JPS58134998A - ２７−デスアミドセクレチンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）発明の背景 接衝分野 本発明は、ｒ−デスアさド竜りレチン（以下、ｒ２Ｆ−
Ｊｔ省略することがある）の製造に調する。

さらに具体的には、本発明は、化学的に合成したデスア
ミドセクレチンの構造遺伝子を使用する遺伝子工学的方
法によってデスアミドセクレチンを製造する方法に関す
る。

消化管ホルモンの一つとしてセクレチンは公知の化合物
で′あり、従来より膵臓からの水および重炭酸塩の分秘
促進衿用等の生理活性が知られていて、実際にも膵臓機
能検査あるいは十二指腸潰瘍治療剤として用いられてい
る。

セクレチンは、下記の構造を有する４リペプチドである
。

Ｈｌｓ−８＠ｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈ＊−Ｔ
ｂｒ−８＠ｒ−Ｇ１ｔ＋−Ｌｅｕ−８＠ｒ−Ａｒｇ−Ｌ
ｅｕ−Ａｒｇ−ＡｒＶ−８＠’ｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌ
ｅｕ−ＧＩＶ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＧＩ
Ｗ−Ｌｅｕ−Ｖａ”ｌ’−Ｎ１３こり、セクレチンを得
るには、天然セクレチン（通常はブタセクレチンである
が、ツタセクレチンのアミノ酸配列もツタセクレチンの
それと同一であることが判っている）の抽出１）および
化学合成２）等の方法が実施されてきた。しかし、これ
らの方法は、入・ずれもコスト、迅速性、生産量等の点
で問題があった。また、従来のブタ小腸からセクレチン
を抽出精製する方法では、混在する数多くの消化管ホル
モン（モチリン、ＶＩＰ　、　ＣＣＫ−ＰＺ　。

ＧＩＰ　、　ａＬＸなど）がセクレチンの正確な生物検
定あるいはラジオイムノアッセイの障害となるという困
難さを伴った。

ところで、最近の合成遺伝子を用いた所謂遺伝子工学技
術の発展はめざましく、各種の生理活性ポリペブチｒが
この技術によって製造可能となりつつある。従って、セ
クレチンが遺伝子工学的に製造できれば、前記の従来の
製造法に認められる問題点に解決が与えられることにな
ろう。

しかし、合成遺伝子を用いる遺伝子工学的方法によるＩ
リペプチドの製造は、構造遺伝子の化学的合成、この遺
伝子の適当プラスミドへの組込み、生成中メラプラスミ
ドによる適当宿主の形質転換、および形質転換体の培養
による目的４リペプチドの産生および回収と（・う工程
により一般に可能であるということは明らかＫされてい
るけれども、あるぼりペプチドが所期の生理活性を持つ
ものとしてこの方法で製造されるか否かＫついては、こ
れを確実に事前に知ることは必ずしも可能ではない。

セクレチンの場合のこの問題についていえば、セクレチ
ンＩリペプチドのＣ末端は上記の通り）々リンのアミド
であるところ、このＩリペプチド倉我現する構造遺伝子
ＤＮＡの末端はバリンに対応するコードンにならざるを
得す、従って産生される４リペプチドはＣ末端がノ々リ
ンであると潟えもれるところより、得られるＩリペプチ
ドがセクレチンの持つ生理活性を示すか否かに関しては
疑念が持たれるところである。

そこで本発明者らは、特願昭５６−８４６０３号および
特願昭５６−８４６０４号によって、Ｃ末端がアミｒ形
でないバリンからなるセクレチン誘導体、すなわちデス
アミドセクレチン、を表現する構造遺伝子が化学合成可
能であること、この遺伝子が適当プラスミドに組込み可
能であること、このキメラプラスミドによる適当宿主細
胞の形質転換および形質転換体の培養によるデスアミド
セクレチンの衆生および回収が可能であること、ならび
に生成デスアミドセクレチンがセクレチンと同様の活性
を有すること、を確認した。

〔璽〕発明の概要 要旨 本発明は、前記した先の発明の技術的範囲に属し、その
改良に係わるものである。即ち、本発明は、デスアミド
セクレチンを製造するにあたり、ラクトースオペロンの
発現系を利用できること、ならびＫこの発現系を利用す
ることによってデスアミドセクレチンの産生重管大幅に
増加させ得ることを確認してなされたものである。

したかつ【、本発明によるｎ−デスアミドセクレチンの
製造法は、下記の工程からなることｔ％黴とするもので
ある。

（１）セクレチンのＣ末端のアミノ酸がバリンであるポ
リペブチＰに相当するデスアミドセクレチンの構造遺伝
子を化学的に合成すること。

（２）ラクトースオペロンの発現系を利用でき、かつ予
定した宿主細胞内で増殖可能なプラスζドを用意するこ
と。

（３）　　このプラスミＰＫ構造遺伝子を組み込んで、
この宿主細胞内で増殖可能なキメラプラスミドをつくる
こと。

（４）このプラスンＰＫよって、宿主細胞を形質転換さ
せること。

（５）得られる形質転換体を培養し、産生されたデスア
ミドセクレチンを回収すること。

上記のような形質転換法において使用する宿主細胞の代
表的なものは＆ｈ・ｒｉｅｈｉａ属に属する大腸菌であ
り、ラクトースオペロンの発現系は大腸菌由来のもので
ある。

したがって、本発明によるγ−デスアミドセクレチンの
製造法は、デスアンドセクレチン構造遺伝子を含むシラ
スミドを組み込んだデスアミドセクレチン生産ＩＮを培
養し、ラクトースオペロンの発現系を利用して産生され
るデスアミドセクレチンを回収することからなるもので
ある。

また、別の観点からすれば本発明は、セクレチンのＣ末
端のアミノ酸がバリンであるポリペブチチンの構造遺伝
子を組み込んだ、ラクトースオペエシェリヒア　コリ（
脂−ｍｄｄａ　ａｏｌｉ　）を提供するものである。

効果 天然セクレチンの抽出の場合Ｋｇめられた抽出および精
製の際の問題は、本発明による遺伝子組換体の抽出物上
出発原料とした場合はこれｔ回避することができる。

また、本発明による方法によれば、ペプチドを構成する
アミノ酸の１種または数種會変化させることが可能であ
り、それによりペプチド本ルモンの構造活性相関を研究
することができる。これは、とりもなおさず、生理活性
ペプチドの任意のアンノ酸置換誘導体を容易に得る方法
をも提供することを意味する。化学合成による高分子の
Ｉリペプチドの誘導体生成は現時点で利用できる方法で
は極めて困難であることを考えると、遺伝子操作による
ＩリペプテｙｌＩ導体生成は最良の方法といえよう。

さらに１本発明で用いた宿主−ベクター系によれば、宿
主１＃胞あたり約３Ｘ１０’分子相当の七りレチン活性
を有するデスアミドセクレチｙｔ産住させることが可能
となり、これはとりも直さず実用に供し得る産生率と言
うことができる。また、稜記に述べる融合タンパクとし
ては２．８５　ＸＩＯ’分子／細胞の収量があり、これ
はゾロテアーゼなどの破壊的（分解）作用のない細菌内
で本発明によるキメ２プラスばドを用いて形質発現させ
ればデスアミドセクレチフ分子の高収量生産が可能とな
ること全示唆するものである。

なお、Ｃ−末端がアミド形となっている一すペゾチドは
セクレチン以外にも存在するが、本発明はこれらのよう
な他のダリペプチドのデスアミド誘導体の製造およびそ
の生理活性の発現に対して示唆を与えるものである。

〔璽〕発明の詳細な説明 １、デスアミドセクレチン 本発明による苔−デスアミドセクレチンは、下記のアミ
ノ酸配列式（１）で示されるぼりペプチドである。

ＨＩ　Ｉ−８＠　ｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈ＠
−Ｔｈｒ−８＠ｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−８＠ｒ−Ａｒｇ−
Ｌ＠ｔｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−８＠ｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
Ｌ＠ｔ＋−Ｇｌｍ−Ａｒｇ−Ｌ＠ｔｓ−Ｌ＠ｕ−Ｇｉｎ
−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｔ−ＯＨ（１）式（，１）中の
Ｈｌｓ等は、いうまでもなく、ヒスチジン等のアミノ酸
を示す。当業界で承認されている記号である。

