JPS58162531A - 細菌莢膜由来の多糖類−蛋白質複合体の製法、その生成物およびそれを含有する免疫原組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は細菌莢膜由来の多糖類−蛋白質複合体の製法、
その生成物およびそれを含有する免疫原組成物に関する
。

ある種の細菌の病毒力は外側膜を包む、種々の成分、と
りわけ、多糖類および蛋白質からなる莢膜の存在による
。

かかる莢膜を有する細菌の例としては、ナイセリア自メ
ニン　　ジチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉ
ｔｉｄｉｓ）、ナイセリア・ゴノーレア（Ｎｅｉｓｓｅ
ｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）　−ヘモフィルズーイン
フルセンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚ
ａｅ　）およびエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ　）が挙げられる。

本発明の複合体およびその製法は、出発微生物がただ莢
膜を有する細菌であることが必要なたけで、特定の種の
特定の株を用いることに関するものではない。すなわち
、出発微生物は臨床的感染症例から当業者が容易に得る
ことができ、識別することかできるものである。

例えは、ナイセリア属のものは典型的な臨床的感染症例
から容易に単離できるよく知られた微生物である。これ
らは非運動性、ダラム陰性の小球菌（約０６μｍ×１０
μｍ）で、単一で増殖するが、しばしば扁平側が隣接し
た一対で、あるいは、場合により、四裂体または集合体
で増殖する。

ナイセリア属のものは基本的に好気性菌であるが、微好
気性条件下でも増殖する。これらのうち、ナイセリア・
メニングチジス８群はいくつかの国における髄膜炎菌疾
患の原因の重大な部分を占めるものである。

ダブリュー・ディ・ゾリンガーら（Ｗ、　Ｄ。

Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、Ｊ、　　Ｃｌ１
ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、５３　：８３６−８４８．１９７
９）は−１培養物から得られたナイセリア・メニングチ
ジス８群の部分精製多糖類を同じ条件下で培養した第２
の培養物から得られた外側膜蛋白質と合した後、この混
合物Ｔ！：さらに加工してリポ多糖類を除去した調製物
がヒトにおいて免疫原性であることを報告している。

ヘモフィルス・インフルエンザもよく知られたダラム陰
性の病原菌で莢膜のないものと、莢膜を有するものがあ
る。莢膜を有するヘモフィルス・インフルエンザは１〜
６型の莢膜多糖類を含み（ａ−１〕、このうち、ｂ型が
ことに若年の小児に対して特に激しい影響を及ぼす病原
菌である。事実、ヘモフィルス・インフルエンザｂ　型
（Ｈｉ、　ｂ）は６オ以下の小児における細菌性髄膜炎
のもつとも一般的な原因菌の１つである。

を髄液のような病理試料に見られる微生物は一般に、小
さな、かつ、莢膜を有するダラム陰性の非運動性の球界
菌性〜桿菌（０，２μｍ−０，３μｍ×０、５　’ｔｒ
ｍ　〜２．０　μｍ　）である。莢膜を有しない株は著
しく多形性で、糸状である。

莢膜を有する病原菌株は固体培地上で小さす［−露玉」
コロニーとして現われ、レビンタール（ＬｅｖｉｎＬｈ
ａｌ　）寒天のような透明培地上では斜めにさす光の中
で特徴的な真珠光を生じる。２４〜４８時間後に莢膜お
よび゛真珠光が消滅し、自己溶解および一定しないダラ
ム染色反応が起る。明らかに、自己溶解よび莢膜破壊は
共に菌体内酵素の作用により起る。同様に、液体培地中
で、莢膜は培１％の初期に消失する。

ヘモフィルス・インフルエンザは通性嫌気性菌で、血中
に存在する２つの生長因子、熱安定性Ｘおよび不安定性
■を要求する。

ａ〜［の６型は、特異抗血清を用いて行なわれる凝集、
沈澱または膨化（ｑｕｅｌｌｕｎｇ）テストにより血清
学的に同定されることが記載されている。

ヒトにとってもつとも重大な病原菌であるｂ型において
、莢膜多糖類はリボース、リビトールおよびリン酸塩を
含有しており、本明細書ではこのポリリボシルリビトー
ル・リン酸塩をＰｋｋ′Ｐと称する。

ヘモフィルス・インフルエンザｂ型の培養法オよびその
莢膜多糖類であるポリリボシルリビトール・リン酸塩の
単離法はエル・ビイ・ロドリゲスｃ、　（Ｌ、　Ｐ、　
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ　ｅｔ　ａｌ、　、Ｊ、１ｍｍｕｎ
ｏｌ、　１０７：　１０７１〜１０８０．１９７１　Ｊ
により記載されており、ヘモフィルス・インフルエンｆ
ｂ型のポリリボシルリビトール・リン酸塩の単離、精製
法が米国特許第４２２０７１７号に開示されている。

ヘモフィルス・インフルエンザｂ型株は米国、メリーラ
ンド、ロックビルのジ・アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション（Ａ’ｒにＣ）にＡＴＣＣ９７４５お
よびＡＴＣＣＩＵ２１１の番号で寄託されており、これ
らの株はＡＴ（Ｃから入手できる。また、前記のとおり
、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型株は典型的な感染
症例から容易に単離できる。これらのいずれの株も、ま
た、前記したような該微生物のいずれの培養法も本発明
の免疫原性ポリリボシルリビトール・リン酸塩−蛋白質
複合体の製造に使用できる。

非常に若年の小児、すなわち、２才以十の小児に対スる
ヘモフィルス・インフルエンｆｂｕワクチンの開発は未
だ初期の段階にある。精製多糖類ワクチンは励みになる
予備的結果を与えたが、後に、２才以下の小児には非常
に貧弱な免疫しか誘発しｆｌイコとが示された（　Ｐ、
　Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、ｌｎｆ、Ｄｉｓ、　１３６　　：５５７−６２　．
１９７７）。

また、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型からのポリリ
ボシルリビトール・リン酸塩−蛋白質複合体の免疫原性
は乳離れしたばかりのウサギにおいてピー・アンダーソ
ンおよびディ・エイチ・スミスによって研究されている
（Ｐ、　Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｄ。

