JPS58103664A - 選択的殺細胞法 - Google Patents
選択的殺細胞法Info
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- JPS58103664A JPS58103664A JP20150381A JP20150381A JPS58103664A JP S58103664 A JPS58103664 A JP S58103664A JP 20150381 A JP20150381 A JP 20150381A JP 20150381 A JP20150381 A JP 20150381A JP S58103664 A JPS58103664 A JP S58103664A
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56972—White blood cells
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発−は、新風な蛋白合成組書活性蛋白を用いた・、特
定細胞群の破壊方法に関する。更に詳しくは１本発明は
、４１定の細胞を１ｌｌＩＩ！する抗体またはその抗原
結合部位を會むフラグメントのピオチ、＆ル化体、ヘチ
マの種子から抽出精製される無細１ＩＪＩ蛋白合虞阻害
活性をもつ新規な蛋白のビオチニル化体、ｔＬびに７−
２ジンを用いる抗体又はその７ラグメンＦが認識する特
定細胞群を破壊する方法ＫｗＡするものｔある。 種々の細胞群の混合体の中から誤る特定の細胞群を選択
的に破壊することは１種々の生化学的操作１例えば、Ｉ
ｍ細胞ベルでの免疫応答機構の解明、薬物の作用機作の
解Ｉ１１．或いは臨床検査において必要とされる場合が
多い、このような目的のために、従来、破壊すべき細胞
群を認識する抗体を補体とともに用いて、補体依存性細
胞溶解反応を起こさせる方法が用いられて来た。しかし
ながらこの方法ては１例えば、ヒトＩ ｇＧＬ ヒ）
Ｉ ｇＧＣ５７） １ ｇＧｌ−ｑ ｔ Ｘ Ｉ ｇＧ
ｌ。 峰ル七ツ） ＩｇＧ１などの如く、用いる抗体のクラス
、サブタラスによっては補体結合性がなく。 細胞溶解反応を起こし得ないし、又、補体結合性抗体で
あっても、用いる補体の自一種によっては補体依存性の
ＪＩＩＩ！ｌ＃ｌ解反応、なおとしｋくい場合がある６
ｇｉＷＣ，補体源として用いる血清中には、補体以外
の各種の血清成分、例えば、フルゾミン、免疫グープリ
ン、リンホカイン等が含まれているので、これらの成分
が目的とする−胞の選択的嬉解反応を阻げる場合がある
。 本発明者らは、これらの欠点を有しない、殺すべき特定
の１ｍＪＩＩ詳を選択的に効率よ（破壊する強力な殺細
胞法を■発すべく鋭意研究の結果。 本発明Ｋｌｌ達した。 即ち本発明は、特定の＠砲をｉｌ繊する抗体またはその
７ラグメントのビオチニル化体とヘチマから得られる無
細胞系蛋白合成阻害活性を有する１ｗ日Ｃ以下ルフィン
という）のビオチニル化体並びにアビジンな用いて、抗
体又はそのフラグメントが特異的Ｋｌｌ織する細胞を選
択的に破壊することを特徴とする選択的殺細胞法である
。 本発明忙於いて用いられる抗体またはそのフラグメント
のビオチニル化体は、抗体または七６フラグメントを公
知の方ｌ＆によりビオチンの活性エステル体と反応せし
めることにより得ることができる。ビオチニル化に用い
る抗体は。 破壊すべき細胞またはその膜抗原をサル、ウマ。 ウシ、ヤギ、ヒラ：、＞、ウサギ等の動物に過免疫した
血清から、コーンのエタノール分−法＃硫安分画法、イ
オン交換りロマトグラフィー法等の公知の手段によって
調製され、さらに必ｇ！虻よっては各種細胞を用いて吸
