JP2771220B2 - 植物性リボソーム不活化タンパク質をコードするヌクレオチド配列 - Google Patents
植物性リボソーム不活化タンパク質をコードするヌクレオチド配列Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、植物性リボソーム不活化タンパク質に係わ
り、特にSaponaria officinalisのリボソーム不活化タ
ンパク質に係わる。
り、特にSaponaria officinalisのリボソーム不活化タ
ンパク質に係わる。
様々な植物からの抽出物が動物細胞のタンパク質合成
を阻害する。そのような抽出物は、ほとんどの場合リボ
ソーム不活化タンパク質（RIP）である。RIPは二つの異
なるグループに分類することができる。第２種のRIPは
リシン、アブリン、モデシン及びビスクミンのような、
細胞結合性のＢ鎖と結合した活性のＡ鎖から成る毒素で
ある。第１種のRIPは、Phytolacca dodecandra、Phytol
acca americana、Dianthus caryophyllus、Gelonium mu
ltiflorum、Momordica charantia、Saponaria officina
lisその他の植物から抽出された。それらのRIPは、タン
パク質合成を阻害する生物活性は有するが第２種RIPの
ような細胞結合活性は有しない単一鎖タンパク質であ
る。細胞結合能を持たないので、第１種RIPは毒性でな
い。1983年にStirpe et al.が、優秀な安定性を有する
第１種RIP、即ちSO−６について報告している。SO−６
は凍結乾燥可能であり、かつ室温で長期間乾燥状態を保
ち得る。そのうえ、37℃で一晩トリプシンあるいはキモ
トリプシンで処理してもRIP活性が低下しない。このこ
とは、血流を介して循環しなければならないタンパク質
にとって重要な特性である。
を阻害する。そのような抽出物は、ほとんどの場合リボ
ソーム不活化タンパク質（RIP）である。RIPは二つの異
なるグループに分類することができる。第２種のRIPは
リシン、アブリン、モデシン及びビスクミンのような、
細胞結合性のＢ鎖と結合した活性のＡ鎖から成る毒素で
ある。第１種のRIPは、Phytolacca dodecandra、Phytol
acca americana、Dianthus caryophyllus、Gelonium mu
ltiflorum、Momordica charantia、Saponaria officina
lisその他の植物から抽出された。それらのRIPは、タン
パク質合成を阻害する生物活性は有するが第２種RIPの
ような細胞結合活性は有しない単一鎖タンパク質であ
る。細胞結合能を持たないので、第１種RIPは毒性でな
い。1983年にStirpe et al.が、優秀な安定性を有する
第１種RIP、即ちSO−６について報告している。SO−６
は凍結乾燥可能であり、かつ室温で長期間乾燥状態を保
ち得る。そのうえ、37℃で一晩トリプシンあるいはキモ
トリプシンで処理してもRIP活性が低下しない。このこ
とは、血流を介して循環しなければならないタンパク質
にとって重要な特性である。
SO−６は分子量30,000のタンパク質である。SO−６
は、Ｎ末端配列においてPhytolacca americana由来のRI
Pと40％アミノ酸配列相同であるが、免疫学的にはこのR
IP並びに他の幾つかのRIPから区別される（Lappi et a
l.,1985）。構造的に高い関連性を有するのは、Saponar
ia officinalisの種子中に存在するタンパク質群の主要
タンパク質種である。それらの種はいずれも、SO−６に
対する抗血清と交叉反応する（Lappi et al.,1986）。T
horpe et al.（1985）はSO−６をイムノトキシンの製造
に用い、製造したイムノトキシンをマウスAKR−Ａリン
パ腫充実性腫瘍に対してin vivoで試験して、培養組織
及び生体の両方のThy−1.1表現細胞に対する特異的細胞
毒性を認めた。
は、Ｎ末端配列においてPhytolacca americana由来のRI
Pと40％アミノ酸配列相同であるが、免疫学的にはこのR
IP並びに他の幾つかのRIPから区別される（Lappi et a
l.,1985）。構造的に高い関連性を有するのは、Saponar
ia officinalisの種子中に存在するタンパク質群の主要
タンパク質種である。それらの種はいずれも、SO−６に
対する抗血清と交叉反応する（Lappi et al.,1986）。T
horpe et al.（1985）はSO−６をイムノトキシンの製造
に用い、製造したイムノトキシンをマウスAKR−Ａリン
パ腫充実性腫瘍に対してin vivoで試験して、培養組織
及び生体の両方のThy−1.1表現細胞に対する特異的細胞
毒性を認めた。
Siena et al.（1987）は、CD2、CD3及びCD5 T細胞抗
原をそれぞれ検出するモノクローナル抗体にSO−６を結
合させて５種類のイムノトキシンを合成した。これらの
イムノトキシンはセルフリーアッセイにおいて末梢血リ
ンパ球（PBL）と結合し、タンパク質合成を阻害した。
温度37℃で２時間経過後、マイトジェンによって誘発さ
れるタンパク質合成並びに細胞増殖が容量次第で阻害さ
れ、一方結合させなかったSO−６あるいは抗体は単独で
は細胞毒性ではなかった。細胞毒性は、予保温（プレイ
ンキュベーション）を未結合の抗CD5抗体を伴って行な
うとブロックされたが抗CD5以外の未結合抗体を伴って
行なってもブロックされず、即ちこのことは、細胞毒性
のブロックがCD5＋細胞との特異的結合によってもたら
されたことを示唆する。
原をそれぞれ検出するモノクローナル抗体にSO−６を結
合させて５種類のイムノトキシンを合成した。これらの
イムノトキシンはセルフリーアッセイにおいて末梢血リ
ンパ球（PBL）と結合し、タンパク質合成を阻害した。
温度37℃で２時間経過後、マイトジェンによって誘発さ
れるタンパク質合成並びに細胞増殖が容量次第で阻害さ
れ、一方結合させなかったSO−６あるいは抗体は単独で
は細胞毒性ではなかった。細胞毒性は、予保温（プレイ
ンキュベーション）を未結合の抗CD5抗体を伴って行な
うとブロックされたが抗CD5以外の未結合抗体を伴って
行なってもブロックされず、即ちこのことは、細胞毒性
のブロックがCD5＋細胞との特異的結合によってもたら
されたことを示唆する。
毒素とリガンドとの間に融合遺伝子を構成するのに、
組み換え体DNA法が用いられている。そのような構成の
第一の例を提示したMurphy et al.（1986）は、切り取