Ｉｌ、Ｓｍ１ｔｈ、Ｊ、Ｉｎｔ、Ｄｉｓ、、１３６　：
　Ｓ６３〜７０゜１９７７）。この研究において、著者
はＰＲＲ’Ｐが細菌に付随している万が精製したよりも
より効力のある免疫原性を有することを示している。彼
等はへモフィルス・インフルエンザｂ型かう高分Ｊ′−
撤の可溶性複合体を単離し・た。この複合体は、１”Ｒ
Ｒ’Ｐが蛋白質と合体していると考えられ、該複合体の
発熱性およびリムラス（ｌｉｍｕｌｕｓ　）溶解質ゲル
化活性は少量のリポ多糖類の存在を示している。

単離した多糖類−蛋白質複合体の免疫原性が、発熱性で
あり、それ故、望ましくない成分であるリポ多糖類の存
在に依存するものではな（、そこに存在する蛋白質の櫨
および性質に依存することが判明した。また、多糖類と
蛋白質の間の非共有結合が、莢膜細菌性多糖類複合体調
製に通常用いられる臭化セトリモニウムやエタノールの
ような物質の存在する液体培地中で非常に不安定である
ことが判明した。

本発明は、例えば−莢膜を有する細菌の野性病原性単離
物の全培養液のような水性培地中に＠濁した細菌からリ
ポ多糖類を含まない免疫原性の細菌莢膜多糖類−蛋白質
非共有結合複合体を製造する方法を提供するものである
。この方法は第４級アンモニウム塩（例えば、臭化セト
リモニウム）の添加により細菌を不活化し、ついで、直
ちに、不溶性フラクションを集め、塩化ナトリウム、塩
化カルシウムまたは塩化マグネシウム、好ましくは、塩
化カルシウムのような非毒性アルカＵ金Ｍｔｔまたはア
ルカリ土類金属塩の０．２〜２Ｎ水性溶液にとり、５〜
４０％（ｖ　／　ｖ　）の水相温性アルコール（好まし
くは、２５％エタノール）の添加により汚染物質（王と
して核酸〕を沈澱させ、該第４級アンモニウム塩をその
不溶性塩の形成、例えば、水石性ヨウ化物、スルホシア
ン化物または安息香酸塩、好ましくは、アルカリ金属塩
の添加により溶液から除去し、沈澱を分離して水性溶液
を得、これから、例えば、限外ｐ過による濃縮および凍
結乾燥により該複合体を単離することからなる。

実施例から明らかなように、複合体中の蛋白質の蹟は本
発明を損うことなく、実際の操作条件、例えは、用いる
非心性アルカリ金属またはアルカリ土類金属の濃度およ
び／または性質によって変えることができる。

ヒトに投与するに適した免疫原調製物を製造するには、
凍結乾燥した複合体を、例えば、生理食塩水に浴解し、
例えば、セファロース２Ｂ−ＣＬ〔スウェーデン、ウプ
サラのファルマシア・ファイン−ケミカルス（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ。

Ｕｐｐｓａｌｅ　、　Ｓｗｅｄｅｎ）の製造、販売する
製品〕上でゲル沖過し、非遅延フラクションを水に対し
て透析し、例えば、単糖類または三糖類（例えば。

乳糖）のような安定剤を補足する。ついで、この溶液を
５ｄガラス薬瓶に１用直当り５μｇ（またはその倍数）
の複合体を含有するように分注し、凍結乾燥し、薬瓶を
密封する。筋肉内または、好ましくは、皮下経路で投与
する前に（好ましくは、１または２回くり返す）、その
場で発熱因子を含ませない生理食塩水を添加してワクチ
ンを復元させる。

また、本発明はへモフイルス・インフルエンサｂ型のリ
ポ多糖類を含まない免疫原性の莢膜多糖類−蛋白質非共
有結合複合体からなるヘモフィルス・インフルエンザｂ
型感染によって起る髄膜炎に対する免疫を生じさせるに
有用な組成物を提供するものである。該複合体の多糖類
部分はポＩＪ　ＩＪボシルリビトール・リン酸塩（ＰＲ
ＲＰ）であり、蛋白質部分は１分子当り１個のメチオニ
ン残基を含み、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で、各々、複
合体中に存在する蛋白質とみｆＡ　Ｅれるポリペプチド
の９０および１０％（ｗ　／　ｗ　）に対沁し、分子蓋
約４００００の主要疎水性サブユニットおよび分子量約
２７０００の微少親水性サブユニ゛ントニ対応する２つ
のスポットを示し、複合体中の蛋白質の総量は複合体の
重量に基き３０％以上、好ましくは一約４０〜９０％で
ある。

本発明の好ましい態様によれは、ＰＲＲ’Ｐ−蛋白質複
合体含有ワクチンは安定剤（例え４よ、単糖類または二
糖類（例えは、乳糖））を補足した凍結乾燥形で提供さ
れ、このワクチンは発熱因子のない生理食塩水の添加に
より復元される。得られた医薬組成物は皮下または筋肉
内経路で投与される。

本発明のＰＲλ°Ｐ−蛋白質複合体Ｇｌ成人および６才
以上の小児において免疫原性であるば力）りでナク、臨
床試験で示されるように非常に若年の小県、すなわち、
２才以下の小児におし）ても免疫１１性テする。該複合
体はモルモットまた＋１マウスにおいて何の毒性徴候も
示さず、ウサギにおし）てテストしても０．１２５μｇ
／ｍｔ／即の用量レベルで非発熱性であり、リムラス溶
解質ゲル化活性も０１２５μ７／ｒｎｌ　　の用量で陰
性である。

かくして得られたワクチンは１回または複数回の注射で
ヒト、ことに、２才以下の小児におけるヘモフィルス・
インフルエンザによって起る感染症に対して充分な保護
を与える。

