JPS5815921A - Preventing agent and remedy for lymphotoxin -sensitive disease - Google Patents

Abstract

PURPOSE:The titled pharmaceutical containing a pymphotoxin obtained by transplanting a cell derived from a man, having the ability to produce the lymphotoxin and cultivated into a strain to a warm-blooded animal other than the man, multiplying the cell, and reacting a lymphotoxin iunducer with the resultant cell. CONSTITUTION:A cell, having the ability to produce lymphotoxin and cultivated into a strain, and derived from a man is transplanted to a warm-blooded animal other than the man, e.g. an egg, embryo or fetus as juvenile as possible, of a bird such as domestic fowl or mammal such as a dog or cat, and multiplied while supplied with the body fluid of the warm-blooded animal to give a cell, which is then reacted with a lymphotoxin inducer and purified to afford a lymphotoxin. The resultant lymphotoxin is then subjected to the affinity chromatography with phytohemagglutinin- ''Sepharose '', etc. and purified to give the lymphotoxin easily and rapidly in high purity. A preventing agent and remedy for lymphotoxin-sensitive diseases very safe in side effects is obtained from the resultant lymphotoxin.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、リンホトキシンを含有するリンホトキシン感
受性疾患予防剤および治療剤に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a preventive and therapeutic agent for lymphotoxin-sensitive diseases containing lymphotoxin.

リンホトキシンは、青木隆−ほか共著「リンホカイン」
、新免疫学叢書６．１９７９年　医学書院、Ｂｌｏｏｍ
、Ｂ、Ｒ０＆Ｇｌａｄｅ、Ｐ、Ｒ０共編［Ｉｎ　ｖｉｔ
ｒｏ　ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎｃｅｌｌ　ｍｅｄｉａｔｅ
ｄ　ｉｒｒｍｕｎｉｔｙＪ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ、　１９７１年、などにも記載されているように、
例えば、感作されたリンパ細胞に抗原を作用させるか、
ミトーゲンとしてフィトヘマグルチニン、コンカナバリ
ンＡをはじめとするリンホトキシン誘導剤を細胞に作用
させることによって、その細胞内外（（誘導生成する蛋
白様物質であって、細胞障害機能を持つ物質に与えられ
た名称であり、特に腫瘍細胞に対して細胞障害機能を持
っていることは公知である。Lymphotoxin is a ``lymphokine'' co-authored by Takashi Aoki et al.
, New Immunology Series 6. 1979 Igaku Shoin, Bloom
, B, R0 & Glade, P, R0 co-editors [In vit
ro methods 1ncell mediate
dirrmunityJ Academic Pre
ss, 1971, etc.,
For example, by allowing antigens to act on sensitized lymph cells,
By acting on cells with lymphotoxin inducers such as phytohemagglutinin and concanavalin A as mitogens, it is possible to induce the formation of protein-like substances inside and outside the cells. It is known to have a cytotoxic function, especially against tumor cells.

リンホトキシンの持つこのような機能から、リンホトキ
シンはその発見の当初より悪性腫瘍治療剤として期待さ
れて来た。Because of these functions of lymphotoxin, lymphotoxin has been expected to be a therapeutic agent for malignant tumors since its discovery.

リンホトキシンは、ヒトをはじめ種々の動物のリンパ細
胞から調整されて来たが、ヒトの治療に供するには、ヒ
トの生細胞由来であることが、治療上に生ずる抗原性な
どの副作用面において極めて安全であり、優れている。Lymphotoxin has been prepared from lymph cells of various animals including humans, but in order to be used for human treatment, it is extremely important to derive it from living human cells in order to avoid side effects such as antigenicity that may occur during treatment. It's safe and good.

従来から、リンホトキシンの調製に使用されて来たヒト
の生細胞には白血球がある。しかしながら、白血球はヒ
トの新鮮面から分離して調整されるものであり、その保
存が困難であって、大量に安価に供給することは極めて
困難である。このような理由から、ヒトの治療に供し得
るリンホトキシンの製造は、未だ工業的規模で実施され
るまでに至っていない。Live human cells that have traditionally been used to prepare lymphotoxin include white blood cells. However, leukocytes are prepared by separating them from fresh human cells, making it difficult to preserve them and extremely difficult to supply them in large quantities at low cost. For these reasons, the production of lymphotoxin that can be used for human treatment has not yet been carried out on an industrial scale.

本発明者らは、工業的規模で容易て実施し得るリンホト
キシンの製造方法を検討し、そのリンホトキシンが悪性
腫瘍の治療剤として有用であるか否かを鋭意研究して来
た。The present inventors have investigated a method for producing lymphotoxin that can be easily carried out on an industrial scale, and have conducted intensive research to determine whether the lymphotoxin is useful as a therapeutic agent for malignant tumors.