られたジフテリア毒素フラグメントをコードする遺伝子
とメラニン細胞刺激ホルモン（α−MSH）をコードする
遺伝子とを融合した。この毒素−ホルモンキメラ遺伝子
の発現によって、ジフテリア毒素のADP−リボシルトラ
ンスフェラーゼ活性を保持し、かつ該毒素の脂質関連ド
メインを保有する融合タンパク質が得られた。しかし、
ジフテリア毒素のレセプター結合ドメインはMSH配列に
置き換えられた。このキメラ毒素は、培養中のMSHレセ
プター陽性であるヒト黒色腫細胞にとっては毒性である
が、α−MSHレセプターを欠くチャイニーズハムスター
卵巣細胞やアフリカミドリザル腎臓細胞にとっては毒性
でないことが判明した。
組み換え体DNA法が用いられている。そのような構成の
第一の例を提示したMurphy et al.（1986）は、切り取
られたジフテリア毒素フラグメントをコードする遺伝子
とメラニン細胞刺激ホルモン（α−MSH）をコードする
遺伝子とを融合した。この毒素−ホルモンキメラ遺伝子
の発現によって、ジフテリア毒素のADP−リボシルトラ
ンスフェラーゼ活性を保持し、かつ該毒素の脂質関連ド
メインを保有する融合タンパク質が得られた。しかし、
ジフテリア毒素のレセプター結合ドメインはMSH配列に
置き換えられた。このキメラ毒素は、培養中のMSHレセ
プター陽性であるヒト黒色腫細胞にとっては毒性である
が、α−MSHレセプターを欠くチャイニーズハムスター
卵巣細胞やアフリカミドリザル腎臓細胞にとっては毒性
でないことが判明した。
最近、Williams et al.（1987）が、インターロイキ
ン２（IL2）をコードする遺伝子をジフテリア毒素断片
遺伝子と融合させても生物活性なキメラIL2毒素が発現
されることを示して、上述のような以前からの観測を拡
大した。上記融合タンパク質は、このハイブリッドのリ
ガンドコンポーネントのための特異的表面レセプターを
有する活性化されたＴ細胞あるいは悪性のＴ細胞を選択
的に標的とすることが判明し、該融合タンパク質はIL2
レセプターとのin vitro結合に続くレセプター媒介エン
ドサイトーシスによって細胞内に取り込まれた。
ン２（IL2）をコードする遺伝子をジフテリア毒素断片
遺伝子と融合させても生物活性なキメラIL2毒素が発現
されることを示して、上述のような以前からの観測を拡
大した。上記融合タンパク質は、このハイブリッドのリ
ガンドコンポーネントのための特異的表面レセプターを
有する活性化されたＴ細胞あるいは悪性のＴ細胞を選択
的に標的とすることが判明し、該融合タンパク質はIL2
レセプターとのin vitro結合に続くレセプター媒介エン
ドサイトーシスによって細胞内に取り込まれた。
部位突然変異によって細胞認識ドメインを欠失させ
た、クローン化したシュードモナス毒素（PE）を形質転
換成長因子α（TGF−α）と融合させた。大腸菌から精
製したこのキメラタンパク質は上皮成長因子レセプター
を発現する細胞を殺したが、上記レセプターを数個しか
有しない細胞に対しては僅かな活性しか示さなかった
（Chaudhary et al.,1987）。
た、クローン化したシュードモナス毒素（PE）を形質転
換成長因子α（TGF−α）と融合させた。大腸菌から精
製したこのキメラタンパク質は上皮成長因子レセプター
を発現する細胞を殺したが、上記レセプターを数個しか
有しない細胞に対しては僅かな活性しか示さなかった
（Chaudhary et al.,1987）。
本出願人はここに、Saponaria officinalisの第１種R
IP SO−６をコードする遺伝子をクローン化し、かつ発
現させた。従って本発明は、DAN配列： を提供する。
IP SO−６をコードする遺伝子をクローン化し、かつ発
現させた。従って本発明は、DAN配列： を提供する。
この配列の前にシグナル配列が位置し得る。好ましく
は、シグナル配列は である。
は、シグナル配列は である。
配列の最後のコドンAACの後に、TAGのような終結コド
ンを付加することができる。あるいは、細胞と結合し得
るリガンド／ハプトマーと融合したRIPを含む融合タン
パク質を得ることが所望である場合は、終結コドンを付
加しないことも可能である。
ンを付加することができる。あるいは、細胞と結合し得
るリガンド／ハプトマーと融合したRIPを含む融合タン
パク質を得ることが所望である場合は、終結コドンを付
加しないことも可能である。
RIP SO−６をコードするDNA配列は、 （i ） Saponaria officinalisからmRNAを単離するこ
と、 （ii ） 上記mRNAからcDNAを合成すること、 （iii） 得られたcDNAをクローニングベクターに***
してcDNAライブラリーを得ること、 （iv ） RIP SO−６のアミノ酸配列の一部に対応する
標識したDNAプローブでcDNAライブラリーを探り、上記D
NA配列を含むクローンの位置を確認すること、及び （v ） 任意に、クローンから上記DNA配列を含むDNA
配列を単離すること を含む方法によって得ることができる。
と、 （ii ） 上記mRNAからcDNAを合成すること、 （iii） 得られたcDNAをクローニングベクターに***
してcDNAライブラリーを得ること、 （iv ） RIP SO−６のアミノ酸配列の一部に対応する
標識したDNAプローブでcDNAライブラリーを探り、上記D
NA配列を含むクローンの位置を確認すること、及び （v ） 任意に、クローンから上記DNA配列を含むDNA
配列を単離すること を含む方法によって得ることができる。
mRNAは、好ましくはSaponaria officinalisの葉ある
いは種子から抽出する。cDNAは標準的な手続きに従って
製造することができる。例えば、cDNAの第一の鎖は逆転
写酵素を用いて合成可能である。第二の鎖は一般的に
は、まずDNAポリメラーゼを、次にT4ポリヌクレオチド
キナーゼを用いて合成する。
いは種子から抽出する。cDNAは標準的な手続きに従って
製造することができる。例えば、cDNAの第一の鎖は逆転
写酵素を用いて合成可能である。第二の鎖は一般的に
は、まずDNAポリメラーゼを、次にT4ポリヌクレオチド
キナーゼを用いて合成する。
cDNAライブラリーを得るべく、cDNAをクローニングベ
クターに***する。クローニングベクターはプラスミド
あるいはファージウイルスベクターであり得る。プラス
ミドの場合、クローニングベクターは天然のプラスミド
か、あるいは好ましくは様々なプラスミドのフラグメン
トに由来する複合プラスミドであり得る。プラスミド
は、RIP遺伝子の発現を促進するプロモーター配列を含