１回の用量レベルは５μ７〜１００μグであり、また２
〜１２週、例えば、８週間隔て２または３回かかる注射
を行なうことも好ましい。

つぎに実施例を挙げて本発明をざらに詳しく説明するが
、これらに限定されるものではなし）。

実施例１ （ａ）　Ｐ　ＲＲ’Ｐ−蛋白質複合体の単離ビイ−１シ
ダーソンら（Ｐ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、＋Ｉ
ｎｆｅｃｔ、ａｎｄ　１ｔｒｒｎｕｎ、　１３　：５８
１〜５８９　＋１９７６　）の記載のように、ヘモフィ
ルス・インフルエンザｂ型の病原性単離物を静止期に到
達するに適した条件下、液体培地２０１中で増殖させる
。

ついで、臭化セトリモニウム２０グを加えて細菌を不活
化し、培地を７ＵＯＯＧで７分間遠心分離する。たまっ
たペレットを水３００ｒｎｌにとり、この懸濁液を７０
００Ｇで７分間遠心分離する。

沈澱を水中１．８Ｎ塩化力ルシウム４００ｍ／ｉことり
、その中でよく分散させて懸濁液とし、４℃で１時間、
激しく振とうする。ついで、９５％エタノール１３０ｍ
１を加え、さらに１時間振とつする。

懸濁液を２０υＯＯＧで１０分間遠心分離し、上澄液に
水１８６０−を加えて稀釈する。

ヨウ化カリウム９，０９５’を加えて該第４級アンモニ
ウム化合物を沈澱させ、４℃で１時間攪拌する。ついて
、４℃にて２００００Ｇで遠心分離してヨウ化セトリモ
ニウムを捨て、上澄液を５ｏｏｏ。

ダルトン・カット・オフ・カートリッジ付ホロー（Ｉ−
〇口ｏｗ）限外濾過装置（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ。

Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ　、　Ｍａｓｓ、Ｕ　Ｓ　Ａ　）中
で最初の容置のＶＯ２に濃縮する。保持物をビスキング
（Ｖｉｓｋｉｎｇ）透析チューブ（Ｓｅｒｖａ　Ｆｅｉ
ｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　＋１１ｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、
　）’ｅｄ、Ｒｅｐ、　ｏｆ　Ｇｅｒｍａｎｙ）で透析
し、３つのメンブレン・フィルター（０，８，０，４５
および０２２μｍ）で連続的に許過し、ガラス薬瓶質 に分注し、凍結乾燥して粗製のＰＲＲ’Ｐ−ｉ白複△ 合体を得る。

（ｂ）　ｐ　ｔｔ　Ｒ・Ｐ−蛋白質複合体の精製および
ワクチンの調製 粗製複合体１７０Ｗ９を水中０．４Ｎ塩化ナトリウム１
００ｍｊに溶解し、この溶液をセファロース２Ｂ−にＬ
ゲルの水中０．４Ｎ塩化ナトリウムで平向にした２１カ
ラ云にかける。非遅延フラクション（複合体９０．２２
”ｌｉ！’）を水に対して透析し、３％（ｗ　／　ｖ　
）の乳糖で補足し、この溶液を０７４５および０．２２
μのメンブレン・フィルターで濾過して滅菌し、各々、
複合体５μＩｉ（またはその倍数）を含有するように５
ｍ／ガラス薬瓶に分注し、凍結乾燥する。ついで、薬瓶
を密封する。

投与前に、薬瓶当り、０．２５％フェノールヲ補足した
生理食塩水０．５〜５−を加えてワクチンを復元させる
。

［Ｃ）精製複合体の物理化学的特性 精製複合体の蛋白質部分は王に疎水性である。

従来記載されている複合体に比して、レムリ（Ｌａｅｍ
ｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ２２７　：　６８０〜６８５　）
の方法に従い、ポリアクリルアミＦ・ゲルの濃度Ｊ１％
（Ｗ／Ｖ、ｌの３＃厚ゲルおよびＰ）１８．３のトリス
−グリセリン緩衛液を洛出液として用いて行なった５１
）Ｓ−ＰＡＧＥ分析は該蛋白質の成分とみなされるただ
２つのポリペプチド、すなわち、４１０００ダルトン・
フラクションの主要成分（約□□□％ｗ／　Ｗ）および
２７０００ダルトン・フラクションの微少成分（約１ｏ
％ｗ　／　ｗ　）の存在を示す。

複合体中の総蛋白質含量は５４％である。

つぎの第１表の５ＤＳ−ＰＡＧＥにおける種々の濃度に
おいての分子量分布は蛋白質部分の著しい同質性を示し
ている。

第１表 該蛋白質は１分子当り１個のメチオニンを含み、メチオ
ニン部位のＣＮＢｒ法による開裂は、各々、約３０００
０およびｉ　ｏ　ｏ　ｏ−ｏダルトンの２つのフラグメ
ントを生じる。

実施例２ 実施例１の方法に従い、ただし、野性単離物の代りにイ
ーガニ／　（Ｅａｇａｎ　）株（Ｐ、ＡｎｄｅｒＳＯｎ
ｅｔ　ａｌ、　、、Ｊ、　にｆｉｎ、　　Ｉｎｖｅｓｔ
、５　ｌ　、　ｐ　３１〜３８゜１９７２）を用い、蛋
白含量６２％（ｗ／Ｗ）の、実施例１で得られた複合体
と同様な特性を示す精製複合体を得る。

実施例３ 実施例１の方法に従い、ただし、１．８Ｎ塩化カルシウ
ムの代りに０５４Ｎ塩化カルシウム、ＩＮ塩化カルシウ
ム、１．８Ｎ塩化マグネシウム、０．２Ｎ塩化ナトリウ
ムまたは１．８Ｎ塩化ナトリウムを用いる。

これらの条件において、各々、蛋白質含量３４．５５．
５８．２２オヨＵ　７０　％　（ｗ　／　ｗ　）　０）
　ｐ　ＲＲ’Ｐ−蛋白質複合体を得る。

実施例４ 莢膜を有するナイセリア・メニンフチジス８群２型から
の多糖類−蛋白質複合体の調製米国特許第３．６３６１
９２号の記載に従って、ナイセリア・メニンフチジス８
群２型の病原性単離物を静止期に到達するに適した条件
下、液体培地中で増殖させる。