収、Ｗｋ着操作を罎どこして得ることができる。また破
壊すべき細胞またはその膜抗原で免疫した動物から得た
リンパ球を、例えば骨髄腫と細胞融合させ、Ｉｉｉ的と
する抗体産生性のクローンな種別して融合細胞（ハイプ
リドーマ）を作製し、これらの培警液から、またはこれ
を動物に接種してその血清または腹腔液からも抗体を得
ることができる。 抗体（免疫グロブリン）Ｋは、ＩｇＧ、 ＩｇＡ、 Ｉ
ｇＭ。 Ｉ ｇＤ−Ｉ ｇ Ｅ ｆ） Ｓ ［ａｉｔ カＪｂ
ルコトカ知うａ テ’イルが、そのどれでも本発明に用
いることができる。 本発＠忙於いては抗体はそのまへでも、或いらなるｔａ
ｂ’ ｅ ｔａｂ’の２量体Ｆ（ａｂ’）ｒ）でもビオ
チニル化して用いることができる。 本発明において、ヘチマから得られる無細胞系蛋白合成
阻害活性を有する蛋白（ルフィン）とは、 ヘチ−ｖ
（Ｌｍｆｆａ ｅｙｌｌｍｄｒｉａ ｒ＠ａｍ）の種子
より抽出後、４０〜ｌ・・％飽和硫安分画、ゲル冑過、
イオン交換樹脂ターマドグラフィー等の全知の生化学的
手法によって゛精製することがで１６、 分子ｍａｔｒ
３ａｏの１ｌｒＩｊＬな蛋白であり。 ウサギ網状赤血球のライゼー） （ｌｙｓｉｔ・）ｋよ
る蛋白合成に対して１強い阻害活性をもっている。 本発ｔ１４に於いて用いられるルフィンのビオチニル化
体は、ビオチニル化抗体を得今会知の方法に準じて、ル
フィンとビオチｌの活性エステル体とを反応せしめるこ
とｋより得ることができる。 本発明において、アビジンとは卵白中に存在する分子量
約ａ ａｏ ｏ ｏの塩基性着贋自であり。 ビタｌ’／Ｈとして知られるビオチンと極めて高い親和
性（ＩＩ和和室定数１０１” Ｉｉｒ” ）を有するこ
とが知られている。 ルフィンのビオチニル化体は、アビジンのビオチンに対
する強いｌｌａ性を利用して、アビジン及び特定の細胞
群を６１１１！する抗体またはそのフラグメントのビオ
チニル仕置と一緒に用いることにより、抗体が認識する
特定細胞群を選択的に破壊するために使用することかで
會る。即ち、蛋白生合成阻害活性な育するルフイ／を。 アビジンとビオチンの強い親和力に基づく非共有的結合
を介して、抗体またはそのフラグメントと結合させるこ
とによってルフィンが、抗体が認識する特定細胞群に対
しａ＠毒性な発揮する。かかる特定細胞群破壊システム
の優れた点の一つは、既に述ぺた通り、補体依存性ａＩ
ＩＩＩ！Ｉ解反応が、抗体のクラス、サックラスによっ
ては補体との結合性がないために、或いは補体結合性が
ある場合でも用いる動物種によっては補体依存性細胞醪
解反応が起こり―いために１遍用できない場合でも本・
発−のシステムは適用で會ることである。また１選択的
補体依存Ｉｋｍ鳳漕解反応が、＠体源として用いるＪｋ
ｆＩＩ中の補体以外の成分で履げられる場合があるのに
対し。 本発明方法ではそのようなことがない、さもに本発明１
昧の特徴は、ルフィンがそれ一体では。 細胞表面と結合する部位を欠い【いるがためｋ。 極めて弱い細胞毒性しか示さないことと、しかも一旦抗
体をキャリアーとして、細胞内へ導入されると極めて強
い細胞毒性を発揮する点に１ｈる。加えて、抗体または
そのフラグメントに複数個のビす牛ンが結合したビオチ
ニル化体を用いると、抗体またはそのフラグメント１分
子当り複数個のルフィンをつけることかで會、細胞破壊
効果の増幅が得られることも本発明方法の特徴として挙
げることができる。 本発明方′法によって特定ｍ１１群を破壊する望ましい
実施態様は、値譲したい細胞群を含む細胞集団を先ず、
その麟―騨を遥択的Ｋ１１ｍ１！する抗体またはそのフ
ラグメントのビオチニル化体（ビオチニル化抗体）濃液
と、ｏＡ−ｓｙ℃で膠〜・Ｏ分接触反応さ臂、ｌＩＡ＠
培養培堆もＬ（は緩衝化食塩水で洗うことｋより過剰の
