JPH11507920A - 修飾アビジンおよびストレプトアビジン分子ならびにこれらの使用 - Google Patents
修飾アビジンおよびストレプトアビジン分子ならびにこれらの使用Info
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Abstract
(57)【要約】
ビオチン結合部位の必須のチロシン残基は、そのpKaが、対応する非修飾アビジン型分子中の非修飾チロシン残基のpKaに比較して低下しているように修飾される、ビオチン結合性修飾アビジン型分子が提供される。このアビジン型分子は、(i)未変性の卵白アビジン;(ii)組換えアビジン;(iii)脱グリコシル化型のアビジン;(iv)細菌性ストレプトアビジン;(v)組換えストレプトアビジン;(vi)端を切り取ったストレプトアビジン;および(vii)必須のチロシン残基以外の部位で修飾された(i)〜(vi)の誘導体、を含有する。修飾は、ニトロ、ハロゲン、アゾおよびアミノのような基により、チロシン残基のヒドロキシル基の1つまたはそれ以上のオルト位で置換することにより行われる。修飾アビジン型分子は、アビジン−ビオチン技術のすべての応用分野で使用することができる。
Description
【発明の詳細な説明】
修飾アビジンおよびストレプトアビジン分子ならびにこれらの使用発明の分野と背景
本発明は、ビオチンの結合に決定的に重要であることが知られている結合部位
のチロシン残基において修飾されるアビジン型の分子に関する。修飾アビジンは
、まだ特定の条件下でビオチンまたはビオチン化リガンドに結合することができ
るが、これらの条件を変更(例えば、高いpHまたはビオチンとの競合)すると
、結合ビオチン残基またはビオチン化リガンドが分離される。従って本発明は、
アビジン−ビオチン技術で使用される可逆型のアビジンを提供し、こうして種々
の応用目的のアビジン分子の大きな欠点(すなわち、アビジン−ビオチン複合体
を破壊するのに必要とされる極端な変性条件)の1つを「修正」することができ
る。アビジン−ビオチン複合体を解離させるのに通常必要な極端な条件は、ビオ
チン化成分の生物活性を不可逆的に不活性化し、従って以後の使用には不適当な
ものにしてしまう。
アビジン(卵白由来)およびストレプトアビジン(ストレプトミセス・アビジ
ニイ(Streptomyces avidinii)由来)は、約10-15Mの同様の解離定数でビオチ
ンに結合する2つの関連するタンパク質である(グリーン(Green),1975)
。ビオチンへの結合以外に、これらの物理特性の多くは非常によく似ている。例
えばいずれも、4つの非共有結合した同一のサブユニットからなり、各サブユニ
ットは1つのビオチン結合部位を有する。またサブユニットのMr値はよく似て
いる。さらに2つのタンパク質の配列中のいくつかの短い区間(特にほぼ同じ位
置に存在する2つのTrp−Lys区間)が保存されている(アルガラナ(Arga
rana)ら,1986)。我々はすでに(ギトリン(Gitlin)ら,1987,19
88a)、いくつかのリジンおよびトリプトファン残基が、両方のタンパク質の
ビオチンの結合に関与していることを証明している(ギトリン(Gitlin)ら,1
988b)。さらに最近、アビジンとストレプトアビジンの両方が同じ3次元折
り畳み構造を示し、結合部位残基のほとんどは同一または同様であることが証
明された(ウェーバー(Wever)ら,1989)。両方のタンパク質とビオチン分
子の間で形成される結合部位の構造と結合は、たしかに非常によく似ている。
これらの類似性にもかかわらず、2つのタンパク質の間にはいくつかの差異が
存在する。アビジンは、2つのメチオニン残基を含有するジスルフィド結合で橋
渡しされた糖タンパク質であり、一方ストレプトアビジンはグリコシル化されて
おらず、イオウ含有アミノ酸側鎖が欠如している。もう1つの大きな差は、チロ
シンの含量である。アビジンはチロシン残基を1つだけ(Tyr−33)含有し
、一方ストレプトアビジンは、22、43、54、60、83および96位に6
つのチロシン残基を有する。興味深いことにアビジンの単一のチロシン残基は、
ストレプトアビジンのチロシン残基の1つ(Thr−Gly−Thr−Tyr区
間中のTyr−43)の配列と同一の配列を含有する領域中に位置する。このチ
ロシン残基は、ビオチン結合部位中に主要な位置を占め、チロシンの水酸基を化
学的に修飾すると、アビジン分子が不可逆的に不活性化される(ギトリン(Gitl
in)ら,1990)。
各アビジンモノマーは、1分子のビオチンに結合する。この結合のユニークな
特徴はもちろん、アビジン−ビオチン複合体の形成の強度と特異性である。得ら
れる親和性定数(アビジンについては1.6×1015M-1そしてストレプトアビ
ジンについては2.5×1013M-1と推定されている(グリーン(Green)ら,1
990))は、タンパク質と有機リガンドについて知られているもののうち最も
高いものである。これは非常に強く、室温での高濃度の変性剤(例えば、6M塩
酸グアニジン、3Mチオシアン酸グアニジン、8M尿素、10%β−メルカプト
エタノール、または10%ドデシル硫酸ナトリウム)のような非常に極端な条件
下に暴露しても、ビオチンを結合部位から分離することはできない。変性剤また
は界面活性剤の存在下で低pH(1.5)または高温(>70℃)での塩酸グア
ニジンによる処理を組合せると、タンパク質は変性され、そしてビオチンは、破
壊された結合部位から分離される。
アビジンは、ビオチンを分子のウレイド(尿素様)環で主に認識する。アビジ
ンの結合部位とこのビタミンのバレリン酸側鎖のイオウ含有環との間の相互作用
は、強度がはるかに小さい。ビオチンのカルボキシ含有側鎖とアビジンの間のこ
の比較的弱い相互作用は、ビオチンが化学的に修飾され、広範囲の生物活性のあ
る物質に結合可能であることを意味し、得られる誘導体または結合体のビオチン
残基は、まだアビジンとの相互作用のために利用可能である。これに対してアビ
ジンは、多くの他の分子(顕著には、異なる型の「プローブ」またはレポーター
基)で誘導体化され得る。
これは、アビジン−ビオチン技術の核心である(ウィルチェックとベイヤー(W
ilchek and Bayer),1990)。すなわち、ある実験系の生物活性のある標的分子は
、そのビオチン化された対応物質(結合物質)で「標識」でき、次に生成物は、
適当なプローブと誘導体化または結合体化して、アビジンと相互作用させること
ができる。
非特異的反応または好ましくない反応を引き起こすことがある高い塩基性(p
I〜10.5)とアビジン分子上の糖残基の存在のために、アビジン−ビオチン
技術における卵白アビジンの使用は時に限定される。最近、細菌のタンパク質で
あるストレプトアビジンは、アビジン−ビオチン技術の多くの分野で卵白アビジ
ンに取って代わりつつある。しかし、ストレプトアビジンの問題(コストが高い
こととビオチンに依存しない細胞結合性)のために、アビジン−ビオチン技術の
標準物質として、卵白アビジンに関心が戻ってきている。この目的のために、未
変性のアビジン(およびその従来の誘導体)やストレプトアビジンに対して改良
された分子特性を示す修飾アビジンが調製されている(例えば、N−ホルミル、
N−アセチルおよびN−スクシニルアビジンのようなN−アシルアビジン)。ア