その結果、培養株化されたヒト由来の細胞を生体外（ｉ
ｒ　ｖｉｔｒｏ　）の栄養培地て接種し、増殖させるの
ではなく、ヒト以外の温血動物体内に移植し、まだは、
拡散チャンバー内に接種してその動物体から栄養物を含
有する体液の供給を受けつつ増殖させ、得られる細胞に
生体内または生体外でリンホトキシン誘導剤を作用させ
ることによって、リンホトキシンが高活性で誘導生成さ
れ、これを精製分取することによってリンホトキシンが
多量容易に製造し得ることを見いだし、そのリンホトキ
シンが悪性腫瘍の治療剤として優れていることを確認し
て本発明を完成した。As a result, the cultured human-derived cells were grown in vitro (i.
Rather than inoculating and propagating in a nutrient medium (r vitro), the cells are transplanted into a warm-blooded animal other than humans, and
Lymphotoxin is induced with high activity by inoculating the cells in a diffusion chamber and growing them while receiving a supply of body fluids containing nutrients from the animal body, and then treating the resulting cells with a lymphotoxin inducer in vivo or in vitro. The inventors discovered that lymphotoxin can be easily produced in large quantities by purifying and fractionating the produced lymphotoxin, and confirmed that the lymphotoxin is an excellent therapeutic agent for malignant tumors, thereby completing the present invention.

本発明において使用されるリンホトキシンの製造方法は
、生細胞を生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）で増殖させる場合
とは違って、高価な血清などを含む栄養培地が不要また
は大幅に節約できるばかりでなく、細胞増殖中の維持管
理も極めて容易であり、その上誘導生成されるリンホト
キシン活性が高い特徴を有している。即ち、培養株化さ
れたヒト由来の細胞をヒト以外の温血動物体内に移植し
、あるいは、その動物の体液の供給を受けることのでき
る拡散チャンバー内に収容し、このチャンバーを動物体
内に埋設し通常の飼育をすれば、温血動物体から供給さ
れる栄養物を含有する体液を利用してその細胞が容易に
増殖しうるのである。更に生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）
で増殖させる場合と比較して、この細胞の増殖が安定し
ていること、その増殖速度が大きいこと、得られる細胞
量が多いこと、更には細胞当りのリンホトキシンの収量
が著増することも大きな特徴である。本発明で使用する
培養株化されたヒト由来の細胞は、ヒト以外の温血動物
体内（で移植して容易に増殖し得てしかもリンホトキシ
ン産生を有するものであればよく、例えば［Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ　Ｖｏｌ、　Ｉ　Ｊ　１１６〜１１７頁（１９７５
）に記載されているＮａｍａｌｖａ細胞、Ｉ　、Ｍｉｙ
ｏｓｈｉ著１’−Ｎａｔｕｒｅ　Ｖｏｌ、　２６７　Ｊ
　８４３〜８４４頁（１９７７年）に記載されているＢ
ＡＬＬ−１細胞、ＴＡＬＬ−１細胞、ＮＡＬＬ−１細胞
、［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｒｒｍｕｎｏｌ−ｏｇｙ
■ｏ１．１１３Ｊ　１３３４〜１３４５頁（１９７４年
）記載のＭ−７００２細胞、Ｂ　−７１０１細胞などが
自由に使用され、本明細書に記載する株化細胞のみに限
定されるものではない。これらの細胞は、後に述べるリ
ンホトキシンを誘導生成させるまでの過程で、単独で又
は２種以上を混合して自由に使用される。Unlike when living cells are grown in vitro, the method for producing lymphotoxin used in the present invention not only eliminates or significantly saves nutrient media containing expensive serum, but also improves cell growth. It is also extremely easy to maintain and manage, and is characterized by high lymphotoxin activity. That is, cultured human-derived cells are transplanted into the body of a warm-blooded animal other than humans, or they are housed in a diffusion chamber that can receive the animal's body fluids, and this chamber is buried within the animal body. However, with normal husbandry, the cells can easily proliferate using the nutrient-containing body fluids provided by the warm-blooded animal. Furthermore, in vitro
Compared to the case where cells are grown in the same way, the growth of these cells is stable, the growth rate is high, the amount of cells obtained is large, and the yield of lymphotoxin per cell is significantly increased. It is a characteristic. The cultured human-derived cells used in the present invention may be any cell that can be transplanted into the body of a warm-blooded animal other than humans and easily proliferate, and also has lymphotoxin production.
al of Cl1nical Microbiolo
gy Vol, I J pp. 116-117 (1975
), Namalva cells, I, Miy
oshi 1'-Nature Vol, 267 J
B described on pages 843-844 (1977)
ALL-1 cells, TALL-1 cells, NALL-1 cells, [Journal of Irrmunol-ogy
■ M-7002 cells, B-7101 cells, etc. described in o1.113J pages 1334-1345 (1974) can be used freely, and the cells are not limited to the established cell lines described herein. These cells can be freely used alone or in combination of two or more types in the process of inducing and producing lymphotoxin, which will be described later.

必要ならば、これに、例えばヒトの新鮮面から調整され
る白血球を使用することもできる。If desired, it is also possible to use, for example, freshly prepared human leukocytes.

本発明で餠用する温血動物は、ヒト由来の細胞が増殖し
得るものであればよく、例えばニワトリ、ハトなどの鳥
類、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウ
シ、モルモット、ラット、ハムスター、普通マウス、ヌ
ードマウスなどの補乳類が使用できる。The warm-blooded animal used in the present invention may be any animal in which human-derived cells can proliferate, such as birds such as chickens and pigeons, dogs, cats, monkeys, rabbits, goats, pigs, horses, cows, and guinea pigs. , rats, hamsters, regular mice, nude mice, and other supplementary mammals can be used.