未反応抗体を除去した後、アビジンを加えて０〜３丁℃
で１− ｍ ＠分接触反応させ、＃１１培讐場地もしく
は緩衝化食塩水で洗うことにより過剰の未反応抗体を除
去した後、さらにルフィンのビオチニル化体を加えて、
Ｏ〜ｓ１℃で１〜３０分接触反応させ１ｍ胞培養培地も
しくは緩衝化食塩水で洗って過剰の蛋白複合体を除去し
た後１ｍ胞培養する方法である。＃Ｉ胞培養は通常の条
件。 即ち５％ＣＱＩ加濃雰囲気下３７℃で通常８時間〜Ｓ日
闘行えばよい、なお、ビオチニル化抗体。 アビジン及びビオチニル化ルフィンの各々の添加後、過
剰の未反応吻を細胞培養培地もしくは緩衝化食塩水で洗
う操作は場合によっては行わなくてもよい、また、ビオ
チニル化と抗体−アビジン及びビオチニル化ルフィンの
添加順序は必ずしも上に述べた通りでな（でもよ（、そ
の倫の任意の順序ｔもよい、さ、らに、予めビナ４−ｚ
ル化抗 を接触させて三者の結合体を作らせた後，その結合体で
細胞集団を処理してもよい。 以下，゛実施例により本発明を詳述する。 実施例 ピ） ヘチマの種子より無ＩＩＩＩＩＩＡ系蛋白合成阻
害活性を有する蛋白質（ルフィン）６１１ｋｌｆｉｌｌ
ｌ１１へφマの皮をむいた種子ｔｉｌ＆−肴砕し。 エーテルで層質を除去した．こうして得た脱脂粉体Ｋａ
冨Ｍ塩化ナト替ウつを會む鵞・ーリン酸緩衝液（ｐＨ
１１ ） （以下バッファーＰと略す）を、１１体のｌ
＠倚景加えて４℃で一晩攪拌を続けた．攪拌後，遠心分
離によって不溶物を除き，硫安を４０％飽和になるよう
に加えた．０℃で１時間攪拌後達心分離し。 上清に１・・％になるように硫安を加えて。 ０℃で１時間壷拌螢，達６分■し沈澱を分離した．この
沈澱Ｋ ／Ｓツ７アーＰを亀・−加えて溶かし，８ｅｍ
Ｍｌｌ化ナト讐ウムを會む２・膣ＭＶン酸緩衝痕（ ｐ
Ｈ１暴）ｋ十分透析した。 次いで同じバッファーに平衝化されているセファクリル
５−ＳＯ・カラムタルマドグラフィー（カラムすイズ亀
＠ ｔｓ Ｘ １ ｍ Ｌ ｍ ｍ ） Ｋかげ１分子
量が畠・男前後で，ウサギ網状赤血球ライゼートにおい
て蛋白合成阻害活性を有している分画なとり，その分画
を―纏後党分に４℃でｓｍＭ ９ ：／鹸す）リウム緩
ｍ１ｌｌ（ ｐＨ亀・）ｋ透析した．そして同じバッフ
ァーで平衡化された．ＣＭ−セフ７デツタスＣ−５・カ
ラムタロＷ）ダラフイーにかけた（カラムナイズＬ ＠
Ｘ 亀ｍ ｅｌｌ ） ｅ次いで１ｍＭ１ン■ナトリ
ウム（ｐＨ亀Ｏ）で溶出後，ｓｅｍＭｅＳＯ６ｍＭ．１
Ｍ塩化ナトリウムを含むロ１９ン酸ナシリウム緩衝液（
ｐＨ亀Ｏ）で溶出した。 ウサギ網状赤血球ライゼートを用いた無１１８＠系で，
ＩＩ自合成阻害活性を有する３００ｍＭ塩化ナトリウム
溶出分画を濃縮し，ルフィンを得た・このルフィンには
，ラウシル硫酸ナトＶｆＰ＾ポＶアクリルアミドゲル電
気泳動（８Ｄ８−ＰＡＧＥ）及びディスクゲル電気線―
（Ｄｌａｅ −ＰＡＧＩＣ ） ｔｃよって傭の蛋白を
含まないことを確認した。 （→ 抗体及びルフィンのビオチニル化マウス替ンパ球
抗原Ｔｈｙ Ｌ ２ Ｋ対するそ）ターーン抗体で島る
抗テｋｙ Ｌ ＲＩｇＭを含むマウス腹腔液を、ＩＭ塩
化ナト讐ウつを含んだ６１Ｍ炭酸水素す）Ｗラム緩衝液
で平衡化されたセフ７デツタス０１１スーパーフアイン
カラ＾（サイズ亀ｓｘｉｎｍ）Ｋかけ、 ａ’ｒｈｙＬ
２ ＩｇＭの部分をプールした。また、ルフイ／１１
波を、１１Ｍ３ａｌｌ？酸緩衝筐（ｐＨＩＩ）で平衡化
されたセファデックスＧ−１１スーパーフアインカラム
（ｔイズａｓｘ４４ｍ）Ｋかけ、低分子物質を除いた。 抗Ｔｈｙ Ｌ ２ ＩｇＭのビオチニル化は、１０！Ｓ
ＳビオチンのＮ−ヒドーキｔタシンイ４ｒエステルを含
むジメチルホルムアｌドｓ ｏ ｊｊを、抗Ｔｈｙ Ｌ