み得る。cDNAライブラリーは、例えば大腸菌のような適
当な宿主内で増幅させることができる。
クターに***する。クローニングベクターはプラスミド
あるいはファージウイルスベクターであり得る。プラス
ミドの場合、クローニングベクターは天然のプラスミド
か、あるいは好ましくは様々なプラスミドのフラグメン
トに由来する複合プラスミドであり得る。プラスミド
は、RIP遺伝子の発現を促進するプロモーター配列を含
み得る。cDNAライブラリーは、例えば大腸菌のような適
当な宿主内で増幅させることができる。
cDNAライブラリーを、求める対象の遺伝子に対応する
RIPのアミノ酸配列の一部に対応する１種以上の標識し
たDNA配列をプローブとして探る。RIPのDNA配列が未知
である場合、DNAプローブ配列はRIPのアミノ酸配列から
推定することができる。プローブ配列はRIPのＣ末端部
分あるいはＮ末端部分に対応し得る。プローブ配列の長
さは120bp以下であり得る。放射能標識を用いることが
可能である。
RIPのアミノ酸配列の一部に対応する１種以上の標識し
たDNA配列をプローブとして探る。RIPのDNA配列が未知
である場合、DNAプローブ配列はRIPのアミノ酸配列から
推定することができる。プローブ配列はRIPのＣ末端部
分あるいはＮ末端部分に対応し得る。プローブ配列の長
さは120bp以下であり得る。放射能標識を用いることが
可能である。
こうして、cDNAライブラリー中に１個以上存在する、
所望RIPをコードするDNA配列を含むクローンの位置を確
認することができる。上記DNA配列、あるいは該配列を
含むより長いDNA配列は適当な制限エンドヌクレアーゼ
を用いて単離し得る。これにより、得られたDNA配列を
所望のようにクローン化し、発現させることが可能とな
る。
所望RIPをコードするDNA配列を含むクローンの位置を確
認することができる。上記DNA配列、あるいは該配列を
含むより長いDNA配列は適当な制限エンドヌクレアーゼ
を用いて単離し得る。これにより、得られたDNA配列を
所望のようにクローン化し、発現させることが可能とな
る。
RIP SO−６を得るために、本発明によるDNA配列を、
形質転換した宿主内でRIP SO−６を発現させ得る発現ベ
クターに組み込む。発現ベクター中に本発明のDNA配列
を、発現調節要素、特にプロモーターと有効に結合させ
て配置する。ベクターは一般に複製起点と表現型マーカ
ーとを有する。発現するべきDNA配列は、翻訳開始シグ
ナルと翻訳停止シグナルとの間に位置する。ベクターは
普通プラスミドである。
形質転換した宿主内でRIP SO−６を発現させ得る発現ベ
クターに組み込む。発現ベクター中に本発明のDNA配列
を、発現調節要素、特にプロモーターと有効に結合させ
て配置する。ベクターは一般に複製起点と表現型マーカ
ーとを有する。発現するべきDNA配列は、翻訳開始シグ
ナルと翻訳停止シグナルとの間に位置する。ベクターは
普通プラスミドである。
本発明によるDNA配列には、例えばイムノトキシンの
発現が所望である場合、細胞と結合し得るリガンド／ハ
プトマーをコードする配列を更に含ませることもでき
る。リガンド／ハプトマーは、腫瘍細胞抗原に特異的な
モノクローナル抗体又はそのＦ（ab′）２フラグメント
であり得る。その場合、リガンド／ハプトマーは抗Ｔ細
胞抗体であり得る。あるいは他の場合には、リガンド／
ハプトマーは特定のレセプター部位に結合するホルモン
タンパク質であり得る。また、本発明によって生成した
RIPにリガンド／ハプトマーを化学的に結合させてイム
ノトキシンを得ることも可能である。
発現が所望である場合、細胞と結合し得るリガンド／ハ
プトマーをコードする配列を更に含ませることもでき
る。リガンド／ハプトマーは、腫瘍細胞抗原に特異的な
モノクローナル抗体又はそのＦ（ab′）２フラグメント
であり得る。その場合、リガンド／ハプトマーは抗Ｔ細
胞抗体であり得る。あるいは他の場合には、リガンド／
ハプトマーは特定のレセプター部位に結合するホルモン
タンパク質であり得る。また、本発明によって生成した
RIPにリガンド／ハプトマーを化学的に結合させてイム
ノトキシンを得ることも可能である。
本発明による発現ベクターで形質転換した宿主は、所
望のRIPを得るべく、あるいは上記発現ベクターに組み
込まれたDNA配列がイムノトキシンのリガンド部分をコ
ードする配列をも含む場合には所望のイムノトキシンを
得るべく培養することができる。宿主は適当なものを用
い得、例えば植物細胞、動物細胞あるいは微生物などで
あり得る。大腸菌のような細菌宿主を用いることもでき
る。発現されたRIPあるいはイムノトキシンは、標準的
な方法で培養物から単離し得る。
望のRIPを得るべく、あるいは上記発現ベクターに組み
込まれたDNA配列がイムノトキシンのリガンド部分をコ
ードする配列をも含む場合には所望のイムノトキシンを
得るべく培養することができる。宿主は適当なものを用
い得、例えば植物細胞、動物細胞あるいは微生物などで
あり得る。大腸菌のような細菌宿主を用いることもでき
る。発現されたRIPあるいはイムノトキシンは、標準的
な方法で培養物から単離し得る。
上記のように発現されたイムノトキシン、あるいは細
胞と結合し得るリガンドを発現されたRIPに結合させて
得たイムノトキシンは、通常投与のために薬学的に許容
可能なキャリヤあるいは稀釈剤と配合する。イムノトキ
シンは注射によって投与可能である。その場合、イムノ
トキシンは注射用水あるいは生理食塩水のような発熱物
質を含有しない無菌液体と配合し得る。
胞と結合し得るリガンドを発現されたRIPに結合させて
得たイムノトキシンは、通常投与のために薬学的に許容
可能なキャリヤあるいは稀釈剤と配合する。イムノトキ
シンは注射によって投与可能である。その場合、イムノ
トキシンは注射用水あるいは生理食塩水のような発熱物
質を含有しない無菌液体と配合し得る。
本発明を、実施例によって以下に詳述する。
実施例 （１） Saponaria officinalis SO−6 RIPのCNBrフラ
グメントのアミノ酸配列 SO−６精製 SO−６を、先に述べたStirpe et al.（1983）の方法
に従って製造した。
グメントのアミノ酸配列 SO−６精製 SO−６を、先に述べたStirpe et al.（1983）の方法
に従って製造した。
CNBr開裂及びフラグメント精製 10mgの精製SO−６を70％蟻酸300μｌに溶解させた。
約30mgのCNBrを添加し、室温で14〜18時間経過後反応混
合物を脱イオン水で稀釈して3mlとし、凍結乾燥した。
得られたペプチドを、Sephadex G−100及び疎水性逆相H