ビジンのこれらの誘導体は、このタンパク質の電荷を低下させるが、これらはす
べてアビジンの利用可能なリジンへの共有結合を介して調製され、その結果遊離
のアミノ基が妨害されて他のタイプの結合体(顕著なものは、アビジン標識酵素
のようなタンパク質−タンパク質結合体)が生成される(これらはしばしば、グ
ルタルアルデヒドのような2官能性試薬を使用してリジン残基を介して架橋する
ことにより調製される)。
リジン修飾のより有用で有効な代替法は、アルギニンを介する修飾である。こ
の場合、このタンパク質のpIは効率的に低下し、リジンはまだ以後の反応に利
用できる。こうして修飾されるアビジンの2つの異なる誘導体が市販されている
。
その1つのエクストラビジン(ExtrAvidin)(登録商標)は、種々の官能基が誘
導体化されたかまたは結合した型でシグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)(
セントルイス、ミズーリ州)から入手できる。2番目のニュートラライトアビジ
ン(NeutraLite Avidin)(登録商標)(ベロヴォケミカルズ(Belovo Chemicals)
の製品、バストン(Bastogne)、ベルギー)は、さらに修飾されており、大量に
購入できる。
卵白アビジンのpIの低下は、問題の1つを解決するが、オリゴ糖残基の存在
は、まだその応用を制限する非特異(ビオチン非依存性)反応の重要な原因であ
る。アビジン−ビオチン技術の標準物質としての卵白アビジンの復活は、その糖
の除去に依存している。
糖タンパク質から糖を除去する確率は非常に限定されている。これは化学的ま
たは酵素的に行われる。HFまたは過ヨウ素酸酸化を使用するような現在利用で
きる化学的方法は、破壊的であるかまたは非効率的である。N−グリカナーゼ(
タレンチオノ(Tarentino)ら,1984)を用いるよく知られている酵素的方法
は、非常に高価であり、従来法を用いる場合はアビジンにとってあまり有効では
ない。結局、実施可能な脱グリコシル化法が確立され、次に得られた生成物はア
ルギニンを介して化学的に修飾され、登録商標ニュートラライトアビジン(Neutr
aLite Avidin)(ベロヴォケミカルズ(Belovo Chemicals))として知られてい
る。
これらの改良にもかかわらず、アビジン−ビオチン技術の応用における大きな
問題の1つは、結合に可逆性がないことであり、操作の最後に、ビオチンブリッ
ジにより結合している生物学的物質を変性または不活性化せずにアビジンとビオ
チン残基を分離することが困難なことである。あるいは、障害または不活性化さ
れた物質をアビジンカラムから除去し、こうしてビオチン化成分の新しい試料の
結合のためにカラムを復元することが有利であろう(特に工業的使用において)
。
本発明の目的は、ビオチン結合性を保持し、方法の可逆性が所望または有利な
アビジン−ビオチン技術を用いる方法で有利に使用される、修飾アビジンを提供
することである。
テトラニトロメタンを使用するモデルペプチドおよびタンパク質のチロシン残
基のニトロ化が記載されている(リオルダン(Riordan)ら,1966;ソコロフ
スキー(Sokolovsky)ら,1967)。本発明者の以前の研究(ギトリン(Gitl
in)ら,1989)において、9M尿素に溶解した卵白アビジンのテトラニトロ
メタン(TNM)によるニトロ化により、アビジンのニトロチロシン誘導体が調
製された。ニトロ化はアビジンの変性型(尿素の存在下)で行われたため、得ら
れるニトロ−アビジン調製物は不活性であり、すなわちビオチンに結合しなかっ
た。こうして調製されるアビジンは、アビジン−ビオチン技術での使用には全く
適さない。
分析目的に125I−標識アビジンおよびストレプトアビジンが調製されている
。各アビジンサブユニットの単一のチロシン残基は、ヨード化にはすぐ利用でき
ない。3−(p−ヒドロキシフェニル)プオピオニル基の導入により、アビジン
をヨード化(クロラミンT法)し易くして、この基を含有する 125I−標識アビ
ジンが調製された。アビジンを標識するのに、 125I−標識ボルトン−ハンター
(Bolton-Hunter)試薬を用いることもできる(フィンとホフマン(Finn and Hofma
nn),1985)。125I−アビジンは、ヨードゲン法(スター(Suter)ら,19
88)を使用して、Na125Iによりストレプトアビジンをヨード化して製造さ
れた。非標識ヨード化アビジンおよびストレプトアビジンは、これまで報告され
ていない。
モデルペプチドおよびタンパク質(例えば、リボヌクレアーゼA)のチロシン
残基のアゾ化およびアミド化は、既に報告されている(ゴレッキ(Gorecki)ら,
1971;ソコロフスキー(Sokolovsky)ら,1967)。発明の要約
本発明は、(i)未変性の卵白アビジン;(ii)組換えアビジン;(iii)脱グリ
コシル化型のアビジン;(iv)細菌性ストレプトアビジン;(v)組換えストレ
プトアビジン;(vi)端を切り取ったストレプトアビジン;および(vii)必須の
チロシン残基以外の部位で修飾された(i)〜(vi)の誘導体、よりなる群から
選択されるビオチン結合性修飾アビジン型分子に関し、ビオチン結合性修飾アビ
ジン型分子においてビオチン結合部位の必須のチロシン残基は、そのpKaが、
対応する非修飾アビジン型分子中の非修飾チロシン残基のpKaに比較して低下
しているように修飾されることを特徴とする。
本発明の修飾アビジン型分子は、アビジン型分子の必須チロシン残基上に1つ
またはそれ以上の求電子基および/または求核基を有し、修飾されたチロシンは
式:
[式中、X1 とX2 は、それぞれニトロ、ハロゲン、NR1R2および--N=NR3
(ここで、R1とR2は、それぞれ水素、C1〜C8アルキルおよびC1〜C6カル
ボキシルアシルから選択され、R3は、酸性の基により置換されたアリールであ
る)から選択される基である]である化合物により例示される。
本発明の好適な実施態様において、アビジン型分子は、チロシン残基へ1つま
たはそれ以上の求電子基を付加することにより修飾される。例えばアビジンまた
はストレプトアビジンは、図1(X1またはX2はNO2またはハロゲン、好まし
くはIである)に示すように、チロシン残基のニトロ化またはハロゲン化(好ま
しくはヨード化)により修飾され、こうしてビオチン結合部位中のチロシン残基
のpKaを10.5〜12.5から6.5〜8.5(好ましくは約7.0)に低
下させる。
アビジン型分子のチロシン残基のこのような修飾は、チロシン環のオルト位(
ヒドロキシル基の隣)に1つまたはそれ以上の求電子基を付加する。このタイプ
の修飾アビジンの例としては、テトラニトロメタン(TNM)を使用するチロシ
ン残基のニトロ化が用いられた。得られるニトロチロシン含有アビジンおよびス
トレプトアビジン(本明細書において、以後それぞれ「ニトロ−アビジン」およ
び「ニトロ−ストレプトアビジン」と呼ぶ)は、ビオチン残基またはビオチン化
リガンド(例えば、ビオチン化抗体、酵素、核酸または細胞)を分離するための
比較的穏和な条件を規定するために、広く研究されている。
本発明においてアビジンのニトロ化は、非変性条件下で行われ、得られるニト
