JPS58216686A - Production of alpha-glycerophosphate- oxidase - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明はα−グリセロホス７℃−トオキシダーゼの製造
法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Technical Field The present invention relates to a method for producing α-glycerophos 7°C-toxidase.

従来技術 α−グリセロホスフェートオキシダーゼ並びに有用な、
七の調製及び抽出技術は、Ｋｏｄｉｔｓｃｈｅｋ　ｒＬ
、に、およびＵｍｂｒｅ　Ｉ　ｔ　ｒＷ　−Ｗ−の６ス
トレプトｊカスフエイチ・ラムＦ２４のα−グリセロポ
ス７エートオキシダーゼ、ツヤ−ナル　オプ　パクテリ
オロジー、９８巻、３号、１０６　：３〜１ｏ６８頁（
１９６９年）並びにＪａｃｏｂｓ　＋　Ｎ　＝Ｊ　、お
よびＶａｎＤｅｍａｒｋ　ｒ　Ｐ　、Ｊ−の１ストレフ
０トコカス　フェカリ乙のα−グリセロホスフェート酸
化酵素の精製及び性質″、アーカイグズ　オプ　バイオ
ケミストリー　アンド　バイオフィノックス、８８巻、
２５０−２５５頁に記載さノ′シ又いる。この酵素は酸
素の存在下にα−グリセロホスフェートに酸化してビヒ
ドロキシアセトンホスフェート及び過酸化水素を生成す
るのに有用である。Prior art α-glycerophosphate oxidase and useful
Preparation and extraction techniques of seven Koditschek rL
, and Umbre ItrW-W-6 Streptococytrin F24 α-Glyceropos-7-Etooxidase.
1969) and Jacobs + N = J, and VanDemark r P, J-, "Purification and properties of α-glycerophosphate oxidase of Tococus faecalis", Archives op Biochemistry and Biofinox, vol. 88,
It is also described on pages 250-255. This enzyme is useful for oxidizing α-glycerophosphate in the presence of oxygen to produce bihydroxyacetone phosphate and hydrogen peroxide.

止揚のＫｏｄ１ｔｓ＋ｃｈｅｋ及びＵｍｂｒｅｉｔは、
検圧検定法を含む様々な効力検定技術を用いｔ研究した
ストレ４Ｌ王左五−スユイチウムＦ２４のα−グリセロ
ホスフェートオキシダーゼの諸性質を説明してらる。ス
トレグトコカス　フエイチウムの培養は１％トリグトン
、１％酵母エキス、０．５チに２ＨＰＯ４，０，１チグ
ルコース及び１．５％アガールから成るＡＣアガール（
以下ＡＣ媒質と呼ぶことがある）の穿刺（５ｔａｂ　）
に保持した。これらの細胞は媒質から分離し、酵素生成
物を検定のため抽出した。The Kod1ts+chek and Umbreit of Doyo are
He explains the various properties of α-glycerophosphate oxidase from Stre 4L Wang Zao-suyitium F24, which have been studied using various potency assay techniques including manometric assays. The culture of Stregutococcus faitium was made using AC agar (1% trigtone, 1% yeast extract, 0.5% 2HPO4, 0,1 tyglucose and 1.5% agar).
Puncture (hereinafter sometimes referred to as AC medium) (5tab)
was held at These cells were separated from the medium and the enzyme products were extracted for assay.

前述のＪａｃｏｂｓ及びＶａｎ　Ｄｅｍａｒｋは、彼等
もその研究において検圧検定法を用いて、ストレグ（工
九五−スエ左悪）１０Ｃ１のα−クリセロホスフェート
オキシダーゼの諸性質について記載している。彼等（は
上述のＡＣ媒質（但しグルコース０．２％）中でストレ
グトコカス　フエカ＋７５を生長させた。彼等はストレ
グトコカス　フェカリス−からの酵素は受媒質としてＬ
−α−グリセロホスフェートに対しては高度な特異性を
示し、β−グリセロホスフェート、グリセロール、ノヒ
ドロキシアセトンホスフエートモシ＜ｕ　１．２−７’
０ノ臂ンジオールホスフエートに対しては認識できるよ
うな活性を示さない旨報じ１いる。Jacobs and Van Demark, supra, have also described the properties of α-chryserophosphate oxidase of Streg 10C1 using the manometry assay in their studies. They grew Stregutococcus faecalis +75 in the AC medium described above (but with 0.2% glucose).
- Highly specific for α-glycerophosphate, β-glycerophosphate, glycerol, nohydroxyacetone phosphate, <u 1.2-7'
It has been reported that it does not show any appreciable activity against 0-benzene diol phosphate1.

Ｊａｃｏｂ、Ｎ＝Ｊ、およびＶａｎ　Ｄｅｍａｒｋ＋Ｐ
、Ｊ、は、ジャーナル　オブ　バクテリオロノー、７９
巻１５３２−５３８頁（１９６０年）の報女“好気的及
び嫌気的に生長させたｚトレグ　コカス　フエカーハに
おけるグリセロール酸化機構の比較”においてストレグ
トコカス　フェカリスからの好気的及び嫌気的生長細胞
を用いた分類学的研究におけるグリセロールの代謝につ
いて論じている。このス　レグ　コカス　フエ九１４は
前述のｈｃ媒質で生長させている。Jacob, N=J, and Van Demark+P
, J., Journal of Bacteriology, 79
Aerobically and anaerobically grown cells from Stregutococus faecalis were used in Hojo's "Comparison of glycerol oxidation mechanisms in aerobically and anaerobically grown Z. Glycerol metabolism in taxonomic studies is discussed. This Sleg Cocus Hue 914 was grown in the above-mentioned HC medium.

Ｇｕｎｇａｌｕｓ＋ｌ−Ｃ１及びＵｍｂｒｓｉｔ＋Ｗ、
Ｗ、の１１上レグトコカス　７エカリ！によるグリセロ
ールの酸化”、ジャーナル　オプ　ノ々クテリオ口ノー
、４９巻、３４７〜３５７（１９４５年）はストレグト
コカス　フェカリスの活性細胞懸濁物によるグリセロー
ルの酸化の検定研究結果を報告している。Gungalus+l-C1 and Umbrsit+W,
W,'s 11 upper legtococcus 7 Ekari! "The Oxidation of Glycerol by Strectococcus faecalis", Journal Op. Nokterio, Vol. 49, 347-357 (1945) reports the results of assay studies of the oxidation of glycerol by active cell suspensions of Stregutococus faecalis.

彼等は検定にピルビン酸塩を添加することによって、ぎ
ルピン酸塩かＨ２Ｏ２のスカベンジャーとじ１作用する
ので、グリセロール酸化レベルを高くすることを見出し
たが、α−グリセロホスフェートオキシダーゼの活性は
記載されでいない。They found that the addition of pyruvate to the assay increased glycerol oxidation levels as gyruvate acted as a scavenger for H2O2, but the activity of α-glycerophosphate oxidase was not described. Not there.

Ｇｕｎｓａｌｕｓ＋１．Ｃ１の１ストレグトコカス　フ
エ力−九！−による嫌気的グリセロール発酵生成物”　
（、ｚヤーナル　オブ　パクテリオロジー、５４巻、２
３９−２４４頁（１９４７年））は、グリセロールと１
％までの酵母エキスを含む媒質中でのる上レグトコカス
　７エカリスの生長につい１報告している。Gunsalus+1. C1's 1-strength coccus Hue force - 9! – anaerobic glycerol fermentation products”
(, Journal of Pacteriology, Volume 54, 2
39-244 (1947)), glycerol and 1
There is one report on the growth of S. 7. ecalis in a medium containing up to % yeast extract.

殆んど認められない（嫌気的生長）旨報告している。It is reported that it is hardly observed (anaerobic growth).

