JPH11507920A

JPH11507920A - 修飾アビジンおよびストレプトアビジン分子ならびにこれらの使用

Info

Publication number: JPH11507920A
Application number: JP9502873A
Authority: JP
Inventors: エイ．バイヤー，エドワード; ウィルチェック，メイヤー; モラグ，エリィ
Original assignee: イエダリサーチアンドデベロツプメントカンパニーリミテツド
Priority date: 1995-06-14
Filing date: 1996-06-13
Publication date: 1999-07-13
Also published as: KR19990022896A; AU713417B2; HUP9900239A2; DE69638257D1; EP0871658A4; WO1997000329A3; US5973124A; WO1997000329A2; AU6135396A; HUP9900239A3; MX9710181A; CN1191018A; IL114149A0; CA2221647A1; EP0871658B1; ATE481417T1; EP0871658A2; CZ401697A3; CN1119353C; BR9609241A

Abstract

(57)【要約】ビオチン結合部位の必須のチロシン残基は、そのｐＫａが、対応する非修飾アビジン型分子中の非修飾チロシン残基のｐＫａに比較して低下しているように修飾される、ビオチン結合性修飾アビジン型分子が提供される。このアビジン型分子は、（ｉ）未変性の卵白アビジン；(ii)組換えアビジン；(iii)脱グリコシル化型のアビジン；（iv）細菌性ストレプトアビジン；（v）組換えストレプトアビジン；（vi）端を切り取ったストレプトアビジン；および(vii)必須のチロシン残基以外の部位で修飾された（ｉ）〜（vi）の誘導体、を含有する。修飾は、ニトロ、ハロゲン、アゾおよびアミノのような基により、チロシン残基のヒドロキシル基の１つまたはそれ以上のオルト位で置換することにより行われる。修飾アビジン型分子は、アビジン−ビオチン技術のすべての応用分野で使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】修飾アビジンおよびストレプトアビジン分子ならびにこれらの使用発明の分野と背景本発明は、ビオチンの結合に決定的に重要であることが知られている結合部位のチロシン残基において修飾されるアビジン型の分子に関する。修飾アビジンは、まだ特定の条件下でビオチンまたはビオチン化リガンドに結合することができるが、これらの条件を変更（例えば、高いｐＨまたはビオチンとの競合）すると、結合ビオチン残基またはビオチン化リガンドが分離される。従って本発明は、アビジン−ビオチン技術で使用される可逆型のアビジンを提供し、こうして種々の応用目的のアビジン分子の大きな欠点（すなわち、アビジン−ビオチン複合体を破壊するのに必要とされる極端な変性条件）の１つを「修正」することができる。アビジン−ビオチン複合体を解離させるのに通常必要な極端な条件は、ビオチン化成分の生物活性を不可逆的に不活性化し、従って以後の使用には不適当なものにしてしまう。アビジン（卵白由来）およびストレプトアビジン（ストレプトミセス・アビジニイ(Streptomyces avidinii)由来）は、約１０^-15Ｍの同様の解離定数でビオチンに結合する２つの関連するタンパク質である（グリーン(Green)，１９７５）。ビオチンへの結合以外に、これらの物理特性の多くは非常によく似ている。例えばいずれも、４つの非共有結合した同一のサブユニットからなり、各サブユニットは１つのビオチン結合部位を有する。またサブユニットのＭ_r値はよく似ている。さらに２つのタンパク質の配列中のいくつかの短い区間（特にほぼ同じ位置に存在する２つのＴｒｐ−Ｌｙｓ区間）が保存されている（アルガラナ（Arga rana）ら，１９８６）。