ロ−アビジンおよびニトロ−ストレプトアビジンは、pH4で効率的かつ強固に
ビオチン化リガンドに結合することが証明された。pHを8に上げても、ビオチ
ン化リガンドはまだカラム上に保持された。しかしpHを10まで上げると、ビ
オチン化リガンドは分離した。あるいは低pH(例えば、pH4〜8の範囲)で
は、ビオチン化リガンドは遊離ビオチンを使用する交換により分離された。ニト
ロ−アビジンとニトロ−ストレプトアビジンのこれらの特性は、種々の応用に適
したアビジンおよびストレプトアビジンの型を提供する。これら物質は、セファ
ロース樹脂に固定化されたニトロ−アビジンおよびニトロ−ストレプトアビジン
へのビオチン化リガンドのいくつかの例の結合および以後の分離、ならびにマイ
クロタイタープレートに吸着されたニトロ−アビジンおよびニトロ−ストレプト
アビジンへのビオチン化リガンドの結合と分離のために、本発明において使用さ
れる。
別の実施態様において本発明は、ハロゲン化、より好ましくは非標識ヨード化
アビジンまたはストレプトアビジンに関する。クロラミンT法を使用してKIに
よりアビジンまたはストレプトアビジンのチロシン残基をヨード化すると、アビ
ジンの有効な可逆性型であることが知られているモノ−および/またはジイソチ
ロシン−アビジンまたは−ストレプトアビジンが得られた。
本発明のさらなる実施態様は、NR1 R2 および--N=NR3 から選択される
1つまたはそれ以上の求核基により、必須チロシン残基で修飾されるアビジン型
分子に関する。
本発明のアゾ誘導体では、すなわち、X1および/またはX2が--N=NR3で
あり、R3 が、カルボキシル、およびリン酸、アルソン酸またはスルホン酸のよ
うな無機酸の残基から選択される酸性の基により置換されたアリール、好ましく
は炭素環式アリール、最も好ましくはフェニルである化合物。
本発明のアゾ誘導体は、対応するp−アミノ誘導体(例えば、p−アルサニル
酸、アントラニル酸、スルファニル酸およびp−アミノリン酸)から、NaNO2
でジアゾ化し、得られるジアゾニウム塩を選択されたアビジン型分子と反応さ
せて、調製される。
本発明のアミノ誘導体では、すなわちX1および/またはX2がNR1R2
(ここでR1とR2は、それぞれ水素、アルキルおよびアシルから選択される)で
ある化合物。アルキル基は、好ましくはC1〜C8直鎖又は分岐鎖アルキルであり
、例としてはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ヘキシル、オ
クチルがある。アシル基は、好ましくはC1〜C6カルボキシアシル(例えば、ア
セチル、プロピオニル、ブチリル、スクシニル、またはベンジルオキシカルボニ
ル)である。
本発明のアミノ誘導体は、対応するアゾ誘導体を亜硝酸ナトリウムNa2S5O4
で誘導体化、または対応するニトロ誘導体をNa2S5O4で還元、そして必要で
あれば、アミノ基を標準的方法でさらにアルキル化またはアシル化することによ
り調製される。
本発明の修飾アビジン型分子は、アビジン−ビオチン技術の非常に多くの応用
分野で使用される。図面の簡単な説明
図1は、本発明のチロシン−修飾アビジン型分子の調製のための反応工程図、
およびアビジン−ビオチン技術を用いる可逆的方法におけるその使用を示す。
図2は、例1(i)に記載するように、テトラニトロメタン(TNM)濃度(
mM)の関数としてのアビジンのニトロ化のレベル(%)を示す。
図3は、例2(i)に記載するように、セファロース−ニトロ−アビジン樹脂
へのビオチン化ウシ血清アルブミン(BSA)の結合に及ぼすpHの影響を示す
。
図4は、例2(ii)に記載するように、吸着ニトロ−アビジンを含有するマイ
クロタイタープレートへのビオチン化アルカリ性ホスファターゼの結合に及ぼす
pHの影響を示す。
図5は、例2(iii)に記載するように、アビジン(黒丸)とニトロ−アビジン
(白丸)のビオチン結合活性の間の比較を示す。
図6は、例3(i)に記載するように、セファロース−ニトロ−アビジン樹脂
からのビオチン化BSAのpH誘導性の分離を示す。
図7は、例3(ii)に記載するように、セファロース−ニトロ−ストレプトア
ビジン樹脂からのビオチン化BSAのpH誘導性の分離を示す。
図8は、例3(iii)に記載するように、遊離ビオチンとの競合によるセファロ
ース−ニトロ−アビジン樹脂からのビオチン化BSAの分離を示す。
図9は、例3(iv)に記載するように、pHの関数としてのビオチン化BSA
のビオチン誘導性の分離を示す。遊離ビオチンは、異なるpH(4〜10の範囲
)の緩衝液に溶解した。比較のために、ビオチンの非存在下のpH10での溶出
を示す。
図10は、例4に記載するように、ニトロ−アビジンのビオチンで阻止した部
位からのビオチンの分離を示す。
図11A〜Bは、例5に記載するように、ニトロ−アビジン−セファロースカ
ラムからのビオチン化BSAの繰り返し適用と溶出の結果を示す。図11Aにお
いて、ビオチン化BSAの同一試料を、セファロース−ニトロ−アビジン樹脂を
含有するカラムに連続的に適用(緩衝液Aを用いてpH4で)し、溶出(緩衝液
Cを用いてpH10で)した。
図11Bは、溶出した画分の蓄積は、サイクル毎に基本的に同じレベルの結合
し溶出したタンパク質を与えることを示す。
図12は、例6に記載するように、ウサギの全血清からの免疫グロブリンの精
製後の、セファロース−ニトロ−アビジン樹脂を含有するカラムからのビオチン
化プロテインAの分離を示す。
図13は、図12のカラムからの試料のSDS−PAGEプロフィールを示す
:レーンA、ウサギ全血清(適用した画分);レーンB、カラム溶出物;レーン
C,緩衝液A(pH4)により溶出したピーク;レーンD、緩衝液C(pH10
)により溶出したピーク;レーンE、ウサギ免疫グロブリンの市販調製物;レー
ンF、ビオチン化プロテインA標準物質。
図14は、例7に記載するように、吸着したヨード化アビジンを含有するマイ
クロタイタープレートからのビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼの分離に及
ぼすpHの影響を示す。発明の詳細な説明
本明細書において「アビジン型分子」という用語は、未変性の卵白糖タンパク
質アビジン、脱グリコシル化型のアビジン、ストレプトミセス(Streptomyces)
の選択された株(例えば、ストレプトミセス・アビジニイ(Streptomyces
avidinii))により産生される細菌性ストレプトアビジン、端を切り取ったスト
レブトアビジン、および組換えアビジンとストレプトアビジン、ならびに、未変
性、脱グリコシル化および組換えアビジンの誘導体、未変性の、組換えおよび端
を切り取ったストレプトアビジンの誘導体[これらは、必須チロシン以外の部位
で修飾されており、例えばN−アシルアビジン(例えば、N−アセチル、N−フ
タリルおよびN−スクシニルアビジン)であり、市販品エクストラビジン(Extr
Avidin)(登録商標)およびニュートラライトアビジン(NeutraLiteAvidin)(
登録商標)がある]を意味する。
すべての型のアビジン型分子は、本発明により包含され、未変性のおよび組換
えアビジンおよびストレプトアビジン、ならびに誘導体化分子(例えば、非グリ
コシル化アビジン、N−アシルアビジンおよび端を切り取ったストレプトアビジ