Ｃｌａｒｉｄｇｅ＋Ｃ−Ａ、及びＨｓｎｄｌｌｎ＋Ｄ、
ｌの１ストレ−グトコ力ス　７エカリスによるグリセロ
ールの酸化″（ツキ−ナル　オブ　パクテリオロジー、
８４巻、１１８１−１１８６頁（１９６２年））は一般
的なワルブルグ検定を用いて行なったストレグに関する
研究を報告し又いる。彼等は、彼等の検定においてグリ
セロールを素早く酸化する細胞を得るために、１％のグ
リセロール（１０ｇ／ｌ）　全補充した、１　ｆｊ／ｌ
のグルコースを含む媒質中で一乙−トレグトコ力ス　フ
ェ力１スを生長させることを示Ｖしでいる。α−グリセ
ロホスフェートオキシダーゼ活性は記載されていない〇 前述のいくつかの文献はグリセロールの酸化についての
研究を一般的に報じている。これらの文献のうちの最初
の二つ、即ち、”ＫＯ旧ｊ６ｃｈｅｋ及びＵｍｂｒｅｌ
ｔ”並びに”Ｊａｃｏｂｓ及びＶａｎ　Ｄｅｍａｒｋ″
のみが彼等の検定でα−グリセロホス７エートオキシダ
ーゼの存在を示している。しかし、いずれノ文献もα−
グリセロホスフェートオキシダーゼ用誘導質、そして好
ましくはこれとグルコースを組合せてバクテリアを生長
させることによってα−クリセロホスフェートオキシダ
ーゼが予想外の高い収率で生成することは示唆しでいな
い。その他の文献はその微生物菌株中にα−グリセロホ
スフェートオキシダーゼか存在することを示唆すらし工
いない。Claridge+C-A, and Hsndlln+D,
Oxidation of glycerol by Echaris
84, pp. 1181-1186 (1962)) also reports a study on strength conducted using the general Walburg test. They used 1 fj/l, fully supplemented with 1% glycerol (10 g/l), to obtain cells that rapidly oxidize glycerol in their assay.
It has been shown that 1-Tregtocopheroid spherules can be grown in a medium containing 50% of glucose. α-Glycerophosphate oxidase activity is not described. Some of the above-mentioned publications generally report studies on the oxidation of glycerol. The first two of these documents, namely “KO old j6chek and Umbrel
t” and “Jacobs and Van Demark”
only showed the presence of α-glycerophos7ate oxidase in their assay. However, all the documents also show α−
There is no suggestion that α-chlycerophosphate oxidase can be produced in unexpectedly high yields by growing bacteria with an inducer for glycerophosphate oxidase, and preferably in combination with glucose. Other documents do not even suggest the presence of α-glycerophosphate oxidase in the microbial strain.

発明の目的及び構成 本発明の目的は微生物を媒質中で生長させることによっ
てα−グリセロホスフェートオキシダーゼを高収率で製
造することにある□ 本発明に従ったα−グリセロホスフェートオキシダーゼ
の製法は、ストレグトコ力Ｘ　Ｘｄ　７’　４オニｚｉ
、Ｘ、　ラクトバシラスおよびリューコノス　、。Object and Structure of the Invention The object of the present invention is to produce α-glycerophosphate oxidase in high yield by growing microorganisms in a medium □ The method for producing α-glycerophosphate oxidase according to the present invention Power X Xd 7' 4 Onizi
, X. Lactobacillus and Leukonus ,.

！塊の一員を生長させてα−グリセロホスフェートオキ
シダーゼを製造するに当シ、前記−員をグリセロールお
よびその同族体から選定さｎたα−グリ七ロホス７エー
トオキシダーゼ用ｉ導質を含む媒質中で生長させ、次い
でα−グリセロホスフェートオキシダーゼを抽出するこ
とから成る。! To produce α-glycerophosphate oxidase, members of the mass are grown in a medium containing a conductor for α-gly7ate oxidase in which the members are selected from glycerol and its congeners. It consists of growing and then extracting the alpha-glycerophosphate oxidase.

発明の構成及び効果の具体的説明 上記成分のほかに、前記媒質かグルコースを含むのも好
ましく、更に酵母エキス、トリノトン及びに２ＨＰＯ４
を含んで成るのも有益である。本発明の更に好ましい態
様では、前記媒質中に無機塩及びビタミンを添加してα
−グリセロホスフェート、１−キシダーゼの収ｌを著し
く増大させることができる。Detailed Description of the Structure and Effects of the Invention In addition to the above-mentioned components, the medium preferably also contains glucose, and further contains yeast extract, trinoton, and 2HPO4.
It is also beneficial to include. In a further preferred embodiment of the present invention, inorganic salts and vitamins are added to the medium to
- The yield of glycerophosphate, 1-oxidase can be significantly increased.

本発明の実施に際し使用出来るストレグトコカスーアｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｌＩｆａｅｃａｌｉｓ　）、スト
レグトコカス　クリモリス（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ　ｃｒｅｍｏｒｌｓ　）％　ストレグトコカス　サリ
ヴエリアス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｌＩｓａｌｌ
ｖａｒｉｕｓ　）、ス　レグ　コ力ス　フェイチウＡ　
（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｓｅｉｕｍ）　：
　１工上ｚｊ　９９２−属のラクトパシラス　グランテ
ルム（Ｌａｅｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕ
ｍ）、ラクトパシラス　力セイ（Ｌａｃｔｏｂａｅｌｌ
ｌｕｓ　ｃａｓｅｉ　）、ラクトパシラス　デルプ１／
エキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃ
ｋ目）、ラクトパシラス　ファーメンタｂ　（Ｌａｃｔ
ｏｂａａｉｌｌｕａ　　ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ　）、　　
ラクトノシとラス　ペントアシティ力ｙ、　（Ｌａｃｔ
ｏｂａｃｌｌｌｕ！Ｉｐｅｎｔｏａｃｅｔｉｃｕ＠）、
−パシース　−　ｆ−ｘ（Ｌａｃｔｏｂａｅｌｌｌｕｓ
　１ａｃｔｌａ）、ラクトパシラス　ブユクネリ（Ｌａ
ｃｔｏｂａｃｌｌＪｕｓ　ｂｕｃｈｎｅｒｌ　）、　５
ｐドパシラス　１／イクマニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｌｌ
ｌｕｓＩｅｉｃｈｍａｎｎ目）；リューコノストック属
のりｊ、−：ｌ　／　ｘ　）　、、、　　　メ１、七ン
ーロ　ｒス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒ
ｏｌｄｅｇ　）及び−２７′イオコカス属のイデイオコ
力ス　セリヴイノイエ（Ｐｅｄｆｏｃｏｃｃｕｓｃｅｒ
ｅｖｌｓｌａｅ　）である。Stregtococcoa t that can be used in carrying out the present invention
reptococculIfaecalis), Strectococcus climoris (5treptococcus)
s cremorls ) % Strectococcus salivuelias ( S cremorls )%
varius), Sleg Core Force Feichiu A
(5treptococcus faseium):
1. On the top of the building zz 992-Lactopacillus plantaru of the genus
m), Lactobaell
lus casei), Lactopacilus delp 1/
Lactobacillus delbruec
kth), Lactopacillus fermenta b (Lact
obaailua fermentum),
Lactonoshi and Las Pentoasity Power, (Lact
obaclllu! Ipentoaceticu@),
- Pachis - f-x (Lactobaellus
1actla), Lactopacilus buyukuneri (La
ctobacllJus buchnerl), 5
p Dopacillus 1/Ikumanii (Lactobacillus
lusIeichmann (order); Leuconostoc genus j, -:l/x)
oldeg) and -27' Iococcus selivinoie (Pedfococcuscer)
evlslae).