PLCでのゲル過によって精製した。
約30mgのCNBrを添加し、室温で14〜18時間経過後反応混
合物を脱イオン水で稀釈して3mlとし、凍結乾燥した。
得られたペプチドを、Sephadex G−100及び疎水性逆相H
PLCでのゲル過によって精製した。
アミノ酸及び配列分析 PICO−TAGアナライザー（Waters）でアミノ酸分析を
実施した。真空下に、フェノール１％含有の絶えず沸騰
するHCl中で温度105℃において24時間加水分解を生起さ
せた。ガス相シークエネーター（Applied Biosystems I
nc.製）で配列分析を行なった。第１図に、SO−６の５
種類のCNBrフラグメントのアミノ酸配列写を示す。アミ
ノ酸分析において、ホモセリンの欠失によりＣ末端CNBr
フラグメントのCNBr5を同定した。
実施した。真空下に、フェノール１％含有の絶えず沸騰
するHCl中で温度105℃において24時間加水分解を生起さ
せた。ガス相シークエネーター（Applied Biosystems I
nc.製）で配列分析を行なった。第１図に、SO−６の５
種類のCNBrフラグメントのアミノ酸配列写を示す。アミ
ノ酸分析において、ホモセリンの欠失によりＣ末端CNBr
フラグメントのCNBr5を同定した。
（２） cDNAライブラリー作製 RNA抽出 10〜20gの冷凍葉を、Ultra Turraxを最高速で５分間
作動させて60mlの4.2Mグアニジン−チオシアネート、25
mMクエン酸ナトリウム、５％サルコシル、0.7mMメルカ
プトエタノール、0.01％消泡剤（pH7）中で均質化し
た。得られた均質スラリーを滅菌ガーゼで過し、温度
４℃において10分間5,000rpmで遠心分離した。上澄み液
5.7M CsCl、pH5.4の25mM酢酸ナトリウム、0.1M EDTAの
上に重ね、温度20℃において20時間SW 40ローターで31,
000rpmで遠心分離した。全RNAペレットを冷たい70％エ
タノールで洗浄し、数ミリリットルの10mMトリスHCl、5
mM EDTA pH7中に再懸濁させて一旦クロロホルムで抽出
し、塩を調節して0.3M酢酸ナトリウムとし、2.5容量の
冷エタノールで析出させた。−80℃で１時間から数時間
経過後、RNAをSorvall遠心分離機において10,000rpmで
１時間遠心分離した。ペレットを冷たい70％エタノール
で洗浄し、結合緩衝液中に再懸濁させた。
作動させて60mlの4.2Mグアニジン−チオシアネート、25
mMクエン酸ナトリウム、５％サルコシル、0.7mMメルカ
プトエタノール、0.01％消泡剤（pH7）中で均質化し
た。得られた均質スラリーを滅菌ガーゼで過し、温度
４℃において10分間5,000rpmで遠心分離した。上澄み液
5.7M CsCl、pH5.4の25mM酢酸ナトリウム、0.1M EDTAの
上に重ね、温度20℃において20時間SW 40ローターで31,
000rpmで遠心分離した。全RNAペレットを冷たい70％エ
タノールで洗浄し、数ミリリットルの10mMトリスHCl、5
mM EDTA pH7中に再懸濁させて一旦クロロホルムで抽出
し、塩を調節して0.3M酢酸ナトリウムとし、2.5容量の
冷エタノールで析出させた。−80℃で１時間から数時間
経過後、RNAをSorvall遠心分離機において10,000rpmで
１時間遠心分離した。ペレットを冷たい70％エタノール
で洗浄し、結合緩衝液中に再懸濁させた。
葉から回収した全RNAの量は、葉1gにつき約1mgであっ
た。
た。
オリゴ（dT）−セルロースでのアフィニティークロマ
トグラフィーによってポリ（Ａ）＋RNAを単離した（Avi
v and Leder,1972）。
トグラフィーによってポリ（Ａ）＋RNAを単離した（Avi
v and Leder,1972）。
回収したポリ（Ａ）＋RNAの量は、全RNA1mgにつき約2
0μｇであった。ホルムアルデヒドを含む１％アガロー
スゲルにおいてポリ（Ａ）＋RNAの長さを確認した。こ
のRNAの大きさは数kbから数百塩基であった。
0μｇであった。ホルムアルデヒドを含む１％アガロー
スゲルにおいてポリ（Ａ）＋RNAの長さを確認した。こ
のRNAの大きさは数kbから数百塩基であった。
第一のcDNA鎖の合成 第一のcDNA鎖の合成を、50μｌの50mMトリスHCl緩衝
液pH8.5、40mM KCl、10mM MgCl2、0.4mM DTT;1mM dATP;
1mM dGTP;1mM dTTP;0.5mM dCTP;0.1mg/mlオリゴ（dT）
12〜18;25Uヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤;20μCi
［α−32P］dCTP3,000Ci/mmol、５μｇポリ（Ａ）＋RNA
並びに40単位のAMV逆転写酵素中で温度42℃で40分間実
施した。
液pH8.5、40mM KCl、10mM MgCl2、0.4mM DTT;1mM dATP;
1mM dGTP;1mM dTTP;0.5mM dCTP;0.1mg/mlオリゴ（dT）
12〜18;25Uヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤;20μCi
［α−32P］dCTP3,000Ci/mmol、５μｇポリ（Ａ）＋RNA
並びに40単位のAMV逆転写酵素中で温度42℃で40分間実
施した。
第二のcDNA鎖の合成 第一のcDNA鎖の反応混合物に、93,5μｌの第二鎖緩衝
液（100mM HEPES pH6.9、100mM KCl、10mM MgCl2）;20
μCi［α−32P］dCTP3,000Ci/mmol;4U大腸菌リボヌクレ
アーゼH;115U大腸菌DNAポリメラーゼＩを添加して、最
終量を250μｌとした。
液（100mM HEPES pH6.9、100mM KCl、10mM MgCl2）;20
μCi［α−32P］dCTP3,000Ci/mmol;4U大腸菌リボヌクレ
アーゼH;115U大腸菌DNAポリメラーゼＩを添加して、最
終量を250μｌとした。
反応混合物を12℃に１時間、22℃に１時間、更に70℃
に10分間保温した。混合物を氷上で冷却してから10UのT
4 DNAポリメラーゼを添加し、その後10分間混合物を37
℃に保温した。
に10分間保温した。混合物を氷上で冷却してから10UのT
4 DNAポリメラーゼを添加し、その後10分間混合物を37
℃に保温した。
EcoR Iリンカーの添加並びにEcoR I消化 フェノール：クロロホルム（1:1）抽出及びエタノー
ル析出によってcDNAを精製した。T4 DNAリガーゼ1Uの存
