JPH11511561A - 蛍光光度計 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、部分透過性ミラー（２７）を有し、それを通じて励起光が試料に導かれ、かつそれを経由して試料からの放射光が反射される蛍光光度計に関する。従って、高感度と、さらに容器内の可能な限り均一な測定感度分布が達成される。測定は上または下のどちらからでも実行できる。本発明は特に蛍光光度計が同時に複数の試料を有する場合適用可能である。

Description

【発明の詳細な説明】 蛍光光度計 技術の分野 本発明は、計測器技術に関し、研究室で使用される蛍光光度計に関するが、こ の蛍光光度計は、例えば、臨床科学や食品生産技術での分析評価で使用される。 本発明は、詳細には、同時に複数の試料を有する蛍光光度計への適用に適してい る。 背景 蛍光分析では、短い波長の励起光が試料に導かれ、分析される物質がより長い 波長の光を放射するようにする。放射光の量が測定され、それによって分析され る物質の量が検出される。一般に、蛍光光度計は１つの測定チャネルを有し、分 析は多数のくぼみを有するプレートの上で行われる。この場合プレートは、各く ぼみが順番に測定位置に達するような方法で、測定チャネルに対して移動する。 分析される試料の外側に入射する励起光によって引き起こされる背景蛍光が蛍 光光度計にまつわる１つの問題を構成する。これは不透明な遮蔽物によって低減 できる。しかし、実際にはこの方法で十分な光気密度を得ることは困難である。 容器を通じた蛍光測定は、この場合多量の励起光も容器を通過し、放射光の測 定を複雑にするので特に推奨できるものではない。容器の材料によって発生しう る背景蛍光は別の問題を構成する。現在日常的な分析のために使用されている蛍 光光度計の大部分では、励起光は上から容器に導かれ、放射光も上から収集され る。それにも関わらず、分析によっては、試料を保持する容器の底を通じて測定 を実行することが最良である。 欧州公開公報第１０８５２４号から上からの蛍光測定が知られる。そこでは励 起光は開口によって領域画定され、光の発散ビームがレンズによって収束され、 光の収束ビームはフィルタとミラーを経由してスポットとして試料保持容器に導 かれる。放射光はそれぞれ容器から、別のミラー、フィルタ、収束レンズおよび 境界画定開口を経由して検出器に導かれる。 上記公開公報第６４０８２８号から上からの蛍光測定が知られるが、ここでは 励起光は二色性ミラーを通じて複数の試料に同時に導かれ、試料保持容器からの 放射光は同じミラーを経由してカメラに反射される。 発明の説明 一般的な説明 請求項１に記載の蛍光光度計がここに発明された。本発明の好適実施形態は他 の請求項に示される。 本発明の第１の特性によれば、本蛍光光度計は部分透過性ミラーを有する。こ の場合、励起チャネルの軸と放射チャネルの軸はミラーと試料の間で一致し、試 料保持容器の開口全体の立体角が利用される。従って、容器内の最大限に均一な 測定感度分布とともに、高い感度が達成される。測定は上からも下からも行うこ とができる。 本発明によるシステムを実現するために特に大きなレンズまたはフィルタは必 要とされない。 部分反射性ミラーは二色性誘電性フィルムを有することがある。しかし、この フィルムは一般にきわめて狭い波長の範囲内（例えば、４００〜６００ｎｍ）で のみ動作し、ほとんどすべての蛍光分析で十分ではない。ミラーは、例えば２６ ０〜８００ｎｍの範囲で動作すべきである。光帯域誘電性ミラーは、ガラスの表 面に、部分光透過性の薄いフィルムを蒸着することによって製造できる。しかし 、こうしたフィルムは多くの損失を生じる。好適には、完全に反射性の領域と完 全に透明な領域からなるミラーが使用される。こうしたミラーは、例えば、アル ミニウムを適当なガラスの表面に蒸着することによって容易に製造される。ミラ ーを使用することによってきわめて広い波長範囲が達成され、反射能力または透 明度は波長にあまり依存しない。また、二色性フィルムで発生するような極性は このミラーでは発生しない。さらに、反射性領域の形状が、例えば、反射または 屈折の影響を除去するために、光学上利用される。 ミラーから反射されるかまたはミラーを通過する励起光は、基準光として使用 され、光源の変化による誤差を除去する。励起光フィルタが使用されることがあ るが、その場合好適にはミラーの前の位置に配置される。 