これらの種のうち、好ましいのはストレグトコカス　７
エカ１スであシ、最も好ましいのはＸ）ｋグ」コＪス　
　エフ１スＡＴＣＣＩ　２７５５である〇ストレグトコ
カス　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ　）ｔ、ｊＷｏｏｄ＋
Ａ−Ｊ、及びＧｕｎｓａｌｕｓ　＋　Ｉ　、Ｃ、の”ス
トレグトコチの活性休止細胞の製造″（ツヤ−ナル　オ
ブ　バクテリオロソー、４４巻、３３３−３４１頁（１
９４２年））に記載さｆＬ″′Ｃいる、「ＳＴＰ媒質」
と呼ばれる媒質中で普通生長する。以下に述べるように
、ＳＴＰ　ｉ　的中でストレグトコカス　７エカリスＡ
ＴＣＣ１２７５５を生長させると、６０〜８０　Ｖｔの
α−グリセロホス７１−トオキシダーゼが製造される。Among these species, preferred is Stregtococcus 7
Eka 1st is the best, the most preferable is
F1S ATCCI 2755 〇Streptococcus 5treptococci)t,jWood+
A-J, and Gunsalus + I, C, “Manufacture of active resting cells of St. flathead”, Journal of Bacteriophore, Vol. 44, pp. 333-341 (1)
942)) fL'''C, "STP medium"
It normally grows in a medium called As described below, STP i hit in Stregutococcus 7 echalis A
Growth of TCC12755 produces 60-80 Vt of α-glycerophos 71-toxidase.

本明細書に記載するストレグトコカス　フェカ１乙ＡＴ
ＣＣｌ　２７５５なる名称の微生物は、最初ＡＴＣＣ（
Ａｒｎｅｒｌｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎ）にストレグトコカス　フェカリスＡ
ＴＣＣ１２７５５としｔ寄託されたもので、ＡＴＣＣの
カタログ（１９７４年、第１１版）Ｋその名称で掲載さ
れている０このものは前記カタログの第１２Ｍでストレ
グトコカス　７エイテ７　Ａ　ＡＴＣＣ１２７５５と名
称変更されている。Stregtococcus Feca 1 Otsu AT described herein
The microorganism named CCl 2755 was first identified by the ATCC (
Arnerlcan Type Culture Co
11ection) Stregtococcus faecalis A
It was deposited as TCC 12755 and is listed under that name in the ATCC catalog (1974, 11th edition).This item was renamed as Stregtococcus 7 aite 7 A ATCC 12755 in No. 12M of the said catalog. .

本発明に従えば、前記微生物、特にストレグトコカス　
フーカリスを炭素源として好ましくはグルコースのｇ　
７１１１　及ヒα−グリセロホス７エートオキシダーゼ
用銹導質の添加によって改良したＳＴＰ媒質中的中長さ
せることによってα−グリセロホスフェートオキシダー
ゼが高収量で取得される。According to the invention, said microorganism, in particular Stregutococcus
g of glucose, preferably using Fucaris as the carbon source.
7111 and human α-glycerophosphate oxidase can be obtained in high yield by medium growth in STP medium improved by the addition of a conductive material for α-glycerophosphate oxidase.

誘導質としてグリセロールを添加することによってα−
グリセロホスフェートオキシダーゼの収量がグリセロー
ルを添加しない場合に比較して３倍以上も増加する。そ
の他の有用なα−グリセロホスフェートオキシダーゼ訴
導質はグリセロールの同族体、例えば、３−メチル−１
，２−グロノＪ？ンノオール、１，３−グロノやンジオ
ール、１．２−グロバンノオール、２，３−ブタンジオ
ニル、１．２．４−；＃７トリオール、モノアセチン、
ｌ−モノグロビオニン、１−モノブチリン、モノステア
リン、モノオレイン及びトリラウリンなどである。α- by adding glycerol as an inducer
The yield of glycerophosphate oxidase is increased by more than three times compared to when no glycerol is added. Other useful alpha-glycerophosphate oxidase stimulants are glycerol congeners, such as 3-methyl-1
,2-Grono J? #7 triol, monoacetin, 1,3-globanol, 1,2-globanol, 2,3-butanediol, 1.2.4-;
These include 1-monoglobionin, 1-monobutyrin, monostearin, monoolein, and trilaurin.

誘導質の有用な鰯は、一般に、媒質リットル当シ約１．
０〜約１０９の範囲内であることを見出した。The sardines useful as inducers generally contain about 1.
It was found to be within the range of 0 to about 109.

好ましい媒質の使用量は媒質リットル当シ約２０〜約５
．０ｇである。The preferred amount of medium used is from about 20 to about 5 per liter of medium.
．． It is 0g.

Ｗｏｏｄ及びＧｕｎｓａｌｕｓによって１呼称されたＳ
ＴＰ媒質は、グルコース−ｉ、　ｏ　ｖｔ　、酵母エキ
ス−１ｏｇ／１１　トリノトンｘｏｇ７を及びに２ＨＰ
Ｏ４−５ｇ／ｌを含む。これらの成分の有用な範囲は、
グルコース約０．１〜３．０ｇ／ｌ、酵母エキス約１．
０〜２０　ｇ／ｌ、好ましくは約２，０〜１０Ｖｔ、ト
リグトン約５〜２０　ｇ／を及びに２ＨＰＯ４少なくと
も約３．０ぬｔ１好ましくば約３．０〜約５、Ｏｇ／ｌ
であることを確認した。S named by Wood and Gunsalus
The TP medium contained glucose-i, ovt, yeast extract-1 og/11 trinoton xog7 and 2 HP.
Contains O4-5g/l. The useful range of these ingredients is
Glucose about 0.1-3.0g/l, yeast extract about 1.
0 to 20 g/l, preferably about 2.0 to 10 Vt, about 5 to 20 g/l of trigton and at least about 3.0 tl, preferably about 3.0 to about 5 Og/l
It was confirmed that

生長媒質においＮ　）　ＩＪグトンに代えて使用するこ
とができる他の蛋白氷解物としＣは、例えば、５ｈｅｆ
ｆｉｅｌｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｄｌｖ、　ｏｆ　Ｋｒ
ａｆｔｃｏ　Ｃｏｒｐ。Other protein lysates that can be used in place of N) IJ guttons in the growth medium are, for example, 5hef
field Chemical Dlv, of Kr
aftco corp.

（ユニオン、ニー−ツヤ−ノー９から市販のソイペプト
ン　タイプＴ　（Ｓｏｙ　Ｐｅｐｔｏｎｅ　Ｔｙｐｅ　
Ｔ］％エダミン（ｇｄａｍｉｎ　）タイプＴ１ファーム
アミン（Ｆｅｒｍ　Ａｍ１ｎｅ　）タイプＩ、Ｉ１．Ｉ
ＩＩ及び■、Ｎ−Ｚアミン（Ａｍ１ｎｅ　）タイ７’Ａ
Ｔ　、ＢＴ　、ＥＴ及びＹＴＴ　ｅ、　Ｃｕｄａｈｙ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（オマノ・、ネブラス力）
から市販のカゼイン　ヒドロリモート（Ｃａ５ｅｉｎ　
Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）、アナトン（Ａｎａｔｏｎｅ
）、ミクロバイオトン（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔｏｎｅ　）
及びファーマトン（Ｐｈａｒｍａｔｏｎｅ）：Ｔｒａｄ
ｅｒｓ　Ｐｒｏ口ｎＤｉｖ・Ｔｒａｄｅｒｓ　０１１　
Ｍｉｌｌ　Ｃｏ、　（フォート　ワース、テキサス）か
ら市販のファーマメディア（Ｐｈａｒｍａｍｅｄｌａ）
並びに硫酸アンモニウムがあげら几る。(Soy Peptone Type T, commercially available from Union, Knee-Tsuya-No-9)
T]% edamine (gdamin) type T1 Ferm Am1ne (ferm Amlne) type I, I1. I
II and ■, N-Z amine (Am1ne) tie 7'A
T, BT, ET and YTT e, Cudahy
Laboratories (Omano, Nebulus Power)
casein hydroremote (Ca5ein
Hydrolysate), Anatone
), Microbiotone
and Pharmatone:Trad
ers Pro Div・Traders 011
Pharmamedla, commercially available from Mill Co., (Fort Worth, Texas)
Also, ammonium sulfate is added.

