JPH1160500A - 血液凝固異常亢進抑制剤 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 播種性血管内凝固などでみられる血液凝固系
の異常亢進を抑制できる薬剤を提供する。 【構成】 有効成分として血液凝固系の亢進を抑制する
分子量54−57kDa(SDS−PAGE)のプロテ
インCインヒビターを含有する血液凝固異常亢進抑制
剤。 【効果】 本発明のプロテインCインヒビターを静脈内
投与することで、出血傾向などの副作用の心配がなく、
播種性血管内凝固でみられる典型的な凝固系異常亢進と
それに伴って起こる二次的な線溶系の亢進を抑制するこ
とができる。
の異常亢進を抑制できる薬剤を提供する。 【構成】 有効成分として血液凝固系の亢進を抑制する
分子量54−57kDa(SDS−PAGE)のプロテ
インCインヒビターを含有する血液凝固異常亢進抑制
剤。 【効果】 本発明のプロテインCインヒビターを静脈内
投与することで、出血傾向などの副作用の心配がなく、
播種性血管内凝固でみられる典型的な凝固系異常亢進と
それに伴って起こる二次的な線溶系の亢進を抑制するこ
とができる。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト尿および血液
からの精製および分離により得られ、血液凝固系の異常
亢進を抑制する分子量54−57kDaのプロテインC
インヒビターを有効成分とする血液凝固異常亢進抑制剤
に関する。
からの精製および分離により得られ、血液凝固系の異常
亢進を抑制する分子量54−57kDaのプロテインC
インヒビターを有効成分とする血液凝固異常亢進抑制剤
に関する。
【0002】
【従来の技術】血液凝固系の異常亢進により引き起こさ
れる疾病としては播種性血管内凝固(以下DICと省略
する)が代表的である。DICは、悪性腫瘍などによる
細胞の破壊および細菌感染(細菌が産生するエンドトキ
シンの作用)により露出した組織因子が血液と接触する
ことで血液凝固系が異常亢進し(血液中のトロンビン濃
度が顕著に上昇し)、全身の細小血管で血栓が形成され
る疾患である(凝固優位型DIC)。しかし、DIC患
者の線溶系は正常であるから形成された血栓を溶解する
ために二次的な線溶系の亢進がみられ、患者の体内では
高頻度で血液凝固−血栓溶解が繰り返されることになる
(代償性DIC)。この時、フィブリノーゲンおよびフ
ィブリン分解産物(以下FDPと省略する)の血中濃度
が上昇する。さらに、重度の場合には血液凝固系の諸因
子(フィブリノーゲンなど)の消費量が生合成量を上回
り出血傾向(線溶優位型DIC)となって死に至る場合
がある。
れる疾病としては播種性血管内凝固(以下DICと省略
する)が代表的である。DICは、悪性腫瘍などによる
細胞の破壊および細菌感染(細菌が産生するエンドトキ
シンの作用)により露出した組織因子が血液と接触する
ことで血液凝固系が異常亢進し(血液中のトロンビン濃
度が顕著に上昇し)、全身の細小血管で血栓が形成され
る疾患である(凝固優位型DIC)。しかし、DIC患
者の線溶系は正常であるから形成された血栓を溶解する
ために二次的な線溶系の亢進がみられ、患者の体内では
高頻度で血液凝固−血栓溶解が繰り返されることになる
(代償性DIC)。この時、フィブリノーゲンおよびフ
ィブリン分解産物(以下FDPと省略する)の血中濃度
が上昇する。さらに、重度の場合には血液凝固系の諸因
子(フィブリノーゲンなど)の消費量が生合成量を上回
り出血傾向(線溶優位型DIC)となって死に至る場合
がある。
【0003】DICはトロンビン血症とも称されるくら
い血中のトロンビン濃度が顕著に上昇し血液凝固系が異
常亢進する疾病であるため、従来使用されている主なD
ICの治療薬には、ヘパリン(分子量4,000〜4
0,000の混合物)、低分子量ヘパリン(ヘパリンか
ら分子量4,000〜5,000のものを分画)および
アンチトロンビンIII 濃縮製剤がある。
い血中のトロンビン濃度が顕著に上昇し血液凝固系が異
常亢進する疾病であるため、従来使用されている主なD
ICの治療薬には、ヘパリン(分子量4,000〜4
0,000の混合物)、低分子量ヘパリン(ヘパリンか
ら分子量4,000〜5,000のものを分画)および
アンチトロンビンIII 濃縮製剤がある。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】現在DICの治療に使
