JPH11513145A - 二重対物レンズ系を有する共焦点顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、試料照明光を対物点に集束させるための対物レンズ２５と、その対物点から発する光を集束するための対物レンズ（３３）を有する顕微鏡用の二重対物レンズ系に関する。両方の対物レンズ（２５，３３）の光学軸は互いに相対的に傾いているので、観察方向と照明方向はある角度で互いに支配される。両方の対物レンズ（２５，３３）は、試料照明光源からの光が光通過孔（５）を通して供給される二重対物レンズ−構成ユニット（１）に対して共用ホルダ（３）で一緒に固定される。そのことによってさらに、照明光線の進路（３５）および／または観察光線の進路（３５）を形成するので、観察対物レンズ（３３）から来る観察光が光通過孔（５）を通って二重対物レンズ−構成ユニット（１）を出る光転向系（１９，２１，２３，３７，３９）を有する。それゆえ、二重対物レンズ−構成ユニットを従来型顕微鏡の構造に組込むことができる。

Description

【発明の詳細な説明】 二重対物レンズ系を有する共焦点顕微鏡 本発明は、試料照明光源の光を照明光線の進路上の対物点に集束させるための 第一対物レンズと、対物点から発せられる光を観察光線の進路上で集束させるた めの第二対物レンズとから成り、第二対物レンズの観察方向が第一対物レンズの 照明方向の角度により決定される、二重対物レンズ系を有する共焦点顕微鏡に関 する。 前記の種類の二重対物レンズ系を有する走査型顕微鏡は、DE 43 26 473 A1 に より知られる。 この周知の走査型顕微鏡は、平行なレーザ光が第一対物レンズによって照明光 線の進路上で対物点に集束される。第二対物レンズは、第一対物レンズに対して 相対的に配置されるので、両方の対物レンズの光学軸が互いに直角になり、第一 対物レンズで照明される対物点が、第二対物レンズの焦点となるので、第二対物 レンズの観察方向が、第一対物レンズの適正角度に決定される。 対物点で発せられ第二対物レンズにて集束される観察光は、この第二対物レン ズにおいて、観察光線の進路上で調整される１枚のレンズにより開口絞りで集束 され、光センサがその開口絞りを通り抜ける光の強さを測定する。 それゆえ、試料領域における走査の途切れ(Abrasterung)によって、光センサ の測定情報から対応画像が生成される。 さらに、刊行物DE 94 08 066 U1 で、立体顕微鏡用の照明方式が知られており 、それは観察試料に対して観察光学系の方向から照明する。この顕微鏡本体と、 従ってセンサ配列として作用する顕微鏡の対物レンズとの照明配列は、構成ユニ ットとなっているほど実用化されている。 この照明調整は、本発明に基づく二重対物レンズ系とは異なる。特に、それが 共焦点顕微鏡での組込みに適さないという点において、また、それが極力検知方 向から照明するという点においてである。 これに対し、本発明に基づく二重対物レンズ系の場合は、極力、照明方向と検 知方向の夾角が適正に実現される。 DE 43 26 473 A1 で周知の走査型顕微鏡は、すでに極めて高い分解能を有する 。これは特に、対物点で適正角度を決定する照明光線の進路と観察光線の進路の 光学軸によって、集束領域で捕捉される共集束量が最小限になることで達成され る。試料領域の照明量を照明軸に沿って長く伸びた楕円形として、また、試料領 域での第二対物レンズの観察量を第二対物レンズの光学軸に沿って長く伸びる楕 円形として、近似的に考察すれば、集束領域または対物点の領域のこれらの楕円 形の干渉によって生じるのは、照明量と観察量の遮断量に本質的に対応する、そ れ相応に小さい共集束量である。そのように観察される共集束量が小さければ小 さいほど、顕微鏡の分解能は優れている。 アナログ観察方式の出発点は、いわゆる照明・点ぼかし機能（照明点・拡散・ 機能）による第一対物レンズの集束領域に於ける試料照明光の照度分散を描写す ることであり、また、観察・点ぼかし機能（検知点・拡散・機能）の検知開口絞 り使用時の第二対物レンズによる集束領域から発する光の検知率を描写すること である。 