しかしながら、前記生長媒質中のトリノトンに代えて上
述の蛋白氷解物の一つを使用した場合には、その蛋白氷
解物の最適量はトリジトンの最適量と多少変動すること
がある。特に有用な、トリノトンの代替物は、ソイ　ペ
グトン　タイプＴで、こ７１．はトリノ°トンを用いた
場合に比較しｔα−グリセロホスフェートオキシダーゼ
の収１１−１５　倍以上も増加させる。However, if one of the protein lysates described above is used in place of trinoton in the growth medium, the optimum amount of the protein lysate may vary somewhat from the optimum amount of trisiton. A particularly useful alternative to Trinoton is Soi Pegton Type T, which is 71. increases the yield of tα-glycerophosphate oxidase by more than 11-15 times compared to the case using trinoton.

前記生長媒質中におい又グルコースに代え℃使用できる
、その他の有用な炭素源は、例えば１クエン酸、乳酸、
酢酸ナトリウム、ニー・り酸ナトリウム、アメノリ４１
ン酸、グルタミン酸、コーンシロラグ、稠密、フラクト
ース、ラクトース、マルトースおよびシュクローズであ
る。Other useful carbon sources that can be used in place of glucose in the growth medium include, for example, citric acid, lactic acid,
Sodium acetate, sodium phosphate, Amenori 41
acid, glutamic acid, corn sillag, densinum, fructose, lactose, maltose and sucrose.

本発明の最も好ましい態様では、生長媒質中にグルコー
ス約０．５〜約３．　ＯＶｔを添加する。In the most preferred embodiment of the invention, from about 0.5 to about 3.0% glucose in the growth medium. Add OVt.

ＭｆＪ記生長媒質中的中効量の無機塩類およびビタミン
類を添加するのか有利であることも見出した。It has also been found that it is advantageous to add effective amounts of inorganic salts and vitamins to the MfJ growth medium.

ここにいう「有効量」なる語は、生長媒質中に加えて酵
素の収ｊｓｉｆｆ：Ｊ？７加させるのに十分な量の無機
塩類及びビタミン類の量をいう。このような無機塩及び
ビタミンの添加愉は塩及びビタミンの種類によっ−Ｃ変
動する。この量は一般に少量で、当業者であればＪＩｉ
＋宮の実験によシ極め又容易に定めることができる。The term "effective amount" herein refers to the amount of enzyme that is present in addition to the growth medium. 7 The amount of inorganic salts and vitamins sufficient to add The amount of addition of such inorganic salts and vitamins varies depending on the types of salts and vitamins. This amount is generally a small amount, and a person skilled in the art will know that JIi
It can be determined and easily determined by + Miya experiment.

大規模な発酵語中でストレグトコカス　フェカリスのよ
うな微生物を生長させ゛Ｃ高収量の酵素を取得する場合
に、しばしば発泡が生ずる。この泡立ちを制鶴１するた
めに、特に酵素を大・マツチで製造する場合に泡制御剤
を使用するのか好ましい。Foaming often occurs when growing microorganisms such as Strectococcus faecalis in large-scale fermentations to obtain high yields of enzyme. In order to control this foaming, it is preferable to use a foam control agent, especially when the enzyme is produced in large or large quantities.

本発明の実施に際して有用な泡制御剤の一例は、ダウケ
ミカル社（ミツドランド、ミシガン〕から市販のポリグ
リコール（Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌ）Ｐ−２０００である
。この消泡剤は酵素の生成を妨害することなく生長媒質
中で０．５９／ｌまでの蓄で使用できる。One example of a foam control agent useful in the practice of the present invention is Polyglycol P-2000, available from The Dow Chemical Company (Midland, Mich.). It can be used at concentrations up to 0.59/l in the medium.

しかし、一般には約０．　Ｉ　Ｖｔで泡を制（財）する
のに十分である。その他の泡制御剤（消泡剤）も使用で
きる。その選定及び使用基準は発泡を制御する（押える
〕ような濃度水準で酵素合成を抑制しないことである。However, generally about 0. IVt is sufficient to control the bubbles. Other foam control agents (defoamers) can also be used. The criteria for its selection and use is that it does not inhibit enzyme synthesis at concentration levels that would control foaming.

不発１３ＩＪにおい−Ｃ使用する微生物Ｖま合理的な温
度範囲で生長させてα−グリセロホス７エートオキシダ
ーゼ全製造することができる。良好な結果は２５〜４２
℃の温度範囲で得ることかできる。最良の給米は約３０
℃の温度で達せられる。細胞を生長さぜ／ζ俵グリセロ
ホスノ１−トオキシダーゼＶよ當法に従っ−（抽出する
ことができる。The microorganisms used can be grown in a reasonable temperature range to produce α-glycerophos7ate oxidase. Good results are 25-42
It can be obtained in the temperature range of ℃. The best rice supply is about 30
Achieved at a temperature of ℃. The cells can be grown and extracted according to the following method: Glycerophosno-1-tooxidase V.

本発明の実施を例示する、以下の例におい−Ｃ次のΦ件
を使用した。The following Φ case was used in the following example to illustrate the practice of the invention.

１、培養 以−トの例１〜５におい−Ｌス）　ｌ／　ｆ　）コカス
　フてカリスＡＴＣＣ１２７５５を用いた。1. Cultivation Examples 1 to 5 Smell L/F) Coccus calis ATCC 12755 was used.

２、媒質 （ａ）　　培養保存媒質。2. Medium (a) Culture preservation medium.

培養保存には０．２％のグリセロールを含ませた、ミク
ロ検定培養アガール（Ｍｉｃｒｏ　ＡｓＩ！ａｙＣｕｌ
ｔｕｒｅ　ａｇａｒ　）　（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ、デ１゛【＋イト、ミシガン）を用いた。For culture preservation, microassay culture agar (Micro AsI!ayCul) containing 0.2% glycerol was used.
ture agar ) (Difco Labora
Tories, Dell, Michigan) was used.