用されているヘパリンは、トロンビン(血液凝固系の主
要因子)だけでなく血液凝固第Xa因子に作用して血液
凝固を阻害するが、主としてトロンビンがアンチトロン
ビンIII (血中に存在するトロンビン阻害因子)に反応
するのを仲介して、つまり間接的に血液凝固を阻害して
いる。一方、生体内でヘパリンが何度も本阻害反応に利
用されるのに対して、アンチトロンビンIII はトロンビ
ンと複合体を形成すると速やかに代謝され消失する。そ
のため、ヘパリンを使用しているDIC患者ではアンチ
トロンビンIII が不足する傾向にあるためアンチトロン
ビンIII の補充が必要となる場合もある。しかし、アン
チトロンビンIII 濃縮製剤は高価であるため使用に関し
て保険上の制限(血中アンチトロンビンIII 濃度が70
%以下の患者でしかも1か月5日以内)があるくらいで
ある。さらに、ヘパリンは血液凝固時間をも延長させる
ため出血傾向になりやすい。この様にヘパリン療法では
出血傾向という副作用を伴うだけでなく、アンチトロン
ビンIII との関係から治療費用もかさむ。このため、ヘ
パリンに比して血液凝固第Xa因子に対する特異性が高
い低分子量ヘパリンも使用されているが、用量によりト
ロンビンと同様出血傾向の副作用を伴うため煩雑な血中
濃度の管理が必要である。さらに、ヘパリンに比して弱
いものの低分子量ヘパリンにもトロンビン阻害作用があ
り、血液凝固系の亢進を抑制するためにアンチトロンビ
ンIII の消費を伴う。このように、ヘパリンおよび低分
子量ヘパリンいずれを用いた治療法でも、程度の違いこ
そあれ、出血傾向およびアンチトロンビンIII の消費を
伴う。
用されているヘパリンは、トロンビン(血液凝固系の主
要因子)だけでなく血液凝固第Xa因子に作用して血液
凝固を阻害するが、主としてトロンビンがアンチトロン
ビンIII (血中に存在するトロンビン阻害因子)に反応
するのを仲介して、つまり間接的に血液凝固を阻害して
いる。一方、生体内でヘパリンが何度も本阻害反応に利
用されるのに対して、アンチトロンビンIII はトロンビ
ンと複合体を形成すると速やかに代謝され消失する。そ
のため、ヘパリンを使用しているDIC患者ではアンチ
トロンビンIII が不足する傾向にあるためアンチトロン
ビンIII の補充が必要となる場合もある。しかし、アン
チトロンビンIII 濃縮製剤は高価であるため使用に関し
て保険上の制限(血中アンチトロンビンIII 濃度が70
%以下の患者でしかも1か月5日以内)があるくらいで
ある。さらに、ヘパリンは血液凝固時間をも延長させる
ため出血傾向になりやすい。この様にヘパリン療法では
出血傾向という副作用を伴うだけでなく、アンチトロン
ビンIII との関係から治療費用もかさむ。このため、ヘ
パリンに比して血液凝固第Xa因子に対する特異性が高
い低分子量ヘパリンも使用されているが、用量によりト
ロンビンと同様出血傾向の副作用を伴うため煩雑な血中
濃度の管理が必要である。さらに、ヘパリンに比して弱
いものの低分子量ヘパリンにもトロンビン阻害作用があ
り、血液凝固系の亢進を抑制するためにアンチトロンビ
ンIII の消費を伴う。このように、ヘパリンおよび低分
子量ヘパリンいずれを用いた治療法でも、程度の違いこ
そあれ、出血傾向およびアンチトロンビンIII の消費を
伴う。
【0005】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは出
血傾向の副作用を示さず血液凝固系の亢進を阻害し血液
凝固系の異常亢進および血栓形成を抑制することができ
ないかと考え、鋭意研究を重ねた結果、尿中に存在する
分子量54−57kDaのタンパク質が意外にもDIC
におけるフィブリノーゲン消費、血液凝固時間延長およ
びFDP血中濃度上昇を抑制することを発見した。これ
は本タンパク質が血液凝固系の異常亢進を抑制する作用
を有することを示すものである。
血傾向の副作用を示さず血液凝固系の亢進を阻害し血液
凝固系の異常亢進および血栓形成を抑制することができ
ないかと考え、鋭意研究を重ねた結果、尿中に存在する
分子量54−57kDaのタンパク質が意外にもDIC
におけるフィブリノーゲン消費、血液凝固時間延長およ
びFDP血中濃度上昇を抑制することを発見した。これ
は本タンパク質が血液凝固系の異常亢進を抑制する作用
を有することを示すものである。
【0006】本タンパク質についてはその精製法、性