本発明の１つの独立した特性によれば、本蛍光光度計は励起チャネルにレンズ 装置を有しており、それによって励起光線の単向性ビームが形成される。本装置 は好適には収束レンズをも有しており、それによって単向性光ビームから励起光 の境界画定スポットが分析される対象の上に形成される。従って、望ましい測定 範囲外で発生する蛍光発光は減少する。 本発明の第２の独立した特性によれば、本蛍光光度計は放射チャネルにレンズ 装置を有し、それによって放射光から光の単向性ビームが形成される。本装置は 好適にはまた、放射光を境界画定領域からのみ放射チャネルに導くための手段を 有する。従って、望ましい測定領域外で発生する放射の検出は減少する。好適に は、本装置はまた放射境界画定手段と励起境界画定手段の両方を有する。この場 合、分析される対象にもっとも近い位置に、両者に共通の部分として機能するレ ンズシステムがある。 光の単向性ビームの波長は、フィルタによって望ましい波長範囲に有効に境界 画定される。これは詳細には干渉フィルタに関する。 本発明の第３の実施形態によれば、本蛍光光度計は、励起光境界画定器と光源 の画像を境界画定器の上に形成するための手段とを含む励起光境界画定装置を有 する。境界画定装置によって、光源の反射・屈折表面によって発生するベールが 除去されるので、励起光は可能な限り正確に望ましい領域にだけ導かれる。レン ズまたはミラー光学が本装置で使用される。境界画定器から光はさらに制御され た方法で試料に導かれる。境界画定器の開口から、好適には望ましい測定領域の 画像が形成されるので、望ましい領域外で発生する蛍光発光は除去される。好適 には、境界画定器は交換可能であり、その場合試料中の望ましい形状と寸法の励 起領域が各所定の時間に得られる。 本発明の第４の独立した特性によれば、本蛍光光度計は放射光領域画定器、開 口中に試料の画定領域の画像を形成するための装置および開口の後の位置にある フィルタを有する。従って、望ましい領域外から達する光の量が減少し、フィル タリングが望ましい方法で容易に配置される。蛍光光度計は、好適には、交換可 能であり、その場合領域画定開口は変化するので、測定光は望ましい種類の領域 から各所定の時間に収集される。好適には、画像形成手段は、試料から放射され た光を収束するためのレンズシステム、光の収束ビームが導かれるミラーおよび 領域画定器開口中にミラーから反射された光の画像を形成するためのもう１つの 収束レンズが含まれる。 本発明の第５の独立した特性によれば、本蛍光光度計は分析される対象までの 距離の変化によって発生する誤差を除去するための手段を有する。本装置は放射 光を平行にするためのレンズシステムと、拡散する光線を光のビームの外に領域 画定する領域画定器とを含む。 本発明の第６の独立した特性によれば、本装置は、その上または下に配置可能 な、光源と検出器の両方を有する光学モジュールを有する。従って、本装置は、 必要に応じて上または下から測定を行うために使用される。しかし、必要な光学 的手段は可動モジュールの一部であり、従って検出器に対して固定して設置され るので、本装置では光を検出器に向けるための光ファイバは必要ない。紫外線領 域で使用可能な光ファイバは特に高価であるため、光ファイバが不要であること は特に有利である。光ファイバはまた背景蛍光発光を発生するが、これも本発明 により回避される。 本発明の第７の独立した特性によれば、光源は交換可能な白熱電球またはファ イバ束ヘッドであり、それによって励起光が外部から励起光学装置に導入される 。 使用される光源は、目的にかなった十分な短波長放射が得られるならば、好適 には、白熱電球である。白熱電球は特殊な装置を必要とせず、さらに、電球全体 の光度を使用することによってその境界画定画像が容易に形成される。 本装置は、好適には、異なった容器に保持された試料をその内部で分析できる 。試料容器は普通複数の容器、例えば、マイクロタイタ（microtiter）プレート の全体を形成する。好適には、本装置は試料用可動測定キャリアを有し、そのキ ャリアによって各試料は順番に測定位置にもたらされる。キャリアの適切な動作 によって、試料は望ましい場合、さらに撹拌されることもある。試料を移動させ ることによっていわゆる走査測定も実行できる。 図面 添付の図面は本発明の説明の一部を構成する。 図１は、本発明による１つの蛍光光度計の側面図を示す。 図２ａは、図１の蛍光光度計の光学装置を示し、図２ｂは、他の光学装置を示 す。 図３は、光学装置中で使用可能な１つのミラーを示す。 図４は、光学装置中で使用可能なもう１つのミラーを示す。 