２ ＩｇＭ １１ ｍ Ｉｆを含むＬｌｍｌの濃液Ｋ
ＪＩＩえ、４時間室温でインキユベートして行い１Ｍ応
液な１１４Ｍ塩化ナト讐ナト上食む重１）ｍＭリン酸緩
ｌｌ１ｌ （ｐＨ７，０） （Ｐ Ｂ Ｂ ）ｋ充分透
析した。ルフィンのビすチ二ル化は３亀６ｊＩのビオチ
ンのＮ−ヒトｐキシサタシンイ１ド エステルを含むジ
メチルホルムア４ド４・ｊｔを、ルフィンｚ ｓ ｓ
ｐｇを含むａＳ−の溶液に加え、４時間室温でインキユ
ベートして行い１反応液をＰＨ１に充分透析した。 （→ マウス リンホーマ細胞ＲＬ８１ Ｋ対する殺細
胞作用 上記（−によって調製したビオチニル化ａ？に７ＬＩＩ
ｇＭとビオチニル化ルフィン並びにアビジンによる標的
細胞ＲＬＩ細胞に対する細胞−性を検討した。
９６穴のマイｙ’ａプレートＫ 、Ｉ Ｘ １０”＠／
ｓｊｆ）ＲＬ１ｍ１１１’含ｔｒｊｉｌｊｌｌｌＲＰＭ
１１＠４０ （＋ＪＩｂ児ｍ清１・％、冨−メルヵプト
エタノール１・１ｌｖｄｌｉとカナマイシンａ１ダ／−
を含む）ａｌ−を分注し、ビオチニル化！−１アビジン
・ ビオチニル化ルフィン液各ａ０１−を全てまたは一
部加えるか（上記ｓｌｌめ液のどれかを加え１ないとき
はその外りＫａｌＭのＰｌｓを加える）、または全く加
えないで、３１℃でＳ％ＣＱＩ雰囲気下で４雪時間培養
後、）＃／４ンプルー染色法により生細胞数を側室した
。 その結果を第１表に示した０表中＋は添加したことを、
−は添加しなかったことを示す・ −この結果よりビオ
チニル化抗Ｔｋｙ Ｌ ｍ ＩｇＭ 。 ７ビジン・ ビオチニル化ルフィンのいずれか一つでも
欠損した場合は、細胞毒性は発現せず、この王者がそろ
ったときのみ細胞毒性が発現していることがわかる。 嬉 １ 表 手続補正書 昭和６７年 ノ月 ２日 特許庁長官殿 １、事件の表示 特願昭 ５６’−３０１５０３号 ２、発明の名称 選択的殺細胞法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 大阪市東区南本町１丁目１１番地 （３００）帝人株式会社 代表者 徳 末 知 夫 （１） 明細書の特許請求の範囲を別紙の通り訂正す
る。 （２） 同第６頁の第５行目に「生合成」とあるな、
「合成」と訂正する。 （３） 同第９頁の末行に「３０」とあるな、「３」
と訂正する。 （４） 同第１０頁の第５行目に「５０」とあるな、
「２５」と訂正する。 （５） 同第１２頁の第１２行目に［培地ＲＰＭ１１
６４０Ｊとあるを、「ダルベツコ変法イーグル培地」と
訂正する。 （６） 同第１２頁の第１８行目に［０，Ｉ Ｊとあ
るな、［’０．０１Ｊと訂正する。 以 上 特許請求の範囲 特定の細胞を認識する抗体声たけそのフラグメントのビ
オチニル化体とヘチマから得られる無細胞系蛋白合成阻
害活性を有する蛋白のビオチニル−焦一体並びにアビジ
ンな用いて、抗体又はそのフラグメントが特異的ＫＭｌ
ｌｉｌｋする細胞を選択的に破壊することを特徴とする
選択的殺細胞法。
定細胞群の破壊方法に関する。更に詳しくは１本発明は
、４１定の細胞を１ｌｌＩＩ！する抗体またはその抗原
結合部位を會むフラグメントのピオチ、＆ル化体、ヘチ
マの種子から抽出精製される無細１ＩＪＩ蛋白合虞阻害
活性をもつ新規な蛋白のビオチニル化体、ｔＬびに７−
２ジンを用いる抗体又はその７ラグメンＦが認識する特
定細胞群を破壊する方法ＫｗＡするものｔある。 種々の細胞群の混合体の中から誤る特定の細胞群を選択
的に破壊することは１種々の生化学的操作１例えば、Ｉ
ｍ細胞ベルでの免疫応答機構の解明、薬物の作用機作の
解Ｉ１１．或いは臨床検査において必要とされる場合が
多い、このような目的のために、従来、破壊すべき細胞