全培養液の２１！部分に、臭化セトリモニウム０゜１％
（ｗ　／　ｖ　）を添加して不活化し、７０００Ｇで７
分間遠心分離する。不活化後、たまったペレットを一夜
−２０℃に保持し、ついで、４℃の１゜８Ｎ塩化カルシ
ウム４０−にとり、得られた懸濁液をよく均質化し、７
０００Ｇで７分間遠心分離する。沈澱物を捨て、激しく
攪拌しながら２５％（ｖ　／　ｖ　）エタノールを上澄
液に加える。エタノールの添加完了後、４℃でさらに１
時間振とつする。沈澱を分離し、上澄液を、塩化カルシ
ウムの水 最終濃度が０．４Ｎになるように稀釈し一氷浴中で△ 冷却する。

ついで、ヨウ化カリウム１．５Ｍ　（３，６６ｍ／）を
加え、４℃で１時間攪拌し、２００００Ｇで遠心分離す
る。１００００ダルトン・カット・オフ・カー）　ＩＪ
ッジ付ホロー限外濾過装置で最終容重５０ｒｎｌまで濃
縮し、４℃で水に対して透析する。

この溶液をセファロース４Ｂ−にＬカラム上で許過し、
０．４Ｎ塩化ナトリウムで溶出して非遅延フラクション
を水に対して透析し、５％（ｗ　／　ｖ〕の乳糖を補足
し、滅菌許過し、凍結乾燥して蛋白質含量６０％（ｗ　
／　ｗ）の複合体を得る。

実施例５ 莢膜を有するナイセリア・メニンジチジスＢ群１５型か
らの多糖類−蛋白質複合体の調製米国特許第３６３６１
９２に記載の方法に従って、ナイセリア・メニンジチジ
スＢ群１５型の病原性単離物を、静止期に到達するに適
した条件Ｆ、液体培地中で増殖させる。

全培養液の３１邪分に臭化セトリモニウム０１％（Ｗ／
Ｖ）を加えて不活化し、７ｏｏｏｃでｔｏ０分間遠心離
する。不活化後、ペレットを一２０℃に一夜保持し、４
℃の０．９Ｍ塩化カルシウム６０−にとり、得られた懸
濁液を充分に均質化する。激しく攪拌しながら懸濁液に
２５％（ｖ　／　ｖ〕エタノールを加える。エタノール
の添加完了後４℃でさらに１時間振とつする。沈澱をＪ
離し、上澄液を、塩化カルシウムの最終濃度が０．２Ｍ
になるように稀釈し、氷水浴中で冷却する。

ついで、ヨウ化カリウム１．５Ｍ（５，５ｍ／）を加え
、４℃で１時間攪拌し、２００００Ｇで遠心分離する。

上澄液をセファクリル５１０００（１’ｈａｒｍａｃｉ
ａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓの製造、販売する製
品〕カラムで沖過し、トロメタモール／塩化カルシウム
０．２Ｍ緩衝液（ＰＨ７）で溶出して非遅延フラクショ
ンを得−これを水に対して透析し、乳糖３１５％（Ｗ／
Ｖ）で補足する。滅菌濾過し、凍結乾燥して蛋白質含量
６０％（ｗ／ｗ　）の複合体を得る。

実施例６ １）　ＲＲ’　Ｐ−蛋白質複合体の免疫原特性へウサギ
におけるＰＲＲ’Ｐ−蛋白質複合体の免疫原性 ２才以下のヒト小児と同様に、該多糖類単独に対して抗
体反応を生じることのできないウサギに対して投与する
ことによりＰＲＲ’Ｐ−蛋白質複合体の免疫原性を評価
した。

この目的のため、ＰＲＲ’Ｐ−蛋白質複合体をｌｕｐ’
ｉ／Ｋｐの用量で６尾のウサギに第０日、第４日お詰び
第８８目に順次３回静脈内注射した。この複合体は前記
の方法を用いて得られたもので−その蛋白質含量は４５
％（ｗ／ｗ　）であった。

第２８日、第３２日および第３６日月に増強投与をした
。

各ウサギから定期的番こ採血し、５６℃で３０分間予備
不活化した血清の殺菌および抗ＰＲＲ’Ｐ血球凝集抗体
力価を測定した。

結果を第２表に示す。この結果は抗体反応のピーク（殺
菌抗体または抗ＰＲＲ’Ｐ抗体）は第１５０目近辺で発
現し、その後、抗体力価が速やかに低下することを示し
ている。複合体の増強投与は血球凝集抗体力価にのみ少
しの一時的増加を生じている。

第２表 ウサギにおけるＰＲＲ’Ｐ−蛋白質複合体の抗原性 対照として、同じ用量のＰＲＲ’Ｐ単独（米国特許第３
６３６１９２号において、イー・シー・ゴシュリ７　ヒ
（Ｅ、Ｃ，Ｇｏｔｓｃｈｌ　１ｃｈ）がナイセリアーメ
ニンジチジスのＡ群および６群多糖類について記載して
いる方法を用いて調製）を同様なスケジュールで２尾の
ウサギに投与し、採血し、抗体力価を測定したが、抗体
反応は全く検知されなかった。

蛋白質含量と複合体の免疫原性の相関関係を評価するた
め、１群３尾のウサギからなる５群に４日間隔でＰＲＲ
′Ｐ２．５μシ弯体重に対応する用量のＰＲＲ′Ｐ−蛋
白質複合体を３回静脈内投与したつ複合体の蛋白質濃度
は、各々、１１，３０，４８゜６９および８６％ＣＷ／
ＡＮ）であった。

第６群３尾のウサギを対照として同様なスケジュールで
用いた。ただし、対照群にはｐ　ＲＲ’　Ｐ　−蛋白質
複合体の代りに同用量のＰ　ＲＲ’　Ｐ　（２，５μｙ
）を投与した。

全てのウサギから同じ時間間隔で採血し、エリザ（Ｅｌ
ｉｓａ）法により抗ＰＲＲ／Ｐ抗体力画を評価した。結
果を第３表に示す。

第３表 ＰＲＲ′Ｐ−蛋白質複合体の免疫原性と蛋白質含量の相
関関係 第３表から、ＰＲＲ’Ｐ単独または蛋白質含量が３０％
より少ないＰＲ−Ｒ’Ｐ−蛋白質複合体の投与後では抗
ＰｋＬＲ／Ｐ抗体力価に少しの増加しか見られないこと
が明らかである。これに対して、４８千以上の蛋白質含
量の複合体は高い免疫原性を有し、蛋白質含量４８％と
８６％の複合体の間には免疫原性において何ら実質的な
差異が見られない。