ン)がある。これらの物質のいくつかは、市販されている(例えば、未変性のア
ビジンおよびストレプトアビジン、非グリコシル化アビジン、N−アシルアビジ
ンおよび端を切り取ったストレプトアビジン)か、または公知の方法[アビジン
とストレプトアビジンの調製についてはグリーン(Green)、1990:非グリコ
シル化アビジンの調製についてはヒラー(Hiller)ら,1990:ストレプトア
ビジンおよび端を切り取ったストレプトアビジンの調製についてはベイアー(Bay
er)ら,1990を参照]により調製される。組換えアビジンとストレプトアビ
ジンは、標準的組換えDNA技術[例えば、組換えアビジンについてはチャンド
ラとグレイ(Chandra and Gray)、1990、そして組換えストレプトアビジン
についてはアルガラナ(Argarana)ら,1986に記載されている]により調製
される。
アビジン−ビオチン技術の応用法において、本発明の修飾アビジンとともに使
用できる「ビオチン化リガンド」は、ビオチン化型の所望のリガンド(例えば、
抗体、酵素、レクチンのようなタンパク質、または糖タンパク質、ガングリオシ
ド、ヘパリン、多糖のような炭水化物および糖結合体、DNAおよびRNAのよ
うな核酸、ファージ、ウイルス、細菌および他の細胞)であり、ここでリガンド
は、ビオチンまたはその同族体、類似体または誘導体に共有結合している。多く
のビオチン化リガンドは市販されているか、または標準的方法により調製される
(例えば、ベイヤーとウィルチェック(Bayer and Wilchek),1992aを参照
)。
本発明の修飾アビジン型分子[主に、結合部位チロシン残基(図1を参照)の
1つまたは両方のオルト位で修飾されているアビジンおよびストレプトアビジン
]は、ビオチン残基との可逆性反応に適しており、従ってアビジン−ビオチン技
術の重要な新しい手段である。
これらの修飾アビジン型分子は、固定化したオルト−フェノール−修飾アビジ
ン型分子から、または溶液中のビオチン化リガンドとともに修飾アビジンを含む
可溶性複合体から、穏和な条件下で、遊離ビオチンおよび/またはビオチン化リ
ガンド(例えば、ビオチン化酵素および他のビオチン化した生物活性物質)を除
去することを可能にする。このような穏和な条件は、過剰濃度のビオチン、高p
H(例えば、pH10)、比較的低い非変性濃度の尿素、グアニジンまたはチオ
サン酸塩、加熱および/またはこれらの組合せからなる。好適な実施態様におい
て、固定化修飾アビジンからのビオチンまたはビオチン化残基の除去は、pHを
変化(例えばpH10まで上げる)させて行われる。別の好適な実施態様におい
て、除去は、過剰のビオチン(例えば、0.6mMのビオチン溶液)を修飾アビジ
ンカラムに通して、ビオチン化成分を置換させることにより行われる。
本発明の修飾アビジン型分子は、アビジン−ビオチン技術を用いる任意の方法
、特にアビジン−ビオチン結合の可逆性が有利である方法、例えば親和性リガン
ドの除去のための親和性クロマトグラフィーに使用する可逆性固定化カラムとし
て;固定化酵素を除去して可逆性酵素反応槽を作成するために;アビジンブリッ
ジを介して架橋したビオチン化物質からなる溶液中の可溶性生物学的物質を破壊
するために;高親和性ファージライブラリーを産生するために;および、細胞分
離に使用して、こうして認識成分またはリガンド(例えば、抗体)とともに生存
または完全な細胞の樹脂からの分離を促進するか、またはアビジンブリッジを解
離させてそのような細胞の凝集に対抗するための、使用に適している。
本発明はまた、固体支持体またはマトリックスに結合した本発明の修飾アビジ
ン型分子に関する。当該分野で使用される任意の固体支持体、例えば樹脂、マイ
クロタイタープレート、ガラスビーズ、磁性ビーズなど(但し、これらに限定さ
れない)が適している。固体支持体へのアビジンの結合は、共有結合または非共
有結合でもよく、標準的方法により行われる。1つの好適な実施態様において、
修飾アビジン型分子は、樹脂(好ましくはセファロース)に固定化され、こうし
て得られたセファロース−ニトロ−アビジン樹脂は、単離操作のためのカラムに
注がれる(ベイヤーとウィルチェック(Bayer and Wilchek),1992b)。本
明細書の説明において「アビジン−セファロースカラム」という用語は、セファ
ロース樹脂に固定化された本発明の修飾アビジン型分子を含有するカラムに使用
されるであろう。これらのカラムは、特に分離操作に適している。
本発明の別の実施態様において、修飾アビジン型分子はマイクロタイタープレ
ートのウェルに結合される。
公知の親和性クロマトグラフィー法(これは、すべての親和性方法の原型であ
る)では、結合リガンド(例えば、抗体または受容体)は固体支持体(例えばセ
ファロース)に結合される。これは、リガンドをビオチン化し、次にアビジンま
たはストレプトアビジンブリッジを介してセファロースに固定化することにより
行われる。得られるアビジン−セファロースカラムは、次にビオチン化リガンド
と反応する物質を単離および精製するためのハンドルとして使用される。多くの
場合、リガンド自身(これは、本質的に貴重であるかまたはこわれやすい)を回
収するためにまたは別の用途のためにカラムを復元するために、アビジン−セフ
ァロースカラムからビオチン化リガンドを分離することが好ましい。これは、本
発明の修飾アビジン型分子を含有するカラムを使用して、ビオチン化リガンドを
固定化し、これを、アルカリ性溶液(例えば、緩衝液C、pH10)を添加する
か、または過剰のビオチン(例えば、任意のpHで0.6mM)を添加してカラム
から分離することにより行われる。次に、復元したアビジンカラムに、新しいタ
イプのビオチン化リガンドまたは新鮮なバッチの同じビオチン化リガンドを添加
することができる。
アビジン−ビオチン系は、種々の方法により細胞を分離するのに使用されてい
る。1つのアプローチは、細胞表面分子(例えば、表面抗原)を認識するビオチ
ン化リガンド(例えば、抗体)を使用する。ビオチン化リガンドは、カラムまた
は他のタイプのマトリックス(例えば、磁性ビーズ)に、アビジンまたはストレ
プトアビジンブリッジを介して結合させることができる。あるいは混合した細胞
集団の懸濁物を、ビオチン化リガンドで処理し、反応性表面分子を有する細胞を
、アビジン溶液を使用して凝集させることができる。通常このアプローチは、混
合集団から特定の集団の細胞を選択的に「除去」するためにのみ使用されている
。アビジンによりマトリックスに結合または凝集されると、細胞の完全性または
生存活性を保持する方法では、関与する親和性反応(すなわち、ビオチン化リガ
ンドと表面分子の間、およびアビジンとビオチンの間)は容易に破壊されない。
例えば、抗体と抗原の間の反応の破壊には通常、多くの細胞に対して障害性の条
件(例えば、低いpH)を必要とする。しかし非反応性の細胞は、回収すること
ができる。結合した細胞集団を回収するために、本発明の修飾アビジン型分子を
含有するカラムを使用することができ、ビオチン含有溶液[例えば、等張条件(
例えば、pH7の0.15MのNaCl)下の0.6mMのビオチン、または適切
な組織培養培地中の過剰濃度のビオチン]を使用して、カラムから細胞(ビオチ
ン化リガンドとともに)を分離するか、または凝集した細胞は同じビオチン含有