（ｂ）　　発ｗ−媒質 グルコース　　　　　　　　　　　　１・０醇母エキス
　　　　　　　　　　　１０．０ト　リ　７０　ト　ン
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１Ｏ１０に２ＨＰＯ４５，０ 蒸留水　　　　　　　全圧勿１６にする量（１１）改良
Ｓ’ｒＰ媒質−Ａ　　　　　　　　ｇ／ｌグルコース　
　　　　　　　　　　　１．０ト　リ　ノ　ト　ン　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０酵母
エキス　　　　　　　　　　　１０．０に２Ｉ（ＰＯ４
５・０ グリセロール　　　　　　　　　　　　２０蒸留水　　
　　　　　全」を１ｔＫする量０１１）改良ＳＴＩ’媒
質−Ｂ　　　　　　　　ｇ／ｌグルコース　　　　　　
　　　　　　２．０酵母エキス　　　　　　　　　　　
２０トリグトン　　　　　　　　　　　　１０．０■（
２１（ＰＯ４５，０ グリセロール　　　　　　　　　　　　　２．０ソルト
ソリコーシ臼ンＰＹ８　　　　　　　　　２０．０１ｄ
ビタミン溶液　、　　　　　　　　　　　１．Ｏｄ蒸留
水　　　　　　　全量を１ｔにする量（Ｖ）　　改良Ｓ
Ｔ２媒質−ｃ　　　　　　　　ｇｌｔピルビン酸ナトリ
ウム　　　　　　　　　２．０酵母エキス　　　　　　
　　　　　２．０トリグトン　　　　　　　　　　　　
１０．０Ｋ２ＨＰ０４５．Ｏ グリセロール　　　　　　　　　　　　　２０ソルトソ
リコーシヨンＰＹＳ　　　　　　　　　　　　２．５は
ビタミン溶液　　　　　　　　　　　　　　　　１　　
ｍｌ水道水　　　　　　　全量を１ｔにする量（ｃ）　
　ソルトソリューションｐｙｓ　　　　　　　ｇ７ｔ”
３Ｃ６”５０７・２Ｈ２０ｒクエン酸ナトリウＡＪ　　
　５．０ＭｎＣＩ２・４Ｈ，，０３，０ ＺｎＣ１２，Ｏ Ｆ　ｅ　Ｃｌ　３　・６Ｈ２０２，０ ＭｇＣＩ２・６　Ｈ２Ｏ５０，０ ＣＩＩＣ１２・２Ｈ２０ｏ、２ ＣａＣ１２’２１１２０　　　　　　　　　　　　　　
０．７５ＣｏＣ１２’２Ｈ２００，２ ＮａＭｏ０４・２Ｈ２００，ｌ Ｎａ２Ｂ４Ｏ７−１０Ｈ，００，１ 蒸留水　　　　　　　　全、１を１１ＶＣするｙ（ｄ）
　　ビタミン溶液　　　　　　　　　　ｍｙ／ｌチアミ
ン・ＨＣＩ　　　　　　　　　　　２００ｐ−アミノ安
息香酸　　　　　　　　２００ピリドキンン・）ＩＣＩ
　　　　　　　　　　　　２００リボフラビン　　　　
　　　　　　　２００１）−ノ４ントテン酸（カルシウ
ムｔｆｉ）　　　　　　　　２００ホール酸　　　　　
　　　　　　　　　２．０ビオチン　　　　　　　　　
　　　　　２，０リゴフラビンは加温して溶液中に溶解
させる。(b) Developing w-medium glucose 1.0 Yumou extract 10.0 birds 70 tons
1O10 to 2HPO45.0 Distilled water Amount to make total pressure 16 (11) Modified S'rP medium-A g/l glucose
1.0 trinoton
10.0 yeast extract 10.0 with 2I (PO4
5.0 glycerol 20 distilled water
011) Improved STI' medium-B g/l glucose
2.0 yeast extract
20 Trigton 10.0■(
21 (PO45.0 Glycerol 2.0 Salt Sorikoshin PY8 20.01d
Vitamin solution, 1. Od Distilled water Amount (V) to make the total amount 1 t Improved S
T2 medium-c glt sodium pyruvate 2.0 yeast extract
2.0 Trigton
10.0K2HP045. O glycerol 20 salt solution PYS 2.5 is vitamin solution 1
ml tap water Amount to make 1 ton (c)
salt solution pys g7t”
3C6”507・2H20r Sodium citrate AJ
5.0MnCI2・4H,,03,0 ZnC12,O Fe Cl 3 ・6H202,0 MgCI2・6 H2O50,0 CIIC12・2H20o, 2 CaC12'21120
0.75CoC12'2H200,2 NaMo04・2H200,l Na2B4O7-10H,00,1 Distilled water Total, 11VCy(d)
Vitamin solution my/l thiamine・HCI 200 p-aminobenzoic acid 200 pyridoquine・)ICI
200 riboflavin
2001)-4-tothenic acid (calcium TFI) 200 Holic acid
2.0 biotin
The 2,0 rigoflavin is dissolved into the solution by heating.

このビタミン溶液は殺菌濾過し、そして殺菌後媒質に加
えた。This vitamin solution was sterile filtered and added to the medium after sterilization.

３、培養物の保存 培養物は０．２チのグリセロールを含ませたミクロ検定
培養アガールの穿刺上に保存した。培養物は少なくとも
週に一度新鮮な穿刺上に移した。3. Storage of Cultures Cultures were stored on microassay culture agar punctures containing 0.2 t of glycerol. Cultures were transferred onto fresh punctures at least once a week.

３０℃で４８時間温装の後穿刺を４℃で保存した。After incubation at 30°C for 48 hours, the punctures were stored at 4°C.

生物体の保存用の別の方法は液体窒素中での貯蔵である
。この目的のため培養物はＳＴＰ媒質中的中０時間生長
させた。次に細胞を分離し、アレン（Ａｌｌｏｎ）のソ
ルトソリ＝−ジョン（ＡＩｌｅｎ、Ｍ、Ｂ　、アーカイ
シス　オブ　マイクロバイオロノー、３２巻、２７０−
２７７頁、１９５９年）を含む無菌の１０％グリセロー
ル水溶液中に再懸濁させた′ｂこの懸濁物の少坩を殺菌
ガラスアングルに添加し、次に密封し、液室中に貯蔵し
た。Another method for preserving living organisms is storage in liquid nitrogen. For this purpose, cultures were grown for 0 hours in STP medium. The cells were then separated and processed using Allon's salt solution (Allen, M.B., Archaeology of Microbiology, Vol. 32, 270-
A small crucible of this suspension was added to a sterile glass angle, which was then sealed and stored in a liquid chamber.

４、発酵 （ａ）　　接種剤の調製 ミクロ検定培養アガールで４８時間生長させた培養を２
５０　ｒｒｔｌエーレンマイヤーフラスコ中の５０Ｍの
、ＳＴＰ媒質中的中した。フラスコを３０℃及び２００
　ｒｐｍで振とうした。２０時間の温良後、内容物をソ
ーパル（５ｏｒｖａｌｌ　）の冷凍遠心機（ＲｃｔｘＢ
ｕ、ｒ　、　醪ン　インスツルメント社、ニュータウン
、コネチカット）において４℃、１２．０００Ｘｇで１
５分間遠心分離した。上澄液は捨て、細胞はもとと同じ
容積の無菌水中に再懸濁した。この懸濁物を接種剤とも
て用いた。4. Fermentation (a) Preparation of inoculum A culture grown for 48 hours in microassay culture Agar was
50 M in STP medium in a 50 rrtl Erlenmeyer flask. The flask was heated to 30°C and 200°C.
Shake at rpm. After 20 hours of warming, the contents were transferred to a Sopal refrigerated centrifuge (RctxB).
1 at 4°C and 12.000 x g
Centrifuged for 5 minutes. The supernatant was discarded and the cells were resuspended in the same volume of sterile water. This suspension was used as an inoculum.

（ｂ）　　酵素の製造 ２５０ｍ／エーレンマイヤーフラスコ中ノ２５ｍ１の発
酵媒質に上記（４，ａ）で述べたようにし′を調製した
接種剤１．５ｍｌを接種した。フラスコを３０℃で２０
　Ｏｒｐｍで振とうした。フラスコを２０時間振とり後
、それぞｎのフラスコからサンダル２、５　ｍｌを採取
した。このサンダルをソーノ々ル冷凍遠心機において１
９，０００Ｘｇで１５分間遠心した。(b) Production of enzyme A 25 ml fermentation medium in a 250 ml Erlenmeyer flask was inoculated with 1.5 ml of the inoculum prepared as described in (4.a) above. Incubate the flask at 30°C for 20
It was shaken at Orpm. After shaking the flask for 20 hours, 2.5 ml of sandal was collected from each n flask. Place these sandals in a Sonoru refrigerating centrifuge.
Centrifugation was performed at 9,000×g for 15 minutes.

この細胞を脱イオン水２．５　ｒｎｌ中に再懸濁させた
。The cells were resuspended in 2.5 rnl of deionized water.

この懸濁物を１０倍に希釈した。この希釈懸濁液を乾燥
細胞重量の決定及びα−グリセロホスフェート（α−〇
Ｐ）オキシダーゼの検定用に用いた。This suspension was diluted 10 times. This diluted suspension was used for determination of dry cell weight and assay of α-glycerophosphate (α-0P) oxidase.

５、乾燥細胞重量の測定 乾燥細胞重量と６６０ＷＩＩ＋＋における吸光度の関係
を示す検量線を調製した。スペクトロニ、ツク２０スペ
クトロフオトメータ（５ｐｅｃｔｒｏｎｔｃ　２０Ｓｐ
ｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ　）　（）”ウシュ　
　アンド　ローム、ロチニスター、ニューヨーク）で吸
光度を測定し、乾燥細胞重量を検量線から計算した。5. Measurement of dry cell weight A calibration curve showing the relationship between dry cell weight and absorbance at 660WII++ was prepared. Spectroni, Tsuku 20 Spectrophotometer (5pectrontc 20Sp
electrophotometer) ()"
Absorbance was measured using a 100-molecular-weight (Andrôme, Rochinister, New York) and dry cell weight was calculated from the standard curve.