これらの動物（（ヒト由来の細胞を移植すると好ましく
ない免疫反応を起すおそれがあるので、その反応をでき
るだけ抑えるだめ、使用する動物はできるだけ幼若な状
態、即ち卵、胚、胎児、または新生期、幼少期のものの
方が好ましい。Transplantation of human-derived cells may cause an unfavorable immune reaction, so in order to suppress this reaction as much as possible, the animals used should be kept as young as possible, i.e. eggs, embryos, fetuses, or newborns. , those from childhood are preferred.

まだ、これら動物１ｃ例えば２００〜６００レム程度の
エックス線若しくはガンマ線を照射するか、まだは抗血
清若しくは免疫抑制剤などを注射するなどの前処置をほ
どこして、免疫反応を弱めて移植してもよい。However, these animals may be transplanted by subjecting them to pretreatment such as irradiation with X-rays or gamma rays at a dose of about 200 to 600 rem, or by injecting antiserum or immunosuppressants to weaken the immune response. .

使用する動物がヌードマウスの場合には、成長したもの
であっても免疫反応が弱いので、これらの前処置を必要
とすることなく、培養株化されたヒト由来の細胞が移植
でき、急速に増殖できるので特に好都合である。When the animals used are nude mice, the immune response is weak even when they are grown, so cultured human-derived cells can be transplanted without the need for these pretreatments, and the cells can be rapidly grown. This is particularly advantageous since it can be propagated.

まだ、培養株化されたヒト由来の細胞を例えば先づハム
スターに移植し増殖させた後、この細胞を更にヌードマ
ウスに移植するなどのように、ヒト以外の温血動物間で
移植してヒト由来の細胞の増殖をより安定化したり、更
にそれらから誘導生成されるリンホトキシン量を増加さ
せることも自由である。However, it is still possible to transplant cultured human-derived cells into warm-blooded animals other than humans, such as first transplanting them into hamsters and growing them, then transplanting these cells into nude mice. It is also possible to further stabilize the proliferation of the derived cells or to increase the amount of lymphotoxin induced therefrom.

この場合、同種間、同属間は勿論のこと、同調間、同門
間移植であってもよい。ヒト由来の細胞を移植する動物
体内の部位は、移植した細胞が増殖しうる部位であれば
よく、例えば尿液腔、静脈、腹腔、皮下など自由だ選ば
れる。In this case, transplantation may be carried out not only between the same species and the same genus, but also among the same species and between the same phylum. The site within the animal body to which the human-derived cells are transplanted may be any site where the transplanted cells can proliferate, such as the allantoic cavity, vein, abdominal cavity, or subcutaneous region.

また、直接動物体内にヒト由来の細胞を移植することな
く、動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の濾過膜、例え
ば孔径約１０　〜１０−３ｍを有するメンブランフィル
タ−１限外濾過膜またはフォローファイバーなどを設け
た公知の各種形状、大きさの拡散チャンバーを動物体内
、例えば腹腔内に埋設して、動物体からの栄養物を含む
体液の供給を受けつつ、そのチャンバー内で前述の培養
株化されたヒト由来の細胞を何れも増殖させることがで
きる。In addition, porous filtration membranes that can block the passage of animal cells without directly transplanting human-derived cells into the animal body, such as Membrane Filter-1 ultrafiltration membranes with a pore diameter of approximately 10 to 10-3 m, or Diffusion chambers of various known shapes and sizes equipped with fibers, etc. are buried in the animal's body, for example, in the abdominal cavity, and the above-mentioned culture strain is grown in the chamber while receiving body fluids containing nutrients from the animal body. Any human-derived cells that have been transformed can be grown.

また必要に応じて、このチャンバー内の栄養物を含む溶
液を動物体内の体液と接続し、潅流させるようにしたチ
ャツバ−を、例えば動物体表に取付け、チャンバー内の
ヒト由来の細胞の増殖状態を透視できるようにすること
も、また、このチャンバ一部分のみを着脱交換できるよ
うにして動物を屠殺せずに寿命一杯細胞を増殖させて、
動物個体当りの細胞生産量を更に高めることもできる。In addition, if necessary, a chatter bar that connects and perfuses the solution containing nutrients in the chamber with body fluids inside the animal body is attached to the surface of the animal body, for example, to monitor the growth of human-derived cells in the chamber. It is also possible to make it possible to see through the animal, and to make it possible to remove and replace only a portion of this chamber, allowing the cells to proliferate to the fullest lifespan without having to sacrifice the animal.
It is also possible to further increase the amount of cells produced per animal.

これらの拡散チャンバーを利用する方法は、ヒト由来の
細胞が動物細胞と直接接触しないので、ヒト由来の細胞
のみが容易に採取できるだけでなく、好ましくない免疫
反応を起す心配も少ないので、免疫反応を抑制する前処
置の必要もなく、各種温血動物を自由に利用できる特徴
を有している。Methods using these diffusion chambers not only allow for easy collection of only human-derived cells since human-derived cells do not come into direct contact with animal cells, but also reduce the risk of unwanted immune reactions. There is no need for pre-treatment to inhibit the use of this method, and it has the advantage of being able to be used freely in a variety of warm-blooded animals.

移植した動物の維持管理は、その動物の通常の飼育管理
を続ければよく、移植後といえども特別の取扱いは何ら
必要としないので好都合である。The transplanted animal can be maintained and managed simply by continuing the normal care and management of the animal, and is convenient because no special handling is required even after transplantation.

ヒト由来の細胞を増殖させるだめの期間ｉｄ通常１〜１
０週の期間で目的を達成することができる。Period ID for growing human-derived cells: usually 1 to 1
You can achieve your goal in 0 weeks.