状、物性が数種の文献〔The Journal of
Biological Chemistry,26
1,12759−12766(1986),Metho
d in Enzymology,222,385−3
99(1993),他〕に発表され、セリンプロテア−
ゼインヒビターファミリーに分類されている。本タンパ
ク質は、尿に限らず血液および***からも検出されてお
り、多くの場合プロテインCインヒビターと呼ばれてい
るので、本明細書においても以下このタンパク質をプロ
テインCインヒビターと略称する。
状、物性が数種の文献〔The Journal of
Biological Chemistry,26
1,12759−12766(1986),Metho
d in Enzymology,222,385−3
99(1993),他〕に発表され、セリンプロテア−
ゼインヒビターファミリーに分類されている。本タンパ
ク質は、尿に限らず血液および***からも検出されてお
り、多くの場合プロテインCインヒビターと呼ばれてい
るので、本明細書においても以下このタンパク質をプロ
テインCインヒビターと略称する。
【0007】本発明は上記の新知見に基づくもので、血
液凝固系の亢進を抑制する分子量54−57kDaのプ
ロテインCインヒビターを有効成分としてなる血液凝固
異常亢進抑制剤に関する。
液凝固系の亢進を抑制する分子量54−57kDaのプ
ロテインCインヒビターを有効成分としてなる血液凝固
異常亢進抑制剤に関する。
【0008】
【発明の実施の形態】本発明に用いるプロテインCイン
ヒビターは尿、血液中に含まれており尿に限らず血液か
ら精製、分離して得たものでもよい。遠心分離など適切
な処理をした尿、血液を金属キレーティングセファロー
スとコナカパリンAセファロースおよびヘパリンセファ
ロースなどのアフィニティーカラム、さらにゲルろ過カ
ラムを組合わせて精製、分離することができる(実施例
1参照)。かくして種々の純度のプロテインCインヒビ
ターが得られるが、有効成分の一定量を確実に投与する
ため、できるだけ高純度のものを用いるのが好ましい。
ヒビターは尿、血液中に含まれており尿に限らず血液か
ら精製、分離して得たものでもよい。遠心分離など適切
な処理をした尿、血液を金属キレーティングセファロー
スとコナカパリンAセファロースおよびヘパリンセファ
ロースなどのアフィニティーカラム、さらにゲルろ過カ
ラムを組合わせて精製、分離することができる(実施例
1参照)。かくして種々の純度のプロテインCインヒビ
ターが得られるが、有効成分の一定量を確実に投与する
ため、できるだけ高純度のものを用いるのが好ましい。
【0009】静脈内投与された本発明のプロテインCイ
ンヒビターは出血傾向を伴うことなく、血液凝固系の異
常亢進とそれに伴って起こる二次的な線溶系の亢進を抑
制することができる(実施例2,3参照)。
ンヒビターは出血傾向を伴うことなく、血液凝固系の異
常亢進とそれに伴って起こる二次的な線溶系の亢進を抑
制することができる(実施例2,3参照)。
【0010】本発明の血液凝固異常亢進抑制剤は血液凝
固系の異常亢進を抑制するために精製物として成人一日
あたり、100−200mgを静脈内に点滴注入するこ
とができる。プロテインCインヒビターは通常血液中に
3.3−6.8μg/ml存在しているもので静脈内投
与による毒性はほとんど認められない。
固系の異常亢進を抑制するために精製物として成人一日
あたり、100−200mgを静脈内に点滴注入するこ
とができる。プロテインCインヒビターは通常血液中に
3.3−6.8μg/ml存在しているもので静脈内投
与による毒性はほとんど認められない。
【0011】
【実施例】以下に実施例の形で本発明をさらに説明する
が本発明はこれによって限定されるものではない。
が本発明はこれによって限定されるものではない。
【0012】実施例1(プロテインCインヒビター精製
物の製造) 以下の精製操作の全過程を4℃で行った。ベンズアミジ
ン(終濃度5mM)存在下採取した健常な成人男子の尿
(30L)を−20℃で一旦凍結させた後融解し、遠心
分離機(TOMY RS−20,TOMY,東京)で
3,000rpm、30分間遠心して得た上澄み液のp
Hを水酸化ナトリウム(6N)で7.4に調製した。こ
れをろ紙で濾過した後、300mM塩化ナトリウムおよ
び5mMベンズアミジンを含む20mMトリス酢酸緩衝
液(pH7.4)で平衡化した亜鉛−キレーティング・