群を認識する抗体を補体とともに用いて、補体依存性細
胞溶解反応を起こさせる方法が用いられて来た。しかし
ながらこの方法ては１例えば、ヒトＩ ｇＧＬ ヒ）
Ｉ ｇＧＣ５７） １ ｇＧｌ−ｑ ｔ Ｘ Ｉ ｇＧ
ｌ。 峰ル七ツ） ＩｇＧ１などの如く、用いる抗体のクラス
、サブタラスによっては補体結合性がなく。 細胞溶解反応を起こし得ないし、又、補体結合性抗体で
あっても、用いる補体の自一種によっては補体依存性の
ＪＩＩＩ！ｌ＃ｌ解反応、なおとしｋくい場合がある６
ｇｉＷＣ，補体源として用いる血清中には、補体以外
の各種の血清成分、例えば、フルゾミン、免疫グープリ
ン、リンホカイン等が含まれているので、これらの成分
が目的とする−胞の選択的嬉解反応を阻げる場合がある
。 本発明者らは、これらの欠点を有しない、殺すべき特定
の１ｍＪＩＩ詳を選択的に効率よ（破壊する強力な殺細
胞法を■発すべく鋭意研究の結果。 本発明Ｋｌｌ達した。 即ち本発明は、特定の＠砲をｉｌ繊する抗体またはその
７ラグメントのビオチニル化体とヘチマから得られる無
細胞系蛋白合成阻害活性を有する１ｗ日Ｃ以下ルフィン
という）のビオチニル化体並びにアビジンな用いて、抗
体又はそのフラグメントが特異的Ｋｌｌ織する細胞を選
択的に破壊することを特徴とする選択的殺細胞法である
。 本発明忙於いて用いられる抗体またはそのフラグメント
のビオチニル化体は、抗体または七６フラグメントを公
知の方ｌ＆によりビオチンの活性エステル体と反応せし
めることにより得ることができる。ビオチニル化に用い
る抗体は。 破壊すべき細胞またはその膜抗原をサル、ウマ。 ウシ、ヤギ、ヒラ：、＞、ウサギ等の動物に過免疫した
血清から、コーンのエタノール分−法＃硫安分画法、イ
オン交換りロマトグラフィー法等の公知の手段によって
調製され、さらに必ｇ！虻よっては各種細胞を用いて吸
収、Ｗｋ着操作を罎どこして得ることができる。また破
壊すべき細胞またはその膜抗原で免疫した動物から得た
リンパ球を、例えば骨髄腫と細胞融合させ、Ｉｉｉ的と
する抗体産生性のクローンな種別して融合細胞（ハイプ
リドーマ）を作製し、これらの培警液から、またはこれ
を動物に接種してその血清または腹腔液からも抗体を得
ることができる。 抗体（免疫グロブリン）Ｋは、ＩｇＧ、 ＩｇＡ、 Ｉ
ｇＭ。 Ｉ ｇＤ−Ｉ ｇ Ｅ ｆ） Ｓ ［ａｉｔ カＪｂ
ルコトカ知うａ テ’イルが、そのどれでも本発明に用
いることができる。 本発＠忙於いては抗体はそのまへでも、或いらなるｔａ
ｂ’ ｅ ｔａｂ’の２量体Ｆ（ａｂ’）ｒ）でもビオ
チニル化して用いることができる。 本発明において、ヘチマから得られる無細胞系蛋白合成
阻害活性を有する蛋白（ルフィン）とは、 ヘチ−ｖ
（Ｌｍｆｆａ ｅｙｌｌｍｄｒｉａ ｒ＠ａｍ）の種子
より抽出後、４０〜ｌ・・％飽和硫安分画、ゲル冑過、
イオン交換樹脂ターマドグラフィー等の全知の生化学的
手法によって゛精製することがで１６、 分子ｍａｔｒ
３ａｏの１ｌｒＩｊＬな蛋白であり。 ウサギ網状赤血球のライゼー） （ｌｙｓｉｔ・）ｋよ
る蛋白合成に対して１強い阻害活性をもっている。 本発ｔ１４に於いて用いられるルフィンのビオチニル化
体は、ビオチニル化抗体を得今会知の方法に準じて、ル
フィンとビオチｌの活性エステル体とを反応せしめるこ
とｋより得ることができる。 本発明において、アビジンとは卵白中に存在する分子量
約ａ ａｏ ｏ ｏの塩基性着贋自であり。 ビタｌ’／Ｈとして知られるビオチンと極めて高い親和
性（ＩＩ和和室定数１０１” Ｉｉｒ” ）を有するこ
とが知られている。 ルフィンのビオチニル化体は、アビジンのビオチンに対
する強いｌｌａ性を利用して、アビジン及び特定の細胞
群を６１１１！する抗体またはそのフラグメントのビオ