この４リベプチドは、Ｃ末端のバリンがアミド形（Ｖａ
ｌ　−ＮＨ２）ではなくてカル−キシル形（Ｍａｌ−Ｏ
Ｈ）　　であるという点で、セクレチンぽリペプチドと
相異している。

デスアミドセクレチンは、セクレチ／と同様の生理活性
、たとえば静脈注射による膵液分泌便進、を有するから
、それ自身でセクレチン様生理活性Ｉリペプチドとして
使用することができる。一方、デスアミドセクレチンは
、Ｃ末端のカル−キシル部分をアミｒ化して、セクレチ
ンに転換させて利用することもできる。この場合のア建
ｒ化には、純化学的な方法、１１素的な方法、および生
体内でこれを行なう生物学的方法が考えられる。

２、デスアミドセクレチンの製造 デスアミドセクレチンはセクレチンのＣ末端の修飾によ
って得ることもできるが、本発１ｊｉＫ従って、このぼ
りペプチドの構造遺伝子を化学的に合成し、これが発現
するようにプラスｔ　ｒｔ造成し、このフッスミＰｔ−
用いて宿主細胞に形質転換を行なわせ、この形質転換体
を培養して目的４リペプチＰｔ産生させてこれを回収す
ることからなる遺伝子工学的方法によって製造すること
が好ましい。

１）構造遺伝子 本発明における、構造遺伝子を含む遺伝子は特願昭５６
−８４６０３号で用いた遺伝子を利用しているが、この
遺伝子を得る手ａｔ、再度記載すれば、次の通りである
。

（１）遺伝子の設計 セクレチンの構造遺伝子がどのような塩基配列のＤＮＡ
からなっているかは不明である。

従って、このペプチＰｔ構成するアミノミｔ指定するい
くつかのコードンのうちから、下記の条件を満たすもの
を選んでＤＮＡｔ合成する。

（１）Ｇ−Ｃ塩基対に富む領域に続いてムーＴ塩基対に
富む領域が続かないようＫする。

（１）　　後記する各々の合成りラブメントが分子内あ
るいは分子間で望まない相補性塩基配列を持たないよう
にする。

また、この構造遺伝子内には、形質転換株の検索を容易
にするため、一つまたは二つ以上の制限酵素認識塩基配
列を含むように設計することが望ましい。デスアミドセ
クレチンでは、制＠−素Ｈ１ｎｆ　１および亀・薦の認
識塩基配列を持たせることが好ましい。

とのよ′うな観点から、デスア電Ｐセクレチン構造遺伝
子のア建ノ酸指定＝−トンの具体例上挙げれば下記の通
りである。

アミノ酸　　　　　　　コードン Ｈｌ　ｓ　　　　　　　　ＣＡＣ ｌｅｔ　　　　　　　　’ｆ’ＣＴ　　ＴＣＡＡｓｐ　
　　　　　　　　　ＧＡＴ ０１７　　　　　　　　　　　ＧＧＴ Ｔｈｒ　　　　　　　　　　ＡＣＴ、ＡＣＣｐｈ・　　
　　　　　　　ＴＴＣ Ｇｌｍ　　　　　　　　ＧＡＡ′ Ｌ＠ｌｌ　　　　　　　　　　ＴＴＧ％ＣＴＣ％Ｃ↑ム
、ＣＴＧ、ＴＥＡ％　０７丁、 ムｒｆ　　　　　　　　　　　　　ＣＧテ、　ＣＧＣＡ
ｌａ　　　　　　　　　　　　ＧＣＡＧｉｎ　　　　　
　　　　　Ｃムム、ＣＡＧＶａｌ　　　　　　　　　　
　　ＧＴＴ従って、本発明で使用するデスアミドセクレ
チンの構造遺伝子の好ましい具体例は、後記の実験例お
よび図面に示した塩基配列のものである（図中、Ｈ１ｓ
Ｋ対応するＣＡＣからＷａｌＫ対応するＧＴＴまでの部
分であることはいうまでもない）。

この構造遺伝子を発現させる方法についてはたとえば特
開昭５４−９２６９６号公報に詳記されているが、この
遺伝子を組込むべきプラスミドとしてｐＢｌ　３２２　
を使用しかつそのツクタマーゼオペ１ンとの融会タンツ
ク質としてデスアミＰセクレチｙを発現させる場合には
、遺伝子管部込むべき場所としてこのオペシン内にある
制限酵素Ｐｅｔ　ｌ認識部位が適当である。すなわち、
まず構造遺伝子の５′−末端側には臭化シアンの攻撃部
位となるメチオニンのブートンＡＴＧを、３′−末端に
は一つまたは二つ以上の停止ゴートンを設ける。続い【
、ラクタマーゼ遺伝子の開始コードンで始まるフレーム
と同ｌさせるためにリムＴＧの５′−儒に２＋３ｍ（ｍ
鴛０．１．２・・・）個の任意に３１１んだ塩基ｔ、さ
らに両端に粘着末端となるＰｓｔ　Ｉの認識塩基配列を
、それぞれ付与する。一般には、両粘着末端を露出させ
たまま構造遺伝子を設計および合成しているが４）希望
するならば両末端を鈍感末端としてもよく、この場合に
は制限−素の水解効率を高めるため認識塩基１列のさら
に外側に任意に選んだ２個以上の塩基を設けることが必
要となる。

なお、ムＴＧの５′側に設けるべき任意の塩基の対は、
一般的にいえば３ｍ対、（３ｍ＋１）対または（３ｍ＋
２）対（■はＯまたは１以上の整数）となる。

これらの考慮を払った、本発明で使用するのに適したデ
スア擢ドセクレチｙ用遺伝子の好ましい具体例は、後記
実験例に示したものである。

（２）合成 上記のように設計した遺伝子を合成するには、十−両鎖
のそれぞれＫついて、これをいくつかのフラグメントに
分けてこれらを化学的に合成し、各々のフラグメントを
結合する方法によればよい。

各−は、９〜１６塩基からなり、各、々が６〜７塩基ず
つ重なるように、１６儒糧度の７ラダメントに分けるの
が好ましい。

各７２グメントの合成法としては、ジエステル法５）、
トリエステル法６）、あるいは固相渋り、液相法、ある
いは酵素を用いる方法２）がある。合成時間、収率、精
製などの点からは、固相法でトリエステル法によるもの
が最も適当である。

合成の具体的な事項に関しては、上記文献および後記実
験例を参照されたい。

（３）精製 オリｌヌクレオチドを化学合成した場合、一般に鎖長が
長くなるにしたがって最終成積体の分離精製がしだいに
困難となってくる。特に、面相合成法においては適当に
保繰されたオリｌヌクレオチドブロックを段階的に縮合
させていくため、従　・来技術たとえばゲルー過、ゲル
電気泳動、イオン交換カラム、高速液体クーマドグラフ
ィーなどでは、Ｍ製は容易でない。

ところで、逆相カラムでは、オリｌヌクレオチドに親油
性の保護基が一つあるなしでその保持時間が大きくずれ
る。そこで、他の保護基ｔはずす条件下で安定な別の保
護基を持つオリｌヌクレオチドブロックを最終の縮合段
階に用い、ついで適当な脱保護の操作を行なえば、目的
の最終産物にのみその保護基のついたオリｌヌクレオチ
ドの混合物が得られる。この保護基の親油性を利用して
逆相カラムで目的とする最終産物を他の未反応混合物か
ら分−し、ついでこの保護基ｔはずせば。

目的とするオリｌヌクレオチｒｔ得ることができる。

この方法により１合成したオリｌヌクレオチドを未反応
混合物の中から効率よく分離精製することが可能である
。

（４）　　リン酸化および結合 こうして得た合成フラグメントをＤＮＮソリ　−４を用
いて順次結合していくのであるが、合成７ラグメントｔ
この酵素の基質とするためには、フラグメントの５′−
水酸基ｔリン酸化しておく必要がある。