我々はすでに（ギトリン（Gitlin）ら，１９８７，１９８８ａ）、いくつかのリジンおよびトリプトファン残基が、両方のタンパク質のビオチンの結合に関与していることを証明している（ギトリン（Gitlin）ら，１９８８ｂ）。さらに最近、アビジンとストレプトアビジンの両方が同じ３次元折り畳み構造を示し、結合部位残基のほとんどは同一または同様であることが証明された（ウェーバー(Wever)ら，１９８９）。両方のタンパク質とビオチン分子の間で形成される結合部位の構造と結合は、たしかに非常によく似ている。これらの類似性にもかかわらず、２つのタンパク質の間にはいくつかの差異が存在する。アビジンは、２つのメチオニン残基を含有するジスルフィド結合で橋渡しされた糖タンパク質であり、一方ストレプトアビジンはグリコシル化されておらず、イオウ含有アミノ酸側鎖が欠如している。もう１つの大きな差は、チロシンの含量である。アビジンはチロシン残基を１つだけ（Ｔｙｒ−３３）含有し、一方ストレプトアビジンは、２２、４３、５４、６０、８３および９６位に６つのチロシン残基を有する。興味深いことにアビジンの単一のチロシン残基は、ストレプトアビジンのチロシン残基の１つ（Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ区間中のＴｙｒ−４３）の配列と同一の配列を含有する領域中に位置する。このチロシン残基は、ビオチン結合部位中に主要な位置を占め、チロシンの水酸基を化学的に修飾すると、アビジン分子が不可逆的に不活性化される（ギトリン（Gitl in）ら，１９９０）。各アビジンモノマーは、１分子のビオチンに結合する。この結合のユニークな特徴はもちろん、アビジン−ビオチン複合体の形成の強度と特異性である。得られる親和性定数（アビジンについては１．６×１０¹⁵Ｍ^-1そしてストレプトアビジンについては２．５×１０¹³Ｍ^-1と推定されている（グリーン(Green)ら，１９９０））は、タンパク質と有機リガンドについて知られているもののうち最も高いものである。これは非常に強く、室温での高濃度の変性剤（例えば、６Ｍ塩酸グアニジン、３Ｍチオシアン酸グアニジン、８Ｍ尿素、１０％β−メルカプトエタノール、または１０％ドデシル硫酸ナトリウム）のような非常に極端な条件下に暴露しても、ビオチンを結合部位から分離することはできない。変性剤または界面活性剤の存在下で低ｐＨ（１．５）または高温（＞７０℃）での塩酸グアニジンによる処理を組合せると、タンパク質は変性され、そしてビオチンは、破壊された結合部位から分離される。アビジンは、ビオチンを分子のウレイド（尿素様）環で主に認識する。アビジンの結合部位とこのビタミンのバレリン酸側鎖のイオウ含有環との間の相互作用は、強度がはるかに小さい。ビオチンのカルボキシ含有側鎖とアビジンの間のこの比較的弱い相互作用は、ビオチンが化学的に修飾され、広範囲の生物活性のある物質に結合可能であることを意味し、得られる誘導体または結合体のビオチン残基は、まだアビジンとの相互作用のために利用可能である。これに対してアビジンは、多くの他の分子（顕著には、異なる型の「プローブ」またはレポーター基）で誘導体化され得る。これは、アビジン−ビオチン技術の核心である（ウィルチェックとベイヤー(W ilchek and Bayer),1990）。すなわち、ある実験系の生物活性のある標的分子は、そのビオチン化された対応物質（結合物質）で「標識」でき、次に生成物は、適当なプローブと誘導体化または結合体化して、アビジンと相互作用させることができる。非特異的反応または好ましくない反応を引き起こすことがある高い塩基性（ｐＩ〜１０．５）とアビジン分子上の糖残基の存在のために、アビジン−ビオチン技術における卵白アビジンの使用は時に限定される。最近、細菌のタンパク質であるストレプトアビジンは、アビジン−ビオチン技術の多くの分野で卵白アビジンに取って代わりつつある。