このようにして得ら゛れるヒト由来の細胞数は動物個体
当り約１０　〜１０　　個、またはそれ以上に達するこ
とも見出した。It has also been found that the number of human-derived cells obtained in this manner reaches about 10 to 10 or more per animal.

換言すれば、本発明で使用するリンホトキシンの製造方
法により増殖させたヒト由来細胞数は、動物個体当り移
植した細胞数の約１０　〜１０　　倍、またはそれμ上
にも達し、生体外の栄養培地に接種して増殖させる場合
の約１０　〜１０　　倍、またはそれ以上にも達して、
リンホトキシンの製造のために極めて好都合である。In other words, the number of human-derived cells proliferated by the method for producing lymphotoxin used in the present invention reaches about 10 to 10 times the number of cells transplanted per individual animal, or even more than that. This is approximately 10 to 10 times more than when inoculating and proliferating.
It is highly advantageous for the production of lymphotoxin.

このようにして増殖させたヒト由来の生細胞からリンホ
トキシンを誘導生成させる方法は自由である。それが増
殖した動物体内のままでリンホトキシン誘導剤を作用さ
せることもできる。例えば、腹腔内の腹水に浮遊状で増
殖したヒト由来の細胞に、または皮下に生じた腫瘍細胞
に、リンホトキシン誘導剤を直接作用させてリンホトキ
シンを誘導生成させ、次いでその腹水または腫瘍からリ
ンホトキシンを精製分取すればよい。Any method can be used to induce and produce lymphotoxin from human-derived living cells grown in this manner. The lymphotoxin-inducing agent can also be applied to the animal in which it has grown. For example, a lymphotoxin-inducing agent is directly applied to human-derived cells grown in suspension in ascites in the peritoneal cavity or tumor cells generated subcutaneously to induce the production of lymphotoxin, and then lymphotoxin is purified from the ascites or tumor. All you have to do is separate it.

また、ヒト由来の増殖細胞を動物体内から取り出し、生
体外でリンホトキシン誘導剤を作用させてリンホトキシ
ンを誘導生成させることもできる。Furthermore, human-derived proliferating cells can be removed from an animal body and lymphotoxin-inducing agents can be applied to the cells in vitro to induce lymphotoxin production.

例えば、腹水中で増殖したヒト由来の細胞を分取し、ま
たは皮下に生じたヒト由来の細胞を含む腫瘍を摘出、分
散し、得られる細胞を約２０〜４０℃に保った栄養培地
に細胞濃度が約１０　〜１０　／　ｍｌになるように浮
遊させ、これにリンホトキシン誘導剤を作用させること
によってリンホトキシンを誘導生成させ、これを精製分
取すればよい。For example, human-derived cells grown in ascites are collected, or tumors containing human-derived cells generated subcutaneously are excised and dispersed, and the resulting cells are placed in a nutrient medium maintained at approximately 20 to 40°C. It may be suspended to a concentration of about 10 to 10/ml, treated with a lymphotoxin inducer to induce lymphotoxin production, and then purified and fractionated.

更に、ヒト由来の細胞を拡散チャンバー内で増殖させた
場合は、増殖させた細胞をチャンノ（−内のままで、ま
たはチャンバーから取り出して、リンホトキシン誘導剤
を作用させ、リンホトキシンを誘導生成させることもで
きる。Furthermore, when human-derived cells are grown in a diffusion chamber, the grown cells can be left in the chamber or removed from the chamber and treated with a lymphotoxin-inducing agent to induce lymphotoxin production. can.

また、例えば増殖させたヒト由来の細胞に先づ動物体内
のままでリンホトキシンを誘導生成させた後、次いで同
一動物固体の特定の部位まだは全体から採取したヒト由
来の細胞に動物体外でリンホトキシンを誘導生成させる
方法、また一度リンホトキシンの誘導生成に使用した細
胞を更に２度以上リンホトキシンの誘導生成に使用する
方法、または動物体内に埋設、若しくは接続するチャン
バーを交換して得られる細胞数を増加させる方法などに
よって、使用する動物個体当りのリンホトキシン生成量
を更に高めることも自由である。For example, lymphotoxin is first induced to be produced in the animal's body in grown human-derived cells, and then lymphotoxin is injected outside the animal into human-derived cells collected from a specific part or the whole animal. A method of induced generation, a method of using cells once used for induced generation of lymphotoxin two or more times, or a method of increasing the number of cells obtained by replacing the chamber buried or connected in the animal body. It is also possible to further increase the amount of lymphotoxin produced per individual animal by changing the method or the like.

リンホトキシン誘導剤としては、通常、例えばフィトヘ
マグルチニン、コンカナバリンＡ、ポークウィードミト
ーゲン、リポポリサツカリド、エンドトキシン、多糖類
、細菌などのミトーゲンおよびウィルス、核酸などの一
種若しくは二種以上が用いられる。As the lymphotoxin inducer, one or more of phytohemagglutinin, concanavalin A, porkweed mitogen, lipopolysaccharide, endotoxin, polysaccharides, mitogens such as bacteria, viruses, and nucleic acids are usually used.

また、感作化された細胞にとりては抗原もリンホトキシ
／誘導剤である。Antigens are also lymphotoxic/inducing agents for sensitized cells.