この目的のためには４リヌクレオチドキナーゼを用いる
のが一般的であるが、化学的なリン酸化も可能である８
）。また、フラグメントの結合に＆１ＤＮムリガーゼを
用いるのが一般的であるが、５′−末端のりン駿基を適
当な方法（例えばイ電メゾール化）で活性化し、対する
側の鎖を＃型として化学的に結合する方法も可能である
？）。

２）ラクトースオペロンをもつベクターの＊＊本発明に
おいては、大腸薗染色体ＤＨ’ム由来のツクドースオー
４０ンの全部または一部を含み力１つ大腸■内で増殖可
能なさまざまなシラスミドを用いることか可能であり、
それ゛らのシラスミｒｔｍ製するにあたっては、分子生
物学の分野で公知の常法に従って行なうことができる。

ラクトースオペロンを含むＤＮＡは大腸菌染色体から直
接得ることも可能であるが、すでにラクトースオペロン
の全部または−ｗｔ含む形質導入ファージ（例えば、Ｐ
ｌｄｌ、Ｆ’−１ａｅ、φ８０ｄｐｌａｏ　、λｈ８Ｇ
ｄｌａｅ　、λｐ１ｍ＠など）が種々得られているので
、これらのファージからラクトースオペロンの必要な部
分ｔとり出すのが好都合である。また、大腸菌内で増殖
可能なシラスＵとするために、本発明に一部・【＆言上
記のラクトースオペロンの必要な部分と大腸−由来の別
のシラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐ８ｃ１０１　
。

λｄＶ１　など）とを結合させ【単一のプラスきドベク
ターとする必要がある。

いている、尚、λｐｌａｅ５　ＤＮＡは、例え＆ｆ、λ
ｐｌａａ５溶原薗であるところのＩ、ｅｏｌｉ　ＰＫ１
５１２から公知の方法２０）Ｋより得ることができる。

このλｐｌａｅ　５は２クトースオペ四ンのｌ遺伝子の
途中から１遺伝子の途中までの領域を持っており、ラク
トースオペロン以外の大腸菌遺伝子をもっていないとい
う利点を有び０）ているので本発＠において好まし−〜
また、大腸菌由来のシラスミＰとしてはｐｎｕｓｔ２を
用いているが、これを選んだ理由は最も入手しやすいプ
ラスミドの一つであること、全塩基配列が決定されてい
ること、アンぜシリン抵抗性およびテトラサイクリン抵
抗性の標識遺伝子を持っていること１等の理由によるも
のである。そして、これらの遺伝子を結合させるＫあた
９それぞれ（λｐｌａｅ　５およびｐｎｉ３２２）を制
限酵素艶Ｒ１およびＨｌｎｄ　ＩＩＩで処理して、λｐ
ｌａｅ　５については３．８　Ｍｄ　ｆ）７　？　／メ
ン）　ｔ”）、ｐＢＲ３２２Ｋツイ”Ｃは大きい方の７
ラグメン）　ｔ１４）それぞれ堆り出し、これらを緊ぎ
合わせて目的ど丁・るシラス・建ドベクターをつくる。

本発明ではこのベクターｔ−ｐＲＥと命名した。

ところで、目的とするデスアミドセクレチンを発現させ
るために大腸菌染色体由来のラクトースオペロンを選ん
だのは、ツクドースオー４−ン中の２遺伝子内にある制
限酵素＆ｏＲＩの認識部位に外来遺伝子を挿入してβ−
ガラクトシダーゼと融合したタンノぐりの形で発現させ
ることができるということ−）−〇、タン・り質を多量
Ｋｌｉ生させ得ること、適当な宿主菌を用いれば誘導産
生を行なわせることができるということ、融合タンＩ＃
りとして安定にまたｆｉ［純粋に回収することが容易で
あること、等の理由によるものである。

したがって、本発明においては詞製したベクターがただ
１か所だけ制限酵素Ｅｇｏ　Ｒ１の認識部位を有してい
ることが望ましく、その目的に合わせるために上記のよ
うにλｐｌａｔ　５およびｐＢＲ３２２とｔ３）キメツ
ゾラスきＰ”゛ （１）造成 上記のように外来遺伝子が発現するようにしくまれたベ
クターの適当な位置に前述のデスアミドセクレチン構造
遺伝子を含む遺伝子ｔｍ諷む。組込操作そのものは、分
子生物学の分野で公知の常法に従って台なうことができ
る。具体的な方法については、後記の実験例管参照され
たい。

本ｉ明の一具体例で＆讐、ベクターシラスミドとしてｐ
ＲＥ　１　ｔ−使用しており、その］Ｃｅｏ　Ｎ認識部
位にデスアミドセクレチン構造遺伝子を含む遺伝子を組
み込んでキメラプラスミドとしている。本発明ではこの
キメラプラスミドをＰＬ８と命名した。

ところで、本発明においては前述のように、上記構造遺
伝子を含む遺伝子は、本出願人に係わる特願昭５６−８
４６０３号発明で用いた遺伝子を利用しており、この遺
伝子番讐その両端に制限−素Ｐｓｔ　Ｉの認識部位を有
しているのでｐｕｌにこの遺伝子を組込むためにはこの
遺伝子の両端の制＠酵素認識部を均１！からセミＲＩに
変換させる必要がある。

（２）　　リンカ− そこで、本発明においては、構造遺伝子を含む遺伝子と
ｐＲＥ　１との緊ぎ手となる２本鎖ＤＮＡが必要である
。すなわち、この２本鎖ＤＮＡはＰａｔｌおよび’Ｆａ
ｅｏ　ＲＩの２つの制限ＩＩ素の認識部位を有し、かつ
β−ガラクトシダーゼ遺伝子の開始□コードンで始まる
翻訳のための読み取りフレーｌと同調させるために両者
の制限酵素認識部位の間に位置する塩基対は３１１＋１
（！１＝１．２．３・・・）対であることが必要である
（塩基対の種類はナンセンスコードンが現われない限り
任意である）。しかしながら、この緊ぎ手となる部分は
最終的に上記の機能を有すればよいのであり、例えば上
記の構造遺伝子を合成した方法を用いて合成して得るこ
とが可能である。本発明の一具体例では、このような合
成法の一例として以下に述べる工夫を細してこの緊ぎ手
を得た。

まず、制限−素Ｐｓｔ　ＩおよびＴｈｏＲＩのｇ繊部位
ｉ有する下記の一本鎖ＤＮＡｔ設計する。

５’　　１２３４５６７８９１０１１１２１３１４１５
１６１７１８１９２０３’ＣＴＧＡＡＴＴＣＡＧＣＴＣ
ＴＧＣＡＧＡＧＬ　　−Ｊ　　　’−ｐ−ｔｚ−’ ！竺■ ここで１．２．９〜１２．１９、頷は次の条件を満たす
隈９任意である。

条件■１と１０．２と９．１１と加、丘と１９は互いに
相補性のある塩基である。

条件■９．１０．１１の配列はいわゆるナンセンスコー
ドンでない。

このようにして設計された一本鎖ＤＮム（本発明ではこ
れをプレリンカ−と称する）は、それ自体の相補性のた
めに１多くのニック（ＤＮＡの二本鎖の一方に生じたす
き閘のない切断点）′ｆ：有する長鎖の二本鎖ＤＮム構
造管とる。したがって、ＤＮＡリガー−ＩＩＰＫより、
すき間のない二本鎖ＤＮＡとすることができるのである
。そしてこのようにして得られた二本鎖ＤＮＡは、制限
酵素ＰｓｔＩおよびＥｅ６　Ｒｒのｖｔ識部位を交互に
、すなわち、上記１〜２０の塩基配列をくり返し有する
二本鎖がりＤＮＡである。

したがって、コ’）　二本１１１　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｔ　１
１１１７１　ｉｌｌ　ＩＡ　Ｐｓｔ■で処理すると、Ｐ
ｉｔ　Ｉ　−Ｅｇｏ　ＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉの粘着末端を
有するリンカ−（緊ぎ手）′ｆ：得ることができるので
ある。