しかし、ストレプトアビジンの問題（コストが高いこととビオチンに依存しない細胞結合性）のために、アビジン−ビオチン技術の標準物質として、卵白アビジンに関心が戻ってきている。この目的のために、未変性のアビジン（およびその従来の誘導体）やストレプトアビジンに対して改良された分子特性を示す修飾アビジンが調製されている（例えば、Ｎ−ホルミル、Ｎ−アセチルおよびＮ−スクシニルアビジンのようなＮ−アシルアビジン）。アビジンのこれらの誘導体は、このタンパク質の電荷を低下させるが、これらはすべてアビジンの利用可能なリジンへの共有結合を介して調製され、その結果遊離のアミノ基が妨害されて他のタイプの結合体（顕著なものは、アビジン標識酵素のようなタンパク質−タンパク質結合体）が生成される（これらはしばしば、グルタルアルデヒドのような２官能性試薬を使用してリジン残基を介して架橋することにより調製される）。リジン修飾のより有用で有効な代替法は、アルギニンを介する修飾である。この場合、このタンパク質のｐＩは効率的に低下し、リジンはまだ以後の反応に利用できる。こうして修飾されるアビジンの２つの異なる誘導体が市販されている。その１つのエクストラビジン（ExtrAvidin）（登録商標）は、種々の官能基が誘導体化されたかまたは結合した型でシグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）（セントルイス、ミズーリ州）から入手できる。２番目のニュートラライトアビジン(NeutraLite Avidin)（登録商標）（ベロヴォケミカルズ(Belovo Chemicals) の製品、バストン（Bastogne）、ベルギー）は、さらに修飾されており、大量に購入できる。卵白アビジンのｐＩの低下は、問題の１つを解決するが、オリゴ糖残基の存在は、まだその応用を制限する非特異（ビオチン非依存性）反応の重要な原因である。アビジン−ビオチン技術の標準物質としての卵白アビジンの復活は、その糖の除去に依存している。糖タンパク質から糖を除去する確率は非常に限定されている。これは化学的または酵素的に行われる。ＨＦまたは過ヨウ素酸酸化を使用するような現在利用できる化学的方法は、破壊的であるかまたは非効率的である。Ｎ−グリカナーゼ（タレンチオノ(Tarentino)ら，１９８４）を用いるよく知られている酵素的方法は、非常に高価であり、従来法を用いる場合はアビジンにとってあまり有効ではない。結局、実施可能な脱グリコシル化法が確立され、次に得られた生成物はアルギニンを介して化学的に修飾され、登録商標ニュートラライトアビジン(Neutr aLite Avidin)（ベロヴォケミカルズ（Belovo Chemicals））として知られている。これらの改良にもかかわらず、アビジン−ビオチン技術の応用における大きな問題の１つは、結合に可逆性がないことであり、操作の最後に、ビオチンブリッジにより結合している生物学的物質を変性または不活性化せずにアビジンとビオチン残基を分離することが困難なことである。あるいは、障害または不活性化された物質をアビジンカラムから除去し、こうしてビオチン化成分の新しい試料の結合のためにカラムを復元することが有利であろう（特に工業的使用において）。本発明の目的は、ビオチン結合性を保持し、方法の可逆性が所望または有利なアビジン−ビオチン技術を用いる方法で有利に使用される、修飾アビジンを提供することである。テトラニトロメタンを使用するモデルペプチドおよびタンパク質のチロシン残基のニトロ化が記載されている（リオルダン(Riordan)ら，１９６６；ソコロフスキー（Sokolovsky）ら，１９６７）。本発明者の以前の研究（ギトリン（Gitl in）ら，１９８９）において、９Ｍ尿素に溶解した卵白アビジンのテトラニトロメタン（ＴＮＭ）によるニトロ化により、アビジンのニトロチロシン誘導体が調製された。ニトロ化はアビジンの変性型（尿素の存在下）で行われたため、得られるニトロ−アビジン調製物は不活性であり、すなわちビオチンに結合しなかった。