在下に、66mMトリスHCl pH7.5、5mM MgCl2、5mMジチオ
トレイトール並びに1mM ATP（連結反応緩衝液）を含有
する反応物20μｌ中の二重鎖cDNA析出物にホスホリル化
したEcoR Iリンカー1mgを添加した。混合物を一晩12℃
に保温した。
ル析出によってcDNAを精製した。T4 DNAリガーゼ1Uの存
在下に、66mMトリスHCl pH7.5、5mM MgCl2、5mMジチオ
トレイトール並びに1mM ATP（連結反応緩衝液）を含有
する反応物20μｌ中の二重鎖cDNA析出物にホスホリル化
したEcoR Iリンカー1mgを添加した。混合物を一晩12℃
に保温した。
NaCl及びスペルミジンを添加して最終濃度をそれぞれ
100mM及び2.5mMとし、また30単位のEcoR Iをも添加して
最終量を100μｌとした後、混合物を２時間37℃に保温
した。
100mM及び2.5mMとし、また30単位のEcoR Iをも添加して
最終量を100μｌとした後、混合物を２時間37℃に保温
した。
混合物をSepharose 4Bカラムの0.3M NaCl、10mMトリ
スHCl pH8、1mM EDTAに通して、組み込まれていないリ
ンカーからcDNAを精製した。8kbから0.5kbの大きさのcD
NAフラクションをプールし、エタノール析出させた。
スHCl pH8、1mM EDTAに通して、組み込まれていないリ
ンカーからcDNAを精製した。8kbから0.5kbの大きさのcD
NAフラクションをプールし、エタノール析出させた。
cDNAのλgt 10アーム（arms）との連結反応並びにin vi
troパッケージング 最終量５μｌの連結反応緩衝液中で0.5μｇのλgt 10
アーム（arms）をT4 DNAリガーゼ2.5単位によってcDNA
と連結させ、一晩15℃に保温した。
troパッケージング 最終量５μｌの連結反応緩衝液中で0.5μｇのλgt 10
アーム（arms）をT4 DNAリガーゼ2.5単位によってcDNA
と連結させ、一晩15℃に保温した。
その後DNAをエタノール析出させ、in vitroパッケー
ジング混合物（Amersham）でのin vitroパッケージング
のため2.5μｌの10mMトリスHCl pH7.5、1mM EDTA中に入
念に再懸濁させた。
ジング混合物（Amersham）でのin vitroパッケージング
のため2.5μｌの10mMトリスHCl pH7.5、1mM EDTA中に入
念に再懸濁させた。
得られたライブラリーを大腸菌NM514宿主を用いて増
幅させた。得られた独立クローンの数は、36％の非組み
換え体相を背景に3.3×1010であった。
幅させた。得られた独立クローンの数は、36％の非組み
換え体相を背景に3.3×1010であった。
（３） cDNAライブラリーのスクリーニングオリゴヌク
レオチドの合成 ａ）長さ111bpのオリゴヌクレオチドの合成 この長いオルゴヌクレオチドは、SO−6 RIPのNH2末端
に位置するアミノ酸の最初の37個に対応した。配列デー
タベース（GenBank）から推定できる範囲で配列決定し
た種子貯蔵タンパク質のコドン頻度に基づいてコドン使
用を選択した。Applied Biosystems Inc.の自動DNA合成
装置Mod380Bを用いてこの長いオリゴヌクレオチドを合
成し、逆相HPLCによって精製し、かつ８種の異なるオリ
ゴヌクレオチド（長さ19〜28塩基）と組み合わせて二重
鎖状にした。
レオチドの合成 ａ）長さ111bpのオリゴヌクレオチドの合成 この長いオルゴヌクレオチドは、SO−6 RIPのNH2末端
に位置するアミノ酸の最初の37個に対応した。配列デー
タベース（GenBank）から推定できる範囲で配列決定し
た種子貯蔵タンパク質のコドン頻度に基づいてコドン使
用を選択した。Applied Biosystems Inc.の自動DNA合成
装置Mod380Bを用いてこの長いオリゴヌクレオチドを合
成し、逆相HPLCによって精製し、かつ８種の異なるオリ
ゴヌクレオチド（長さ19〜28塩基）と組み合わせて二重
鎖状にした。
オリゴヌクレオチド同士を連結反応させ、得られた二
重鎖オリゴヌクレオチドをM13mp8のSma I部位に***
し、ヌクレオチド配列を確認するべく配列分析を行なっ
た。
重鎖オリゴヌクレオチドをM13mp8のSma I部位に***
し、ヌクレオチド配列を確認するべく配列分析を行なっ
た。
ｂ）短いオリゴヌクレオチドの合成 SO−６のＣ末端のCNBrフラグメントに対応する16種の
短い（21塩基）オリゴヌクレオチドの混合物を、上記Ap
plied Biosystems Inc.製の合成装置を用いて合成し
た。
短い（21塩基）オリゴヌクレオチドの混合物を、上記Ap
plied Biosystems Inc.製の合成装置を用いて合成し
た。
オリゴヌクレオチドの標識 ａ）111bpの“長い”オリゴヌクレオチド 上述のようにss DNAファージM13mp8に***したこのオ
リゴヌクレオチドを、該オリゴヌクレオチドに隣接する
M13配列と相補的なプライマーヘアニーリングした後、D
NAポリメラーゼによって標識した。30μｌの7mMトリスH
Cl pH7.5、7mM MgCl2、50mM NaCl、10mM DTT、0.1mM ED
TA pH8.0（１×Klenow緩衝液）中でM13mp8−111オリゴ
ヌクレオチド５μｇを温度60℃で１時間約６μｇのプラ
イマーとアニーリングさせ、50μｌの［α−32P］dCTP
3,000Ci/mmol、dCTP、dTTP、最終濃度50μＭのdATP、並
びに５単位のDNAポリメラーゼ（Klenowフラグメント）
を添加して最終量45μｌとした。
リゴヌクレオチドを、該オリゴヌクレオチドに隣接する
M13配列と相補的なプライマーヘアニーリングした後、D
NAポリメラーゼによって標識した。30μｌの7mMトリスH
Cl pH7.5、7mM MgCl2、50mM NaCl、10mM DTT、0.1mM ED
TA pH8.0（１×Klenow緩衝液）中でM13mp8−111オリゴ
ヌクレオチド５μｇを温度60℃で１時間約６μｇのプラ
イマーとアニーリングさせ、50μｌの［α−32P］dCTP
3,000Ci/mmol、dCTP、dTTP、最終濃度50μＭのdATP、並
びに５単位のDNAポリメラーゼ（Klenowフラグメント）
を添加して最終量45μｌとした。
15分間室温に保温した後１μｌの1mM dCTPを添加し、
この混合物を再び15分間室温に保温した。
この混合物を再び15分間室温に保温した。
前記DNAポリメラーゼを70℃で10分間失活させた。1.3
μｌの5M NaCl並びに各20単位のEcoR I及びBamH Iの添