セファロース(14×6.9cm)のカラムにアプライ
し同緩衝液でカラムを洗浄した後、50mMイミダゾー
ルを含む同緩衝液で溶出した。吸収波長280nmで極
大吸収を示す画分を集め、150mM塩化ナトリウム、
5mMベンズアミジンおよび1mMフェニルメチルスル
フォニルフロリド(以下PMSFと省略する)を含む2
0mMトリス酢酸緩衝液(pH7.4)で平衡化したコ
ナカパリンAセファロースカラム(2.5×7.1c
m)にアプライし、緩衝液を0.15M塩化ナトリウ
ム、5mMベンズアミジンおよび1mMフェニルメチル
スルフォニルフロリド(以下PMSFと省略する)を含
む20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.4)に置換えた
後、150mM塩化ナトリウム、1mMベンズアミジン
および1mM PMSFを含む20mMトリス塩酸緩衝
液(pH7.4)でカラムを洗浄し、0.5Mメチル−
α−D−グルコシドを含む同緩衝液で溶出した。次に、
吸収波長280nmで極大吸収を示す画分を集め、50
mM塩化ナトリウム、5mMベンズアミジンおよび1m
M PMSFを含む20mMトリス塩酸緩衝液(pH
7.4)に対して、内液の電導度が同緩衝液の電導度
(4.5mS/cm)と同じになるまで透析を行った。
物の製造) 以下の精製操作の全過程を4℃で行った。ベンズアミジ
ン(終濃度5mM)存在下採取した健常な成人男子の尿
(30L)を−20℃で一旦凍結させた後融解し、遠心
分離機(TOMY RS−20,TOMY,東京)で
3,000rpm、30分間遠心して得た上澄み液のp
Hを水酸化ナトリウム(6N)で7.4に調製した。こ
れをろ紙で濾過した後、300mM塩化ナトリウムおよ
び5mMベンズアミジンを含む20mMトリス酢酸緩衝
液(pH7.4)で平衡化した亜鉛−キレーティング・
セファロース(14×6.9cm)のカラムにアプライ
し同緩衝液でカラムを洗浄した後、50mMイミダゾー
ルを含む同緩衝液で溶出した。吸収波長280nmで極
大吸収を示す画分を集め、150mM塩化ナトリウム、
5mMベンズアミジンおよび1mMフェニルメチルスル
フォニルフロリド(以下PMSFと省略する)を含む2
0mMトリス酢酸緩衝液(pH7.4)で平衡化したコ
ナカパリンAセファロースカラム(2.5×7.1c
m)にアプライし、緩衝液を0.15M塩化ナトリウ
ム、5mMベンズアミジンおよび1mMフェニルメチル
スルフォニルフロリド(以下PMSFと省略する)を含
む20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.4)に置換えた
後、150mM塩化ナトリウム、1mMベンズアミジン
および1mM PMSFを含む20mMトリス塩酸緩衝
液(pH7.4)でカラムを洗浄し、0.5Mメチル−
α−D−グルコシドを含む同緩衝液で溶出した。次に、
吸収波長280nmで極大吸収を示す画分を集め、50
mM塩化ナトリウム、5mMベンズアミジンおよび1m
M PMSFを含む20mMトリス塩酸緩衝液(pH
7.4)に対して、内液の電導度が同緩衝液の電導度
(4.5mS/cm)と同じになるまで透析を行った。
【0013】この透析内液を50mM塩化ナトリウム、
5mMベンズアミジンおよび1mMPMSFを含む20
mMトリス塩酸緩衝液(pH7.4)で平衡化したヘパ
リンセファロースカラム(1.5×4.5cm)にアプ
ライし、200mM塩化ナトリウムを含む20mMトリ
ス塩酸緩衝液(pH7.4)で洗浄した後、500mM
塩化ナトリウムを含む20mMトリス塩酸緩衝液(pH
7.4)で溶出し、標準ヒト血漿(George Ki
ng Bio−medical社)のプロトロンビン時
間を延長させる(血液凝固系の亢進を阻害する)画分を
集めた(画分A)。本画分を300mM塩化ナトリウム
を含む20mMトリス塩酸緩衝液で平衡化したゲルろ過
用カラム(TSK−G300XL)でゲルろ過し主ピー
クを分取し(画分B)、使用するまで−20℃で凍結保
存した。本精製で新鮮尿30LからプロテインCインヒ
ビター約600μgを得た。プロテインCインヒビター
の定量には市販のプロテインCインヒビター定量キット
(PCI antigen ELISA kit, T
echnoclone社)を用いた。上記の画分A及び
Bについて電気泳動を行った(図1)。
5mMベンズアミジンおよび1mMPMSFを含む20