一般的に２つの制限酵素の認識部位を有するリンカ−の
用途はさまざまであ゛す、従来は、例えば２種のオリ♂
！−を用いることによりそれらの目的を達してきた。こ
こに掲げた発動は、１種のオリ♂マーで、上に述ぺた方
法により、その目的を運することができるものであり、
この一本−ＤＮＡは、一般的には下記の表現が可能であ
る。

ここでＸと！’、’　ＹとＹ′は互いに相補性を有する
任意の塩基（Ａ、Ｇ％Ｃ，Ｔ）である。（ｍｗｍ諺０，
１．２・・・） 本発明の場合、ＡがＥｅｏ　ＲＩ、ＢがＰｓｔ　Ｉ、ｎ
＋ｍ−３１＋１　（１＝１．２・・・）であるが、ｊ　
−１゜２が望ましい。

体）　方向性の判定 シラスミドに組込まれたｒ−デスア建ドセクレチン遺伝
子の方向性の判定は、構造遺伝子内に含まれる特定の部
位ｔｌｉｌｌｌＩＩＩする酵素（＆ｅ　ＩＩ　）でその
部位を切断し、構造遺伝子外の特定の位置に別の酵素で
切断を入れ、得られた断片のサイｊｅｆ分析することＫ
より行なうことができる。

４）形質転換 （１）　　宿主菌 前記のようなデスア建ドセレクチン構造遺伝子を組込ん
だキメラシーラスミド１）Ｌ８　、たとえばｐｕｓ詔、
管用いて形質転換させる宿主細胞の一具体例は、エシェ
リヒア　コリに属する大腸菌株ＸＡ３５質を有し、他の
性質についてはＫＬ２株のそれと異なるところのない菌
株である。

（８ｍ’、　　１ａｃ−（１，つ、２〕本発Ｆ！＃によ
るデスアオドセクレチン構造遺伝子を組込んだシラスミ
ドによる形質転換はあらゆる大腸菌株において可能であ
る。しかしながら、デスアｊ　ｐセクレチン會β−ガラ
クトシダーゼとの融合タン／ダクとして回収するためｋ
は正常なβ−ガラクトシＩ−ぜの混在をふせぐために宿
主■としてβ−ガラクトシＩ−ぜの遺伝子を欠失してい
る株を用いるのが好ましい。また、一般的には、ツクド
ースオペロンのリプレッサー遺伝子（ｉ遺伝子）Ｋよっ
てタンツクの産生が制御されているのであるが、野生製
の大腸菌を用（い−る・場合にはインデエーサー（例え
ばＩＰＴＧ　）　Ｉｃよって融合タンパクを誘導産生さ
せることができ、１遺伝子の高温感受性株を用（〜ＷＪ
　’場合には温度を上昇させることにより融合タンパク
ｔ＃導させることができ、１遺伝子の欠損株管用いも場
合には常忙融合１８） タンノ臂りｔＩｌ生させることができる。

本発明による一具体例では、β−ガツクトシ〆−ゼの遺
伝子を欠失しかつ１遺伝子の欠損株であるところの大腸
菌株ＸＡ３５を用いた。

（２）形質転換 形質転換操作そのものは、分子生物学の分野で全知の常
法に従って行なうことができる。具体的な方法について
は、後記の実験例を参照されたい。

（３）　　形質転換体 形質転換体の一具体例は、大腸菌株ＸＡ３６をｐＬｓ５
８によって形質転換させて得た形質転換体であって、本
発明ではこれを大腸菌ＸＡ３５（ｐＩＩ３５Ｂ）と命名
している。

この形質転換体大腸菌ＸＡ３）（ａ８５８）　　は後記
に述べる実験例によって明らかなように前記大腸−株Ｘ
Ａ３５とは下記の性質において異なる菌株である。

（Ａｍ’、Ｉａｃ”　） ５）デスアミドセクレチンの産生 このように形質転換した菌を常法に従つ【培養すればデ
スアミドセクレチンが産生される。具体的な方法につい
ては、−記の実験例゛を参照されたい。

３、実験例 デスアミドセクレチン遺伝子の設計 １）添付の図面に示したブロックＡＳＢおよびＣの結合
からなる塩基配列の遺伝子を設計し丸、各プａツクは下
記の通りの７ラグメントからなっている。

Ａ　　　　　８−１〜Ｂ−４，８−６ Ｂ８−５．８−７〜５−１０．８−１２ＣＢ−１１Ｓ８
−１３〜８−１６ ２）設計手順は、下記の通りである。

（１）　　コードンの選定 図面に示し九通シにコードンを選ぶ。

（２）Ｎ末端にメチオニンの＝−トンＡＴＧを付加し、
合成され九ポリペプチドがこの場所で化学的処ＩＩ　（
＋　ＣＮ　Ｂｒ　）によｐ切断されるようにする。

（３）Ｃ末端には、余計なペプチドが産生されないよう
に２個の転写終了”コードン（ＴＡＧｆｉたＦｉＴＧＡ
）を付加する。

（４）２クタマーゼ遺伝子の開始コードンで始まる７レ
ーふと同調させる九めに、メチオニンの上流に選んだ塩
基２対（一般的には、２＋３ｍ　（＊ＭＯ１１，２，３
、・・・ｉ対）を付加する。

（５）Ｐｓｔ１部位を両端に付加する。

なお、下流側のＰｓ１１部位の直前に各７ラグメント合
成上部合がよければ任意の数の塩基対を付加してもよい
。

（６）最後に、制限１素Ｐａ１ｌの水屏効率を高めるた
め、任意の塩基対を２対両端に付加する。

以上のようＫして設計された遺伝子は、ブタ竜りレチン
構造遺伝子中に互１ｍｆ　１部位および１竺１１部位を
含むものである。

フラグメントの化学合成 １）　合成 ７ヲグメントの合成は文献６１）記載の方法に従って固
相法によって行なつ九。しかし、合成７２グメントの単
離精製は以下に示す改嵐法で行なった。

各７ラグメントの合成収率は、下表に示す過シである。

８−Ｉ　　　　ＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＣ１６
８３Ｓ−２ＧＣＴＧＣＡＧＧＴ　　　　　　　　　　　
９　　　５２Ｂ−３ＴＣＡＧＡＴＧＧＴＡＣＴＴ　　　
　　　１３　　　５６Ｂ−４ムＴＣＴＧＡＧＴＧＣＡ’
ｒＧ　　　　　　１３　　　４２ｇ−５ＴＣＡＣＣＴＣ
ＡＧＡＡＣＴＡＴ　　　　１５　　　４８８−６　　　
ＧＡＧＧＴＧＡＡＡＧＴＡＣＣ１４４７８−７ＣＴＣＩ
ＩＴＣＴＡＣＧＴＧＡＴＴ　　　　１５　　　３８８−
８　　　ＡＧＡＣＧＡＧＡＴＡＧＴＴＣＴ　　　　１５
　　　２７８−９　　　　ＣＡＧＣＡＣＧＣＣＴＣＣＡ
ＧＣ１５３２Ｂ−１０ＣＧＴＧＣＴＧＡＡＴＣＡＣＧＴ
　　　　１５　　　４３Ｂ−１１ＧＣＴＴＧＣＴＧＣム
ムＧＧＴ　　　　　１４　　　２２Ｂ−１２ムＧＣムム
ＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧ　　　　１５　　　４４ｇ−１３
ＣＴＣＧＴＴＴＧＡＴＡＧＧ　　　　　　１３　　　４
７Ｂ−１４ムムムＣＧＡＧＡＣＣＴＴＧＣ１４４２８−
１５８−２と同じ ８−１６　　　ムＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴＡＴＣ１５３
２２）精製 合成終了後の樹脂５０ｍｇ　Ｋ対し、Ｑｈ　５Ｍ　ｍビ
ーリンアルドキシムテトラメチルグアニジン、およびジ
オキサン：水（１：１）混合物１００〜２００μｍを加
え、１４）室温数時間放置し、ついで濃アンモニア水２
ｍｌを加え、密役して一夜５１５”Ｃで放置する。