こうして調製されるアビジンは、アビジン−ビオチン技術での使用には全く適さない。分析目的に¹²⁵Ｉ−標識アビジンおよびストレプトアビジンが調製されている。各アビジンサブユニットの単一のチロシン残基は、ヨード化にはすぐ利用できない。３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プオピオニル基の導入により、アビジンをヨード化（クロラミンＴ法）し易くして、この基を含有する ¹²⁵Ｉ−標識アビジンが調製された。アビジンを標識するのに、 ¹²⁵Ｉ−標識ボルトン−ハンター (Bolton-Hunter)試薬を用いることもできる（フィンとホフマン(Finn and Hofma nn)，１９８５）。¹²⁵Ｉ−アビジンは、ヨードゲン法（スター(Suter)ら，１９８８）を使用して、Ｎａ¹²⁵Ｉによりストレプトアビジンをヨード化して製造された。非標識ヨード化アビジンおよびストレプトアビジンは、これまで報告されていない。モデルペプチドおよびタンパク質（例えば、リボヌクレアーゼＡ）のチロシン残基のアゾ化およびアミド化は、既に報告されている（ゴレッキ(Gorecki)ら，１９７１；ソコロフスキー（Sokolovsky）ら，１９６７）。発明の要約本発明は、（ｉ）未変性の卵白アビジン；(ii)組換えアビジン；(iii)脱グリコシル化型のアビジン；（iv）細菌性ストレプトアビジン；（v）組換えストレプトアビジン；（vi）端を切り取ったストレプトアビジン；および(vii)必須のチロシン残基以外の部位で修飾された（ｉ）〜（vi）の誘導体、よりなる群から選択されるビオチン結合性修飾アビジン型分子に関し、ビオチン結合性修飾アビジン型分子においてビオチン結合部位の必須のチロシン残基は、そのｐＫａが、対応する非修飾アビジン型分子中の非修飾チロシン残基のｐＫａに比較して低下しているように修飾されることを特徴とする。本発明の修飾アビジン型分子は、アビジン型分子の必須チロシン残基上に１つまたはそれ以上の求電子基および／または求核基を有し、修飾されたチロシンは式：［式中、Ｘ₁ とＸ₂ は、それぞれニトロ、ハロゲン、ＮＲ₁Ｒ₂および--Ｎ＝ＮＲ₃ （ここで、Ｒ₁とＲ₂は、それぞれ水素、Ｃ₁〜Ｃ₈アルキルおよびＣ₁〜Ｃ₆カルボキシルアシルから選択され、Ｒ₃は、酸性の基により置換されたアリールである）から選択される基である］である化合物により例示される。本発明の好適な実施態様において、アビジン型分子は、チロシン残基へ１つまたはそれ以上の求電子基を付加することにより修飾される。例えばアビジンまたはストレプトアビジンは、図１（Ｘ₁またはＸ₂はＮＯ₂またはハロゲン、好ましくはＩである）に示すように、チロシン残基のニトロ化またはハロゲン化（好ましくはヨード化）により修飾され、こうしてビオチン結合部位中のチロシン残基のｐＫａを１０．５〜１２．５から６．５〜８．５（好ましくは約７．０）に低下させる。アビジン型分子のチロシン残基のこのような修飾は、チロシン環のオルト位（ヒドロキシル基の隣）に１つまたはそれ以上の求電子基を付加する。このタイプの修飾アビジンの例としては、テトラニトロメタン（ＴＮＭ）を使用するチロシン残基のニトロ化が用いられた。得られるニトロチロシン含有アビジンおよびストレプトアビジン（本明細書において、以後それぞれ「ニトロ−アビジン」および「ニトロ−ストレプトアビジン」と呼ぶ）は、ビオチン残基またはビオチン化リガンド（例えば、ビオチン化抗体、酵素、核酸または細胞）を分離するための比較的穏和な条件を規定するために、広く研究されている。本発明においてアビジンのニトロ化は、非変性条件下で行われ、得られるニトロ−アビジンおよびニトロ−ストレプトアビジンは、ｐＨ４で効率的かつ強固にビオチン化リガンドに結合することが証明された。ｐＨを８に上げても、ビオチン化リガンドはまだカラム上に保持された。しかしｐＨを１０まで上げると、ビオチン化リガンドは分離した。