mMトリス塩酸緩衝液(pH7.4)で平衡化したヘパ
リンセファロースカラム(1.5×4.5cm)にアプ
ライし、200mM塩化ナトリウムを含む20mMトリ
ス塩酸緩衝液(pH7.4)で洗浄した後、500mM
塩化ナトリウムを含む20mMトリス塩酸緩衝液(pH
7.4)で溶出し、標準ヒト血漿(George Ki
ng Bio−medical社)のプロトロンビン時
間を延長させる(血液凝固系の亢進を阻害する)画分を
集めた(画分A)。本画分を300mM塩化ナトリウム
を含む20mMトリス塩酸緩衝液で平衡化したゲルろ過
用カラム(TSK−G300XL)でゲルろ過し主ピー
クを分取し(画分B)、使用するまで−20℃で凍結保
存した。本精製で新鮮尿30LからプロテインCインヒ
ビター約600μgを得た。プロテインCインヒビター
の定量には市販のプロテインCインヒビター定量キット
(PCI antigen ELISA kit, T
echnoclone社)を用いた。上記の画分A及び
Bについて電気泳動を行った(図1)。
【0014】実施例2(エンドトキシン誘発DICモデ
ルラットの作製) DICが発症する原因の一つに細菌感染がある。これ
は、細菌の産生するエンドトキシンが最終的に血管内皮
細胞表面に組織因子を発現させ、凝固系の亢進を引き起
こすためである。よって、DICモデルラットを作製す
るためにエンドトキシンを利用した。詳細は方法は次の
通り。ペントバルビタール麻酔した雄性ラット(170
〜200g)3匹に対して体重1kgあたり50mgの
エンドトキシン(E.coli 0127:B8,DI
FCO社)を尾静脈から60分かけて定速注入した。エ
ンドトキシン注入開始から180分間まで観察を行っ
た。つまり、エンドトキシン注入開始前、注入開始から
90、120、150および180分それぞれの時間で
血液300μlをラット頸静脈から採取した。採取した
血液を下記(イ)、(ロ)、(ハ)の試験に用いた。さ
らに、観察終了直後に下行大静脈より3.8%クエン酸
ナトリウム200μlを入れたシリンジを用いて180
0μlの血液を採取して遠心分離して得た血漿をプロト
ロンビン時間測定(ニ)のための試料とした。表1にこ
れら(イ)〜(ニ)の試験結果を示す。
ルラットの作製) DICが発症する原因の一つに細菌感染がある。これ
は、細菌の産生するエンドトキシンが最終的に血管内皮
細胞表面に組織因子を発現させ、凝固系の亢進を引き起
こすためである。よって、DICモデルラットを作製す
るためにエンドトキシンを利用した。詳細は方法は次の
通り。ペントバルビタール麻酔した雄性ラット(170
〜200g)3匹に対して体重1kgあたり50mgの
エンドトキシン(E.coli 0127:B8,DI
FCO社)を尾静脈から60分かけて定速注入した。エ
ンドトキシン注入開始から180分間まで観察を行っ
た。つまり、エンドトキシン注入開始前、注入開始から
90、120、150および180分それぞれの時間で
血液300μlをラット頸静脈から採取した。採取した
血液を下記(イ)、(ロ)、(ハ)の試験に用いた。さ
らに、観察終了直後に下行大静脈より3.8%クエン酸
ナトリウム200μlを入れたシリンジを用いて180
0μlの血液を採取して遠心分離して得た血漿をプロト
ロンビン時間測定(ニ)のための試料とした。表1にこ
れら(イ)〜(ニ)の試験結果を示す。
【0015】
【表1】
【0016】(イ)血小板数 血液中の血小板数を計数するために上記の各時間に採取
した血液100μlを抗凝固剤としてエチレンジアミン
4酢酸をコーティングしてある採血ビン(Sysmex
社)に採った。この血液を自動血球計数装置F−800
(Sysmex社)に供したところ、エンドトキシン注
入開始から90分まではエンドトキシン注入前と比べて
もほとんど変化は認められなかったが、注入開始から1
20および180分それぞれの時間で血小板数はエンド
トキシン注入前の75.0±4.1(%)および50.
2±1.5(%)まで減少した。
した血液100μlを抗凝固剤としてエチレンジアミン
4酢酸をコーティングしてある採血ビン(Sysmex
社)に採った。この血液を自動血球計数装置F−800
(Sysmex社)に供したところ、エンドトキシン注
入開始から90分まではエンドトキシン注入前と比べて
もほとんど変化は認められなかったが、注入開始から1
20および180分それぞれの時間で血小板数はエンド
トキシン注入前の75.0±4.1(%)および50.