−１℃口７、スフニー　　オキシダーゼ活性の検定 α−ＧＰオキシダーゼ活性は、α−ＧＰオキシダーゼに
よってα−グリセロホスフェートを酸化させるに際し又
放出さｎるＨ２Ｏ２によるロイコ染料のペルオキシダー
ゼ接触酸化を測定することによって決定した。酵素活性
の一単位（Ｕ）は３７℃及びＰＨ７，０で１分間当シに
基質のｌ　ｌｔモルを製品に転換する酵素の量で定義す
る。−1°C Port 7, Assay of Sufney Oxidase Activity α-GP oxidase activity is determined by measuring peroxidase-catalyzed oxidation of leuco dyes by H2O2, which is also released upon oxidation of α-glycerophosphate by α-GP oxidase. did. One unit (U) of enzyme activity is defined as the amount of enzyme that converts 1 lt moles of substrate to product in one minute at 37°C and pH 7.0.

（ａ）試薬 （＋）ＫＰ−ぐ、ファー：０．１Ｍリン酸カリウム緩衝
液、Ｐ　Ｉ■７．０ （１１）基質溶液：　１００１ＭノＫＰハッ７７　１ｃ
α−グリセロホスフェート１７．２８８　ｇ’を溶解、
。(a) Reagent (+) KP-g, Far: 0.1M potassium phosphate buffer, PI 7.0 (11) Substrate solution: 1001M KP H77 1c
Dissolve 17.288 g' of α-glycerophosphate,
.

０１１）染料溶液：１００ｍＪの脱イオン水に３，３′
−ジメトキシ−ベンチノン　ジヒドロクロリド（０−ソ
アニノン）１ｇを溶解、 （Ｖ）　　洗浄剤：ＫＰバッファー１０ｍ１中にトリト
ン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（ローム　アンド　）１
−ス、フィラデルフィア、インシルグアニア、から市販
のポリエトキシエチレン界面活性ｑＪ　）　１　ｇを溶
解、 （■）バッファー溶液：ＫＰバッファー５Ｑｒｎｌ中に
ホースラデイン−４ルオキシダーゼ　タイグ■３．３　
＋Ｉ＋２を溶解し、こｎに染料溶液１．１ｍｌ及び洗浄
剤溶液６．６Ｍを添加し、ＫＰ−々ッファーで全量を１
００ｍ１にする◎ （ｂ）　　方法 試験管中のバッファー溶液６ＷＬｔ及び基質溶液１ゴを
水浴シェカー（二一一プランズウィックサイエンティフ
ィック、ニーープランズウィック、ニューツヤ−ノー）
で３７℃で１５分間で平衡状態にさせた。このサンダル
を縦画ｊ９５−２５ｍＵのα−ＧＰオキ゛シダーゼを含
むように稀釈した。正しく希釈し、たサンダル１ｍｌを
平衡させた前記試験管に添加した。サンダルの代シに脱
イオン水１　ｍｌでブランクを調製した。試験管を水浴
シェカー中で３７℃で振とうした。色の展開を、スペク
トロニック２０ス４クトロメーターを用いて４３０ｍで
５分毎に１時間測定した。011) Dye solution: 3,3' in 100 mJ deionized water
-Dimethoxy-bencinone Dissolve 1 g of dihydrochloride (0-soaninone), (V) Cleaning agent: 1 Triton X-100 (ROHM AND) in 10 ml of KP buffer.
Dissolve 1 g of polyethoxyethylene surfactant qJ) commercially available from S.A., Inc., Philadelphia, Inc., (■) Buffer solution: horseradine-4 oxidase 3.3 in 5 Qrnl of KP buffer.
+I+2 was dissolved, 1.1 ml of the dye solution and 6.6 M of the detergent solution were added thereto, and the total volume was diluted to 1
(b) Method 6WLt of buffer solution and 1Lt of substrate solution in a test tube were shaken in a water bath (211 Prinswick Scientific, New York, New York).
Equilibration was carried out at 37° C. for 15 minutes. This sandal was diluted to contain 95-25 mU of α-GP oxidase. 1 ml of properly diluted sandal was added to the equilibrated tube. A blank was prepared with 1 ml of deionized water in place of the sandals. The tubes were shaken at 37°C in a water bath shaker. Color development was measured every 5 minutes for 1 hour at 430 m using a Spectronic 20 S 4 chromameter.

染料に対する吸光係数を求め、光学濃度を利用された基
質の濃度に変換するのに用いた。The extinction coefficient for the dye was determined and used to convert the optical density to the concentration of the substrate utilized.

、物質移動係数（ＫＬ−ａ）の決定 物質移動係数は溶存酸累濃匿と出口酸素濃度とを監視す
ることによシ求めた。溶存酸素濃度は前述の５　、　（
ｂ）項（α−ＧＰオキシダーゼの製造）で述べた膜電極
を用いて求めた。, Determination of Mass Transfer Coefficient (KL-a) The mass transfer coefficient was determined by monitoring accumulated dissolved acid concentration and outlet oxygen concentration. Dissolved oxygen concentration is calculated from the above-mentioned 5, (
It was determined using the membrane electrode described in section b) (Production of α-GP oxidase).

出口酸素濃度は磁気分析針（タイグＣＡｌ５０、サーデ
メックスコントローズ　リミテイド、クロラボロウ、ザ
セックス、英国）を用いて測定した。Exit oxygen concentration was measured using a magnetic analysis needle (Taig CAl50, Surdemex Controls Limited, Cloborrow, Thesex, UK).

ＫＬ−ａの計算には次の関係式を用いた。The following relational expression was used to calculate KL-a.

Ｎ　Ａ＝Ｋ　Ｌ−ａ　（Ｃ”　Ｃ１，）式中、ＮＡ＝物
質移動速度 ＫＬ＝物質移動係数 ａ＝界面積 Ｃ＊＝溶存酸素の飽和濃度 ＣＬ＝瞬間溶存酸素濃度 例１：グリセロールの誘導効果 グリセロールの添加は酵素の製造に画期的な効果をもつ
。グリセロール２　ｇ／ｌを含む媒質において最大の製
造結果か得られた（第１表参照）。更にグリセロール濃
度を増大させでも酵素の収量は増大しなかった。培養物
の生長は大きく影響を受けなかった。即ち、乾燥細胞重
量は高々２０チ程度増大したのに対し、酵素収量の増大
は３倍以上であった。NA=K L−a (C” C1,) where NA=mass transfer rate KL=mass transfer coefficient a=interfacial area C*=saturation concentration of dissolved oxygen CL=instantaneous dissolved oxygen concentration Example 1: Induction of glycerol Effect The addition of glycerol has a revolutionary effect on the production of enzymes.The maximum production results were obtained in a medium containing 2 g/l of glycerol (see Table 1).Furthermore, increasing the glycerol concentration did not improve the production of enzymes. Yield was not increased. Growth of the culture was not significantly affected; ie, dry cell weight increased by no more than 20 cm, whereas enzyme yield increased by more than 3 times.

第　　１　　表 ０．０”　　０．３４　　６２　１００２．０　　０．
４１　２０５　３３０ ５．０　　０．３８　２０３　３２８ １０．０　　０．３４　１７８　２８７ａ：対照 培養物は表示の濃度のグリセロールを補充したＳＴＰ媒
質中的中長させた。Table 1 0.0” 0.34 62 1002.0 0.
41 205 330 5.0 0.38 203 328 10.0 0.34 178 287a: Control cultures were grown medium in STP medium supplemented with the indicated concentrations of glycerol.

第２表に示したように、培養物の生長はグルコースの濃
度に完全に依存した。グルコースを含まない媒質で得ら
扛た乾燥細胞重量に比較して３ルｔのグルコースを添加
した場合には乾燥細胞重量が３倍増加した。グルコース
濃度もα−ＧＰオキシダーゼの生成に重大な効果を呈し
、媒質中にグルコースのない場合には３８襲の生成曾低
下を来した。酵素の生成量は、グルコース濃度が１．０
ｇ／ｌまではグルコース濃度の増加に従って増加した。As shown in Table 2, the growth of the culture was completely dependent on the concentration of glucose. There was a 3-fold increase in dry cell weight when 3 t of glucose was added compared to the dry cell weight obtained with glucose-free medium. Glucose concentration also had a significant effect on α-GP oxidase production, with 38 times less production in the absence of glucose in the medium. The amount of enzyme produced is determined when the glucose concentration is 1.0.
g/l increased with increasing glucose concentration.