チニル仕置と一緒に用いることにより、抗体が認識する
特定細胞群を選択的に破壊するために使用することかで
會る。即ち、蛋白生合成阻害活性な育するルフイ／を。 アビジンとビオチンの強い親和力に基づく非共有的結合
を介して、抗体またはそのフラグメントと結合させるこ
とによってルフィンが、抗体が認識する特定細胞群に対
しａ＠毒性な発揮する。かかる特定細胞群破壊システム
の優れた点の一つは、既に述ぺた通り、補体依存性ａＩ
ＩＩＩ！Ｉ解反応が、抗体のクラス、サックラスによっ
ては補体との結合性がないために、或いは補体結合性が
ある場合でも用いる動物種によっては補体依存性細胞醪
解反応が起こり―いために１遍用できない場合でも本・
発−のシステムは適用で會ることである。また１選択的
補体依存Ｉｋｍ鳳漕解反応が、＠体源として用いるＪｋ
ｆＩＩ中の補体以外の成分で履げられる場合があるのに
対し。 本発明方法ではそのようなことがない、さもに本発明１
昧の特徴は、ルフィンがそれ一体では。 細胞表面と結合する部位を欠い【いるがためｋ。 極めて弱い細胞毒性しか示さないことと、しかも一旦抗
体をキャリアーとして、細胞内へ導入されると極めて強
い細胞毒性を発揮する点に１ｈる。加えて、抗体または
そのフラグメントに複数個のビす牛ンが結合したビオチ
ニル化体を用いると、抗体またはそのフラグメント１分
子当り複数個のルフィンをつけることかで會、細胞破壊
効果の増幅が得られることも本発明方法の特徴として挙
げることができる。 本発明方′法によって特定ｍ１１群を破壊する望ましい
実施態様は、値譲したい細胞群を含む細胞集団を先ず、
その麟―騨を遥択的Ｋ１１ｍ１！する抗体またはそのフ
ラグメントのビオチニル化体（ビオチニル化抗体）濃液
と、ｏＡ−ｓｙ℃で膠〜・Ｏ分接触反応さ臂、ｌＩＡ＠
培養培堆もＬ（は緩衝化食塩水で洗うことｋより過剰の
未反応抗体を除去した後、アビジンを加えて０〜３丁℃
で１− ｍ ＠分接触反応させ、＃１１培讐場地もしく
は緩衝化食塩水で洗うことにより過剰の未反応抗体を除
去した後、さらにルフィンのビオチニル化体を加えて、
Ｏ〜ｓ１℃で１〜３０分接触反応させ１ｍ胞培養培地も
しくは緩衝化食塩水で洗って過剰の蛋白複合体を除去し
た後１ｍ胞培養する方法である。＃Ｉ胞培養は通常の条
件。 即ち５％ＣＱＩ加濃雰囲気下３７℃で通常８時間〜Ｓ日
闘行えばよい、なお、ビオチニル化抗体。 アビジン及びビオチニル化ルフィンの各々の添加後、過
剰の未反応吻を細胞培養培地もしくは緩衝化食塩水で洗
う操作は場合によっては行わなくてもよい、また、ビオ
チニル化と抗体−アビジン及びビオチニル化ルフィンの
添加順序は必ずしも上に述べた通りでな（でもよ（、そ
の倫の任意の順序ｔもよい、さ、らに、予めビナ４−ｚ
ル化抗 を接触させて三者の結合体を作らせた後，その結合体で
細胞集団を処理してもよい。 以下，゛実施例により本発明を詳述する。 実施例 ピ） ヘチマの種子より無ＩＩＩＩＩＩＡ系蛋白合成阻
害活性を有する蛋白質（ルフィン）６１１ｋｌｆｉｌｌ
ｌ１１へφマの皮をむいた種子ｔｉｌ＆−肴砕し。 エーテルで層質を除去した．こうして得た脱脂粉体Ｋａ
冨Ｍ塩化ナト替ウつを會む鵞・ーリン酸緩衝液（ｐＨ
１１ ） （以下バッファーＰと略す）を、１１体のｌ
＠倚景加えて４℃で一晩攪拌を続けた．攪拌後，遠心分
離によって不溶物を除き，硫安を４０％飽和になるよう
に加えた．０℃で１時間攪拌後達心分離し。 上清に１・・％になるように硫安を加えて。 ０℃で１時間壷拌螢，達６分■し沈澱を分離した．この
沈澱Ｋ ／Ｓツ７アーＰを亀・−加えて溶かし，８ｅｍ
Ｍｌｌ化ナト讐ウムを會む２・膣ＭＶン酸緩衝痕（ ｐ
Ｈ１暴）ｋ十分透析した。 次いで同じバッファーに平衝化されているセファクリル