このようにして誘導生成されたリンホトキシンは、公知
の精製分離法、例えば、塩析、透析、濾過、遠心分離、
濃縮、凍結乾燥などを行うことによって容易に精製分離
し、採取することができる。The lymphotoxin induced and produced in this way can be purified by known purification and separation methods such as salting out, dialysis, filtration, centrifugation,
It can be easily purified, separated, and collected by concentration, freeze-drying, etc.

更に高度の精製を必要とする場合ては例えばイオン交換
体への吸着−溶出、ゲル濾過および等電分画、電気泳動
などの公知の方法を組合せれば、最高純度のリンホトキ
シンを採取することも可能だが、フィトヘマグルチニン
ーセファロースヲ用いたアフィニティクロマトグラフィ
ーにより、高純度のリンホトキシンを極めて簡便かつ迅
速に製造できるので、非常に好都合である。この場合、
フィトヘマグルチニンはフィトヘマグルｆ＝ｙ−Ｐ。If a higher level of purification is required, the highest purity lymphotoxin can be obtained by combining known methods such as adsorption-elution to ion exchangers, gel filtration, isoelectric fractionation, and electrophoresis. Although it is possible, affinity chromatography using phytohemagglutinin-Sepharose is very convenient because highly purified lymphotoxin can be produced extremely easily and quickly. in this case,
Phytohemagglutinin is phytohemagglutin f=y-P.

フィトヘマグルチニン−Ｍ、フィトヘマグルチニン−Ｅ
などどんなフィトヘマグルチニンを用いても良い□ リンホトキシンは、その分子量から、７〜９万、３．５
〜５万、１〜２万の３種、すなわち、α、βおよびγ−
リ／ホトキシンが存在することが記載されている（Ｃｏ
ｈｅｎら編［Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌｙｍｐ
ｈｏｋｉｎｅｓｊＡｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１
９７９年）〕。リンホトキシンの活性は、Ｂｌｏｏｍ、
　Ｂ、Ｒ，＆Ｇ１ａｄｅ、　Ｐ、Ｒ，共編「Ｉｎ　ｖｉ
’ｔｒ。Phytohemagglutinin-M, phytohemagglutinin-E
Any phytohemagglutinin can be used, such as □ Lymphotoxin has a molecular weight of 70,000 to 90,000, 3.5
-50,000, 1-20,000 three types, namely α, β and γ-
It has been described that li/photoxin exists (Co
Edited by Hen et al. [Biology of the Lymp
hokinesj Academic Press (1
979)]. The activity of lymphotoxin is determined by Bloom,
B, R, & G1ade, P, R, co-editors “In vi
'tr.

ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　
ｉｔｒｍｕｎｉｔｙＪ　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ　
（１９７１年）に報告されているマウスＬ細胞を使用し
て、一定時間培養後の生残細胞数を測定する公知の方法
を用いた。methods in cell-mediated
itrmunityJ AcademicPress
(1971) using mouse L cells and a known method of measuring the number of surviving cells after culturing for a certain period of time.

本発明におけるリンホトキシン感受性疾患の予防剤、治
療剤の有効成分であるリンホトキシ／は、例えば次のよ
うな製造例により調製できる。Lymphotox, which is the active ingredient of the prophylactic and therapeutic agent for lymphotoxin-sensitive diseases in the present invention, can be prepared, for example, by the following production example.

成長したヌードマウスの皮下に、培養株化されたＢＡＬ
Ｌ−１細胞を移植した後、通常の方法で３週間飼育した
。皮下に生じた約１０ｇの腫瘍を摘出し細切した後、ト
リプシン含有の生理食塩水に懸濁して細胞を分散分取し
た。この細胞をヒト血清５　ｖ／ｖ　％含有するＰ）１
７．２のＥａｇｌｅの最小基本培地で洗浄し３７℃に保
った同じ組成の培地に細胞濃度が約５Ｘ１０／ｍＡ’に
なるよう希釈し、これにフィトヘマグルチニンを約２０
０μ９／ｍｌの割合で加えて２日間保ってリンホトキシ
ンを誘導生成せしめた。これを４℃、約１，０００　ｇ
で遠心分離し、沈澱物を除去し、得られた上清をＰＨ７
，２，０，０１Ｍ　ＩＪン酸塩緩衝液を含有する生理食
塩水で２１時間透析し、更に精密濾過して得た濾液を濃
縮し、凍結乾燥してリンホトキシン活性を含有する粉末
を得た。得られた、粉末をＧ、Ｂｏｄｏの報告（Ｓｙｍ
ｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ。BAL cultured under the skin of adult nude mice
After transplanting the L-1 cells, they were raised in the usual manner for 3 weeks. Approximately 10 g of tumor that had occurred under the skin was excised and cut into small pieces, and then suspended in trypsin-containing physiological saline to disperse and separate the cells. P)1 containing these cells at 5% v/v of human serum.
Cells were washed with Eagle's minimal basal medium in 7.2 and diluted to a medium with the same composition kept at 37°C to a concentration of approximately 5 x 10/mA', and phytohemagglutinin was added to this at approximately 20°C.
It was added at a rate of 0 μ9/ml and kept for 2 days to induce lymphotoxin production. About 1,000 g of this at 4℃
The precipitate was removed, and the resulting supernatant was adjusted to pH 7.
, 2,0,01M IJ phosphate buffer solution for 21 hours, followed by microfiltration, the resulting filtrate was concentrated and lyophilized to obtain a powder containing lymphotoxin activity. The resulting powder was reported by G. Bodo (Sym
posium on preparation.

５ｔａｎｄａｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｌｉｎｉｃ
ａｌ　ｕｓｅ　ｏｆ　１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ。5Tandarization and clinic
al use of 1nterferon.

１１ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｒｒｍｕｎ
ｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ８＆９　
Ｊ　ｕｎｅ　１９７７　、　Ｚａｇｒｅｂ、　Ｙｕｇｏ
ｓｌａｖｉａ　）に準じティオン交換への吸脱着、ゲル
濾過による分子量分画、濃縮および精密濾過などの手段
によりインターフェロンを除去し、更に硫安塩析、フィ
トヘマグルチニン−セファロースアフィニティークロマ
トグラフィーにより精製し、高純度リンホトキシンを得
た。11th International Irrmun
obiological Symposium8&9
June 1977, Zagreb, Yugo
Interferon was removed by means such as adsorption and desorption on ion exchange, molecular weight fractionation by gel filtration, concentration, and microfiltration in accordance with the method of slavia), and further purified by ammonium sulfate salting out and phytohemagglutinin-Sepharose affinity chromatography to obtain high-purity lymphotoxin. I got it.

このようにして得られたリンホトキシンは、比活性３０
，０００単位／ｆｎ９であツタ。The lymphotoxin thus obtained has a specific activity of 30
,000 units/fn9 ivy.

更に、ゲル濾過法により分子量分画したところ、α−リ
ンホトキシン（分子量７〜９万）、β−リンホトキシン
（分子量３．５〜５万）、およびγ−リンホトキシン（
分子量１〜２万）の３種類が、活性量比的１：１：２の
割合で分取された。Furthermore, molecular weight fractionation by gel filtration revealed α-lymphotoxin (molecular weight 70,000 to 90,000), β-lymphotoxin (molecular weight 35,000 to 50,000), and γ-lymphotoxin (molecular weight 35,000 to 50,000).
Three types with a molecular weight of 10,000 to 20,000) were fractionated at a ratio of 1:1:2 in terms of their active amounts.

以下、本発明の主成分であるリンホトキシンの有効性、
毒性、用法および用量について説明する。Below, the effectiveness of lymphotoxin, which is the main component of the present invention,
Describe toxicity, usage, and dosage.

実験例　Ｉ ＢＡＬＢ／Ｃ由来ヌードマウスに人乳癌組織片を背部皮
下に移植する。腫瘍体積が約２００ｉ＋ｊの時期から前
述の製造例で得られだα−２β−９γ−リンホトキシン
混合品（以下、単にリンホトキシンと称する。）を４お
よび４０単位／に９．１日２回に分けて靜注し、１５日
目処マウスを殺し、腫瘍重量を測定した。その結果を第
１表に示した。なお、対照はリンホトキシン無含有生理
食塩水を静注した。Experimental Example I A piece of human breast cancer tissue is subcutaneously transplanted into the back of a BALB/C-derived nude mouse. From the time when the tumor volume was about 200i+j, the α-2β-9γ-lymphotoxin mixture (hereinafter simply referred to as lymphotoxin) obtained in the above production example was divided into 4 and 40 units/dose twice a day. The mice were sacrificed on the 15th day and the tumor weight was measured. The results are shown in Table 1. As a control, lymphotoxin-free physiological saline was intravenously injected.

※　危険率５チ以下で対照の値に比し、推計学的に有意
差あり。*There is a statistically significant difference compared to the control value when the risk rate is 5 or less.

実験例　２ 体重２５ｇ前後のＢＤＦ１雄マウスを１群１０匹とし、
２ｘｎ角に切断したルイス肺癌を背部皮下に移植した。Experimental Example 2 A group of 10 BDF1 male mice weighing around 25 g,
A Lewis lung cancer cut into 2xn squares was subcutaneously transplanted into the back.

移植後８日目から前述の製造例で得られたリンホトキシ
ンおよびγ−リンホトキシンをそれぞれ４および４０単
位／ｋｇ、、１日２回に分けて連日静注し、２１１日目
マウスを殺して腫瘍重量を測定した。From the 8th day after transplantation, lymphotoxin and γ-lymphotoxin obtained in the above-mentioned production example were intravenously injected twice a day at 4 and 40 units/kg, respectively, and on the 211th day, the mice were killed and the tumor weight was determined. was measured.

その結果を第２表に示した。カお、対照はりンホトキシ
ン無含有生理食塩水を静注した。The results are shown in Table 2. As a control, lymphotoxin-free physiological saline was intravenously injected.

※　危険率５チ以下で対照の値に比し、推計学的に有意
差あり。*There is a statistically significant difference compared to the control value when the risk rate is 5 or less.

実験例　３　　急性毒性□ 生後即日のマウスを使用して、前述の製造例で得られた
リンホトキシンの急性毒性試験をしたところ、本リンホ
トキシンの毒性は極めて低く、腹腔内に注射した時のＬ
Ｄ６０は１０，０００単位／に９以上であることが判明
した。Experimental Example 3 Acute Toxicity □ An acute toxicity test of the lymphotoxin obtained in the above production example was conducted using mice the same day after birth, and the toxicity of this lymphotoxin was extremely low, with L
D60 was found to be greater than 9 in 10,000 units/.