結果的に生じる共焦点顕微鏡の対物点の点ぼかし機能（ＫＰＶＦ）は、照明・ 点ぼかし機能と観察・点ぼかし機能の産物である。ＫＰＶＦが広がれば広がるほ ど、顕微鏡の分解能は悪くなる。今、照明・点ぼかし機能と，観察・点ぼかし機 能を互いにほぼ直角に配置すると、第一対物レンズの光学軸に沿って照明・点ぼ かし機能が比較的大きく拡大しても相殺されるので、３本の空間軸に沿っていず れもほぼ同等の良好な分解能が得られる。対物点で照明光線と観察光線の進路が 直交することによって、非常に良好な分解能が得られる。 対物点で交差する照明光線と観察光線の進路を互いに成立させるためには、DE 43 26 473 A1 によると、観察光線の進路を照明光線の進路から完全に分離した 特殊構造が想定される。そのような特殊構造は、互いに直交する照明光線と観察 光線の進路方向の双方に、比較的多くのスペースを必要とし、従来型の走査型顕 微鏡としてはそれなりに取り扱いが難しく、その場合、照明光線と観察光線の進 路は減衰し、試料照明光の集束と対物点から来る観察光の集束は同様の対物レン ズによって行われる。 公知の発明によれば、課題として、DE 43 26 473 A1 による公知の光学原理が 従来型顕微鏡と構造的に相違せずに光学顕微鏡に適用できる方法が提示されてい る。 これに関して、本発明は以下の如く提案する： 両方の対物レンズは、両方の対物レンズを含む関連のある構造群または構成ユ ニットという形態を採るので、共用ホルダに取付けられており、その際、二重対 物レンズ・構成ユニットは試料照明光源からの光を供給するための光通過孔を具 備し、さらに光転向系を装備し、それは第二対物レンズから来る観察光が光通過 孔を通って二重対物レンズ・構成ユニットを出るように照明光線および／または 観察光線の進路を形成する。 本発明に基づく二重対物レンズ系は、光線の進路と適合性のある対物レンズ系 として共通の光通過孔を通る光の頻繁な出入りに基づいており、他の従来型で、 同様の対物レンズで照明し観察するために設計された顕微鏡、特に走査型顕微鏡 で利用可能であり、その際、従来型顕微鏡の場合は、従来通り個別対物レンズが 交換される。 それ故、空間３方向全てにおいて極めて高い分解能を得るために、DE 43 26 4 73 A1 で周知の光学原理を従来通りの顕微鏡の構造と結びつけて具体化すること ができる。 特に、両方の対物レンズと光転向系は、試料照明光源の光が入射し、観察光が 出射するための孔がある共通のハウジングに収納される。特にそのハウジングは 、二重対物レンズ・構成ユニットの照明光線の進路を顕微鏡の照明光線の進路に 統合し、また、二重対物レンズ・構成ユニットの観察光線の進路を顕微鏡の観察 光線の進路に統合するために、他の従来型顕微鏡のホルダに、特にホルダ軸の周 りで回転可能な状熊で取付け可能である。 高い分解能を達成するには、第一対物レンズの照明方向と第二対物レンズの観 察方向の夾角は、ほぼ９０度でなければならない。しかし、本発明の利点は、そ の角度が９０度から大きく逸脱しなければ、なお十分な精度が得られることであ る。 照明方向と観察方向は、第一対物レンズの出射光線の進路方向、または第二対 物レンズの入射光線の進路方向と関係する。 本発明の詳細な説明に基づいて、下記の如く解決することができる： 照明方向と観察方向の夾角を任意に変えられるように、対物レンズは互いに相 対的に調整できる。例えば、角度が９０度よりいく分小さく設定されていれば、 二重対物レンズ・構成ユニットの前の試料スペースが、大して制約されないので 、達成される分解能に関しての大幅な妥協が不要となる。 対物レンズは口径が主として同等で、特に数値的に大きく、従来のレンズ部品 からなる。対物レンズは主として作動距離が大きくなければならない。 両方の対物レンズの光学軸の夾角を小さくするために、対物レンズのレンズ部 品を研磨することができ、これによって個別対物レンズの視野がもはや丸みを帯 びなくなる。