2±1.5(%)まで減少した。
【0017】(ロ)フィブリノーゲン濃度 各時間に採取した血液90μlを10μlの9.8%ク
エン酸ナトリウムに加えて遠心分離することで得た血漿
を試料としてフィブリノーゲン・テストキット(和光純
薬)に供して血漿フィブリノーゲン濃度を測定した。こ
の結果、エンドトキシン注入開始から90分まではエン
ドトキシン注入前と比べても濃度に差異は認められなか
ったが、注入開始から120および180分それぞれの
時間でフィブリノーゲン濃度はエンドトキシン注入前の
80.7±6.6(%)および41.0±3.7(%)
まで減少した。
エン酸ナトリウムに加えて遠心分離することで得た血漿
を試料としてフィブリノーゲン・テストキット(和光純
薬)に供して血漿フィブリノーゲン濃度を測定した。こ
の結果、エンドトキシン注入開始から90分まではエン
ドトキシン注入前と比べても濃度に差異は認められなか
ったが、注入開始から120および180分それぞれの
時間でフィブリノーゲン濃度はエンドトキシン注入前の
80.7±6.6(%)および41.0±3.7(%)
まで減少した。
【0018】(ハ)FDP濃度 各時間に採取した血液100μlをFDPテストキット
(帝国臓器)に添付されていた凝固促進剤で凝固させた
後、遠心分離して得た血清のFDP濃度を本キットを用
いて測定した。エンドトキシン注入開始から90分まで
はFDPは検出できなかったが、開始から後120分お
よび180分それぞれの時間で3.3±1.4(μg/
ml)および20.0±0.0(μg/ml)まで上昇
した。この結果はエンドトキシン注入開始から120分
以降で線溶系が亢進したことを示唆している。
(帝国臓器)に添付されていた凝固促進剤で凝固させた
後、遠心分離して得た血清のFDP濃度を本キットを用
いて測定した。エンドトキシン注入開始から90分まで
はFDPは検出できなかったが、開始から後120分お
よび180分それぞれの時間で3.3±1.4(μg/
ml)および20.0±0.0(μg/ml)まで上昇
した。この結果はエンドトキシン注入開始から120分
以降で線溶系が亢進したことを示唆している。
【0019】(ニ)プロトロンビン時間 上記の様にして得た血漿100μlをプロトロンビン時
間測定用キット(和光純薬)を用いて測定したところ、
26.5±1.9秒であり、エンドトキシン注入前の1
2.6±0.4秒に比べて顕著に延長した。これは本モ
デルにおいて血液凝固外因系因子が急激に消費されてい
ることを表している。
間測定用キット(和光純薬)を用いて測定したところ、
26.5±1.9秒であり、エンドトキシン注入前の1
2.6±0.4秒に比べて顕著に延長した。これは本モ
デルにおいて血液凝固外因系因子が急激に消費されてい
ることを表している。
【0020】以上、(イ)と(ロ)の結果から、エンド
トキシン注入開始から120分以降で血液凝固系の異常
亢進により著しい血栓形成が起こっていることが、
(ハ)の結果から凝固系の異常亢進に伴って線溶系が亢
進していることが、(ニ)の結果から本モデルでは凝固
因子の急激な消費が起こることがわかった。つまり、本
モデルでは、エンドトキシン注入開始から120分以降
で代償性DICでみられる典型的な凝固系の異常亢進が
起こることがわかった。そこで、エンドトキシン注入開
始から120分を経たラットをエンドトキシン誘発DI
Cモデルとして実施例3で利用した。
トキシン注入開始から120分以降で血液凝固系の異常
亢進により著しい血栓形成が起こっていることが、
(ハ)の結果から凝固系の異常亢進に伴って線溶系が亢
進していることが、(ニ)の結果から本モデルでは凝固
因子の急激な消費が起こることがわかった。つまり、本
モデルでは、エンドトキシン注入開始から120分以降
で代償性DICでみられる典型的な凝固系の異常亢進が
起こることがわかった。そこで、エンドトキシン注入開
始から120分を経たラットをエンドトキシン誘発DI
Cモデルとして実施例3で利用した。
【0021】実施例3(エンドトキシン誘発DICモデ
ルラットに対するプロテインCインヒビターの影響) 実施例1で得たプロテインCインヒビター(90μg/
ml)1mlもしくは対照として300mM塩化ナトリ
ウムを含む20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.4)1
mlを実施例2で記した様にエンドトキシン注入開始か
ら120分を経たエンドトキシン誘発DICモデルラッ
ト(各群3匹)の大腿静脈から60分間かけて定速で注
入し、表2で示した時間、つまり、プロテインCインヒ
ビターもしくは緩衝液注入開始前(120分)、注入開
始から30(150分)、60分(180分)それぞれ
の時間で採取した血液中の血小板数、フィブリノーゲン
濃度およびFDP濃度を測定した。さらに、観察終了直
後(180分)に下行大静脈より3.8%クエン酸ナト
リウム200μlを入れたシリンジを用いて1800μ
lの血液を採取して遠心分離して得た血漿を用いてプロ
トロンビン時間を測定した。これらの操作の手順を表2
に、結果を表3に示す。
ルラットに対するプロテインCインヒビターの影響) 実施例1で得たプロテインCインヒビター(90μg/
ml)1mlもしくは対照として300mM塩化ナトリ
ウムを含む20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.4)1
mlを実施例2で記した様にエンドトキシン注入開始か
ら120分を経たエンドトキシン誘発DICモデルラッ
ト(各群3匹)の大腿静脈から60分間かけて定速で注
入し、表2で示した時間、つまり、プロテインCインヒ
ビターもしくは緩衝液注入開始前(120分)、注入開
始から30(150分)、60分(180分)それぞれ
の時間で採取した血液中の血小板数、フィブリノーゲン
濃度およびFDP濃度を測定した。さらに、観察終了直
後(180分)に下行大静脈より3.8%クエン酸ナト
リウム200μlを入れたシリンジを用いて1800μ
lの血液を採取して遠心分離して得た血漿を用いてプロ
トロンビン時間を測定した。これらの操作の手順を表2
に、結果を表3に示す。
【0022】
【表2】
【0023】
【表3】
【0024】各採血時間(プロテインCインヒビターも
しくは緩衝液注入開始前、開始から30および60分)
で血液中の血小板数、フィブリノーゲン濃度およびFD
P濃度を測定した。両投与群間で血小板数(%)の減少
を比較したところ、注入開始から30分、60分いずれ
の時間でも差異は認められなかった。血栓の形成に利用
され消費される血漿フィブリノーゲン濃度を比較する
と、対照群では注入開始から30分および60分それぞ
れの時間で注入開始前の75.2±9.9および50.