加後、長さ111bpのオリグヌクレオチドをファージベク
ターから切り出すべく混合物を37℃に２時間保温した。
その後、オリゴヌクレオチドを3.5％PAGEにおいてベク
ターから分離し、かつ一晩37℃のH2O中に溶離した。比
活性は、DNA1μｇ当たり約５×108DPMであった。
μｌの5M NaCl並びに各20単位のEcoR I及びBamH Iの添
加後、長さ111bpのオリグヌクレオチドをファージベク
ターから切り出すべく混合物を37℃に２時間保温した。
その後、オリゴヌクレオチドを3.5％PAGEにおいてベク
ターから分離し、かつ一晩37℃のH2O中に溶離した。比
活性は、DNA1μｇ当たり約５×108DPMであった。
ｂ）“短い”混合オリゴヌクレオチド 短い（21bp）オルゴヌクレオチドの混合物を、1986年
にDavies et al.が述べているようにT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いて末端標識した。
にDavies et al.が述べているようにT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いて末端標識した。
プローブとしてオリゴヌクレオチドを用いるプラークハ
イブリダイゼーション ａ）cDNAライブラリーの、長さ111bpのオリゴヌクレオ
チドでのスクリーニング 約200,000個のファージを、密集状態の大腸菌NM514細
胞上で平板培養した。37℃で一晩成長させた後、組み換
え体ファージを二重ニトロセルロースフィルターに移
し、そのDNAを変性させ、中和し、かつ真空下に80℃で
２時間ベークした。
イブリダイゼーション ａ）cDNAライブラリーの、長さ111bpのオリゴヌクレオ
チドでのスクリーニング 約200,000個のファージを、密集状態の大腸菌NM514細
胞上で平板培養した。37℃で一晩成長させた後、組み換
え体ファージを二重ニトロセルロースフィルターに移
し、そのDNAを変性させ、中和し、かつ真空下に80℃で
２時間ベークした。
該フィルターを、まず６×SSC、５×Denhardt′ｓ、
0.1％SDS、100μg/mlサケ***DNA中、50℃で２時間掛け
てハイブリダイゼーションした。
0.1％SDS、100μg/mlサケ***DNA中、50℃で２時間掛け
てハイブリダイゼーションした。
これを更に、上記と同じ混合物に標識したプローブ
（プローブａ）１×106cpm/mlを添加したものの中で50
℃で一晩ハイブリダイゼーションした。該フィルターを
60℃の0.1×SSC、0.1％SDSで洗浄し、オートラジオグラ
フィーに掛けた。
（プローブａ）１×106cpm/mlを添加したものの中で50
℃で一晩ハイブリダイゼーションした。該フィルターを
60℃の0.1×SSC、0.1％SDSで洗浄し、オートラジオグラ
フィーに掛けた。
陽性ファージプラークを単離し、単独クローンを単離
するべく更に２回スクリーニングした。
するべく更に２回スクリーニングした。
ｂ）陽性クローンの、オリゴヌクレオチド混合物（プロ
ーブｂ）でのスクリーニング 111bpプローブとのハイブリッドを形成したクローン
を平板培養し、標識した“短い”オルゴヌクレオチドの
混合物でスクリーニングした。
ーブｂ）でのスクリーニング 111bpプローブとのハイブリッドを形成したクローン
を平板培養し、標識した“短い”オルゴヌクレオチドの
混合物でスクリーニングした。
このフィルターを、まず６×SSC、５×Denhardt′
ｓ、0.1％SDSS、100μg/mlサケ***DNA中で42℃でハイ
ブリダイゼーションした。
ｓ、0.1％SDSS、100μg/mlサケ***DNA中で42℃でハイ
ブリダイゼーションした。
続いて標識オリゴヌクレオチド混合物を添加してか
ら、上記フィルターを42℃で一晩ハイブリダイゼーショ
ンした。
ら、上記フィルターを42℃で一晩ハイブリダイゼーショ
ンした。
その後、フィルターを45℃の６×SSC、0.1％SDS中で
洗浄し、オートラジオグラフィーに掛けた。両プローブ
に陽性のクローンを１個単離し、配列を分析した。
洗浄し、オートラジオグラフィーに掛けた。両プローブ
に陽性のクローンを１個単離し、配列を分析した。
DNA配列分析 陽性クローンpBL6のDNAをPromega LambdaSorbファー
ジ吸着剤法で単離し、***断片をEcoR Iで除去し、かつ
両方向においてM13mp8のEcoR I部位と連結させた。pBL6
クローンの制限エンドヌクレアーゼ地図を第２図に示
す。配列分析はSanger法で行なった。遺伝子の両方の鎖
を配列分析したところ、280アミノ酸のタンパク質をコ
ードする読み取り枠が明らかになった。
ジ吸着剤法で単離し、***断片をEcoR Iで除去し、かつ
両方向においてM13mp8のEcoR I部位と連結させた。pBL6
クローンの制限エンドヌクレアーゼ地図を第２図に示
す。配列分析はSanger法で行なった。遺伝子の両方の鎖
を配列分析したところ、280アミノ酸のタンパク質をコ
ードする読み取り枠が明らかになった。
Lappi et al.（1985）が報告しているSO−６の公知Ｎ
末端アミノ酸配列をクローンpBL6の配列と比較すること
により、本発明クローンによってコードされた成熟タン
パク質のアミノ酸配列開始点を予測できた（第３図）。
翻訳開始部位は、ヌクレオチド残基−72〜−70に位置す
るメチオニンコドンｄ（ATG）によって規定された。第
３図に示した配列から、Ｎ末端でシグナルペプチドであ
る24個のアミノ酸が伸長することが予測できる。このデ
ータはリシンシグナルペプチドの長さ（24アミノ酸）に
一致する。しかし、SO−６のCNBrフラグメントを予測さ
れたクローンpBL6のアミノ酸配列と比較したところ、個
々のアミノ酸残基において六つの相違が判明した（第４
図）。このことは、アミノ酸配列決定上の誤りか、ある
いはSaponaria officinalisから精製したRIPにおける配
列の不均一性（Stirpe et al.,1983）に起因し得よう。
末端アミノ酸配列をクローンpBL6の配列と比較すること
により、本発明クローンによってコードされた成熟タン
パク質のアミノ酸配列開始点を予測できた（第３図）。
翻訳開始部位は、ヌクレオチド残基−72〜−70に位置す
るメチオニンコドンｄ（ATG）によって規定された。第
３図に示した配列から、Ｎ末端でシグナルペプチドであ
る24個のアミノ酸が伸長することが予測できる。このデ
ータはリシンシグナルペプチドの長さ（24アミノ酸）に
一致する。しかし、SO−６のCNBrフラグメントを予測さ