あるいは低ｐＨ（例えば、ｐＨ４〜８の範囲）では、ビオチン化リガンドは遊離ビオチンを使用する交換により分離された。ニトロ−アビジンとニトロ−ストレプトアビジンのこれらの特性は、種々の応用に適したアビジンおよびストレプトアビジンの型を提供する。これら物質は、セファロース樹脂に固定化されたニトロ−アビジンおよびニトロ−ストレプトアビジンへのビオチン化リガンドのいくつかの例の結合および以後の分離、ならびにマイクロタイタープレートに吸着されたニトロ−アビジンおよびニトロ−ストレプトアビジンへのビオチン化リガンドの結合と分離のために、本発明において使用される。別の実施態様において本発明は、ハロゲン化、より好ましくは非標識ヨード化アビジンまたはストレプトアビジンに関する。クロラミンＴ法を使用してＫＩによりアビジンまたはストレプトアビジンのチロシン残基をヨード化すると、アビジンの有効な可逆性型であることが知られているモノ−および／またはジイソチロシン−アビジンまたは−ストレプトアビジンが得られた。本発明のさらなる実施態様は、ＮＲ₁ Ｒ₂ および--Ｎ＝ＮＲ₃ から選択される１つまたはそれ以上の求核基により、必須チロシン残基で修飾されるアビジン型分子に関する。本発明のアゾ誘導体では、すなわち、Ｘ₁および／またはＸ₂が--Ｎ＝ＮＲ₃であり、Ｒ₃ が、カルボキシル、およびリン酸、アルソン酸またはスルホン酸のような無機酸の残基から選択される酸性の基により置換されたアリール、好ましくは炭素環式アリール、最も好ましくはフェニルである化合物。本発明のアゾ誘導体は、対応するｐ−アミノ誘導体（例えば、ｐ−アルサニル酸、アントラニル酸、スルファニル酸およびｐ−アミノリン酸）から、ＮａＮＯ₂ でジアゾ化し、得られるジアゾニウム塩を選択されたアビジン型分子と反応させて、調製される。本発明のアミノ誘導体では、すなわちＸ₁および／またはＸ₂がＮＲ₁Ｒ₂ （ここでＲ₁とＲ₂は、それぞれ水素、アルキルおよびアシルから選択される）である化合物。アルキル基は、好ましくはＣ₁〜Ｃ₈直鎖又は分岐鎖アルキルであり、例としてはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ヘキシル、オクチルがある。アシル基は、好ましくはＣ₁〜Ｃ₆カルボキシアシル（例えば、アセチル、プロピオニル、ブチリル、スクシニル、またはベンジルオキシカルボニル）である。本発明のアミノ誘導体は、対応するアゾ誘導体を亜硝酸ナトリウムＮａ₂Ｓ₅Ｏ₄ で誘導体化、または対応するニトロ誘導体をＮａ₂Ｓ₅Ｏ₄で還元、そして必要であれば、アミノ基を標準的方法でさらにアルキル化またはアシル化することにより調製される。本発明の修飾アビジン型分子は、アビジン−ビオチン技術の非常に多くの応用分野で使用される。図面の簡単な説明図１は、本発明のチロシン−修飾アビジン型分子の調製のための反応工程図、およびアビジン−ビオチン技術を用いる可逆的方法におけるその使用を示す。図２は、例１（ｉ）に記載するように、テトラニトロメタン（ＴＮＭ）濃度（ mM）の関数としてのアビジンのニトロ化のレベル（％）を示す。図３は、例２（ｉ）に記載するように、セファロース−ニトロ−アビジン樹脂へのビオチン化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の結合に及ぼすｐＨの影響を示す。図４は、例２（ii）に記載するように、吸着ニトロ−アビジンを含有するマイクロタイタープレートへのビオチン化アルカリ性ホスファターゼの結合に及ぼすｐＨの影響を示す。図５は、例２(iii)に記載するように、アビジン（黒丸）とニトロ−アビジン（白丸）のビオチン結合活性の間の比較を示す。図６は、例３（ｉ）に記載するように、セファロース−ニトロ−アビジン樹脂からのビオチン化ＢＳＡのｐＨ誘導性の分離を示す。図７は、例３（ii）に記載するように、セファロース−ニトロ−ストレプトアビジン樹脂からのビオチン化ＢＳＡのｐＨ誘導性の分離を示す。