該複合体に対する反応にどのような抗体が包含されるか
を明らかにするため、５尾のウサギに、第０日、第４日
および第８日日にＰＲＲ’Ｐ−蛋白質複合体（実施例１
の方法を用いて得られた蛋白質含量４５％（Ｗ／Ｗ）（
７）もの）を１０　ｔｔｆ／／Ｖ？体重の用量で順次３
回静脈内投与し、第４３日日および第４６日日に同用量
で静脈内増強投与して免疫付与した。ついで、抗Ｐ　Ｒ
Ｒ’　Ｐ抗体力価を０．１Ｍ２−メルカプトエタノール
（すなわち、ＩｇＭをそのモノマーに解離させ、ＩｇＧ
を損傷させずに保つとして知られる試薬）の存在下また
は非存在下に同時に種々の回数血球凝集反応を行なって
評価した。つぎの第４表に１尾のウサギから得られた結
果を示す。他のウサギの反応パターンも同様であり、主
として反応強度が異なる。

第４表 抗ＰＲＲ’Ｐ血球凝集抗体力価に及ぼす２−メルカプト
エタノール（２−ＭＥ）の影響 第４表の数値は、メルカプトエタノール処理後、血清の
血球凝集特性が消失しているので、最初の３回の注射後
に観察される血球凝集力価の大部分はＩｇＭによるもの
であることを示している。にもかかわらず、わずかに血
球凝集反応が残ることは第３８目から少量のＩｇＧが存
在していることを示している。

最後の注射後、メルカプト処理にも、非処理にも増強効
果が観察され、第２の一連の注射後、ＩｇＧおよびＩｇ
Ｍの両方が生成したことを示している。

−しかし、ＩｇＧ反応は最初の注射後よりも増強投与後
の方が大きい。

したがって、第４表の数値はＰ　ＲＲ’　Ｐ−蛋白質複
合体で免疫付与後に■（およびＩｇＭの両方が生成して
いることを示しており、ＰＩＬｆｌ、′Ｐ　−ｉ白質複
合体がチモ依存性（ｔｈｙｍｏｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　）
　　抗原であることを示唆している。

チモ依存性はＰＲＲ／Ｐ−蛋白質を第０日月および２週
後に静脈内投与して得られる反応パターンによって確認
される。

第０日および第１５日にＰＲＲ’Ｐ−蛋白質複合体（蛋
白質含量４５％Ｗ／Ｗ）３０μｙをウサギに静脈内投与
して得られる抗ＰＲＲ１Ｐ抗体力価（工リザ単位）を第
５表に示す。

第５表 ＰＲＲ′Ｐ−蛋白質複合体で免疫付与後の抗ＰＲ艮′Ｐ
抗体反応の挙動 Ｂ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるウサギ胛臓細胞の刺激（
リンパ芽球変態） ３尾のウサギにＰＲＲ／Ｐ−ｉ白質複合体（蛋白質含隈
４５％Ｗ／Ｗ）または該多糖類単独で免疫付与した（前
記のスケジュールに従って、第０日、第４日および第８
日にＰＲＲ’Ｐ−ｉ白質複合体またはＰＲＥＬ’Ｐ１０
μシ却体重を順次３回注射した）。ＰＲＲ’Ｐ−ｉ白質
複合体を注射したウサギの最高血清抗体力・価に相当す
る第１５白目に各ウサギの拌臓を摘出した。ついで、Ｒ
ＰＭＩ　１６４０培地（Ｇ、ＥｏＭｏｏｒｅ　ｅｔ　ａ
ｌ、、Ｊ、Ａ、Ｍ、Ａ、１９９　：　５１９〜５２４．
１９６７参照）を用い、Ｌ−グルタミ７２ｍ　Ｍ　、　
ヘニシリンｃ　１００１Ｕ／ｍ／、　　２−メルカプト
エタノール５．１０−５Ｍおよび正常なウサギ血清１０
％を補足し、１〜１００μグ／−の種々の濃度のＰ　Ｒ
Ｒ’、Ｐ−ｉ白質複合体または該多糖類単独の存在下、
眸臓細胞を５日間培養した（５％ＣＯ２を含有する湿潤
雰囲気下、３７°Ｃ１細胞密度３．１０６＃ｌ胞／−）
。培養終了時に培養物に１１−チミジン５μＣｉを加え
、細胞を回収し、１８時間後、自動採集機７７　シ（Ｍ
ａｓｈ）ＩＩ（ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉ
ｎｃ、、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭａｒｙｌａｎｄＵＳＡ
）を用いて洗浄した。

細胞にとりこまれた放射能をパラカード・トリカーブ（
Ｐａｃｋａｒｄ　Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ）液体シンチレーシ
ョン−カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ　Ｉｎｓ　ｔ　ｒ　
、Ｇｏ　、、　ＤｏｗｎｅｒｓＧｒｏｖｅ、ｌ１ｌｉｎ
ｏｉｓ、ＵＳＡ）で計数した。

結果を第６表に示す。

第６表はＰＲＲ’Ｐで免疫付与されたウサギの肺臓細胞
が該複合体にも、該多糖類にも応答しないことを示して
いる。このことは、該多糖類午独で免疫付与したウサギ
の血清において抗ＰＲＲ’Ｐ抗体のないことと一致する
。一方、高しベルノ３０−チミジンを伴なうＰＬＲ′Ｐ
−蛋白質複合体で免疫付与されたウサギの肺臓細胞はＰ
ＲＲ’Ｐ−ｉ白質の存在で高率の増殖を示す。増殖は抗
原濃度に相関する。ＰＲＲ′Ｐ−ｉ白質複合体の代りに
ＰＲＲ’Ｐ単独を加えても肺臓細胞は増殖しない。