溶液を使用して分散させることができる。
固定化酵素は、主に食品、薬品および化学工業の分野で使用される(カチャル
スキー−カツジール(Katchalsky-Katzir),1993)。酵素反応槽系で使用す
る場合の固定化酵素の1つの問題は、酵素またはそのマトリックスは一種のエー
ジング反応を受けることである。例えば、酵素は有名な高感受性タンパク質であ
り、一定の半減期を有し、使用または保存により時間とともに不活性化されてい
く。従って工業的使用には、結合酵素が使用できなくなった時固定化マトリック
スが再使用することが有利である。従って、本発明の修飾アビジン型分子を含有
するカラムに結合したビオチン化酵素からなる酵素反応槽は、アルカリ性溶液(
例えば、緩衝液C、pH10)を添加するか、または過剰のビオチン(例えば、
任意のpHで0.6mM)を添加することにより、不活性化ビオチン化酵素を除去
ことにより復元することができる。次に、新鮮なバッチのビオチン化酵素を、復
元した修飾アビジンカラムに加えることができる。
同様に、細胞を修飾アビジンカラムに固定化し、細胞ベースの反応槽系として
使用することができる。ビオチン含有溶液[例えば、等張条件(例えば、pH7
の0.15MのNaCl)下の0.6mMのビオチン、または適切な組織培養培地
中の過剰濃度のビオチン]を使用して細胞を分離させ、こうして修飾アビジンカ
ラムを復元することができる。
ファージライブラリー法では、ビオチン化リガンド(例えば、抗体、受容体)
は、マイクロタイタープレートのような固体支持体に結合される。これはしばし
ば、リガンドのビオチン化、および以後のストレプトアビジンブリッジを介する
プレートへの固定化により行われる。次に繊維状バクテリオファージ(例えば、
M13)を加え、固定化リガンドと反応できる表面ペプチドを含有するファージ
は、プレートに結合する。非特異的に結合したファージは、低濃度の中性界面活
性剤(例えばツイーン20)で洗浄して除去する。次に、結合しているファージ
は、pHを下げて(これは、固定化リガンドとファージ上の表面ペプチドの反応
を破壊する)プレートから分離される。このアプローチの1つの可能性のある問
題は、あるファージは非常に高い親和性反応によりプレートに結合することがあ
ることである。これらのファージは、ビオチン化リガンドに対する高親和性ペプ
チドのために特に興味深い。すなわち、本発明の修飾アビジンまたはストレプト
アビジンを使用して、高親和性ファージは、アルカリ性溶液(例えば、緩衝液C
、pH10)を加えるかまたは過剰のビオチン(例えば、任意のpHの0.6mM
)を加えて、ビオチン化リガンドとともにマイクロタイタープレートから分離す
ることができる。ファージに結合した回収された高親和性ペプチドは次に、細菌
に感染させて、および確立されたファージライブラリー法(例えば、スコット(S
cott),1992を参照)により、増やすことができる。
遺伝子増加とDNA単離は、ビオチン化DNAを本発明の修飾アビジン型分子
または修飾アビジンカラムと、公知の方法により複合体を形成させることにより
行われる(ウィルチェックとベイヤー(Wilchek and Bayer),1988を参照)
。複合体からビオチン化DNAを分離するために、アビジンを消化するのにこれ
までタンパク質分解性酵素(例えば、プロテイナーゼK)が使用されてきた。本
発明の修飾アビジン型分子を使用することにより、ビオチン化DNAは、アルカ
リ性溶液(例えば、緩衝液C、pH10)を用いるかまたは過剰のビオチン(例
えば、任意のpHの0.6mM)を加えることにより、分離できる。
バイオセンサーは、特異性を付与する生物学的感知成分および生物学的イベン
トを、さらに処理または定量可能な応答に変換する変換機能(すなわち、電気化
学的、光学的、熱量的または音響的)からなる。生物学的リガンドは、触媒性(
例えば、酵素、細菌細胞、組織)または非触媒性(例えば、抗体、受容体、DN
A)のいずれかでよい。そのような検出器は、感知表面への反応性成分の1つの
固定化に依存し、完成したバイオセンサー装置の得られる成分は非常に高価であ
る。アビジン−ビオチン系はこれまで、そのようなリガンドをバイオセンサーに
固定化するための一般的な方法として使用されてきた。未変性のアビジンまたは
ストレプトアビジンを本発明の修飾アビジンで置換する能力は、コストおよび簡
便性で有利な可逆性タイプのバイオセンサーを提供するであろう。従って、ビオ
チン化リガンドは、修飾アビジンまたはストレプトアビジンを介してバイオセン
サーに固定化され、必要な場合は、ビオチン化リガンドはアルカリ性溶液(例え
ば、緩衝液C、pH10)を用いるかまたは過剰のビオチン(例えば、所望のp
H、イオン強度などの条件の0.6mMビオチン)を加えることにより、分離でき
る。次にバイオセンサーの修飾アビジン型分子は、同じかまたは異なるビオチン
化リガンドで充填することができる。
本発明はまた、アビジン−ビオチン技術を用いるアビジン−カラムまたはビオ
チン化リガンドのいずれかの回収方法であって、(i)樹脂に結合した本発明の
修飾アビジン型分子を含有するカラムにビオチン化リガンドを固定化し;(ii)
こうして固定化されたビオチン化リガンドにより、所望の反応または分離操作を
実施し;(iii)条件を変更して、固定化された修飾アビジンカラムからビオチン
化リガンドを除去し;そして(iv)さらなる使用のためにビオチン化リガンドお
よび/または修飾アビジンカラムを回収する、ことからなる上記方法を提供する
。ビオチン化リガンドは、pHの上昇、加熱、過剰濃度のビオチン、または低濃
度の尿素、グアニジンまたはチオシアン酸の添加、および/またはこれらの組合
せにより、固定化された修飾アビジンカラムから除去される。好適な実施態様に
おいて、ビオチン化リガンドは、pHを10に上げるかまたは0.6mMビオチン
を添加することにより、固定化修飾アビジンカラムから除去される。
本発明を以下の非限定例により例示する。
例
材料と方法
(i)材料。卵白アビジンは、STCラボ(STC labs)(ウィニペグ(Winnipeg
)、カナダ)またはベロヴォケミカルズ(Belovo Chemicals)(バストン(Bast
ogne)、ベルギー)から提供された。ストレプトアビジンは、既に記載されてい
るように(ベイアー(Bayer)ら,1990)、改良されたイミノビオチン−セフ
ァロースカラムを使用して、ストレプトミセス・アビジニイ(Streptomyces avid
inii)の培養濾液から精製した。セファロース4B CLはファルマシア(Pharma
cia)(ウプサラ(Uppsala)、スエーデン)から入手した。テトラニトロメタンは
、フルカ(Fluka)から得た。プロテインAおよびウシ血清アルブミン(BSA)
は、シグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)(セントルイス、ミズーリ州、米
国)から得た。
(ii)緩衝液:緩衝液A:50mMクエン酸−リン酸、pH3〜6;緩衝液B、5
0mMトリス−塩酸、pH7〜9;緩衝液C、50mM炭酸ナトリウム−HCl、p
H10。
(iii)ビオチン化法:例で使用されるタンパク質および酵素は、既に記載され
ているように(ベイヤーとウィルチェック(Bayer and Wilchek),1990)、