8±2.8(%)と減少したのに対して、プロテインC
インヒビター投与群ではそれぞれ93.4±7.9およ
び64.7±2.0(%)とその減少は有意に抑制され
ていた。さらに本モデルは血液凝固外因系を亢進させて
作製したモデルであることから外因系凝固因子の消費を
検討するために観察終了直後(180分)の血漿のプロ
トロンビン時間(正常ラット血漿で12.6±0.4
秒)を測定したところ、対照群では26.5±1.9秒
であったのに比してプロテインCインヒビター投与群で
は20.4±0.5秒と有意にその時間が短縮され、正
常値に近づいた。一方、血液凝固系の亢進に伴って起こ
る線溶系亢進の指標となるFDPの血中濃度は、対照群
で注入開始から30分および60分それぞれの時間で1
1.7±7.6および20.0±0.0(μg/ml)
と上昇していたが、プロテインCインヒビター投与群で
はそれぞれ5.0±0.0および10.0±0.0(μ
g/ml)とその上昇は抑制されていた。
しくは緩衝液注入開始前、開始から30および60分)
で血液中の血小板数、フィブリノーゲン濃度およびFD
P濃度を測定した。両投与群間で血小板数(%)の減少
を比較したところ、注入開始から30分、60分いずれ
の時間でも差異は認められなかった。血栓の形成に利用
され消費される血漿フィブリノーゲン濃度を比較する
と、対照群では注入開始から30分および60分それぞ
れの時間で注入開始前の75.2±9.9および50.
8±2.8(%)と減少したのに対して、プロテインC
インヒビター投与群ではそれぞれ93.4±7.9およ
び64.7±2.0(%)とその減少は有意に抑制され
ていた。さらに本モデルは血液凝固外因系を亢進させて
作製したモデルであることから外因系凝固因子の消費を
検討するために観察終了直後(180分)の血漿のプロ
トロンビン時間(正常ラット血漿で12.6±0.4
秒)を測定したところ、対照群では26.5±1.9秒
であったのに比してプロテインCインヒビター投与群で
は20.4±0.5秒と有意にその時間が短縮され、正
常値に近づいた。一方、血液凝固系の亢進に伴って起こ
る線溶系亢進の指標となるFDPの血中濃度は、対照群
で注入開始から30分および60分それぞれの時間で1
1.7±7.6および20.0±0.0(μg/ml)
と上昇していたが、プロテインCインヒビター投与群で
はそれぞれ5.0±0.0および10.0±0.0(μ
g/ml)とその上昇は抑制されていた。
【0025】これらの結果から、プロテインCインヒビ
ターは、DICなどの様に血液凝固系の異常亢進がみら
れる病態において、止血血栓(白色血栓)の形成に重要
な血小板凝集を抑制することなく、血栓形成に関与する
因子であるフィブリノーゲンの減少(消費)および外因
系凝固因子の消費を抑制することが判った。さらに、血
液凝固系の異常亢進を抑制することで血液凝固系異常亢
進に伴って起こる二次的な線溶系の亢進をも抑制するこ
とも判明した。したがって、プロテインCインヒビター
は、出血傾向などの副作用を伴うことなく、DICで高
頻度に起こっている血液凝固−血栓溶解の繰返しを抑制
する作用を有すると言うことができる。
ターは、DICなどの様に血液凝固系の異常亢進がみら
れる病態において、止血血栓(白色血栓)の形成に重要
な血小板凝集を抑制することなく、血栓形成に関与する
因子であるフィブリノーゲンの減少(消費)および外因
系凝固因子の消費を抑制することが判った。さらに、血
液凝固系の異常亢進を抑制することで血液凝固系異常亢
進に伴って起こる二次的な線溶系の亢進をも抑制するこ
とも判明した。したがって、プロテインCインヒビター
は、出血傾向などの副作用を伴うことなく、DICで高
頻度に起こっている血液凝固−血栓溶解の繰返しを抑制
する作用を有すると言うことができる。
【0026】
【発明の効果】本発明によれば出血傾向などの副作用の
心配がなく、DICでみられる典型的な血液凝固系の異
常亢進とそれに伴って起こる二次的な線溶系の亢進を抑
制する血液凝固異常亢進抑制剤が提供される。
心配がなく、DICでみられる典型的な血液凝固系の異
常亢進とそれに伴って起こる二次的な線溶系の亢進を抑
制する血液凝固異常亢進抑制剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図1】 実施例1における精製プロテインCインヒビ
ターの電気泳動パターンを示す。染色は0.25%クー
マジー・ブリリアント・ブルーで行った。左から順にM
は分子量マーカー(上から200,97.4,68,4
3,29,18.4,14.3kDa)、1はヘパリン
カラム溶出画分(A)、2はゲルろ過画分(B)であ
る。
ターの電気泳動パターンを示す。染色は0.25%クー
マジー・ブリリアント・ブルーで行った。左から順にM
は分子量マーカー(上から200,97.4,68,4
3,29,18.4,14.3kDa)、1はヘパリン
カラム溶出画分(A)、2はゲルろ過画分(B)であ
る。
Claims (3)
- 【請求項1】 有効成分として血液凝固系の亢進を抑制
する分子量54−57kDa(SDS−PAGE)のプ
ロテインCインヒビターを含有する血液凝固異常亢進抑
制剤。 - 【請求項2】 静脈内投与用の剤形である請求項1記載
の血液凝固異常亢進抑制剤。 - 【請求項3】 プロテインCインヒビターがヒト尿およ
び血液からの精製、分離により得られるプロテインCイ
ンヒビター画分である請求項1記載の血液凝固異常亢進
抑制剤。
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9230294A JPH1160500A (ja) | 1997-08-11 | 1997-08-11 | 血液凝固異常亢進抑制剤 |
DE69810724T DE69810724T2 (de) | 1997-08-11 | 1998-08-11 | Verwendung von Protein C Inhibitor zur Behandlung disseminierter intravasaler Gerinnung (DIC) |
AT98115110T ATE231001T1 (de) | 1997-08-11 | 1998-08-11 | Verwendung von protein c inhibitor zur behandlung disseminierter intravasaler gerinnung (dic) |
CA002244801A CA2244801A1 (en) | 1997-08-11 | 1998-08-11 | Suppressory agents against hypercoagulation |