この実験から、ＰＲＲ／Ｐ単独に対して、Ｐ　ＲＲ′Ｐ
−蛋白質複合体はそれで免疫付与されたウサギの肝臓に
おいて１群のＴ細胞増殖を誘導できると結論づけられる
。このＴ細胞群はｉｎ　ｖｉｔｒｏでＰＲＲ′Ｐ−ｉ白
質複合体によって刺激されることができるが、ＰＲＲ’
Ｐ単独では刺激されず、Ｔ細胞によって認識される決定
因子が該複合体の蛋白質部分に存在することを示唆して
いる。

また、リンパ芽球変態テストをＰＲＲ’Ｐ−蛋白質複合
体による免疫付与数ケ月後のウサギ肝臓中における記憶
の存在を調べるために用いた。

この目的のため、前記のスケジュールに従ってウサギを
ＰＲＲ’Ｐ複合体（蛋白質含量４５％Ｗ／Ｗ）で免疫付
与した（ＰＲＲ’Ｐ−蛋白質複合体１０μ７膚体重で順
次３回静脈注射、第４３〜４６白目に増強投与）。該増
強投与は抗ＰＲＲ’Ｐ抗体の速かな増加を誘導したが、
予期されたように、つぎの１５日間で力価は速かに低下
した。

最後の増強投与２０日後、抗体力価は５０日間に達した
力価の１／４以下になった。

結果を第７表に示す。

第７Ａ表 肝臓における記憶細胞の持続性：抗体反応の挙動 最初の免疫付与１００日・後、肝臓摘出時１こさらに抗
体力価の減少が実験的に示された。

肝臓から単離した細胞（６，１０５）　　を、自己熱不
活化ウサギ正常血清１０％で補足し、種々の濃度（１０
０μり／ｒｎＩまで）のＰＲＲ−′ＰまたはＰ　ＲＲ’
Ｐ−蛋白質複合体（蛋白質含量４５％Ｗ／Ｗ）を含有す
る良ＰＭ１１６４０培地を用い、５％ＣＯ２を含有する
湿潤雰囲気中、３７°Ｇで５日間培養した。第５８目、
細胞を５３Ｈ−チミジンｌμＣｉで１８時間照射し、細
胞の放射能を測定した。

結果を第７Ｂ表に示す。この結果は肝臓細胞がｐｇｇ′
ｐ−蛋白質複合体に応答して増殖するが、ＰＲＲ′Ｐ単
独には応答しないことを示している。

これから、３．５ケ月前に免疫付与され、最初の免疫付
与１．５ケ月後、血清に何らの抗体も検出されなかった
ときに増強投与したウサギの肝臓に記憶細胞（Ｔ細胞）
が残存していると結論される。

１００日目（前記に示したと同様）に摘出した肝臓細胞
の１ｎｖｉｔｒｏにおける第２の抗体反応発現能力をつ
ぎのとおり評価した。

丸底プラスチック試験管を用い、グルタミン２−ｎＭ１
メルカプトエタノール５．１０−５Ｍ、ベニシリアＧ　
１００１０／ｍ１．、ストレプトマイシン１０１００ａ
９７および熱不活化ウサギ正常血清１０％を補ｉした艮
ＰＭ１１６４０培地１−中、肝臓細胞を３．１０６細胞
／−の濃度で、５％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気中、３７°
Ｃで６日間培養した。抗原（ＰＲＲ′Ｐまたは複合体）
を２５μグ汐までの種々の濃度で培地に加えた。

６日後、遠心分離により細胞をｆＬＰＭＩ培地で洗浄し
て抗原を除き、抗原を含まない同様な培地中で１日、つ
いで、１０％ウシ胎児血清を補足した該培地でさらに１
日培養してウサギ血清蛋白を余去したつついで、細胞を
洗浄し、ウシ胎児血清を含有する該培地でさらに３日培
養した。培養終了時、細胞を沈澱させ、上澄液を集め、
ベルオキシターゼーラベル・ヤシ抗ウサギＩｇＧを用い
、工リプ法によって抗ＰＲＲ′Ｐ抗体を測定した。

結果を第７Ｃ表に示す。これらの結果は、明らかに、肝
臓細胞をＰＲＲ′Ｐ−蛋白質複合体と共に培養すると、
それらが１ｎｖｉｔｒｏで抗ＰＲＲ’Ｐ抗体を生成でき
ることを示している。この反応は用量依存性で、該多糖
類に対する反応では抗Ｐ　ＲＲ’　Ｐ抗体の生成は何ら
観察されない。

実施例７ ■、未成年における臨床テスト 未成年の男女（１５〜１６オ）８２人を１群４１人の２
群に分けた。

ワクチン投与前の血清を採取して抗体の測定を行ない、
第１群には実施例１で得られたＰＲＲＰ−蛋白質ワクチ
ンを皮下投与し、また、第２群にはＰＲＩＬ’Ｐワクチ
ンを皮下投与した。

用量は第１群にはＰＲＲ’Ｐ−蛋白質複合体２１μ７、
第２群にはＰＲＲ’Ｐ１３．７μｍで、最初の注射４週
間後、各群に増強投与を行なった。

テストは二重盲検条件下で行なった。

ＰＲＲ’Ｐ−蛋白質複合体ワクチンを投与した被験者で
は、最初の投与後、２人が軽い局所紅斑を、また、１人
が軽い頭痛を訴え、増強投与後、２人が軽い全身的およ
び局所的症状および１人が局所反応を訴えた。

ＰＲＲ’Ｐ・ワクチンを投与した被験者では、最初の投
与後、１人が軽い局所的および全身的反応を示し、増強
投与後、同じ被験者が軽い局所的痛みを示した。

エリザ法によって得られた血清学的結果は、ＰＲＲ′Ｐ
−蛋白質複合体ワクチン投与の被験者の７１％、また、
ＰＲＲ′Ｐワクチン投与の被験者の５０％において血清
転換の２倍以上の増加を示した、各々、７５％および６
３％の被験者において殺菌抗体の２倍の増加が観察され
た。