これをｆ過して樹脂を分離し、Ｐ液を淡縮しゲルｆ過を
行なう、　５０ｍＭ　ＴＥＡＢ緩衝＠　ｐＨ７、５で溶
出し、ボイドボリュームに溶出してくるものを集める。

これを濃縮し、逆相カラ五〇−１８（ウオータース「ラ
ジアルパツクム」径８　ａｍ　ｘｌＯｅｍ　）のＨＰＬ
ＣＫアプライし、０．０１Ｍ　　エチレンジアミンジア
セテ−）ｐＨ７，８の緩衝液中、アセトニトリルのｌＯ
−から３２−１での一度勾配を２１１１　／ｒｍ　ｌ　
ｎの流速で１６分かけて溶出させる。１１−１２分で溶
出されるものを集める。このとき、トリチル基のないオ
リゴヌクレオチドはインジェクタＮ／ビークとして溶出
される。溶出液を澁細し、８０１Ｊ６酢酸１ｍｌを加え
、室温で１５分間放置する。トリタノールを抽出除去し
、水層を濃縮し、再び逆相カラ五Ｋかける。先と同じ条
件下にアセトニトリルの０−から２０ｓｔでの議度勾配
で溶出を行ない、戊〜Ｂ分で溶出されるものを集める。

リン酸化 フラグメント３０１を１）ｍＪ４）リス塩酸緩衝液ｐＨ
７，５Ｋ溶解し、［ｒ　”Ｐ　］ムＴＰ　６６ＪＩＣ１
（１９，８ｐｍ＠ｌ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ２＃１（９単位）を加え、全量５０Ｊ１１とし、３
７’Ｃで加分加温する。

ついで、フラグメントに対してｌＯ当量のムＴＰ及び丁
番ポリヌクレオチドキナーゼ（９単位）を加え、３７’
Ｃで加分加温する。１０ｆｆ’Ｃで２分加熱して反応を
止め、グルー過により精製する。各フラグメントは、２
０−ゲル電気泳動によｊ）ａｉｌＬ九。

フラグメントの結合反応 Ｓ−１，８−２，８−３，８−４、および８−６各ｏ、
　ｏｓム２．。を緩衝液（２００１Ｍ）リス塩＠　ｐＨ
７，５，１０ｍＭ陶Ｃ１，、ｌｏｍＭ　ＤＴＴ、　０．
２−ムＴＰ　）に溶かして全量を３０ｓｌとし、Ｔ４−
ＤＮムリガー（１−１（１５０単位）を加え、１０℃で
一晩放置し、８ｇ６アクリルアイドゲル電気泳動によシ
反応を確認すゐ。

ｆｌｌｌｌＫ、ブロックＢおよびＣ１を合成する。

ブロックムおよびブロックＢの反応混液を混合し、０．
２ｏｄ４　ＡＴＰ　３μｌ５Ｔ４　ＤＭＡリガーゼ　１
μ１（１５０単位）を加え、１０℃で一夜放置する。８
チアクリルアミドゲル電気泳動で反応を確認し九あと、
プｑツクＣの反応混液を加え、同様に一晩反応させる。

５チアクリルアＺドゲル電気泳動により、反応の進行を
確等する。

反応混液を６ｇ′Ｃで１５分加混し、室温まで冷却する
。ついで、０．５Ｍ　ＮａＣ１１５ｊｌ、および制限酵
素Ｐｓｔ　Ｉ　８０単位を加え、γ℃で一夜放置する。

９（１’Ｃで１分加熱して反応を止め、５−アクリルア
電ドゲル電気泳動により分離する。最長鎖のバンドを切
り出し、ＩＩｓ低融点アガロースゲル電気泳動に移し、
得られたバンドを抽出する。。

λｐｌａｅ５ＤＮムおよびｐＢＲ３２２ＤＮムの調製λ
ｐｌａｅ５ＤＮムは溶原薗Ｅ、　ｅｏｌｉ　ＰｉＣ１５
１２よシ得たが、具体的な調製法は、大島の方法２０）
Ｋ従かった。

ｐＢＲ３２２ＤＮＡＦｉＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２０６０
０（ｐＢＲ３２１！　）（微工研曹寄第６０１７号、特
願昭５６−８４６０３号参照）より得たが、具体的な調
製法は、Ｍ、カーノらＯ方法２１）Ｋ従かった。

ｐＲｌｌの調製 λｐｌａｅ！＄ＤＮム１０１を１００ｍＭ　）リス塩酸
緩衝液ｐＨ７，５、’ＩｍＭＭｚＣ１ｚ　ｓｉ−よび５
ＧｍＭ　ＮａＣｌ　Ｏ％會物（全量２０μｌ）に加え、
制限酵素、シ＋ｏＲ１１０単位および制限酵素Ｈ１ｓｓ
ｄｌ旧０単位を用いて田℃で２時間反応させ九。ついで
１−アガロースゲル電気泳動で３．８メガダルトンのＤ
Ｎム断片を精製した。

ｐＢＲ３２２ＤＮムｌｊＩｇを上記と同様の混合物（全
量１０Ｊ１１）Ｋ加え、制限酵素ＥｅｏＲ１１単位およ
び制限酵素Ｈ１ｎｌｌ［１１単位を用いて３７”Ｃで２
時間反応させた。ついで１１アガロースゲル電気泳動で
２．６メガダルトンのＤＮム断片を精製した。

得られ九それぞれの断片を５０ｍＭトリス塩駿緩慎重［
ｐＨ７，８、ｉｏ　ｔａｘｉ　ＭｇＣｌｘ、２０　ｍＭ
　ＤＴＴ　、および１　ｍＭ　ＡＴＰの混合物（全量１
０＃１）Ｋ加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（資）単位を用い
て１４℃、湿時間反応させ九。

この反応混液を用いて大腸菌株ＸＡ３５の形質転換を行
なった。形質転換はクシエナーの方法１０）Ｋ従がい、
実験１ｉＰ−１物理的封じ込め設備内で行なった。１り 形質転換株を、Ａｐ（２０声ｖ−１）　を含有するＬ−
プレート（１−バクトトリ１トン、０．６−）（クトイ
ースト抽出物、０．５％　ＮａＣｌ、　１．５％　”ク
トアガー）上で選択し、得られた形質転換株をＫＭＢ−
１ａｅＯプレート（２，２５％バクトｇｍブロース、１
．５１６バクトアガー）Ｋレプリカし、Ｌａｇ４″＜ｍ
色のコロニー）となつ丸味をさらに選択し九。これらの
株のうち任意に５株を選びプラスミドを調製し、数種の
制限酵素で解析したところ、４株のプラスミドがλｐｌ
ａｃ５ＯＮＡの３．８メガダルトン断片とｐＢＲのＥｅ
ｏＲＩ−Ｈｌｍｄｌ　断片が緒会しているものであるこ
とが確かめられた。これらのうち１株を大腸菌ＸＡ３５
　（ｐＲＥ　１　）と命冬し友。即ち、この形質転換体
大腸ｇＸＡ３５（ｐＲＥｌ）は前述の大腸菌株ＸＡ３５
とは下記の性質において異ｂ１株である。

〔・°騨ｒ、Ｌ紅け〕

リンカ−°　　） ＣＴＧＡＡＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＡＧＡＧの塩基配列
の７２グメントの合成を行なった０合成および精製方法
は、精製方法に準じた（収率４Ｇ９ｇ）。本発明ではこ
の一本鎖ＤＮムをプレリンカ−と命名した。

プレリンカ−１５１を５０ｍＭ　　）リス塩酸緩衝液ｐ
Ｈ７，５，１０ｍＭＭｇＣ１，，０，１ｍＭスペルミジ
ン、０．１！！ＬＭ　ＥＤＴＡＳｌｏｍＭＤＴＴ、およ
び０．２ａＭ　ＡＴＰ　Ｏ混合物（金量３０１１１）中
でＴ４−ポリヌクレオチドキナー−ｖ２０単位とともに
γ℃で４０分間保温した。