US09/132,534 US5948752A (en) | 1997-08-11 | 1998-08-11 | Suppressory agents against hypercoagulation |
EP98115110A EP0904785B1 (en) | 1997-08-11 | 1998-08-11 | Use of protein C inhibitor for the treatment of disseminated intrvascular coagulation (DIC) |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9230294A JPH1160500A (ja) | 1997-08-11 | 1997-08-11 | 血液凝固異常亢進抑制剤 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH1160500A true JPH1160500A (ja) | 1999-03-02 |
Family
ID=16905575
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9230294A Pending JPH1160500A (ja) | 1997-08-11 | 1997-08-11 | 血液凝固異常亢進抑制剤 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5948752A (ja) |
EP (1) | EP0904785B1 (ja) |
JP (1) | JPH1160500A (ja) |
AT (1) | ATE231001T1 (ja) |
CA (1) | CA2244801A1 (ja) |
DE (1) | DE69810724T2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002010783A (ja) * | 2000-06-29 | 2002-01-15 | Jcr Pharmaceuticals Co Ltd | 改変型ヒトプロテインcインヒビター |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TW200407335A (en) * | 2002-07-22 | 2004-05-16 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Non-neutralizing antibody to inhibit the inactivation of activated protein C |
WO2004065418A1 (ja) * | 2003-01-20 | 2004-08-05 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 抗pci中和抗体 |
FR2945126B1 (fr) * | 2009-04-29 | 2019-11-01 | Commissariat A L'energie Atomique | Procede et appareil de comptage des thrombocytes |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3705745A1 (de) * | 1987-02-23 | 1988-09-01 | Behringwerke Ag | Protein c-inhibitor (pci) als pharmazeutikum und in vitro-diagnostikum, verfahren zur herstellung eines solchen pharmazeutikums oder diagnostikums sowie ein mittel enthaltend pci |
WO1993000926A1 (en) * | 1991-07-02 | 1993-01-21 | Children's Medical Center Corporation | Treatment of periodontal disease with protease inhibitors |
-
1997
- 1997-08-11 JP JP9230294A patent/JPH1160500A/ja active Pending
-
1998
- 1998-08-11 AT AT98115110T patent/ATE231001T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-08-11 DE DE69810724T patent/DE69810724T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1998-08-11 EP EP98115110A patent/EP0904785B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 US US09/132,534 patent/US5948752A/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-08-11 CA CA002244801A patent/CA2244801A1/en not_active Abandoned
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002010783A (ja) * | 2000-06-29 | 2002-01-15 | Jcr Pharmaceuticals Co Ltd | 改変型ヒトプロテインcインヒビター |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0904785B1 (en) | 2003-01-15 |
DE69810724T2 (de) | 2003-05-08 |
CA2244801A1 (en) | 1999-02-11 |
US5948752A (en) | 1999-09-07 |
EP0904785A1 (en) | 1999-03-31 |
DE69810724D1 (de) | 2003-02-20 |
ATE231001T1 (de) | 2003-02-15 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061010 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070227 |