■ノ」・児における臨床テスト 男女の小児（６オ）７１人を、各々、３２人および３９
人の２群に分けた。

ワクチン投与前の血清を採取して抗体の測定を行ない、
第１群には実施例１で得られたＰＲＲ’Ｐ複合体ワクチ
ンを皮下投与し、第２群には同じ経路でＰＲＩＬ’Ｐワ
クチンを投与した。

用量単位は第１群に複合体１０μグ、第２群にＰＲＲ’
Ｐ５．３５μＫ、最初の注射４週間後に増強投与した。

テストは二重盲検条件下で行なった。

ＰＲＲ’Ｐ−蛋白質複合体ワクチンを投与した小児では
、最初の投与後、２人が軽い局所紅斑を訴え、増強投与
後、２人が軽い痛みを訴えた。

ＰＲＲ′Ｐワクチンを投与した小児では、最初の投与後
、１人が軽い痛み、１人が頭痛および１人が発熱し、増
強投与後、３人が軽い痛みを訴えた。

エリザ法によって得られた血清学的結果は、最初のＰＲ
Ｒ’Ｐ−ｉ白質複合体ワクチン注射後、６８．８％の小
児で、また、増強投与後６２５％の小児で、一方、ＰＲ
Ｒ′Ｐワクチン投与した小児では、各々、７１．８％お
よび７６．９％の小児で抗ＰＲＲ′Ｐ抗体力価の２倍以
上の増加を示した。

殺菌抗体については、各々、第１群で６６％および７５
％、第２群では７９％および８２％の結果であった。

１１１、ｆＬ児における臨床テスト 実施例１に従って得られたＰＲＲ’Ｐ−ｉ白質複合体ワ
クチンを前記のワクチン投与スケジュールに従って４人
の乳児（４〜８月令）に皮下経路で投与した。用量単位
は１人当り１３．５μ７であったっワクチンの投与前後
に、エリザ法によりｌｄ当り３２μｙの抗ＰＲＲ’Ｐ沈
降抗体を含有するヒトの標準品を用いて抗体力価（Ｉｇ
Ｇ％　ＩｇＡおよびＩｇＭ）を評価した。結果を第８表
に示す。この結果中、カッコ内の値は第１の投与後（ポ
スト−１）および増強投与後（ポスト−２）の増加倍数
を示す。

これらの値は、第１の投与後、２人の乳児のＩｇＧおよ
び１人の乳児のＩｇＡまたはＩｇＭに２倍の増加かある
ことを示している。増強投与後、４人の乳児のＩｇＧ、
２人の乳児のＩｇＡおよび１人の乳児のＩｇＭに２倍の
増加が見られる。

これらの結果から、本発明のＰＲＲ’Ｐ−蛋白質複合体
とＰＲＲ′Ｐワクチンは実質的に副作用なく成人および
小児に対して免疫付与するのに同等に有用であることが
わかる。さらに、ＰＲＲＰ−ｉ白質複合体ワクチンは若
年の乳児（１８ケ月以下）においても有効である。

実施例８ ナイセリア・メニンメロジス８群多糖類−蛋白質複合体
に対するウサギの抗体反応 実施例４で得られたナイセリア・メニングチジス８群２
型の多糖類−蛋白質複合体を複合体１０μに〜体重の用
量で第０日、第４日および第８日に３尾のウサ・ギに静
脈内注射した。対照として、第２群の３尾のウサギに同
じ経路で第０日、第４日および第８日１こナイセリア・
メニングチジメロ群多糖類２型（ＰＳＢ）を５μ７Ａ体
重の用量で注射した。両群のウサギから４日間隔で採血
し、エリザ法により順次血清中の抗ＰＳＢ抗体カ価を測
定した。該多糖類−蛋白質複合体を得た菌株（血清型抗
原２または５ＴＡ２を含有する菌株）または８群の菌株
ではあるが、血清型が異なる菌株（血清型抗原６または
５ＴＡ５）を用いて殺菌抗体を同じ血清で評価した。こ
の分析は抗ＰＳＢ殺菌抗体と他の特異抗体の識別を可能
にする。結果を第９表に示す。この結果は該多糖類幣独
ではなく、複合体が抗ＰＳＢ抗体反応を発現できること
を明らかにしている。抗体レベルは第８日〜第１２日で
最高となり、その後、ゆっくりと低下し、第１回の投与
′３θ日後には有意ではなくなる。また、殺菌抗体は複
合体の免疫付与によっても発現する、いくつかは５ＴＡ
２を有する菌株と共に、ＰＳＢしか持たない５ＴＡ５を
有する菌株に対しても殺菌性であり、抗ＰＳＢ抗体と同
様な挙動を示す。

これらの結果はウサギにおいて該複合体により誘発され
る抗ＰＳＢ抗体が殺菌性であることを示している。さら
に、第３０日において、Ｓ１’Ａ２を含む菌株に対する
殺菌抗体が有意な濃度で存在し、５ＴＡ６を含む菌株に
対してはそうでないことは、ある種の殺菌抗体が複合体
の蛋白質成分に対して向けられていることを示している
。

向けられているのか、他の体細胞抗原に向けられている
のかを検討するため、前記と同様に、実施例４の方法に
従って得られた蛋白質含酸７９％の多糖類−蛋白質複合
体で免疫付与されたウサギの血清を用い、種々の血清型
抗原を含有するナイセリア・メニンジチジスＢ群の数珠
に対する該血清中の殺菌抗体の含量をテストした。該複
合体の第１の投与２９日後に得られた血清はエリザ法で
示されるような抗ＰＳＢ抗体を含有しなかった。この血
清は複合体を調製した菌株（ＳＴＡ２含有ンおよび５Ｔ
Ａ２を含有するナイセリア・メニンジチジスＢ群または
０群の数種の菌株に対して殺菌性である。

しかし、該血清は他の血清型抗原（すなわち、５−ｒＡ
１＋４＋６＋８＋９．１１．１２および１４）を有する
細声を殺菌することはできなかった。　　　　・したか
って、血清型抗原２（ＳＴＡ２）が実施例４に記載した
複合体の蛋白質部分の少なくとも１つの成分であると結
論することができる。