図５は、図１の蛍光光度計の試料プレート移送装置の平面図を示す。 図６は、注入および測定位置にあるプレートを伴う図の蛍光光度計の詳細を示 す。 詳細な説明 図１の蛍光光度計は、とりわけ制御ユニット２と電源および装置外の機能への 接続部を収容する下部ハウジング１を有する。下部ハウジングの頂部には、光気 密性測定ユニット３がある。その後部エッジは下部ハウジングの後部エッジと蝶 番４で取り付けられているので、測定ユニットは蝶番によって上向きに旋回し、 その下の部品への接近が容易である。蝶番付き測定ユニットは、空気ばね５によ って（図１の点線で示される）上部の位置に保持される。下部ハウジングと測定 ユニットの上に着脱可能な上部ハウジング６がある。測定ユニットと上部ハウジ ングの前部壁に光気密性ハッチを備えた開口７があり、その開口を通じて試料が 測定ユニットの内外に移送される。 測定ユニット３は下部デッキ８と上部デッキ９を有する。これらの間の空間を 測定キャリア１０が移送手段１１によって移動させられる。分析される試料を有 するプレート１２が測定キャリアに配置される。測定キャリアは開口７を通じて 取り出される。 測定ユニット３の下部デッキ８には下部測定開口１３があり、上部デッキ９に は上部測定開口１４がある。測定ユニットは光学モジュール１５を有するが、こ れは測定ユニットの上または下のどちらかに配置される。上部デッキはさらに液 体注入ユニット１６と注入開口１７を有し、これを通じて液体がプレート１２の くぼみの中に注入される。 光学モジュール１５の主要な部品は光源ユニット１８、ミラーユニット１９お よび検出器ユニット２０である。光学モジュールは、試料への励起光と試料から の放射光の両方を、上または下から導くために使用される。 光源ユニット１８は白熱電球２１を有する。電球のフィラメントの画像はレン ズシステム２２によってミラーユニット１９の励起領域画定器２３の開口２４に 集光される。有効寿命を延ばすために、電球は測定中にだけ電源が入るようにす ることが好適である。 開口２４から来る励起光はレンズシステム２５を使用して平行にされ、平行に された光はフィルタ２６を通じて部分透過性ミラー２７に導かれる。フィルタに よって励起光の波長は望ましい範囲に領域画定される。 ミラー２７を通過する光は焦点レンズシステム２８を経由して試料に収束され る。従って光のスポット２９が試料の画定空間領域に得られる。 励起光のミラー２７から反射された部分は基準検出器３０に導かれる。それに よって励起光の強度の変化によって測定結果中に発生する誤差が補償される。励 起光の代表的なサンプルがミラーから得られる。光の半分は励起のために使用さ れ、残りの半分は励起の振幅を判定するために利用される。光の単向性ビームは 大きな表面積を有する検出器に送られるか、または収束レンズによってもっと小 さな検出器に送られる。 試料のスポット２９から放射された光は焦点レンズシステム２８を経由してミ ラー２７の下部表面に伝わる。ミラーから反射された部分から、放射領域画定器 ３２の開口３３に、収束レンズシステム３１によってスポットの画像が形成され る。開口から放射光はレンズシステム３４によって平行にされてフィルタ３５に 達し、そこから集光レンズシステム３６を経由して検出器３７に導かれる。フィ ルタによって、望ましい波長範囲が放射光から画定される。ここではフィルタは 干渉フィルタである。検出器は光電子増倍管である。 ミラー２７が励起チャネルと放射チャネルに共通の画像処理レンズシステム２ ８の近くに配置されている時、ミラー中の画像は分析される対象から離れた位置 に形成される。ミラーが焦点距離未満の距離にある時は画像は形成されない。 本装置は複数の異なった励起フィルタ２６と放射フィルタ３５を有する。フィ ルタは円盤に設置されており、望ましいフィルタは円盤を回転することによって 設置される。フィルタの円盤も交換可能である。 励起領域画定器２３は交換可能であるので、望ましい寸法と形状の最適な励起 開口２４が常にモジュールに配置される。従って励起光は有効な効率比で、所定 の時間に分析される試料または、その好適または十分な範囲に正確に焦点を合わ せることができる。領域画定器によって、詳細には隣接する試料の蛍光発光によ って発生する妨害を除去することができる。 領域画定開口２４の形状も実施形態によって変化する。例えば、ある実施形態 では試料の電気泳動によって形成された線の蛍光発光が測定される。この場合に は、適切な線状開口が使用される。 