れたクローンpBL6のアミノ酸配列と比較したところ、個
々のアミノ酸残基において六つの相違が判明した（第４
図）。このことは、アミノ酸配列決定上の誤りか、ある
いはSaponaria officinalisから精製したRIPにおける配
列の不均一性（Stirpe et al.,1983）に起因し得よう。
（４） 大腸菌における発現 クローンpBL6の持つSO−６遺伝子から始め、900bpのE
coR Iフラグメント（第２図）をベクターpUC 8（Amersh
am,U.K.）のEcoR I部位へとサブクローン化した。こう
して得たプラスミドをBgl II及びPst Iで切断して、SO
−６遺伝子を含むがシグナルペプチド並びに最初の６ア
ミノ酸残基をコードする５′領域に欠けるフラグメント
を回収した（第２図及び第３図）。フラグメントの３′
末端には、SO−6 cDNAに続き、EcoR I部位とPst I部位
との間に位置するpUC 8ポリリンカーに由来するDNA片が
更に位置した。
coR Iフラグメント（第２図）をベクターpUC 8（Amersh
am,U.K.）のEcoR I部位へとサブクローン化した。こう
して得たプラスミドをBgl II及びPst Iで切断して、SO
−６遺伝子を含むがシグナルペプチド並びに最初の６ア
ミノ酸残基をコードする５′領域に欠けるフラグメント
を回収した（第２図及び第３図）。フラグメントの３′
末端には、SO−6 cDNAに続き、EcoR I部位とPst I部位
との間に位置するpUC 8ポリリンカーに由来するDNA片が
更に位置した。
SO−６のための遺伝子を持つBgl II−Pst Iフラグメ
ントと、BamH I及びPst Iで切断した発現ベクターpUEX3
（Bressan and Stanley,1987）との連結反応により、β
−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子（Stanley and
Luzio,1984）とSO−６のためのコード配列のほとんどを
含む遺伝子との枠内（in−frame）融合が生起した。SO
−６遺伝子下流において、ベクターpUEX3中に存在する
終結コドンが翻訳を終了させた。
ントと、BamH I及びPst Iで切断した発現ベクターpUEX3
（Bressan and Stanley,1987）との連結反応により、β
−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子（Stanley and
Luzio,1984）とSO−６のためのコード配列のほとんどを
含む遺伝子との枠内（in−frame）融合が生起した。SO
−６遺伝子下流において、ベクターpUEX3中に存在する
終結コドンが翻訳を終了させた。
こうして得た組み換え体プラスミドを、細菌宿主であ
る大腸菌DM105（Amersham,U.K.）の形質転換に用いた。
λ−RRプロモーターによって調節されるハイブリッド遺
伝子は、実質的にZabeau and Stanleyが述べている（19
82）ように発現した。細菌を30℃で成長させて、OD600
を0.9とした。予め加熱して54℃としたブイヨンを等量
添加することにより、急激に温度を42℃まで上昇させ
た。培養物を42℃に２時間保温してから収穫した。全細
胞溶解物を、Laemmli法を用いて（適当濃度の）ポリア
クリルアミドスラブゲル上に装荷した。イムノブロッテ
ィングのため上記ゲルを、25mMトリス塩基、192mMグリ
シン、20％メタノール中で４℃で４時間、0.2Aでトラン
スブロット装置（Bio−Rad）を用いてニトロセルロース
フィルター上に転移した。転移後、フィルターを蒸留水
で洗浄し、PBS＋３％BSAと共に穏やかに振盪しつつ１時
間保温した。フィルターを再び蒸留水で洗浄し、PBSで
1:250に稀釈したウサギ由来の抗SO−６血清と共に１時
間室温に保温した。PBS並びにPBS＋0.05％Tween20で２
回洗浄した後、これを1:7,500に稀釈したセウヨウワサ
ビペルオキシダーゼと結合したヤギ由来の抗ウサギIgG
血清と共に１時間室温に保温した。更に２回洗浄した
後、フィルターを４−クロロ−１−ナフトールで染色し
た。
る大腸菌DM105（Amersham,U.K.）の形質転換に用いた。
λ−RRプロモーターによって調節されるハイブリッド遺
伝子は、実質的にZabeau and Stanleyが述べている（19
82）ように発現した。細菌を30℃で成長させて、OD600
を0.9とした。予め加熱して54℃としたブイヨンを等量
添加することにより、急激に温度を42℃まで上昇させ
た。培養物を42℃に２時間保温してから収穫した。全細
胞溶解物を、Laemmli法を用いて（適当濃度の）ポリア
クリルアミドスラブゲル上に装荷した。イムノブロッテ
ィングのため上記ゲルを、25mMトリス塩基、192mMグリ
シン、20％メタノール中で４℃で４時間、0.2Aでトラン
スブロット装置（Bio−Rad）を用いてニトロセルロース
フィルター上に転移した。転移後、フィルターを蒸留水
で洗浄し、PBS＋３％BSAと共に穏やかに振盪しつつ１時
間保温した。フィルターを再び蒸留水で洗浄し、PBSで
1:250に稀釈したウサギ由来の抗SO−６血清と共に１時
間室温に保温した。PBS並びにPBS＋0.05％Tween20で２
回洗浄した後、これを1:7,500に稀釈したセウヨウワサ
ビペルオキシダーゼと結合したヤギ由来の抗ウサギIgG
血清と共に１時間室温に保温した。更に２回洗浄した
後、フィルターを４−クロロ−１−ナフトールで染色し
た。
上述の操作により、ハイブリッドβ−ガラクトシダー
ゼ−SO−６タンパク質の分子量は予想どおりSDS−PAGE
において145kdであることが判明した。ゲル上のこの地
点に移動するバンドを、上記イムノブロッティング法に
より抗SO−６血清で特異的に確認した。
ゼ−SO−６タンパク質の分子量は予想どおりSDS−PAGE
において145kdであることが判明した。ゲル上のこの地
点に移動するバンドを、上記イムノブロッティング法に
より抗SO−６血清で特異的に確認した。
ハイブリッドタンパク質の精製には次の方法を用い
た。培養物100mlから得た細菌ペレットを３〜5mlの緩衝
液Ａ（50mMトリスHCl pH7.4、170mM NaCl、2.5mg/mlリ
ゾチーム）中に再懸濁させ、氷中で30分間保温し、更に
氷上で20秒かけて５回音波処理した。遠心分離（Sorval
l SS34ローターで４℃で40分間、10,000rpm）後、ペレ
ットを10mlの緩衝液Ｂ（7M尿素、10mMトリスHCl pH7.