以上の実験からも明らかなように、本発明のり゛ンホ）
４シンは、その有効用量からも極めて安全であシ、リン
ホトキシン感受性疾患に用いることができる。リンホト
キシン感受性疾患とは、リンホトキシンによって予防さ
れ、若しくは治療される疾患であり、例えば乳癌、肺癌
、肝癌、膀胱癌、子宮癌、胃癌、大腸癌、白血病、リン
パ腫、皮膚癌などの悪性腫瘍であってもよい。As is clear from the above experiments, the resin of the present invention)
4-syn is extremely safe due to its effective dose and can be used for lymphotoxin-sensitive diseases. Lymphotoxin-sensitive diseases are diseases that are prevented or treated by lymphotoxin, such as malignant tumors such as breast cancer, lung cancer, liver cancer, bladder cancer, uterine cancer, stomach cancer, colorectal cancer, leukemia, lymphoma, and skin cancer. Good too.

更には、悪性腫瘍に適用するにあたっては、例えば患者
の腫瘍の一部を取り、本発明のリンホトキシンと生体外
で処理することによって腫瘍の免疫原性を高めた後、腫
瘍患者の体内に戻すことにより、この悪性腫瘍の治療を
行うこともできる。Furthermore, when applied to malignant tumors, for example, a part of a patient's tumor is taken, treated with the lymphotoxin of the present invention in vitro to increase the immunogenicity of the tumor, and then returned to the tumor patient's body. This malignant tumor can also be treated.

本発明のリンホトキシンの成人１日当りの用量は５〜５
００，０００単位であり、好ましくは局所注射および点
眼などの局所適用用量は５〜１，０００単位、軟膏の場
合１０〜１，０００単位、静注および筋注など全身注射
の場合刃〜２，０００２，０００単与の場合５００〜５
００，０００単位であるが用法あるいは症状に応じて適
宜増減することができる。必要に応じて任意、慣用の製
薬用担体、基剤あるいは賦形剤とともに慣用の方法で医
薬用製剤に調製することができる。The daily dose for adults of the lymphotoxin of the present invention is 5 to 5
00,000 units, preferably 5 to 1,000 units for local applications such as local injections and eye drops, 10 to 1,000 units for ointments, and ~2,000 units for systemic injections such as intravenous and intramuscular injections. 500 to 5 in case of 0002,000 units
The dosage is 00,000 units, but it can be increased or decreased as appropriate depending on the usage or symptoms. If necessary, it can be prepared into a pharmaceutical preparation by a conventional method together with any conventional pharmaceutical carrier, base, or excipient.

本発明のリンホトキシンを含有するリンホトキシン感受
性疾患予防剤、若しくは治療剤は、その目的１ｃ応じて
その形状を自由【選択できる。The form of the lymphotoxin-containing preventive or therapeutic agent for lymphotoxin-sensitive diseases of the present invention can be freely selected depending on its purpose.

経口投与剤としてはカプセル剤、錠剤、散剤などの腸溶
製剤、直腸内投与剤としては直腸半開、注射剤としては
、例えば用量に注射用蒸溜水に溶解して使用する凍結乾
燥注射剤、その他点鼻もしくは点眼、軟膏剤として用り
ることもできる。Oral preparations include enteric preparations such as capsules, tablets, and powders; intrarectal preparations include semirectal preparations; injections include, for example, freeze-dried injections that are dissolved in distilled water for injection, and others. It can also be used as nasal or eye drops, or as an ointment.

以下に製剤の実施例を示すが、製剤はこれのみに限定さ
れるものではない。Examples of formulations are shown below, but the formulations are not limited thereto.

実施例　１　　注　射　剤 前述の製造例で調整したリンホトキシン２０，０００単
位を２００罰の生理食塩水に溶解し、メンブランフィル
タ−を用いて無菌的に濾過する。濾液を滅菌したガラス
容器に２ＷＬｌずつ充填して凍結乾燥し、これを密栓し
て、凍結乾燥粉末製剤とする。Example 1 Injection 20,000 units of lymphotoxin prepared in the above production example is dissolved in 200% physiological saline and aseptically filtered using a membrane filter. The filtrate is filled into a sterilized glass container in an amount of 2WLl and freeze-dried, and the container is sealed tightly to obtain a freeze-dried powder preparation.

本市は、乳癌、肺癌、肝癌、白血病などの治療に好適で
ある。This product is suitable for treating breast cancer, lung cancer, liver cancer, leukemia, etc.

実施例　２　　軟　膏　剤 前述の製造例で調製したリンホトキシンを常法に従い少
量の流動パラフィンに研和した後、ワセリンを加え関単
位／ｇの軟膏薬とした。Example 2 Ointment After the lymphotoxin prepared in the above production example was dissolved in a small amount of liquid paraffin according to a conventional method, vaseline was added to prepare an ointment with a concentration of functional units/g.

本品は、皮膚癌、乳癌、リンパ腫などの治療に好適であ
る。This product is suitable for treating skin cancer, breast cancer, lymphoma, etc.

実施例　３　　点　眼　剤 蒸溜水８００ｒｎｌトβ−フェニルエチルアルコール５
　ｍｌと前述の製造例で調製したリンホトキシンを４０
，０００単位とに等張化するよう食塩を加え蒸溜水で１
．０００７ｎｌとし点眼剤とした。Example 3 Eye drops Distilled water 800rnl β-phenylethyl alcohol 5
ml and lymphotoxin prepared in the above production example.
,000 units, and add salt to make it isotonic and dilute with distilled water.
．． 0007nl and used as eye drops.