しかし、このことによっては、二重対物レンズ系を光走査式の走査 型顕微鏡に組込む際、写像特性に関して影響が無いので、光線はその都度、対物 レンズの光学軸に対して直角になる寸法でのみ走査される。 本発明に基づく二重対物レンズ・構成ユニットを従来型の走査型顕微鏡の構造 に利用できることによって、走査（光走査および／または試料走査）のために不 可欠な従来型の光線または試料の移動手段はそのまま活かせるので、適合させる ための特殊な作業が不要であるという、さらに本質的な利点が生じる。光走査は 従来通りの方法で両方の対物レンズの光学軸に直角に行われる。このことによっ て、光走査の際に、照明点と観察点が一緒に移動することが保証される。 本発明に基づく二重対物レンズ・構成ユニットによって、有利な方法で、液浸 媒質を走査型顕微鏡に利用可能とできる。 二重対物レンズ・構成ユニットの光転向系には、例えば、ミラー、二色ミラー 、分光器、または光ファイバを含めることができる。 特に光転向系のいくつかの光学部品は、少なくともハウジング内で移動可動な 調整ピンに取付られ、しかも、必要ならば交換できる。ほとんどのものが対物レ ンズに適用できる。 本発明に基づく二重対物レンズ・構成ユニットは、従来型顕微鏡の場合、主た るものは従来的な対物レンズで簡単に取扱うことができ、蛍光着色料が単光子吸 収によって、あるいは多光子吸収によっても刺激される蛍光顕微鏡に組込むこと ができる。 蛍光を観察する場合は、光の波長に影響を及ぼす特有の光学部品を想定するこ とができる。例えば、分光フィルタであってもよいが、そのような光学部品を、 二重対物レンズ・構成ユニット内で分離されて走る照明光線と観察光線の進路上 に組込むことができる。他方、そのような部品の組込みは（両）光線の進路が共 に走る所でも可能である。 本発明に基づく二重対物レンズ・構成ユニットは散乱光で作動する顕微鏡の場 合にも代用できる。散乱光の観察の場合は、光の偏光方向に影響を及ぼす特有の 光学部品を想定することができる。 そのような偏光子を、例えば、二重対物レンズ・構成ユニット内で分離されて 走る照明光線と観察光線の進路上に組込めるが、その代替案として、両方の光線 の進路が共に走る所でも組込める。 本発明に基づく二重対物レンズ系は、いわゆる両方の光線の進路に関して、照 明と観察とを取替えられような技術が可能である。そこでは、必要ならば、接眼 レンズ系による視覚的観察を行なう上で、その都度、一方の、あるいはもう一方 の光線の進路のみを、従来の方法で、照明光線の進路として、また、観察光線の 進路として同時に役立つ、というさらなる可能性がある。 次に、図面に関して、本発明の実施例を詳細に説明する。 図１は、本発明に基づく二重対物レンズ系の実施例を示し、関連して、また、 ユニットとして取扱い可能な構成群１（二重対物レンズ・構成ユニット）を断面 で図示する。 二重対物レンズ・構成ユニット１は、ソケット７によって囲まれた光通過孔５ を有する。二重対物レンズ・構成ユニット１は、符号１１付近で途切れて略記さ れた顕微鏡の、一部図示された対物レンズホルダ９付きのソケット７で結合され る。その結果、光通過孔５は鏡筒の光学軸１３に関して芯出しされるので、二重 対物レンズ・構成ユニット１は光学軸１３の周りで任意に回転可能となる。 二重対物レンズ・構成ユニット１は、顕微鏡１１の全照明光線の進路の一部を 成す照明光線の進路１５を有する。照明顕微鏡の場合のように、顕微鏡１１の試 料照明光源５３から来る分光器４７用およびミラー４５用の光は、光学軸１３に 沿って孔５を通って対物レンズ系１へと進入する。その際、試料照明光は、ハウ ジングに配置される光転向系の分光器１９の表面１７で横方向に反射し、相次い で転向ミラー２１と２３に当たり、転向ミラー２３で反射した光は、第一対物レ ンズ２５を通って照明光線の進路に出会う。第一対物レンズ２５は、試料照明光 源からスライドガラス２９上に載っている試料の対物点までの光を集束させるの に使用する。 