５−ＳＯ・カラムタルマドグラフィー（カラムすイズ亀
＠ ｔｓ Ｘ １ ｍ Ｌ ｍ ｍ ） Ｋかげ１分子
量が畠・男前後で，ウサギ網状赤血球ライゼートにおい
て蛋白合成阻害活性を有している分画なとり，その分画
を―纏後党分に４℃でｓｍＭ ９ ：／鹸す）リウム緩
ｍ１ｌｌ（ ｐＨ亀・）ｋ透析した．そして同じバッフ
ァーで平衡化された．ＣＭ−セフ７デツタスＣ−５・カ
ラムタロＷ）ダラフイーにかけた（カラムナイズＬ ＠
Ｘ 亀ｍ ｅｌｌ ） ｅ次いで１ｍＭ１ン■ナトリ
ウム（ｐＨ亀Ｏ）で溶出後，ｓｅｍＭｅＳＯ６ｍＭ．１
Ｍ塩化ナトリウムを含むロ１９ン酸ナシリウム緩衝液（
ｐＨ亀Ｏ）で溶出した。 ウサギ網状赤血球ライゼートを用いた無１１８＠系で，
ＩＩ自合成阻害活性を有する３００ｍＭ塩化ナトリウム
溶出分画を濃縮し，ルフィンを得た・このルフィンには
，ラウシル硫酸ナトＶｆＰ＾ポＶアクリルアミドゲル電
気泳動（８Ｄ８−ＰＡＧＥ）及びディスクゲル電気線―
（Ｄｌａｅ −ＰＡＧＩＣ ） ｔｃよって傭の蛋白を
含まないことを確認した。 （→ 抗体及びルフィンのビオチニル化マウス替ンパ球
抗原Ｔｈｙ Ｌ ２ Ｋ対するそ）ターーン抗体で島る
抗テｋｙ Ｌ ＲＩｇＭを含むマウス腹腔液を、ＩＭ塩
化ナト讐ウつを含んだ６１Ｍ炭酸水素す）Ｗラム緩衝液
で平衡化されたセフ７デツタス０１１スーパーフアイン
カラ＾（サイズ亀ｓｘｉｎｍ）Ｋかけ、 ａ’ｒｈｙＬ
２ ＩｇＭの部分をプールした。また、ルフイ／１１
波を、１１Ｍ３ａｌｌ？酸緩衝筐（ｐＨＩＩ）で平衡化
されたセファデックスＧ−１１スーパーフアインカラム
（ｔイズａｓｘ４４ｍ）Ｋかけ、低分子物質を除いた。 抗Ｔｈｙ Ｌ ２ ＩｇＭのビオチニル化は、１０！Ｓ
ＳビオチンのＮ−ヒドーキｔタシンイ４ｒエステルを含
むジメチルホルムアｌドｓ ｏ ｊｊを、抗Ｔｈｙ Ｌ
２ ＩｇＭ １１ ｍ Ｉｆを含むＬｌｍｌの濃液Ｋ
ＪＩＩえ、４時間室温でインキユベートして行い１Ｍ応
液な１１４Ｍ塩化ナト讐ナト上食む重１）ｍＭリン酸緩
ｌｌ１ｌ （ｐＨ７，０） （Ｐ Ｂ Ｂ ）ｋ充分透
析した。ルフィンのビすチ二ル化は３亀６ｊＩのビオチ
ンのＮ−ヒトｐキシサタシンイ１ド エステルを含むジ
メチルホルムア４ド４・ｊｔを、ルフィンｚ ｓ ｓ
ｐｇを含むａＳ−の溶液に加え、４時間室温でインキユ
ベートして行い１反応液をＰＨ１に充分透析した。 （→ マウス リンホーマ細胞ＲＬ８１ Ｋ対する殺細
胞作用 上記（−によって調製したビオチニル化ａ？に７ＬＩＩ
ｇＭとビオチニル化ルフィン並びにアビジンによる標的
細胞ＲＬＩ細胞に対する細胞−性を検討した。
９６穴のマイｙ’ａプレートＫ 、Ｉ Ｘ １０”＠／
ｓｊｆ）ＲＬ１ｍ１１１’含ｔｒｊｉｌｊｌｌｌＲＰＭ
１１＠４０ （＋ＪＩｂ児ｍ清１・％、冨−メルヵプト
エタノール１・１ｌｖｄｌｉとカナマイシンａ１ダ／−
を含む）ａｌ−を分注し、ビオチニル化！−１アビジン
・ ビオチニル化ルフィン液各ａ０１−を全てまたは一
部加えるか（上記ｓｌｌめ液のどれかを加え１ないとき
はその外りＫａｌＭのＰｌｓを加える）、または全く加
えないで、３１℃でＳ％ＣＱＩ雰囲気下で４雪時間培養
後、）＃／４ンプルー染色法により生細胞数を側室した
。 その結果を第１表に示した０表中＋は添加したことを、
−は添加しなかったことを示す・ −この結果よりビオ
チニル化抗Ｔｋｙ Ｌ ｍ ＩｇＭ 。 ７ビジン・ ビオチニル化ルフィンのいずれか一つでも
欠損した場合は、細胞毒性は発現せず、この王者がそろ