本品は、網膜芽細胞腫などの治療に好適である。This product is suitable for the treatment of retinoblastoma, etc.

実施例　４　　腸溶性錠剤 前述の製造例で調製したγ−リンホトキシンを常法に雪
って澱粉とマルトースとを混合使用して打錠するｒ際し
、リンホトキシンを製品１錠゛（１００ｍ９）当り２，
０００単位になるよ５うに含有せしめて錠剤を製造し、
これにメチルセルロースフタレートをコーティングして
腸溶性錠剤としだ。Example 4 Enteric-coated tablet When compressing the γ-lymphotoxin prepared in the above production example into tablets using a mixture of starch and maltose in a conventional manner, the amount of lymphotoxin was 2 times per tablet (100 m9) of the product. ，
Producing tablets by containing 5,000 units,
This is coated with methylcellulose phthalate to form enteric-coated tablets.

本品は、大腸癌、結腸癌、肝癌などの治療に好適である
。This product is suitable for the treatment of colorectal cancer, colon cancer, liver cancer, etc.

昭和５６輸１１・６月３日 特許庁長官　島　１）春　樹　殿 Ｌ　事件の表示 昭和５６年特許願第１１２９１４号 ２、　発明の名称 リンホトキシン感受性疾患の予防剤および治療剤ａ　補
正をする者 事件との関係　　特許出願人 代表者　　持　１）　　　英 （ほか１名） 生代理人 東京都港区新橋６丁目５番４号 ＤＩＫマンンメン新橋　２１９号 弁理士（７９７１）桜　井　　　守 五　補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の項 Ｇ　補正の内容 （１）明細書第５頁第９〜１ｏ行記載Ｏｒ　Ｂ−７１０
１細胞などが自由に使用され、」を、次文のように補正
します。June 3, 1982, Commissioner of the Japan Patent Office Shima 1) Haruki Tono L Case indication 1982 Patent Application No. 112914 2 Title of invention Prophylactic and therapeutic agents for lymphotoxin-sensitive diseases a Case made by person making an amendment Relationship with Patent applicant representative: Mochi 1) Eiji (and 1 other person) Living agent: DIK Manmen Shinbashi 219, 6-5-4 Shinbashi, Minato-ku, Tokyo Patent attorney (7971) Morigo Sakurai Specification subject to amendment Section G of “Detailed Description of the Invention” Contents of Amendment (1) Statement in lines 9 to 1o on page 5 of the specification Or B-710
1 cell etc. can be used freely,'' should be corrected as in the following sentence.

ｒ　Ｂ　−７１０１細胞などのほか、マクロファージ繊
維芽細胞なども自由に使用され、また、これら細胞のリ
ンホトキシン産生能を持つ遺伝子を、例えばポリエチレ
ングリコール、センダイウィルスなどを利用する細胞融
合の手段や、ＤＮＡリガーゼ、制限酵素（ヌクレアーゼ
）、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素を利用する遺伝子組
み換えの手段などによって、より容易に継代培養しうる
培養株化されたリンパ芽様細胞などに導入し、その増殖
速度を高めたシ、細胞当シのリンホトキシン産生能を高
めたりして使用してもよく、」 （２）　　明細書第１１頁第１４行記載の「よって容易
に精製分離し、」を「よって、同時に誘導生成されたイ
ンターフェロンなどと容易に精製分離し、」に補正しま
す。In addition to rB-7101 cells, macrophage fibroblasts and the like can be freely used, and the gene with lymphotoxin-producing ability of these cells can be transferred to cell fusion methods using polyethylene glycol, Sendai virus, etc., or DNA. By introducing genetic recombination methods using enzymes such as ligase, restriction enzymes (nucleases), and DNA polymerases into cultured lymphoblast-like cells that can be more easily subcultured, the proliferation rate is increased. (2) "Therefore, it can be easily purified and separated," as described in page 11, line 14 of the specification, can be replaced with "therefore, it can be simultaneously induced." It is easily purified and separated from generated interferon, etc., and corrected.

（３）　　同頁第１６〜１７行記載の「等電分画、」を
「等電点分画、」に補正します。(3) Correct "Isoelectric fraction," written in lines 16-17 of the same page, to "Isoelectric point fraction."

（４）明細書第１４頁第１２行記載の「主成分」を「有
効成分」に補正します４、(4) “Main ingredient” written in line 12 of page 14 of the specification will be amended to “active ingredient”4.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] リンホトキシン産生能を有する培養株化されたヒト由来
の細胞を、ヒト以外の温血動物体内知移植し、その温血
動物の体液の供給を受けながら増殖させて得られる細胞
に、生体内または生体外でリンホトキシン誘導剤を作用
させて生成せしめたリンホトキシンを更に精製分取し−
で得たリンホトキシンを含有するリンホトキシン感受性
疾患の予防剤および治療剤。Cultured human-derived cells with lymphotoxin-producing ability are transplanted into a warm-blooded animal other than humans, and the resulting cells are grown while being supplied with body fluids from the warm-blooded animal. The lymphotoxin produced by the action of a lymphotoxin inducer outside is further purified and fractionated.
A prophylactic and therapeutic agent for lymphotoxin-sensitive diseases containing lymphotoxin obtained in .