図１から分るように、第一対物レンズ２５の光学軸３１は、顕微鏡１１の鏡筒 の光学軸１３に対して角度ｂ１（図１と請求項６ではβ１となっている）だけ傾 く。 対物点２７を観察するために、二重対物レンズ・構成ユニット１は、ハウジン グ３内に、観察光線の進路３５上に配置して対物点２７から来る光を集束させる 第二対物レンズ３３を有する。第二対物レンズ３３の光出射側には、第二対物レ ンズ３３によって集束された観察光がその先の転向ミラー３９方向に横に反射す る転向ミラー３７を有する。転向ミラー３９で反射された観察光は、分光器１９ を通って進入し、そして光学軸１３に沿ってミラー４５と分光器４７のための孔 ５を通り、ついには（図示されていない）観察系あるいは表示されているセンサ ５１に到達するが、その前に顕微鏡１１の光検知システムのピンホール４９が配 置されている。 第二対物レンズ３３の光学軸４１は、光学軸１３に対して相対的に角度ｂ2（ 図１と請求項７ではβ２となっている）だけ傾いており、それゆえに角度ｂ2は 特に対称角ｂ1と同値となる。 両方の対物レンズ２５と３３の光学軸３１と４１の夾角ａ（特許請求の範囲の 請求項１、４、５ではαとなっている）は、図１の実施例では９０度よりいく分 小さいが、他の実施形態では正確に９０度であってもよい。 照明用対物レンズ２５に対して観察用対物レンズ３３をそのように相対的に配 置することによって、本発明に基づく二重対物レンズ・構成ユニット１の場合、 DE・05 43 26 473 に基づく走査型顕微鏡の場合と同様の極めて高い分解能という 利点が得られ、干渉を利用しない遠視野光学顕微鏡がもちうる最高の分解能での 写像が可能となる。それ以上に従来型の対物レンズによって照明光線と観察光線 の共通の進路を具備する従来型走査型顕微鏡の場合、、対物レンズへのインタフ ェースで、本発明に基づく二重対物レンズ・構成ユニット１を組込むことができ る。 二重対物レンズ・構成ユニット１の照明光線と観察光線の進路は光通過孔５の 範囲で、従って、従来型顕微鏡の構造への接続範囲で、軸１３に沿って走るので 、従来型顕微鏡の構造の照明／観察光線の進路に関して、発明に基づく二重対物 レンズ・構成ユニット１の場合の接続互換性が存する。 両方の対物レンズ２５と３３ならびに光転向系１９、２１、２３、３７、３９ は、共通のハウジング内に収納されるので、従来型走査型顕微鏡の場合、本発明 に基づく二重対物レンズ・構成ユニット１は、基本的に、従来型の個別対物レン ズで取扱うことができる。特に二重対物レンズ・構成ユニット１は取外し可能で あり、顕微鏡の構造１１に取付け可能であるから、別の対物レンズ、例えば、従 来型の個別対物レンズに対して、それが必要ならば、交換できる。 対物レンズ２５と３３は、主として従来型の対物レンズから成る。特に、対物 レンズ２５と３３は、同一構造を具備することができ、同一数値の口径を具備す ることができるので、その数値の口径は極力大きいはずだから、対物レンズ２５ と３３が具備する作動距離は特に大きく、視野は小さいはずである。 図１に基づく実施例の場合、観察光線の進路３５上の光学部品（特に転向ミラ ー３７と３９）はハウジング３に関して所定位置に配置されるので、観察点は固 定され、照明点の挿入の参考基準として役立つことができる。それ故、照明光線 の進路調整には自由度５を必要とするが、例えば、転向ミラー２１と２３によっ てその都度自由度２を、また、対物レンズ２５によって自由度１を自由に使うこ とができる。 図１では、走査型顕微鏡を用いて制御する移動可能な戴物台を４３で示すが、 それによって制御された試料が移動するので、顕微鏡で試料走査が相対的に可能 になる。戴物台４３は主として、走査を制御して並進運動と回転運動を実行でき る。 本発明に基づく二重対物レンズ・構成ユニット１は光線走査式の顕微鏡の場合 にも組込めるが、その場合、商業用顕微鏡１１の走査ユニット（図示されていな い）を照明光線と観察光線の進路を移動させるので、照明点と観察点は制御条件 下で試料に対して相対運動するが、速さという利点を必然的に伴う。