ω℃で２分間保温し、反応を止め九。皇温に１時間放置
したのち３００単位、ＩＪＩ　ＯＴ４　ＤＮムリガーゼ
を加え、−晩１４℃で反応させ九、６０℃で２分間保温
し、反応を止めた。ｉｉａに１時間放置したのち制限酵
ｊｉＰｓｔ１２０単位を加え、５時間反応させた。６０
℃で２分間保温し、反応を止めた。

このようにしてＰｓｔ　Ｉ−ＥｅｏＲＩ−Ｐａｔ　１リ
ンカ−１５声「を得え。

ｊｉｊＪＬＲｌ−紅捗１構造遺伝子の調製上記で得九ヱ
畦Ｉ−！！５！Ｒ１ジエリリンカ−４鰭とｂｌｌ−Ｐｓ
ｔｌ構造遺伝子（特許１ｉ！１５６−８４６０３号を本
発明において参照とすゐ）０．６ｓｇとを１００ａ＋Ｍ
トリス塩酸緩衝液ｐＨ７，８、７ｍＭ　ＭｇＣｌ　、、
および（資）ｍＭ　ＮａＣ１の混合物（全量襲ｘｌ）Ｋ
加え、Ｔ４　ＤＮムリガーゼ３００単位を用いて１４℃
でガ時間友応させた。

ついで６ｆＣで１０分間加熱し、反応を止め九後徐々に
冷却した。

反応生成混合物に制＠酵素ｇ＊ｅＲＩ　（１００単位）
を加え、３７’Ｃで５時間反応させ丸めと、５−ポリア
クリルア建トグル電気泳動で、１２０塩基対のＤＮＡフ
ラグメントを精製し九。

ｐＬ８の調製およびクローニング ｐＲｌｃｌ　０．２Ｓｐｇを１０（ｈａＭ　）リス塩酸
緩債＊ｐＨ７，５，７ｒａ）１１　Ｍｇ　Ｃｌｚ、およ
び６０１ＮａＣ１の温食物（全量４μｍ）Ｋ加え、制＠
酵素シｅＲ１１単位を用いて３７”Ｃで１時間反応させ
た。

このようにして得られ九（ｇｃｏＢｆで切断され九）プ
ラスミドｐＲ１：１０．２しｇと！門訓−亙シ３Ｉ構造
遺伝子０．０２μｇとを、５（ｂａＭ　）リス塩酸緩衝
液ｐＨ７，８，１０ｍＭ　ＭｇＣＩ、、　２０　ｍＭ　
ＤＴＴ、およびＩＩａＭＡＴＰの混合物（全量１０ｓｌ
）Ｋ加え、Ｔ４ＯＮムリガーイ加単位食用いて１４℃で
ｚ時間反応させた。

この反応混液を用いて大腸菌株Ｘム３６の形質転換を行
なった。形質転換はクシエナーの方法に従がい、１０）
実験はＰ−３物理的封じ込め設備内で行なった。１り 形質転換株をＡＰ（２０ｘｇ／ｍｌ）　を含有するＬ−
プレート（前記）上で選択した。得られた形質転換株を
ＥＭＢ−１ａ　ａのプレート（前記）にレプリカし、Ｌ
ａｅ＋の株をさらに選択した。これらの株のうち２００
株を選びプラス建ドＤＮＡ會調製し、制限酵素力１１あ
るい社Ｈａｓ　ＩＩ　Ｋよりそれらの構造を解析したと
ころ、ｌ１株のプラスミドが上記構造遺伝子を持ってい
ることが確かめられた。

方向性の決定 構造遺伝子を持っている１１株のプラスミドのそれセれ
Ｋついて以下の実験を行なった。

プラスイド２Ｄｓｔｘを１０ｍ１Ｍ）リス塩酸緩衝液ｐ
Ｂ７．５．６６−Ｍｇ　Ｃｌ　ｘ、および４９ｍＭ　Ｎ
ａＣ１の混合物（全量２０μｍ３に加え、あらに制限酵
素１ｕ」■単位を加えて３７℃で２時間保温する。これ
から１−アガロースゲル電気泳動で約１メガダルトンの
断片と、約０．７メガダルトンの断片を抽出する。それ
ぞれのＤＮＡ断片を上記と同様の操作で制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩを用いて切断後、ＬＳ−ポリアクリルア叱ドゲル電
気泳動で約４０塩基対のＤＮＡ断片が約１メガダルトン
の断片から得られえもの、および約８０塩基対のＤＮＡ
断片が０．７メガダルトンの断片から得られたものを構
造遺−子が正しい方向に挿入され九グ２スξドとし九。

これらの実験により１１株の構造遺伝子をもつプラス建
ドのうち、５株のプラスイドが正しい方向をもつもので
６つ九、それらのうち０１株を任意に選択し、大腸菌Ｘ
五３５（ｐＬ！１６１１）と命鳴し九。

融合タンパク質の同定と精製 大腸菌ＸＡ３５　（ｐＬ８５８）をアンピシリン２０　
ｓｄｒｍ　１を含むＬｕｒｉｍ−ブロース１４中でγ℃
で、菌数が１ｍｌあ九シ５ＸＩＯ’になるまで振とう培
養した。

ついで遠心分離により集菌し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝
液ｐＨ７，５およびｔｏ！ｌＩＭＭｇ０１ｍ　の混合物
（全１１１００ａｔ１）に懸濁させ、久保田超音波発生
装置「インソネータ−２００ＭＪＫより（資）分間処理
して菌体を破壊しえ。

このようにして得られ九液２声ｌを７．５−の８ＤＢポ
リアクリルアミドゲル電気泳動したところ、約１２万ダ
ルトンの大きさのタンパク質のバンドが認められ喪。プ
ラス建ドをもたない薗（大腸菌株ＸＡ３５　）から同様
に得た抽出液ではこのバンド−認められなかった。し九
がってこのタンパク質は、プ２スミ）　ｐＬ８５ｇ由来
のものであると考えられ九。

また、このタンパク質は大腸菌由来のβ−ガラクトシダ
ーゼ１９Ｊとほぼ同じ大きさで６９、デスアンドセクレ
チンとβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質の大き
さく　１１７．８７３ダルトン）と矛盾しないことを確
認した。

したがって、この約り万ダルトンのタンパク質が融合タ
ンパク質であると結論し、このタンパク質の精製を行な
つ九。

超音波破砕により得られた抽出液を遠心分離し、その沈
殿物を回収した。この中に融合タンパク質がｔｌぼ回収
される。沈殿物を１０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液ｐＨ７，
５およびｉ　ｍＭＭｇＣ２２’との混合物（全量１００
ｍ１　）ＫＪＩ濁して遠心分離を行ない沈殿物を回収し
た。この操作をさらに２回くり返すととにより水溶性の
ものをとシ除い九。

得られた沈殿物を２０ｇ＋Ｍ　）リス塩酸緩衝液ｐＨ７
，５，１ａＭＭｇＣＩ、、Ｉ　Ｏ！ｌＩＭＮａＣｌ　ｓ
および７Ｍｊｉ車の混合物（全量）　Ｚｏｏ！！１１１
１Ｃ溶かし、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化しであるＤ
ＩＣＡＥセルロースのカラム（５０ｃｍψ×３ｅｒｍ）
　Ｋのせえ。

同じ緩衝液２０ｍ１で洗浄し九のち、ＮａＣ１浪度を５
０ｒｘＭ　Ｋ　Ｌ九同様の緩衝液１００ｍ１　でさらに
洗浄し九。ついでＮ１０１１１１度を１５０ＩａＭＫシ
九同様の緩衝液１５０ｍ１で融合タンパク質を溶出させ
た。

この溶液にβ−メルカプトエタノールを最終機度が１−
になるように加え、５Ｊの水に対し、３回透析した。透
析後、遠心分離し、融合タンパク質を沈殿物として回収
した。

得られた融合タンパク質は８Ｄ８ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動でほぼ単一のバンドを与え、２８０ｎｍにお
ける吸光度から換算して、ＩＩの培養液から約２８ｍｇ
得られたことになる。これを１細胞あたりに換算すると
約四万分子となる。