ビオチニルN−ヒドロキシスクシンイミジル活性ステル(BNHS)を用いる通
常のビオチン化法によりビオチン化した。
(iv)アビジンおよびストレプトアビジンのセファロースへの固定化は、既に記
載されているように(コーンとウィルチェック(Kohn and Wilchek),1984
)、臭化シアン法により行った。
(v)酵素測定法
(a)西洋ワサビペルオキシダーゼ活性 ペルオキシダーゼ活性は、2,2’
−アジノ−ビス(3−エチルベンズ−チアゾリン−6−スルホン酸)(ABTS
)を基質として使用して測定した。基質溶液は、緩衝液A(pH5)10ml当た
り2.5mgの基質を含み、ここに10μlの30%過酸化水素を加えた。色の生
成を420nmで測定した。
(b)アルカリ性ホスファターゼ活性は、p−ニトロフェニルホスフェートを
基質として使用して測定した。基質溶液は、0.5mM MgCl2 を含有する1
Mのジエタノールアミン緩衝液(pH9.8)10ml当たり10mgの基質を含有
した。色の生成を410nmで測定した。
(vi)タンパク質:タンパク質は、アビジンまたはストレプトアビジン(適宜)
またはBSAを標準物質として用いて、ブラッドフォード(Bradford)法により
測定した。例1
:ニトロ−アビジン、ニトロ−ストレプトアビジンの調製、およびセファロ
ースへのこれらの固定化
(i)ニトロ−アビジンの調製:卵白アビジンの試料[1mlの50mMトリス緩衝
液(pH8またはそれ以上)中5mg]を、異なる濃度のテトラニトロメタン[T
NM)(約5〜50mMに対応する0.5〜5μl]で、23℃で30分間処理し
た。試料を、1M NaClで1回、そして2回蒸留水で2回、一晩透析した。
試料中の修飾チロシンの量は、アミノ酸解析により測定した。図2に示すように
、修飾法の条件下で、20mM濃度以上の試薬を使用して最大レベル(約70%)
の修飾が達成され、すなわち、平均してアビジンテトラマーの4つのサブユニッ
トのうち約3つが修飾されているようであった。以後の実験で、使用したニトロ
−アビジンは、2μlを用いて調製した。
(ii)ニトロ−ストレプトアビジンの調製:ストレプトアビジン分子のサブユニ
ット当たりのチロシン残基の数が多いため、ストレプトアビジン(2.5mg/ml
緩衝液)を、より高レベルのテトラニトロメタン(約50mMに対応する6μl)
を用いてニトロ化した。
(iii)セファロースに固定化されたニトロ−アビジンとニトロ−ストレプトア ビジンの調製
(a)セファロース4B CLの臭化シアン活性化 水を切ったセファロース
4B CLの40gをまず水で洗浄し、次に30%アセトン(v/v)そして最後に
60%アセトン(v/v)で洗浄した。樹脂を6mlの60%アセトンに再懸濁し、0
〜4℃に冷却した。磁性攪拌棒で攪拌しながら、6mlのCNBr溶液(10g/
100mlアセトン)を加え、次に同量のトリエチルアミン(TEA)溶液(15
.2g/100mlアセトン)を1〜2分間で滴下して加えた。活性化した樹脂を
濾
過し、0.1M重炭酸ナトリウムで洗浄した。
(b)セファロースへの固定化 活性化セファロース4B CLへのニトロ−
アビジンとニトロ−ストレプトアビジンの結合は、0.1M重炭酸溶液中で4℃
で16時間行った。
(iv)アビジン−セファロースおよびストレプトアビジン−セファロース樹脂の ニトロ化
上記(iii)(b)で記載したように(しかし非修飾アビジンを使用
して)調製した4mlのアビジン−セファロース樹脂(1.4mgアビジン/mlセフ
ァロース)を、50mMトリス緩衝液(pH8)で洗浄し、6μl のTNMで23
℃で50分間処理した。ニトロ修飾した樹脂をまず1M NaCl、次に2回蒸
留水で、そして最後にPBSで洗浄した。例2
.ニトロ−アビジンへのビオチン化タンパク質の結合
(i)ニトロ−アビジンへのビオチン化タンパク質の結合をいくつかの方法で試
験した。1つの実験では、例1(iii)の臭化シアン法により、セファロース1ml
当たり約0.5mgのアビジンを使用して、ニトロ−アビジンをセファロースに固
定化し、緩衝液A、B、またはC(100μl)中のビオチン化BSAの試料を
、100μl のニトロ−アビジンセファロース樹脂に適用した。溶出画分をタン
パク質について測定した。異なるpH値での結合パーセントを、樹脂に適用した
タンパク質の量から、溶出画分中のタンパク質の量を引いて求めた。図3に示す
ように、最適の結合はpH4で起きた。より高いpH(5〜8の間)では、結合
のプラトーレベルが観察された。pH8より上では、結合は顕著に低下し、pH
10では結合は無視できるほどであった。
(ii)マイクロタイタープレート測定法でビオチン化アルカリ性ホスファターゼ
酵素を使用して、同様の結果が得られた(図4)。この実験では、例1(i)に
従って調製したニトロ−アビジンは、マイクロタイタープレートに吸着(1μg
ニトロ−アビジン/100μl リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)/ウェル)さ
れ、プレートを1%BSA溶液でブロッキングし、ビオチン化アルカリ性ホスフ
ァターゼの試料を、異なるpHの緩衝液A、B、およびC中で適用した(37μ
g /0.1ml緩衝液/ウェル)。プレートを洗浄し、結合した酵素画分を、p−
ニトロフェニルホスフェートを基質として使用して前記方法v(b)に記載し
たように酵素測定法により比色法で測定した。
(iii)同様のマイクロタイタープレート酵素測定法を使用して、ニトロ−アビ
ジンの結合活性を、未変性の(非修飾)アビジンのそれと比較した。アビジンま
たはニトロ−アビジン(1μg/100μl PBS/ウェル)でコーティングし
たマイクロタイタープレートに、実験的に決定した最適の結合pH(すなわち、
pH4)で異なる濃度(150μl の緩衝液A中10ng〜1μg)のビオチン化
西洋ワサビペルオキシダーゼを入れた。プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ酵
素活性を、ABTSを基質として使用して前記方法v(a)に記載したように測
定した。図5に示すように、これらの条件下では、非修飾アビジンおよびニトロ
−アビジンのビオチン結合性能は区別できなかった。例3
.ニトロ−アビジンからのビオチン化タンパク質の分離
(i)ニトロ−アビジンカラムからのビオチンの分離についての好適な条件を決
定するために、ビオチン化BSA(1.5mg/150μl 緩衝液A、pH4)を
、例1(iv)のニトロ−アビジン−セファロース樹脂を含有するカラムに適用し
た。結合した物質を、上昇するpHの緩衝液A、BおよびCで洗浄し、溶出画分
のタンパク質濃度を追跡した。図6に示すように、樹脂からビオチン化タンパク
質を分離させるのにアルカリ性溶液(緩衝液C、pH10)が必要であった。
(ii)ニトロ−ストレプトアビジンを例1(iii)のセファロースに結合させて調
製したニトロ−ストレプトアビジンカラムを使用して、同じ方法を使用して(但
し、緩衝液C(pH10)のみで洗浄)、同様の結果(図7)が得られた。
(iii)同様の実験で、例1(iv)に従って調製したニトロ−アビジン−セファ
ロース樹脂を含有するカラムから、ビオチン化BSAを分離するための手段とし