使用者は、必要な場合には、形成される光のスポットの寸法と形状を視覚的に 確認することができる。 放射領域画定器３２も交換可能であるので、検出器に達する光は開口３３によ って領域画定される。光は常に正確に決定された範囲から測定される。これは検 出器に達する背景放射を最小にするために使用されるが、こうした放射は詳細に は隣接するくぼみから来る。開口の形状も分析される試料またはその部分的な範 囲によって変化する。 望ましい場合、測定範囲の寸法と形状を決定するために励起領域画定開口２４ と放射領域画定開口３３の両方を使用することが可能である。妨害の原因となる 隣接する試料はどんな場合でも広い方の領域画定開口の範囲外にあるため、領域 画定器を１つだけ交換すれば十分であることが多い。好適には励起光領域を放射 測定領域より小さくする。 説明された放射光処理光学装置は、分析される対象までの距離の変化によって 発生する誤差を除去するためにも使用される。こうした誤差は例えば、プレート の湾曲、通路の傾きおよび試料の量の変化によって発生する。放射感度は、測定 の立体角を一定にすることによって一定にされる。これはミラー２７の後の位置 に配置された開口領域画定平行光線によって達成される。図示した実施形態では 、レンズの保持器３１が領域画定器として機能する。適切な寸法決定によって、 深度効果がほぼ完全に除去される。 光源ユニット１８も交換可能である。その位置には領域画定開口２４に対して 光ファイバ束が設置できるが、それによって励起光が外部光源から送られる。こ の場合、画像はファイバ束の端部に形成される。この装置は、例えば、特殊な安 全装置を要求するクセノン電球が必要な場合使用される。光を導くために使用さ れるファイバ特有の蛍光発光は、ファイバの後光が励起フィルタ２６を通過する ためここでは問題を発生しない。図２ｂはこうした光学モジュール１５’を示す が、これは独立した光源ユニット１８’を有しており、そこから電球２１’の光 がレンズ２２’とフィルタ束２３’によって導かれる。 有用な部分透過性ミラー２７は、ガラス薄板の上に反射性のスポット（直径は 、例えば、約１mm）を形成することによって製造されるが、こうしたスポットは 光透過性表面の半分を覆う。反射材料は好適には、非常に広い反射波長範囲（約 ２００〜１５００nm）を有するアルミニウムである。ガラス薄板は、好適には、 ガラスの内部反射による散乱光の量を最小にするできるだけ薄いものである。 しかし、好適には適切な形状の反射領域が使用される。図３の部分透過性ミラ ー２７．１の反射領域は、円形の中心３８．１とその周囲の個別の放射状セクタ ３９．１からなり、透過性領域４０．１は対応する車輪形状である。図４による ミラーでは、その部分の代わりに連続反射領域があるが、これは車輪形状の中心 ３８．２およびそれに結合する放射状のセクタ３９．２と、個別の放射状セクタ ４０．２によって形成される透過性領域とからなる。中心領域は光学装置の内部 反射を最小にする。放射状反射領域のエッジのため、光の屈折が半径に対して直 角の接線の方向に発生する。 １つの実施形態によれば、ミラー２７．１または２７．２は、その４５°射影 が円である楕円である。 図５による移送手段１１では、キャリア１０が縦のスライドバー４１に沿って スライドするように設置され、そのスライドバーが横のスライドバー４２に沿っ てスライドするように設置される。スライドバーは電動機とベルト４３および４ ４を使用することによって動かせるので、キャリアは測定ユニット内または前部 壁の開口の外の望ましい位置にもたらされる。 キャリア１０は矩形で、後部壁４５と側壁４６を有している。側壁の下部には 中央に開いた空間が残るような支え４７がある。支えの端部には内向きの突起が ある。突起はその前縁に着脱可能な垂直ピン４８を有する。キャリア１０は、く ぼみの底部が開口の範囲にあるように、分析用プレートが支え４７の上に乗るよ う配置できる寸法である。使用されるプレートが開口より小さい場合、適切なア ダプタトレーが支えの上に乗るよう配置される。 キャリア１０の１つの側面エッジはプレート保持器４９を有する。これは鈍角 Ｖの基本的形状を有し、その頂点がキャリアの垂直ピン５０に蝶番式に取り付け られるレバーである。それにばね５１が結合され、その一端はキャリアの枠に接 し、もう一端は保持器に接するので、保持器の外側の枝をキャリアの中央の方向 に（図５では時計回り方向に）回転させようとする。保持器の外側の枝の端部に はキャリアの方向を向いた突起５２がある。