グルコース濃度が更に増加させるとα−ＧＰオキシダー
ゼの生成量は低下した。As the glucose concentration further increased, the amount of α-GP oxidase produced decreased.

第２表 グルコースの効果 グルコ−内震度乾燥細胞重鼠　α−ＧＰオキシダーゼの
生成Ｃｇ／ｌ）　　　　　（ｇ／ｌ）　　　（［１／Ｌ
Ｘ対照に対する％）０　　　　　　０．２２　　　５２
　　　　６２０．５０．２９　　　６２　　　　７６１
．０ａ　　　　０．３２　　　８２　　　１００２．０
　　　　　０．５７　　　３０　　　　３６３．０　　
　　　　０．６１　　　　３９　　　　　４７ａ：対照 前述の如く、培養はＳＴＰ媒質中的中施した。Table 2 Effect of Glucose Gluco-Intensity Dry Cell Heavy Rat Production of α-GP Oxidase Cg/l) (g/l) ([1/L
% of X control) 0 0.22 52
620.50.29 62 761
．． 0a 0.32 82 1002.0
0.57 30 363.0
0.61 39 47a: Control As described above, culture was carried out in STP medium.

グルコニスの量は表示の通シ変化させた。The amount of gluconis was varied throughout the display.

す、千余白 （１））グルコースの効果（その２） グルコースの存在及び不存在下におけるα−ＧＰオキシ
ダーゼの生長の結果を第３表に示した。(1) Effect of Glucose (Part 2) Table 3 shows the growth results of α-GP oxidase in the presence and absence of glucose.

媒質は炭素源を除き改良ＳＴＰ媒質−Ａを用いた。The medium used was improved STP medium-A except for the carbon source.

第３表 な　　し　　０．００．１９　　　　　　　　　１７６
グ”　　　１．０　　　０．３３　　　　　　１９９−
ス （ｃ）グルコースと　　塩類及びビタミン類と°の組合
せ効果 第４表に示すように、グルコース２．０　ｇ／ｌと無機
塩類及びビタミン類を共用した場合には培養物の生長が
増大し、そして驚くべきことに同時に酵素生成量が著し
く増加することが認められた。No Table 3 0.00.19 176
1.0 0.33 199-
(c) Combination effect of glucose and salts and vitamins As shown in Table 4, when 2.0 g/l of glucose and inorganic salts and vitamins were used together, the growth of the culture increased; Surprisingly, it was also observed that the amount of enzyme produced increased significantly.

以下余白 第４表 ０　　　　　　　０．３３　　　　　　　　　２３７０
．５０．５１　　　　　　　　　２８２１．０　　　　
　０．４９　　　　　　　　　１９４２．０　　　　　
０．６２　　　　　　　　　４１８３．０　　　　　０
．７２　　　　　　　　　　　２７培養物は上記グルコ
ース濃度の改良ＳＴＰ　ｔｓ、質−Ｂで生長させた。Margin below Table 4 0 0.33 2370
．． 50.51 2821.0
0.49 1942.0
0.62 4183.0 0
．． 72 27 cultures were grown in modified STP ts, quality-B at the glucose concentrations listed above.

例３：グリセロール同族体の効果 我々はα−オキシダーゼが誘導性の酵素であシ、そして
グリセロールで誘導さ九ることを示した。Example 3: Effect of glycerol analogues We have shown that α-oxidase is an inducible enzyme and is induced by glycerol.

グリセロールは基質、α−グリセロホスフェートの前駆
物質であシ、そして容易に利用される炭素源であるので
、その濃度は発酵中に減少するに違いない。それ故、発
酵中にその濃度が減少しない誘導質、即ち無償の誘導質
を見つけることは有用である。この理由のために我々は
多くのグリセロール同族体及びモノグリセリドについて
試験した。Since glycerol is a substrate, a precursor of α-glycerophosphate, and a readily available carbon source, its concentration must decrease during fermentation. Therefore, it would be useful to find an inducer whose concentration does not decrease during fermentation, ie a free inducer. For this reason we tested a number of glycerol congeners and monoglycerides.

以下の実験は振とうフラスコ中で実施した。α−ＧＰオ
キシダーゼの誘導は、試験したすべてのグリセロール同
族体について得られた（第５表１照）。グリセロールを
媒質から吐いた場合には酵素量は対照の３８％に減少し
た。この量は、グリセロールの同族体を添加した場合に
は、エチレングリコールは例外として、対照の５０％に
増加した。エチレングリコールは酵素の合成を強く抑制
した。Ｉ゛ｌ　１．’全白 第５表 な　　し　　　　　　　　　−０，３１３８グリセロー
ル　　　０ＤＯ２０，４１１００エチレングリコール　
００３２　　　０．３０　　　　　　　１７２　＋　Ｊ
−；’　ｌ　ｙノ’　　０Ｄ２２　　０．３０　　　　
　　５２−ル モノアセテン　０．０１５　　０．４０　　　　　９８
■　−１′グ°ビ’　　　０．１３　　　　０．３８　
　　　　　　　　７０二ン １−モノプテリン　０ｉ）１２　　０．３７　　　　　
　９２モノステアリン　０ＤＯ６０，３４３４モノオレ
イン　０Ω０６　　０．２８　　　　４１トリラウリン
０ｆｉ０３０．３２４６ ＋ｌ：すべてのグリセロール同族体は２．０　Ｖｔで試
験。The following experiments were conducted in shake flasks. Induction of α-GP oxidase was obtained for all glycerol congeners tested (see Table 1). When glycerol was expelled from the medium, the enzyme amount was reduced to 38% of the control. This amount increased to 50% of the control when the glycerol congeners were added, with the exception of ethylene glycol. Ethylene glycol strongly inhibited enzyme synthesis. I゛l 1. 'All White Table 5 None -0,3138 Glycerol 0DO20,41100 Ethylene Glycol
0032 0.30 172 + J
-;'lyノ' 0D22 0.30
52-monoacetene 0.015 0.40 98
■ -1'Gubi' 0.13 0.38
702-1-monopterin 0i)12 0.37
92 Monostearin 0DO60,3434 Monoolein 0Ω06 0.28 41 Trilaurin 0fi030.3246 +l: All glycerol congeners tested at 2.0 Vt.

ｂ：対照 培養物は２　Ｖｔの酵母エキスを加えた改良ＳＴＰ媒質
−Ａ中で生長させた。但し、グリセロールは上表のよう
にその同族体に置換した。b: Control cultures were grown in modified STP medium-A supplemented with 2 Vt of yeast extract. However, glycerol was replaced with its homolog as shown in the table above.

ストレグトコカス　フェカリス　ＡＴＣＣ１２７５５に
代えて第６表に掲げた、他の様々な微生物を用いて、α
−グリセロホスフェート　オキシダーゼの製造実験を行
なった。使用媒質は改良ＳＴＰ媒質−〇で、培養物は３
０℃及び３７℃で生長させた。Using various other microorganisms listed in Table 6 in place of Stregutococus faecalis ATCC12755, α
- An experiment was conducted to produce glycerophosphate oxidase. The medium used was improved STP medium-〇, and the culture was
Grown at 0°C and 37°C.

結果を第６表に示す。The results are shown in Table 6.

