照〕。グリセロール
を媒質から除いた場合には酵素量は対照の３８％に減少
した。この量は、グリセロールの同族体を添加した場合
には、エチレングリコールは例外として、対照の５０％
に増加した。エチレングリコールは酵素の合成を強く抑
制した。The following experiments were conducted in shake flasks. Induction of α-GP oxidase was obtained for all glycerol congeners tested (see Table 11). When glycerol was removed from the medium, the amount of enzyme was reduced to 38% of the control. When glycerol congeners were added, 50% of the control was added, with the exception of ethylene glycol.
increased to Ethylene glycol strongly inhibited enzyme synthesis.

第１．０表 なし　　　　　　　　　　０．３１　　　３８Ｆ＋）セ
ｏ−ルｂＯ，００２０，４１１００エチレングリコール
　　０．０３２　０．３０　　　　　１７２．３−ブタ
ンノメール　０．０２２　　０．３０　　　　　５２モ
ノアセブン０．０１５　０．４０　　　　９８１−モノ
プロピオ−’−ン０．１３　　　０．３８　　　　　７
０１−モノブチリン０．０１２　０．３７　　　　９２
モノステアリン　　　０．００６　０．３４　　　　３
４モノオレイ７　　　　　０．００６　０．２８　　　
　４１トリラウリン　　　　　０．００３　０．３２　
　　　４６ａ：すべてのグリセロール同族体は２．０９
／Ａで試験。No Table 1.0 0.31 38F+) Seol bO,0020,41100 Ethylene glycol 0.032 0.30 172.3-Butanenomer 0.022 0.30 52 Monoa Seven 0.015 0.40 981 -Monopropion-'-one 0.13 0.38 7
01-Monobutyrin 0.012 0.37 92
Monostearin 0.006 0.34 3
4 Monolay 7 0.006 0.28
41 Trilaurin 0.003 0.32
46a: All glycerol congeners are 2.09
/A test.

ｂ：対照 ｉ４養物は２ｇ／ノの酵母エキスを加えた改良ＳＴＰ媒
質−１中で生長させた。グリセロールを上表のように置
換した。b: Control i4 culture was grown in modified STP medium-1 supplemented with 2 g/no yeast extract. Glycerol was substituted as shown in the table above.

例９：温度効果 発酵温度の３０℃から２５℃への降温は酵素生成を２２
％だけ減少し、生長をほんの僅かに増大させた。し、か
じ、温度を下げることによって最大生長及び酵素生成に
到達するのに黴する時間に驚くべき影響を与えた。即ち
、それは２５℃において３０℃における値の２倍にもな
った（第１１表参照） 第　　１１　　　表 温度効果 温度　　　　　生　　　　　長　　　　　α−ＧＰオキ
シダーゼ３０ａＯ，６３６，５１０５４６，５ ２５０，７１１２，０８２２１３，０ ＩＬ＝対照 使用媒質は改良ＳＴＰ媒＊−６で、接種剤のサイズはｌ
Ｏ！であった。Example 9: Temperature effect Decreasing the fermentation temperature from 30°C to 25°C reduces enzyme production by 22°C.
% and increased growth only slightly. However, lowering the temperature had a surprising effect on the molding time to reach maximum growth and enzyme production. That is, it was twice the value at 30°C at 25°C (see Table 11). = The control medium used was modified STP medium*-6, and the inoculum size was l.
O! Met.

例１Ｏ：窒素源の変更の効果 我々はトリプトンに代えて他の窒素源を評価した。トリ
グチカーゼ（ｔｒｉｐｔｃａｓｅ）　ペプトンが良好な
基質であることを見出しだ。トリグチカーゼペプトンを
含んだ媒質におけるα−ＧＰオキシダーゼの生成はトリ
プトンを含む媒質の場合に匹敵し。Example 1O: Effect of changing nitrogen sources We evaluated other nitrogen sources in place of tryptone. It was discovered that peptone is a good substrate for trigticase. The production of α-GP oxidase in media containing trigticase peptone was comparable to that in media containing tryptone.

た。ただし、トリグチカーゼペプトンはストレグトコカ
スの生長を同様にし１、支持しなかった。結果は第１２
表に示す通シであった。Ta. However, trigticase peptone caused similar growth of Stregutococcus 1 and did not support it. The result is the 12th
The rules were as shown in the table.

第１２表 窒素源の変更の効果 窒　　累　　源　　　　乾燥細胞型α−ＧＰオキシ＊　
ディフコ　ラゲラトリーズ（デトロイト、ミシガン）の
製品 ＊＊　ＢＢＬＸ７ｊイグイジ酉ン　オプ　ペプトン　デ
ィキンソン社（コツケイスグイレエ、メリーランド）の
製品 これらの研究における使用媒質は改良ＳＴＰ媒質−７で
あった。トリプトンは同濃度のトリグチカーゼペプトン
で置換えた。接種剤は１４！発酵器で生長させた。Table 12 Effect of changing nitrogen source Nitrogen source Dry cell type α-GP oxy*
Product of Difco Lagelatories (Detroit, Michigan) ** BBLX7J Iguiji Tokien Op Peptone Product of Dickinson Company (Kotkeis Gail, MD) The medium used in these studies was modified STP medium-7. Tryptone was replaced with the same concentration of trigticase peptone. There are 14 inoculators! Grown in a fermenter.

酵素の生成は生長と明らかに相関する結果が得られた。The results showed that enzyme production clearly correlates with growth.

第１図は、発酵中の改良ＳＴＰ媒質４−の生長、α−Ｇ
Ｐオキシ汐゛−ゼの生成、溶存酸素濃度及びＰｌｌを示
す。生長は６時間で最大に達し、酵素の生成は９時間で
最大に達した。酵素濃度は最大に達した後約２時間安定
である。好ましい発酵時間は６〜１２時間である。Figure 1 shows the growth of modified STP medium 4- during fermentation, α-G
The production of P oxidase, dissolved oxygen concentration and Pll are shown. Growth reached maximum at 6 hours and enzyme production reached maximum at 9 hours. The enzyme concentration remains stable for approximately 2 hours after reaching a maximum. The preferred fermentation time is 6 to 12 hours.

た場合の結果 ストレグトコカス　フェカリスＡＴＣＣ１２７５５に代
えて第１３表に掲げた、他の様々なラクトパシラチェエ
科の微生物を用いて、α−グリセロホスフェート　オキ
シダーゼの製造実験を行なった。Experiments for the production of α-glycerophosphate oxidase were conducted using various other microorganisms of the Lactopasillaceae family listed in Table 13 in place of Stregutococcus faecalis ATCC 12755.

使用媒質は改良ＳＴＰ媒質−７で、培養物は３０℃及び
３７℃で生長させた。結果を第１３表に示す。The medium used was modified STP medium-7 and the cultures were grown at 30°C and 37°C. The results are shown in Table 13.

第　１３　表Table 13

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] １、　ペディオコカス属の一員を生長媒質中において生
長せしめ、次いで生成α−グリセロホスフェートオキシ
ダーゼを抽出することを特徴とするα−グリセロホス７
エートオキシダーゼの製造方法０1. α-glycerophos 7, which is characterized by growing a member of the genus Pediococcus in a growth medium and then extracting the produced α-glycerophosphate oxidase.
Production method of ethyl oxidase 0