精製された融合タンパク質を−ｍｌの７０−ギ酸に溶か
し、１００ｍ１ｇの臭化シアンで１８時間処理した。

エバポレージ璽ン後、残留物を６ｍｌのイソプ四パノー
ルにより、つづいて５ｍｌのメタノールにより抽出し、
凍結乾燥した。

生物検定 得られ九凍結乾燥標品を計δｍｌの生理食塩水に溶解し
、その５０ＪＩＩｌずつを５匹のラットの股静脈よシ注
入し、人工膵管より流出する膵液の分泌量を５分率位で
測定し、その増加分をもってセクレチンの生物活性とす
る生物検定法１２）を用いた。

標準セクレチンとしてはセクレパン（エーザイ）１単位
、２単位、４単位／ラットを同じラットの静脈に前もっ
て注入しその分泌膵液量を測定し、エーザイ単位（Ｃｒ
１ｅｋ　Ｈａｒｐ＠ｒ　Ｒａｐ＠ｒ単位とほぼ等しい）
との対応を求めておい九。

その結果、大腸菌ＸＡ３５　（ｐＬ８５８　）から得ら
れ九試料では膵液分泌量増加が与られたが、一方デスア
建ド七りレチン遺伝子を含まずｐｌ鳶１のみを含んだり
鴛−ンよ〉得られ九菌体抽出物から出発して得られた試
料を同じ方法で検定しぇ場合は、膵筐分沁増加は認めも
れなかつ九、このことは、大腸菌ＸＡ３５　（ｐＬ８５
ｇ）細胞内でセクレチン様の生物活性をもつ物質が全量
され、大腸菌ＸＡ３１５　ｔｐｇｇｉ　）細胞内ではそ
の物質の全量が認められないことを示すものである。

片対数方課紙に膵液分泌増加量を縦軸に、セクレチン単
位を横軸（対数目盛）Ｋ目盛り得られ九直纏に大腸菌Ｘ
Ａ３５（ｐＬ８５ｍ）より得られ九試料による膵液分泌
増加量をプ■ットし内挿法でセクレチン単位を求めると
約３ニーずイ単位／ｓｏμｌ／ラットとなる。凍結乾燥
標品を含む生態食塩水δｍｌ全量については約１５００
ニーずイ単位となる。

最高純度に精製され九セクレチンは１６．０ＯＯＣＩＩ
Ｒ単位／呵の比活性を有することが知られている轡ので
、１５００単位は約２６ｍｍ＠ｌ・のセクレチン分子に
相当し、約１．６Ｘ１Ｇ”セクレチン分子相当の活性を
有するデスアンドセクレチンが生合成されたことＫなる
。計約５ｘｔｏ”ｓｏ大大腸ＸＡ３８（ｐＬＩＩｓ８）
細胞を出発原料としてデスアンドセクレチンが調製され
たので、最小限約３×１０　セクレチン相幽分子／１細
施が回収されていることになる。

これから、大腸菌ＸＡ３５　（ｐｔｓｓｓ　）細胞内で
、合成ｎ−デスアンドセクレチン遺伝子は、大腸菌ラク
トースオペロンプロ毫−ターの働きによって形質発現さ
れ、その翻訳産物（２７−ゾスアにドセクレチン）がセ
クレチンと同様の活性を示すことが結論できる。

放射免疫分析 試料の希釈は５０ｍＭ　）リス塩酸（ｐＨ８，０）１０
．１１１牛血清アルプ建ンで行なつ九、希釈試料のラジ
オイムノアッセイ社第−ラジオアイソトープ研究所ＩＩ
Ｉ＠セクレチンキット「第一」”を用いて指示され九欄
定法に従って測定をし、その活性を確認し丸。

４、遺伝子設計図 下記は、４−デスアンドセクレチン構造遺伝子を含む遺
伝子の塩基配列をブロックム、ＢおよびＣＫ分けて示す
ものである。

ａ・・・任意の塩基対、ｂ・”ｊｌＬ１部位、噛・・・
任意の塩基対、ｄ・・・開始コードン、・・・・１ｂ１
−１１１位、ｆ・・・Ｊ■紅部位。

５、微生物の寄託 大腸−株（Ｅ、　ｃｏｌｔ　）　ＸＡ３５およびそのプ
ラス（ドｐＲＥＩＫよる形質転換体である大腸菌（１，
５ｅｌｌ）ＸＡ３５（ＰＲＥＩ）は、工業技術院微生物
工業技術研究所（ＩＩ工研）（茨城県筑波郡谷田部町東
−丁目一番三号）に寄託の申請管したところ、それぞれ
微工研薗寄第６３０１号および６３０２号として受託さ
れた。

λｐｌａｅ５＃原−であるところの大腸菌（ＩＣ，ａｏ
ｌｉ）ＰＫ１５１２は、黴工研に寄託の申請ｔしたとこ
ろ、受託を拒否された。―、この微生物を財団法人発−
研究所（大阪市淀用区十三本町二丁＠１７番羽号）ＫＩ
Ｆ託の申請をしたところＩＦＯ１ｋ１４１４Ｇとして受
託された。

キメラプラス２ドによる形質転換体である大腸ａｌ　（
Ｅ、ｃｏｌｔ　）　ＸＡ　３５　（ｐＬ８５Ｂ　）は、
シダベスト条約に基づく国際を託機関であるアメリカン
、タイプ、カルチャー、コレクシｌン（ＡＴＣＣ）　（
アメリカ合衆国メリーランド州２０８５２、四ツクヴキ
ル、パークローン−ライ／、　　１２３０１）に寄託の
申請をしたところ、ＡＴＣＣ３９０４０として受託され
た。