て、遊離ビオチンとの競合を探索した。ビオチン化BSA(1.5mg/150μ
l 緩衝液A、pH4)を、2mlのニトロ−アビジン−セファロースカラムに適用
した。緩衝液A(pH4)中の0.6mMビオチンを含有する溶液をカラムに通し
、タンパク質濃度を追跡した。図8に示すように、ビオチニル−BSAの大部分
は、緩衝液A(pH4)中の0.6mMビオチンを使用して分離された。ビオチニ
ル−BSAのビオチン誘導性溶出を、pH4〜10の緩衝液A、B、またはCを
使用して、pHの関数として試験した。
(iv)遊離ビオチンをpH4から10の範囲の異なるpHの緩衝液に溶解した以
外は、例1(iv)に従って調製したニトロ−アビジン−セファロース樹脂で同じ
条件下で、同様の実験を行った。図9に示すように、遊離ビオチンは試験した全
pH範囲にわたって有効な溶出物であった。比較のために、ビオチンの非存在下
のpH10での溶出を示す。例4
.非修飾ビオチン結合部位のブロッキング
記載した条件下では結合部位チロシンの部分的修飾しか達成できないため、非
修飾部位は、ニトロ−アビジンの以後の適用において問題となる可能性がある。
従って異なるレベルのニトロ−チロシンを含有する例1(i)に従って調製した
ニトロ−アビジン試料(図2を参照)を、マイクロタイタープレートのウェルに
コーティングした(1μg /100μl PBS/ウェル)。同様の濃度の未変性
の卵白アビジンを対照として使用した。ウェルを1%BSAでブロッキングし、
吸着したタンパク質試料は、緩衝液A(pH4)中の0.6mMビオチンを使用し
て過剰レベルの遊離ビオチンでブロッキングした。修飾された結合部位を占有し
たビオチンは、前記例3で記載したアルカリ性溶液(緩衝液C、pH10)を使
用して分離された。ブロッキングとアルカリ処理の後に、部分的にニトロ化され
たアビジン試料のビオチン結合能を、ビオチン化ペルオキシダーゼ系を使用して
マイクロタイタープレート中の酵素測定法により測定した(前記方法v(a))
。
図10に示すように、結合は修飾の程度に比例し、最大の結合は約60%の修飾
で起きた。例5
.ニトロ−アビジンカラムの繰り返し使用
例1 (iii)のセファロース−ニトロ−アビジン樹脂を含有するカラムの安定性
を、ビオチン化タンパク質の繰り返し適用と溶出により試験した。ビオチン化B
SAの同一試料(300μg /ml緩衝液A、pH4)を、セファロース−ニトロ
−アビジン樹脂の0.75mlのカラムに適用した。カラムを緩衝液A(pH4)
で洗浄し、緩衝液C(pH10)を使用して溶出した。この操作をさらに3回繰
り返し、ブラッドフォード(Bradford)測定法によりタンパク質について画分を
追跡した(図11A)。図11Bに示すように、溶出した画分の蓄積は、サイク
ル毎にニトロ−アビジンカラムに結合し分離されるビオチン化タンパク質の基本
的に同じレベルを与えた。例6
.ビオチニル−プロテインA/ニトロ−アビジンカラム上のIgGの精製
普遍的な親和性樹脂としてのニトロ−アビジンカラムの性能を調べた。このア
プローチでは、ビオチン化プロテインAを、セファロースに結合させ、カラムに
注ぎ、カラムを、ウサギの全血清から直接免疫グロブリンを精製するための免疫
親和性カラムとして使用し、次にビオチン化プロテインAをカラムから分離させ
た。例1(iv)に従って調製した0.5mgニトロ−アビジン/mlセファロースを
含有する2mlのカラムに、4mlの緩衝液A(pH4)中の1.8mgのプロテイン
Aを加えた。ウサギ全血清[0.1M緩衝液B(pH8)で4倍希釈したものを
0.5ml]をカラムに適用した。カラムを同じ緩衝液で洗浄し、次に同じ緩衝液
で10mM濃度で洗浄した。結合した免疫グロブリンは、緩衝液A(pH4)によ
りカラムから分離された。次に50mM緩衝液C(pH10)により、ビオチン化
プロテインAを除去した。結果を図12に示す。次に種々のピークをSDS−P
AGEにより調べ、これにより基本的に純粋な画分の予測されたタンパク質を示
した(図13)。精製した免疫グロブリンは、同等の画分の市販試料と同様に純
粋であり、アルカリ処理によりカラムから溶出したビオチニルプロテインAは同
様に純粋であった。例7
.ヨード化アビジンの調製とマイクロタイタープレートに吸着したヨード化
アビジンへのビオチン化タンパク質の結合
(I)ヨード化アビジンの調製 0.5mlのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7)
中の2mgのアビジンの試料を、10μl のKI溶液(32mg/ml)と200μl
のクロラミンT(2mg/ml)で処理した。23℃で30分間インキュベート後、
300μl のメタ重亜硫酸ナトリウム(2mg/ml)を1分間加えた。1mlの1%
KI溶液を添加して反応を停止させた。試料を2回蒸留水に対して透析した。
(ii)ヨード化アビジンへのビオチン化ペルオキシダーゼの結合 ヨード化アビ
ジンをマイクロタイタープレートに吸着させ、プレートを1%BSA溶液でブロ
ッキングし、そしてビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼの試料を、異なるp
Hの緩衝液A、B、およびC(37μg/0.1ml緩衝液/ウェル)中で適用し
た。プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼの酵素活性を、ABTSを基質とし
て前記方法v(a)中に記載したように測定した。図14に示すように、最適の
結合はpH5で起きた。例8
.アゾチロシン−アビジンおよびストレプトアビジンの調製
0.3MのHCL(10ml)に溶解したp−アルサニル酸(p−アミノベンゼ
ンアルソン酸)(100mg)を、氷浴中でNANO2(5mlの水中35mg)で処
理した。6分後、溶液をNaOHでpH5に調整し、直ちに使用した。得られた
アゾアルサニル酸[0.1Mのホウ酸ナトリウム緩衝液(pH8.4)中2mg]
0.5mlを、アビジンの溶液[4.5mlの0.1Mのホウ酸ナトリウム緩衝液(
pH8.4)中5mg]に加え、室温で2時間反応を行った。反応の進行は分光光
度計(λmax 342nm)で追跡し、アゾアルサニル酸誘導体化アビジンを、PB
Sまたは50mMのトリス緩衝液(pH8)に対して透析した。
アゾ−チロシンストレプトアビジンを同様にして調製した。
p−アルサニル酸の代わりに他のp−アミノベンゼン誘導体[例えば、アント
ラニル酸(o−アミノ安息香酸)、p−アミノ安息香酸、p−アミノベンゼンリ
ン酸およびスルファニル酸(p−アミノベンゼンスルホン酸)]を使用して、対
応するアゾ誘導体を得る。例9
.アミノチロシン−アビジンおよびストレプトアビジンの調製
ニトロ−アビジンまたはアゾチロシン−アビジン(1mlの50mMトリス緩衝液
(pH8)中2mg)を、24倍モル過剰のNA2S2O4(4mlの同じ緩衝液中1
.4mg)で処理した。反応は室温で16時間行い、還元の程度は分光光度計で証
明した(ニトロ−アビジンについてはλmax428nm、アゾチロシン−アビジン
については342nmでの吸光度の低下)。タンパク質をPBSに対して透析した
。
アミノチロシン−ストレプトアビジンを、1mgのニトロ−ストレプトアビジン