以下◇白 第６表 第１頁の続き ０発　明　者　チャールズ・トーマス・グツドピユー アメリカ合衆国ニュー−１−’）・ ロツチェスター・ハイデン・ス プリング・サークル８９Below ◇White Table 6 Continuation of page 1 0 shots by Charles Thomas Gutsudopiyu United States New-1-’)・ Rotchester Heiden Su pulling circle 89

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １、　ス　レグ　コカスー、弐ア」」三り１己１え久ド
パシラスおよび１ニーコノスレ′り属の一員を生長させ
ｔα−グリセロホスフェートオキシダーゼを製造するに
当り、前記−員をグリセロールおよびその同族体から選
定されたα−グリセロホスフェートオキシダーゼ用誘導
質を含む媒質中で生長させ、次いでα−グリセロホスフ
ェートオキシダーゼを抽出することを特徴とするα−グ
リセロホスフェートオキシダーゼの製造法。 レエキイ、ラクトパシラス　乙り二）７１ＡＳ９クトパ
シラス　Ｋントアシティカス、ラクトパシ囲第１項記載
の製造法。 ３、　前記媒質か更にグルコースを含む特許請求の範囲
第１項の製造法。 ４、　α−グリセロホスフェートオキシダーゼ用誘導質
を含む媒質中でストレグトコカス　フェカリスを生長さ
せてα−グリセロホスフェートオキシダーゼを生成させ
、次いでこの生成α−グリセロホスフェートオキシダー
ゼを抽出する特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ５、　前記誘導質がグリセロール、３−メチル−１，２
−ｆ日ノ４ンジオール、１．３−ニア’ロノぐンジオー
ル、１，２−グロノやンジオール、２，３−ブタンノオ
ール、１，２．４−ブタントリオール、モノアセチン、
１−モノグロピオニン、１−モノブチリン、モノステア
リン、モノオレインおよびトリラウリンの群から選定さ
几る特許請求の範囲第１項又は第４項記載の製造法。 ６、前６Ｃ誘導質が媒質リットル当シ約１．０〜１０グ
ラムの量で媒質中に存在する特許請求の範囲第１項又は
第４項記載の製造法。 ７、　前記製法が前記媒質にα−グリセロホス７エート
オキシダーゼの生成を増加させるのに有効な量の無機塩
類及びビタミン類を加える工程を含む特許請求の範囲第
１項又は第４項記載の製造法。 ８、前記無機塩類がソルトソリーーシ目ンＰＹＳである
特許請求の範囲第７項記載の製造法。 ９、媒質リットル当シ、グリセロール、モノアセチンも
しくは１−モノブチリンの群から選定されたα−グリセ
ロホスフェートオキシダーゼ誘誘導的約２０〜約５．０
　ｇ　％酵母エキス約ｌＯ〜約２０ｇ、蛋白氷解物的５
〜約２０ｇ及びに２ＨＰ０４少なくとも約３゜Ｏｇを含
んで成る媒質中でストレグトコカス　７エカリスＡＴＣ
Ｃ１２７５５の細胞を成長すせ、生成α−グリセロホス
フェートオキシダーゼを抽出しでα−グリセロホスフェ
ートオキシダーゼ生成物を取得する特許請求の範囲第４
項記載の製造法。 １０、グルコース及ヒα−グリセロホスフェートオキシ
ダーゼ用誘導質を含む媒質中でストレグトコカス　　フ
ェカリスを生長させｔα−グリセロホスフエートオギシ
ダーゼを生成させ、このα−グリセロホスフェートオキ
シダーゼを抽出する特許請求の範囲第４項記載の製造法
。 １１　　前記銹導質が媒質リットル当シ約１．ｏ〜１０
ｇの量で存在する特許請求の範囲第１０項記載の製造法
。 １２　　前記銹導質か媒質リットル当シ約０．５〜約３
．０ｇのグルコースを含む特許請求の範囲第１０項記載
の製造法。 １３、前記製法が前記媒質にα−グリセロホスフェート
オキシダーゼの生成を増加させるのに有効な量の無機塩
類及びビタミン類を加える工程を含む特許請求の範囲第
１０項記載の製造法。 １４、前記無機塩がソルトソリューションＰＹＳである
特許請求の範囲第１３項１Ｃ載の製造法。 １５、媒質り、トル当ｐ、グルコース約０．５〜約３、
Ｏｇｓグリセロール、モノアセチンもしくは１−モノブ
チリンの群から選定されたα−グリセロホスフェートオ
キシダーゼ誘誘導的約２０〜約５．０ｇ１酵母エキス約
１．０〜約２０ｇ及びに２ＨＰＯ４少なくとも約３．０
ｇを含んで成る媒質中でストレグトコカス　フェカリス
ＡＴＣＣ１２７５５の細胞を生長させ、生成α−グリセ
ロホスフェートオキシダーゼを抽出してα−グリセロホ
スフェートオキシダーゼ生成物を取得する特許請求の範
囲第４項記載の製法。 １６、前記製法か前記媒質にα−グリセロホスフェート
オキシダーゼの生成を増加させるのに有効な量の無機塩
類及びビタミン類を添加する工程を含むｌ特許請求の範
囲第１５項記載の製法。 １７、前記細胞を生長させながら前記媒質の温度を約３
０℃に調節する特許請求の範囲第１５項８１シ載の製法
。[Scope of Claims] 1. In producing tα-glycerophosphate oxidase by growing members of the genera S. reg. 1. A method for producing α-glycerophosphate oxidase, which comprises growing α-glycerophosphate oxidase in a medium containing an α-glycerophosphate oxidase derivative selected from glycerol and its homologs, and then extracting α-glycerophosphate oxidase. 71AS9 Lactopacillus, Lactopacilus Otori 2) The production method described in paragraph 1 of the section. 3. The manufacturing method according to claim 1, wherein the medium further contains glucose. 4. The method according to claim 1, wherein Stregutococcus faecalis is grown in a medium containing an inducer for α-glycerophosphate oxidase to produce α-glycerophosphate oxidase, and then the produced α-glycerophosphate oxidase is extracted. Manufacturing method. 5. The inducer is glycerol, 3-methyl-1,2
-f day diol, 1,3-nia' lono diol, 1,2-gulon diol, 2,3-butane diol, 1,2,4-butanetriol, monoacetin,
5. The method according to claim 1 or 4, wherein the compound is selected from the group of 1-monoglopionine, 1-monobutyrin, monostearin, monoolein and trilaurin. 6. The method of claim 1 or claim 4, wherein the 6C derivative is present in the medium in an amount of about 1.0 to 10 grams per liter of medium. 7. The manufacturing method according to claim 1 or 4, wherein the manufacturing method includes the step of adding to the medium an amount of inorganic salts and vitamins effective to increase the production of α-glycerophos7ate oxidase. . 8. The manufacturing method according to claim 7, wherein the inorganic salt is a salt salt PYS. 9. α-glycerophosphate oxidase inducer selected from the group of glycerol, monoacetin or 1-monobutyrin per liter of medium, from about 20 to about 5.0
g % yeast extract about 10 to about 20 g, protein thawed product 5
Stregutococcus 7 ecalis ATC in a medium comprising ~20 g and at least about 3° Og of 2HP04.
Claim 4: Growing cells of C12755 and extracting the produced α-glycerophosphate oxidase to obtain an α-glycerophosphate oxidase product.
Manufacturing method described in section. 10. Claim 4, wherein Stregutococcus faecalis is grown in a medium containing glucose and an inducer for α-glycerophosphate oxidase to produce tα-glycerophosphate oxidase, and this α-glycerophosphate oxidase is extracted. Manufacturing method described. 11. The rust conductive material is approximately 1. o~10
11. A method according to claim 10, wherein the amount of g. 12 About 0.5 to about 3 per liter of the rust conductive medium
．． 11. The method according to claim 10, comprising 0 g of glucose. 13. The method of claim 10, wherein the method includes the step of adding to the medium an amount of inorganic salts and vitamins effective to increase the production of alpha-glycerophosphate oxidase. 14. The manufacturing method according to claim 13, 1C, wherein the inorganic salt is a salt solution PYS. 15, medium, torr p, glucose about 0.5 to about 3,
from about 20 to about 5.0 g of yeast extract selected from the group of Ogs glycerol, monoacetin or 1-monobutyrin and at least about 3.0 g of 2HPO4.
The method of claim 4, wherein the α-glycerophosphate oxidase product is obtained by growing cells of Stregutococcus faecalis ATCC 12755 in a medium comprising g. 16. The method of claim 15, wherein the method includes the step of adding to the medium an amount of inorganic salts and vitamins effective to increase the production of alpha-glycerophosphate oxidase. 17. While growing the cells, increase the temperature of the medium to about 3
The manufacturing method according to claim 15, wherein the temperature is adjusted to 0°C.