６、引用文献 １）アクタ・ケ建力・スカンジナビカ （Ａｅｔａ、Ｃｈ＠ｗ、５ａａｎｄ、　　）、　１５、
１７９０．　　（１９６１）２）ａ）少々カル・インダ
ストリー （Ｃｈ＠ｗ、Ｉｎｄ、　）、　１９６６　、１７５７ｂ
）ジャーナル・オブφジ・アメリカン・ケミカル・ソサ
エティ （Ｊ、Ａｍ、Ｃｈ＠ｍ、８ｏｃ、）、８９　、６７５３
　、　（１９６７）３）！ロシーデインダス・オシ・デ
・ナシ璽ナル・アカデミー−オシ・サイエンスΦオシ・
ｆ・ユナイテツー・ステーク・オシ・アメリカ（Ｐｒｏ
ｅ、Ｎａｔｌ　、Ａｅａｄ、ｅｅｌ　、ＵＳＡ）　、７
５　、３７３’ｌ、　（１９７８）４）ａ）サイエンス
（８ａｌ＠ｎｅｅ　）　、１９８．１０６６、　（１９
７７）ｂ）プｐシーデイングズ・オシ・デ・ナシ璽ナル
・アカデミ−・オシ・サイエンス・オシ・ザ・ユナイテ
ッド・ステーク・オシ・アメリカ （Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ　、ＵＳＡ
、）　、　７５．５７６５゜（１９７８） Ｃ）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅλ２８１．１８．　（１
９７９）ｄ）ｚｔイオケミスＦリー （Ｂｉｏｅｈ幅１ｓｔｒｙ　）、１９８０．６０ｆ５．
（１９８０）５）サイエンス（Ｓｃｉ＠ｎｃｅ入２０３
．６１４．　（１９７９）６）ａ）ヌクレイツク・アシ
ツメ・リサーチ（Ｎｕｅｌ＊ｉｅ　　Ａｅｌｄｓ　　Ｒ
ａ５ｅａｒｃｈ　　）ｓ　８．　５４９１．　　（１９
８０）ｂ）ヌクレイツク・アシツメ・リサーチ（Ｎｕｅ
ｌ＠ｌａ　Ａｅｉｄｓ　Ｒａ５ｅａｒｃｈ　）、８．５
１９３．　（１９８０）Ｃ）テトラヘドロン・レターズ （Ｔ＠ｔｒａｈ＠ｄｒｏｎ　Ｉａｔｔ、）、２１．４１
５９．　（１９８０）ｄ）ヌクレイツク・アシツメ・リ
サーチ（Ｎｕｅｌ＠ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａ５ｅａｒｃ
ｈ　）、８．２３３１．　（１９８０）７）ａ）ザ・ジ
ャーナル・オシ・バイオＧ１？カルケ建ストリー（Ｊ、
Ｂｌｏｌ、Ｃｋｅｍ、　）、２４１、２０１４．　（１
９６６） ｂ）ヌクレイツク−アシツメｅリサーチ（Ｎｕｃｌ＠ｉ
ｃ　　Ａａｌｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　）　、　１
．　１６６５．　　（１９７４）８）ヌクレイツク・ア
シツメ・リサーチ（ト石ｃｌ＊ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒ
＠ｓ＠ａｒ＠ｈ　　）、　８．５フ５３．　　（１９８
０）９）ケミカル・アンＰΦファーマシニーティカル・
（１９７Ｂ） １０）ジエネテイツク・エンジニアリングＣＧ＠ｓ＠ｔ
ｉｅ　Ｔｈｇｉｎ＊ｅｒｉｎｇ　　）　、１９７８．　
１？、　　＜１９７８）１１）組み換えＤＮＡ実験指針
、昭和５４１ｆ−８月告示１２）　　ｆ−ジャパニーズ
・ジャーナル嗜オブ・７アーマコ胃ジー（Ｊａｐａｎ、
Ｊ、Ｐｈａｍａｅｏｌ、）、２１゜３２５、　（１９７
１） １■１）へミツシエ・ペリヒテ（Ｃｈｅｗ、ｋｒ、）１
０５、２５０８．　（１９７２） ｂ）へきツシエ・ペリヒテ（Ｃｈ＠ｗ、Ｂ＠ｒ、）１０
５、２５１５．　（１９７２） １荀　テトラヘト四ン・レターＩ　（Ｔｈｔｒａｈ＠ｄ
ｒｏｍ　Ｌａｔｔ、）１９７８、２７２’ｌ、　（１９
７ｇ）Ｉｓ）　　ゾ四シーディン／ズφオブ・ザ拳ナシ
曹ナル・アカデミ−・オシ・サイエンス・オブ串ザ・エ
ナイテツド・ステーツΦオブ・アメリカ（Ｐｒｏｅ、Ｎ
ａｔｌ、ムｅａｄ、ｊｉｉａｌ　、Ｕ８ム）、７３．３
９００　（１９７６）１６）ジーン（Ｇ＠！ｌ＠　）、
２．９５　＜１９７７）１７）　　プロシーデインダズ
・オシ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オシ・サイエン
スＱオシ・ザ・ユナイテッド・ステーク・オシ・アメリ
カ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、Ａａａｄ　、Ｂｅ　１　、
ＵＳＡ　）、７６、１０６　（１９７９）１８）ザ・オ
ペロン（Ｔｈｅ　ｏｐ＠ｒｏｎ　）、３１　（１９８０
）（著者：　Ｊ、ｉｉ、ミラー、Ｗ、８６レメニコフ、
発行者：：Ｉ−ルｒ・スフリング・ハーバ−・ツーラト
リー） １９）プロシーデイングズ・オシ・ザ・ナショナル・ア
カデミ−・オシ・サイエンス・オブ拳ザ拳エナイテツド
壷ステーツ・オシ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、８＠ｉ、ＵＳＡ　）　、？４．１５０７　（１
９７７）Ｉ）別置蛋白質核酸酵素、核酸実験法、下１、
１９　（１９７３） ２１）メソツメ・イン・エンディ曇ｊ−だ（Ｍ＠ｔｈｏ
ｄｓ　１！ｌ　Ｔｈｓｙｍｏｌｏｚｙ　）　、６８．２
６５　（１９７９）（転）マイクロバイオロジカル・レ
ビューズ（Ｍｉｅｒｏｂｌｏｌｏｇｌｃａｌ　Ｒ＠ｖｉ
＠ＷＩ）　、４４．１〜５Ｑ、　（１９８Ｑ）（２）ネ
イチャー（Ｎａｔｕｒ・）　、２２４．７６８　（１９
６９）第１頁の続き ０発　明　者　長谷川明 広島県高田郡吉田町大字吉田１８ ４−２ ０発　明　者　西澤勉 広島市安佐北区高陽町矢口５４４ ２３ ０発　明　者　不破亨 広島市中区小町６番１７号の６０２ 手続補正書 昭和酊年Ｓ月１３日 特許庁長官　　島　１）春　樹　　殿 １、事件の表示 昭和ｓｙ年特許願第１６７３４号 ２、発明の名称 γ−デスアセｒ＊Ｉレテνの側造法 ３、補正をする者 事件との関係特許出願人 〔電話東京（２１１）　２３２１大代表〕４２３０　　
弁理士　猪　股 ５、補正命令の日付 ７、補正の対象 ＠膿書のｒｉｍＨの―層な脱−」の欄 明細書を、下記の通りに補正する。

ＩＪＬ　　　ＩＪｊＬ　　　　　　　Ｅ」Ｅ３７　　分
泌促進　　　　　分泌促進 ３渦８−ムＩ晶−−ム１ｔ− ７１０１ｃｂｅｒｉｃｈｉａ属　　　１ｓｃｂ＊ｒｉｃ
ｋｉａ属１０　　ＩＩ　　　示す、　　　　　　示す、
１０″ＦＮ：）１＄　分泌促進、　　　　分泌促進作用
、１９″ＦＭＳ　緊ぎ　　　　　　　繋「４末行　緊ぎ
手　　　　　　繁ぎ手 ２２９　　　ＩＩぎ手　　　　　　繋ぎ手２２　１４　
　１１１ｑｐＨｆ手 ｎ末行　緊ぎ手　　　　　　繋ぎ手 ２５　Ｔｆ１４４　　（Ｉｓつ、２　　　　（輸−１ｘ
−）３ＢＩ　　　　ＤＭＡすを−ぜ　　　　Ｄ）ｉＡす
ｌ−４３３６確等する。　　　　確認する・ ３３７　　加温し、　　　　　　ｍ温し。

３５　１２　　１１１Ｌｆ）　　　　　　　ｐｉｌｌ　
８２２　Ｄ）ｉＡ　＃）田−鴎も２Ｉｈらに　　　　　
　さらに鰺　・　　得られたもの、ｔｈｉ　　得られ、
かつ約よび鞠 ３９７０．７　　　　　　　約０．７ ４１７　　（全量）　１００１１ｍ　　　（金量１００
ｍ１→４７２　　大腸１株　　　　　大腸曹 ５０　７　　　Ｐｋｓ鴎帥１．　　　　　Ｐ−１鴎帥１
゜５５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記工程からなることｔｅａとする、γ−デスア電
   Ｐセクレチンの製造法。 （１）セクレチンのＣ末端のア叱ノ駿がバリンであるぼ
   りペゾチＰＫ＠当するデスア擢Ｐセクレチンの構造遺伝
   子を化学的に合成すること。 （２）９クトースオベロンの発現系を利用でき、かつ予
   定した宿主ｍ脂肉で増備可能なゾツス之ドを用意するこ
   と。 （３）このプラスミドに構造遺伝子を組み込んで。 この宿主細胞内で増殖可能なキメラゾツス樗ドｔつくる
   こと。 （４）このプラス電１’によって、ＩＩ主−胞を形質転
   換させること。 （５）得られる形質転換体を培養し、〜産生されたデス
   ア電ドセクレチンｔａ収すること。 １宿主細胞がＥｓｃｈ＠ｒｉｅｈｉｍｌｌ　Ｋ属する大
   腸■である、特許請求の範囲第１項゛記載のＩ−デスア
   ζドセクレチンの製造法。 ３、ツタドースオペロンの発現系が大腸菌由来のもので
   ある、特許請求の範囲第１項記載のτ−デスア建Ｐセク
   レチンの製造法。 ４、セクレチンのＣ末端のア建ノ酸がバリンである４リ
   ベゾチドに相当する化学的に合成されたデスアｔドセク
   レチンの構造遺伝子ｔＩｌみ込んだ、ツタドースオペロ
   ンの発現系を利用できか