と対応するモル過剰のNA2S2O4を使用して、同様の方法により産生した。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,S
Z,UG),UA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD
,RU,TJ,TM),AL,AM,AT,AU,AZ
,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CZ,
DE,DK,EE,ES,FI,GB,GE,HU,I
L,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LK
,LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,
MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,R
U,SD,SE,SG,SI,SK,TJ,TM,TR
,TT,UA,UG,US,UZ,VN
(72)発明者 モラグ,エリィ
イスラエル国 64954 テル−アビブ,デ
ビッド ハメレチ ブールバード 25
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.(i)未変性の卵白アビジン;(ii)組換えアビジン;(iii)脱グリコシル 化型のアビジン;(iv)細菌性ストレプトアビジン;(v)組換えストレプトア ビジン;(vi)端を切り取ったストレプトアビジン;および(vii)必須のチロシ ン残基以外の部位で修飾された(i)〜(vi)の誘導体、よりなる群から選択さ れるビオチン結合性修飾アビジン型分子であって、該ビオチン結合性修飾アビジ ン型分子において、ビオチン結合部位の必須のチロシン残基は、そのpKaが、 対応する非修飾アビジン型分子中の非修飾チロシン残基のpKaに比較して低下 しているように修飾されることを特徴とする、上記分子。 2.ビオチン結合部位でのチロシンのpKaは、チロシン残基への1つまたは それ以上の求電子基および/または求核基の付加により低下している、請求の範 囲第1項に記載の修飾アビジン型分子。 3.請求の範囲第2項に記載の修飾アビジン型分子であって、修飾された必須 のチロシン残基は、式: [式中、X1とX2は、それぞれニトロ、ハロゲン、NR1R2および--N=NR3 (ここで、R1とR2は、それぞれ水素、C1〜C8アルキルおよびC1〜C6カルボ キシアシルから選択され、R3は、酸性の基により置換されたアリールである) から選択される基である]を有する、上記分子。 4.X1および/またはX2は、ニトロ基である、請求の範囲第3項に記載の修 飾アビジン型分子。 5.ニトロ−チロシン未変性卵白アビジン。 6.ニトロ−チロシン細菌性ストレプトアビジン。 7.非修飾アビジン型分子を、非変性条件下でテトラニトロメタンと反応させ ることからなる、請求の範囲第4〜6項までのいずれか1項に記載のビオチン結 合性ニトロ−チロシン修飾アビジン型分子の製造方法。 8.X1および/またはX2は、ハロゲンである、請求の範囲第3項に記載の修 飾アビジン型分子。 9.ハロゲンはヨードである、請求の範囲第3項に記載の修飾アビジン型分子 。 10.X1および/またはX2は、アゾ基である、請求の範囲第3項に記載の修飾 アビジン型分子。 11.X1および/またはX2は、アミノ基である、請求の範囲第3項に記載の修 飾アビジン型分子。 12.X1および/またはX2は、--N=NR3基(ここで、R3は、カルボキシル または酸性の基からのアシル基により置換されたフェニルである)である、請求 の範囲第3項に記載の修飾アビジン型分子。 13.固体支持体に結合した、請求の範囲第1〜6項、および第8項〜12項ま でのいずれか1項に記載の修飾アビジン型分子。 14.固体支持体は、樹脂、マイクロタイタープレート、ガラスビーズまたは磁 性ビーズである、請求の範囲第13項に記載の修飾アビジン型分子。 15.固体支持体は樹脂である。請求の範囲第13項に記載の修飾アビジン型分 子。 16.樹脂はセファロースである、請求の範囲第13項に記載の修飾アビジン型 分子。 17.樹脂に結合した請求の範囲第1項に記載の修飾アビジン型分子を含有する ビオチン化リガンドの固定化のためのカラム。 18.修飾アビジン型分子は、ニトロ−チロシン未変性卵白アビジンであり、樹 脂はセファロースである、請求の範囲第17項に記載のカラム。 19.修飾アビジン型分子は、ニトロ−チロシン細菌性ストレプトアビジンであ り、樹脂はセファロースである、請求の範囲第17項に記載のカラム。 20.アビジン−ビオチン技術を用いる方法における、請求の範囲第1項〜6項 、第8項〜12項および第14項〜16項のいずれか1項に記載のビオチン結合 性修飾アビジン型分子、または請求の範囲第17項〜19項のいずれか1項に記 載 のカラム、の使用。 21.細胞の固定化と分離ための、DNAの捕捉と分離のための、ビオチン化酵 素の固定化と分離ための、ファージライブラリーの製造ための、およびバイオセ ンサーの可逆性マトリックスとしての、細胞分離における親和性クロマトグラフ ィー中の修飾アビジン型分子またはカラムの、請求の範囲第20項に記載の使用 。 22.アビジン−ビオチン技術を用いる方法におけるアビジン−カラムまたはビ オチン化リガンドの回収方法であって、 (i)樹脂に結合した請求の範囲第1項記載の修飾アビジン型分子を含有するカ ラムにビオチン化リガンドを固定化し; (ii)こうして固定化されたビオチン化リガンドにより所望の反応または分離操 作を実施し; (iii)条件を変更して、固定化された修飾アビジンカラムからビオチン化リガ ンドを除去し;そして (iv)さらなる使用のためにビオチン化リガンドおよび/または修飾アビジンカ ラムを回収する、 ことからなる上記方法。 23.pHの上昇、加熱、過剰濃度のビオチン、または低濃度の尿素、グアニジ ンまたはチオシアン酸の添加、および/またはこれらの組合せにより、固定化さ れた修飾アビジンカラムから、ビオチン化リガンドは除去される、請求の範囲第 22項に記載の方法。 24.pHを10に上げることにより、ビオチン化リガンドは固定化修飾アビジ ンカラムから除去される、請求の範囲第23項に記載の方法。 25.0.6mMのビオチンを添加することにより、ビオチン化リガンドは固定化 修飾アビジンカラムから除去される、請求の範囲第23項に記載の方法。 26.請求の範囲第22項〜25項のいずれか1項に記載の方法であって、修飾 アビジン型分子は、式 [式中、X1および/またはX2は、それぞれニトロ、ハロゲン、NR1R2および --N=NR3(ここで、R1とR2は、それぞれ水素、C1〜C8アルキルおよびC1 〜C6カルキシルアシルから選択され、R3は、酸性の基により置換されたアリー ルである)から選択される基である]の修飾された必須チロシン残基を有する、 上記方法。 27.修飾アビジン型分子はニトロ−チロシン未変性卵白アビジンである、請求 の範囲第22項〜25項のいずれか1項に記載の方法。 28.修飾アビジン型分子はニトロ−チロシン細菌性ストレプトアビジンである 、請求の範囲第22項〜25項のいずれか1項に記載の方法。
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