保持器は、開放された状態にある時 、キャリア内のプレートを後部壁と、保持器の反対にある側壁に押しつける。従 ってプレートは常にキャリア内で角に接する同じ位置に自動的に配置される。キ ャリアが測定装置から取り出される時、保持器の内側の枝は移送装置のストップ 壁５３に衝突するので、ストップ壁は保持器が開くようにする。従って、プレー トはキャリアに配置されるか、またはそれから取り外される。ピン４８を取り外 すと、プレートはやはり水平な通路に沿ってキャリアに移送できる。 キャリア１０の後部エッジは４つの異なった蛍光基準面５４を有し、それによ って必要な場合検出器の感度が検査できる。 図６はキャリア１０内のプレート１２への液体の注入を示す。注入開口１７か ら、内側の斜面に２つの注入ヘッド５６および５７が入る。第１のヘッドは液体 を測定位置のくぼみに注入するために使用され、第２のヘッドは液体を測定位置 に隣接する、詳細には次に測定位置に達するくぼみに注入するために使用される 。さらに、開口は好適には第３の注入ヘッドを有し、測定位置の横に隣接するく ぼみ（図６では測定されるくぼみの後方）に液体を注入するために使用される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．試料の光学的特性を測定するための蛍光光度計であって、励起光を光源か ら前記試料に導くための手段と、放射光を前記試料から検出器に導くための手段 と、部分透過性ミラー（２７；２７．１；２７．２）とを有するものにおいて、 前記励起光が前記ミラーを通じて前記試料に導かれ、前記放射光が前記試 料から前記ミラーを経由して反射によって導かれるかまたは前記励起光が前記試 料に前記ミラーを経由して反射によって導かれ、前記放射光が前記試料から前記 ミラーを通じて導かれ、前記ミラー（２７；２７．１；２７．２）が励起光また は放射光を透過する複数の領域かまたは放射光または励起光を透過しない複数の 領域を有することを、特徴とする蛍光光度計。 ２．請求項１に記載の蛍光光度計において、前記励起光が前記試料に部分透過 性ミラー（２７；２７．１；２７．２）を通じて導かれる蛍光光度計。 ３．請求項１または請求項２に記載の蛍光光度計において、前記部分透過性ミ ラー（２７；２７．１；２７．２）の前記透過性領域が実質上完全に光を透過す る蛍光光度計。 ４．請求項１〜請求項３の何れか一つに記載の蛍光光度計において、前記部分 透過性ミラー（２７；２７．１；２７．２）の非透過性領域が実質上完全に光を 透過しない蛍光光度計。 ５．請求項１〜請求項４の何れか一つに記載の蛍光光度計において、前記ミラ ーの前記反射性領域（３８．１，３９．１；３８．２，３９．２）が反射または 屈折の影響を除去するような形状である蛍光光度計。 ６．請求項１〜請求項５の何れか一つに記載の蛍光光度計において、前記試料 が底部と側面の壁および開いた口を有する容器内にある蛍光光度計。 ７．請求項１〜請求項６の何れか一つに記載の蛍光光度計において、前記試料 までの距離の変化によって前記放射光中に発生する誤差を除去するための手段（ ２８、３１）を有する蛍光光度計。 ８．請求項１〜請求項７の何れか一つに記載の蛍光光度計において、前記励起 光を平行にするための手段（２５）または前記放射光を平行にするための手段（ ３４）を有する蛍光光度計。 ９．請求項１〜請求項８の何れか一つに記載の蛍光光度計において、励起光の ための交換可能な領域画定器（２３；２３’）または前記放射光のための交換可 能な領域画定器（３３）を有する蛍光光度計。 １０．請求項１〜請求項９の何れか一つに記載の蛍光光度計において、前記領域 画定器（２３；２３’）において前記励起光の画像を形成するための手段（２２ ；２２’）を有する蛍光光度計。 １１．請求項１〜請求項１０の何れか一つに記載の蛍光光度計において、前記放 射光を領域画定するための手段（３３）と前記放射光をフィルタリングするため の手段（３５）とを有する蛍光光度計。 １２．請求項１〜請求項１１の何れか一つに記載の蛍光光度計において、前記試 料が配置される測定キャリア（１０）と、光学モジュール（１５）とを有し、前 記光学モジュールが検出器と前記試料から前記検出器に放射される光を導くため 光学手段とを有し、光が前記試料の上から前記検出器に導かれるか、または光が 前記試料の下から前記検出器に導かれるように配置される蛍光光度計。 １３．請求項１〜請求項１２の何れか一つに記載の蛍光光度計において、交換可 能な光源（２１）を有する蛍光光度計。