ったときのみ細胞毒性が発現していることがわかる。 嬉 １ 表 手続補正書 昭和６７年 ノ月 ２日 特許庁長官殿 １、事件の表示 特願昭 ５６’−３０１５０３号 ２、発明の名称 選択的殺細胞法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 大阪市東区南本町１丁目１１番地 （３００）帝人株式会社 代表者 徳 末 知 夫 （１） 明細書の特許請求の範囲を別紙の通り訂正す
る。 （２） 同第６頁の第５行目に「生合成」とあるな、
「合成」と訂正する。 （３） 同第９頁の末行に「３０」とあるな、「３」
と訂正する。 （４） 同第１０頁の第５行目に「５０」とあるな、
「２５」と訂正する。 （５） 同第１２頁の第１２行目に［培地ＲＰＭ１１
６４０Ｊとあるを、「ダルベツコ変法イーグル培地」と
訂正する。 （６） 同第１２頁の第１８行目に［０，Ｉ Ｊとあ
るな、［’０．０１Ｊと訂正する。 以 上 特許請求の範囲 特定の細胞を認識する抗体声たけそのフラグメントのビ
オチニル化体とヘチマから得られる無細胞系蛋白合成阻
害活性を有する蛋白のビオチニル−焦一体並びにアビジ
ンな用いて、抗体又はそのフラグメントが特異的ＫＭｌ
ｌｉｌｋする細胞を選択的に破壊することを特徴とする
選択的殺細胞法。
Claims (1)
- 特定の１１１１１を認識する抗体またはそのフラグメン
トのビオチニル化体とヘチマから得られる無細胞系蛋白
命成阻書ｆａ性を有する蛋白のビオチニル体並びにアビ
ジンを用いて、抗体又はそのフラグメントが特異的Ｋｉ
ｌ識する１ａｊ１を選択的に砿麿することを特徴とする
選択的殺細胞法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20150381A JPS58103664A (ja) | 1981-12-16 | 1981-12-16 | 選択的殺細胞法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20150381A JPS58103664A (ja) | 1981-12-16 | 1981-12-16 | 選択的殺細胞法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58103664A true JPS58103664A (ja) | 1983-06-20 |
Family
ID=16442127
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20150381A Pending JPS58103664A (ja) | 1981-12-16 | 1981-12-16 | 選択的殺細胞法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58103664A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01209370A (ja) * | 1987-12-24 | 1989-08-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | 免疫活性物質の測定法及び測定試薬 |
-
1981
- 1981-12-16 JP JP20150381A patent/JPS58103664A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01209370A (ja) * | 1987-12-24 | 1989-08-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | 免疫活性物質の測定法及び測定試薬 |
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