第９表 ＰＳＢ−蛋白質複合体またはＰＳＢ単独で免疫付与した
ウサギにおける抗体反応 米：これらの値は３尾のウサギから得られた数値の幾何
平均（エリザ抗体）または算術平均（殺菌抗体）である
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）細菌を第４級アンモニウム塩の添加により不活化
   し、ついて、直ちに不溶性フラクションを集め、非毒性
   のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩の０．２〜
   ２Ｎ水浴液にとり、５〜４０％Ｖ／〜パの水相溶性アル
   コールの添加により汚染物質を沈澱させ、水溶性ヨウ化
   物、スルホシアン化物または安息香酸塩の添加により該
   第４級アンモニウム塩を除去し、沈澱物を分離して水溶
   液を得、これから所望の複合体を単離することを特徴と
   する水性培地中に懸濁した細菌からのリポ多糖類を含ま
   ない免疫原性の細菌莢膜多糖類−蛋白質非共有結合複合
   体の製造。 （２１Ｍ　細菌がへモフィルス・インフルエンザ（１−
   １ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎ［１ｕｅｎｚａｅＪ　ｂ
   型である前記第（１）項の製法。 （３）該細菌がナイセリア・メニンジチジス（Ｎｅｉｓ
   ｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）　Ｂ群である
   前記第（１）項の製法。 （４）該水性培地が全培養液である１ｒｉＩ記第（１）
   項〜第（３）項いずれか１つの製法。 （５１第４級アンモニウム塩が臭化セトリモニウムであ
   る前記第（１１項〜第（４）項いずれか１つの製法。 （６）非毒性の金属塩が塩化カルシウムであるａｉＩ記
   第（１）項〜第（５）項いずれか１つの製法。 （７）水相温性アルコールがエタノール２５％Ｖ／Ｖで
   ある前記第（１）項〜第（６）項いずれか１つの製法。 （８）水浴性ヨウ化物がアルカリ金属塩である前記第（
   １）項〜第（７）項いずれか１つの製法。 （９）該水溶液からの単離を限外沖過および凍結乾燥で
   行なう前記第（１）項〜第（８）項いずれか１つの製法
   。 （１０１多糖頬部分がポリリボシルリビトール・リン酸
   塩で、蛋白質部分に１分子当り１つのメチオニン残基を
   有し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド・
   ゲル電気泳動でテストすると、へ合体中に存在する蛋白
   質のポリペプチドの９０％φおよび１０％φに相当する
   ２つのスポットを示し、主要フラクションが疎水性で４
   １０００ダルトンの分−＋ｍを有し、複合体中の蛋白質
   の総量が複合体重量に基き、少なくとも３０％であるこ
   とを特徴とするヘモフィルス・インフルエンザｂ型のリ
   ポ多糖類を含まない免疫原性の細菌莢膜多糖類−蛋白質
   非共有複合体。 （１１）蛋白質含量が複合体に基き４０〜９０％ｗ／ｗ
   である前記第（］■項の複合体。 （１２１多糖類部分がポリリボシルリビトール・リン酸
   塩で、蛋白質部分に１分子当り１つのメチオニン残基を
   有し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド・
   ゲル電気泳動でテストすると、複合体中に存在する蛋白
   質のポリペプチドの９０％Ｗ　／　Ｗおよび１０％ｗ　
   ／　ｗに相当する２つのスポットを示し、主要フラクシ
   ョンが疎水性で４１０００ダルトンの分子量を有し、複
   合体中の蛋白質の総量が複合体重量に基き、少なくとも
   ３０％であるヘモフィルス舎インフルエンザｂ型のりポ
   多糖類を含まない免役原性の細菌莢膜多糖類−蛋白質非
   共有複合体の宵装置の凍結乾燥物と安定剤からなること
   を特徴とする髄膜炎ワクチン。 （１３１該複合体の蛋白質含量が複合体に基き４０〜９
   ０％Ｗ　／　Ｗである前記第（１２１項のワクチン。 （１１莢膜を有するナイセリア・メニングチジス８群細
   菌を第４級アンモニウム塩の添加により不活化し、つい
   で、直ちに不溶性フラクションを集め、非毒性のアルカ
   リ金属塩またはアルカリ土類金属塩の０．２〜２Ｎ水浴
   液にとり、５〜４０％ｖ　／　ｖの水相２性アルコール
   の添加により汚染物質を沈澱させ、水溶性ヨウ化物、ス
   ルホシアン化物または安息香酸塩の添加により該第４級
   アンモニウム塩を除去し、沈澱物を分離して水溶液を得
   、これから単離することにより得られるナイセリア・メ
   ニンジチジスＢ群のリポ多糖類を含まない免疫原性の莢
   膜多糖類二°蛋白質非共有複合体。 α５第４級アンモニウム塩が臭化セトリモニウムである
   前記第（１４１項の複合体。 叫非毒性金属塩が塩化カルシウムである前記第、Ｉ４１
   項または第０５）項の複合体。 ＋１７１水相浴性アルコールがエタノール２５％Ｖ／Ｖ
   である前記第圓項〜第（１Ｇ１項いずれか１つの複合体
   。 叩水溶性ヨウ化物がアルカリ金属塩である前記第圓項〜
   第ｑ７１項いずれか１っの複合体。 （１９１水浴液からの単離を限外許過および凍結乾燥で
   行なう前記第（１４１項〜第ｔ１８１項いずれか１つの
   複合体。 （２υ）莢膜を有するナイセリア・メニングチジス８群
   細菌を第４級アンモニウム塩の添加により不活化し、つ
   いで、直ちに不溶性フラクションを集め、非毒性のアル
   カリ金属塩またはアルカリ土類金属塩の０．２〜２へ水
   浴液にとり、５〜４ｏ％ｖ　／　ｖの水相溶性アルコー
   ルの添加により汚染物質を沈澱させ、水浴性ヨウ化物、
   スルホシアン化物または安息香酸塩の添加により該第４
   級アンモニウム塩を除去し、沈澱物を分離して水溶液を
   得、これから弔離することにより得られるナイセリア・
   メニンジチジスＢ群のリポ多糖類を含まない免疫原性の
   莢膜多糖類−蛋白質非共有複合体の有効用からなる髄膜
   炎ワクチン。