作業の種類 で場合によっては試料走査と光線走査を結合することもできる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 試料照明光源からの光を対物点（２７）で集束させるために照明光線の進 路（１５）上に第一対物レンズ（２５）と、対物点（２７）から発せられた光を 集束させるために観察光線の進路（３５）上に第二対物レンズ（３３）を有し、 そのことによって第二対物レンズ（３３）の観察方向が第一対物レンズの照明方 向への角度（α）を決定し、 両方の対物レンズを含む二重対物レンズ・構成ユニット（３，１９，２１，２ ３，２５，３３，３７，３９）が形成されて、両方の対物レンズ（２５，３３） が共用ホルダ（３）に固定され、そのことによって二重対物レンズ・構成ユニッ ト（３，１９，２１，２３，２５，３３，３７，３９）は、試料照明光源の光を 供給するための光通過孔（５）を具備し、 さらに、光転向系（１９，２１，２３，３７，３９）を含むので、第二対物レ ンズから来る観察光が光通過孔（５）を通って走るように照明光線の進路（１５ ）および／または観察光線の進路（３５）が形成されることによって特徴付けら れる 顕微鏡用、特に走査型顕微鏡用の二重対物レンズ系。 ２． 前記共用ホルダが、両方の対物レンズ（２５，３３）と光転向系（１９， ２１，２３，３７，３９）を含み、光通過孔（５）を形成するハウジング孔を含 むハウジング（３）を具備することによって特徴付けられる、請求項１に基づく 二重対物レンズ系。 ３． 前記二重対物レンズ・構成ユニットの照明光線の進路（１５）を顕微鏡（ １１）の照明光線の進路に統合するために、また、二重対物レンズ・構成ユニッ トの観察光線の進路（３５）を顕微鏡（１１）の観察光線の進路に統合するため に、ハウジング（３）が顕微鏡（１１）の対物レンズホルダに、特に対物レンズ ホルダの軸の周りで回転可能なように、固定されることによって特徴付けられる 、請求項２記載の二重対物レンズ系。 ４． 第一対物レンズ（２５）の照明方向と第二対物レンズ（３３）の観察方向 の夾角（α）がほぼ９０度となることえお特徴とする、前記請求項の一に基づく 二重対物レンズ系。 ５． 前記照明方向と観察方向の夾角（α）を任意に変更するために第一対物レ ンズ（２５）および／または第二対物レンズ（３３）が可動状態に保たれている ことを特徴とする、前記請求項の一に基づく二重対物レンズ系。 ６． 前記第一対物レンズ（２５）の光学軸（３１）が、光通過孔の軸（１３） に対して相対的に第一の傾斜角（β１）で傾いて走り、第一対物レンズ（２５） の光入射側で、光通過孔（５）の軸（１３）に沿って進入する試料照明光源の光 が、第一対物レンズ（２５）を通過するために転向する光転向部品（１７，２１ ，２３）、特に転向ミラーが想定されることを特徴とする、前記請求項の一に基 づく二重対物レンズ系。 ７． 前記第二対物レンズ（３３）の光学軸（４１）が、光通過孔の軸（１３） に対して相対的にある傾斜角（β２）で傾いて走り、第二対物レンズ（３３）の 光出射側で、第二対物レンズ（３３）から来る観察光が転向するので、光通過孔 （５）の軸（１３）に沿って二重対物レンズ−構成ユニットを出ることになる光 転向系の光転向部品（３７，３９，１９）、特に転向ミラーが想定されることを 特徴とする、前記請求項の一に基づく二重対物レンズ系。 ８． 前記光転向系が光ファイバを含むことを特徴とする、前記請求項の一に基 づく二重対物レンズ系。 ９． 前記両方の対物レンズ（２５，３３）が、本質的に同数値の口径を具備す ることを特徴とする、前記請求項の一に基づく二重対物レンズ系。 １０． 先行請求項の一に基づく二重対物レンズ系を有する顕微鏡であって、特 に走査型顕微鏡。 １１． それが蛍光顕微鏡であることを特徴とする、請求項１０に基づく顕微鏡 。 １２． それが散乱光および／または反射光の観察のために装備されることこと を特徴とする、請求項１０に基づく顕微鏡。