4、1mM EDTA）中に再懸濁させ、30分間室温に放置し
た。この懸濁液を上記と同様に遠心分離し、上澄み液を
21の50mMトリスHCl pH7.4に対し４℃で大規模に透析し
た。
た。培養物100mlから得た細菌ペレットを３〜5mlの緩衝
液Ａ（50mMトリスHCl pH7.4、170mM NaCl、2.5mg/mlリ
ゾチーム）中に再懸濁させ、氷中で30分間保温し、更に
氷上で20秒かけて５回音波処理した。遠心分離（Sorval
l SS34ローターで４℃で40分間、10,000rpm）後、ペレ
ットを10mlの緩衝液Ｂ（7M尿素、10mMトリスHCl pH7.
4、1mM EDTA）中に再懸濁させ、30分間室温に放置し
た。この懸濁液を上記と同様に遠心分離し、上澄み液を
21の50mMトリスHCl pH7.4に対し４℃で大規模に透析し
た。
精製は、Ullmann（1984）が述べているようにｐ−ア
ミノフェニルチオガラクトシド−Sepharoseでのアフィ
ニティークロマトグラフィーで達成した。精製物質のSD
S−PAGEを上述の未精製物質のSDS−PAGEに並行し実施し
たところ、既に述べた手順によるイムノブロッティング
後、特異的抗SO−６血清で確認した予想分子量の際立っ
たバンドが明らかになった。精製した組み換え体タンパ
ク質は移動において、誘導大腸菌株の抽出物中に存在す
るハイブリッドβ−ガラクトシダーゼ−SO−６に対応し
た。
ミノフェニルチオガラクトシド−Sepharoseでのアフィ
ニティークロマトグラフィーで達成した。精製物質のSD
S−PAGEを上述の未精製物質のSDS−PAGEに並行し実施し
たところ、既に述べた手順によるイムノブロッティング
後、特異的抗SO−６血清で確認した予想分子量の際立っ
たバンドが明らかになった。精製した組み換え体タンパ
ク質は移動において、誘導大腸菌株の抽出物中に存在す
るハイブリッドβ−ガラクトシダーゼ−SO−６に対応し
た。
下記の文献は明細書中に引用されたものである：
【図面の簡単な説明】 第１図はSO−６の５種類のCNBrフラグメントのアミノ酸
配列を示す説明図、第２図はクローンpBL6のEcoR I***
断片の制限酵素地図、第３図はクローンpBL6のEcoR I插
入断片のDNA配列と、予測される対応アミノ酸配列とを
示す説明図、第４図はSO−６のCNBrフラグメントを予測
されるアミノ酸配列と比較する説明図である。
配列を示す説明図、第２図はクローンpBL6のEcoR I***
断片の制限酵素地図、第３図はクローンpBL6のEcoR I插
入断片のDNA配列と、予測される対応アミノ酸配列とを
示す説明図、第４図はSO−６のCNBrフラグメントを予測
されるアミノ酸配列と比較する説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 マリア・ダニ イタリー国、20100・ミラン、ビア・チ レア、106 (72)発明者 ダグラス・ラツピー イタリー国、20100・ミラン、ビア・チ エザーレ・ダ・セスート、26 (72)発明者 マレア・ベアトリーチエ・サツカルド イタリー国、バレーゼ、21047・サロツ ノ、ビア・アリアタ、16 (72)発明者 マルコ・ソーリア イタリー国、20100・ミラン、ビア・グ エリーニ、13 (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂ ｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖ ｏｌ．129 Ｎｏ．３ （1985−６−28) Ｐ．934−942 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ（ＧＥＮＥＴ ＹＸ)
Claims (11)
- 【請求項１】リボソーム不活化タンパク質（RIP）SO−
６をコードし、以下の配列： から成るDNA分子。 - 【請求項２】請求項１記載のDNA配列と、その直前に位
置するシグナル配列 とから成るDNA分子。 - 【請求項３】以下のヌクレオチド配列： から成るDNA分子。
- 【請求項４】請求項１から３のいずれか１項に記載のDN
A配列を含むクローニングベクター。 - 【請求項５】プラスミドであることを特徴とする請求項
４に記載のベクター。 - 【請求項６】ファージウイルスベクターであることを特
徴とする請求項５に記載のベクター。 - 【請求項７】形質転換した宿主内でRIP SO−６を発現し
得る、請求項１から３のいずれか１項に記載のDNA配列
を含む発現ベクター。 - 【請求項８】プラスミドであることを特徴とする請求項
７に記載のベクター。 - 【請求項９】形質転換した宿主内で、細胞と結合し得る
リガンドと結合したRIP SO−６を含む結合体を発現し得
ることを特徴とする請求項７または８に記載のベクタ
ー。 - 【請求項１０】請求項７から９のいずれか１項に記載の
ベクターで形質転換させた宿主。 - 【請求項１１】RIP SO−６か、あるいは細胞と結合し得
るリガンドと結合したRIP SO−６を含む結合体を製造す
る方法であって、請求項10に記載の形質転換宿主を培養
すること、及びそのようにして生産したRIPあるいは結
合体を単離することを含む製造方法。
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