図８は、例３(iii)に記載するように、遊離ビオチンとの競合によるセファロース−ニトロ−アビジン樹脂からのビオチン化ＢＳＡの分離を示す。図９は、例３（iv）に記載するように、ｐＨの関数としてのビオチン化ＢＳＡのビオチン誘導性の分離を示す。遊離ビオチンは、異なるｐＨ（４〜１０の範囲）の緩衝液に溶解した。比較のために、ビオチンの非存在下のｐＨ１０での溶出を示す。図１０は、例４に記載するように、ニトロ−アビジンのビオチンで阻止した部位からのビオチンの分離を示す。図１１Ａ〜Ｂは、例５に記載するように、ニトロ−アビジン−セファロースカラムからのビオチン化ＢＳＡの繰り返し適用と溶出の結果を示す。図１１Ａにおいて、ビオチン化ＢＳＡの同一試料を、セファロース−ニトロ−アビジン樹脂を含有するカラムに連続的に適用（緩衝液Ａを用いてｐＨ４で）し、溶出（緩衝液Ｃを用いてｐＨ１０で）した。図１１Ｂは、溶出した画分の蓄積は、サイクル毎に基本的に同じレベルの結合し溶出したタンパク質を与えることを示す。図１２は、例６に記載するように、ウサギの全血清からの免疫グロブリンの精製後の、セファロース−ニトロ−アビジン樹脂を含有するカラムからのビオチン化プロテインＡの分離を示す。図１３は、図１２のカラムからの試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールを示す：レーンＡ、ウサギ全血清（適用した画分）；レーンＢ、カラム溶出物；レーンＣ，緩衝液Ａ（ｐＨ４）により溶出したピーク；レーンＤ、緩衝液Ｃ（ｐＨ１０）により溶出したピーク；レーンＥ、ウサギ免疫グロブリンの市販調製物；レーンＦ、ビオチン化プロテインＡ標準物質。図１４は、例７に記載するように、吸着したヨード化アビジンを含有するマイクロタイタープレートからのビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼの分離に及ぼすｐＨの影響を示す。発明の詳細な説明本明細書において「アビジン型分子」という用語は、未変性の卵白糖タンパク質アビジン、脱グリコシル化型のアビジン、ストレプトミセス（Streptomyces）の選択された株（例えば、ストレプトミセス・アビジニイ（Streptomyces avidinii））により産生される細菌性ストレプトアビジン、端を切り取ったストレブトアビジン、および組換えアビジンとストレプトアビジン、ならびに、未変性、脱グリコシル化および組換えアビジンの誘導体、未変性の、組換えおよび端を切り取ったストレプトアビジンの誘導体［これらは、必須チロシン以外の部位で修飾されており、例えばＮ−アシルアビジン（例えば、Ｎ−アセチル、Ｎ−フタリルおよびＮ−スクシニルアビジン）であり、市販品エクストラビジン（Extr Avidin）（登録商標）およびニュートラライトアビジン（NeutraLiteAvidin）（登録商標）がある］を意味する。すべての型のアビジン型分子は、本発明により包含され、未変性のおよび組換えアビジンおよびストレプトアビジン、ならびに誘導体化分子（例えば、非グリコシル化アビジン、Ｎ−アシルアビジンおよび端を切り取ったストレプトアビジン）がある。これらの物質のいくつかは、市販されている（例えば、未変性のアビジンおよびストレプトアビジン、非グリコシル化アビジン、Ｎ−アシルアビジンおよび端を切り取ったストレプトアビジン）か、または公知の方法［アビジンとストレプトアビジンの調製についてはグリーン(Green)、１９９０：非グリコシル化アビジンの調製についてはヒラー（Hiller）ら，１９９０：ストレプトアビジンおよび端を切り取ったストレプトアビジンの調製についてはベイアー(Bay er)ら，１９９０を参照］により調製される。組換えアビジンとストレプトアビジンは、標準的組換えＤＮＡ技術［例えば、組換えアビジンについてはチャンドラとグレイ（Chandra and Gray）、１９９０、そして組換えストレプトアビジンについてはアルガラナ（Argarana）ら，１９８６に記載されている］により調製される。アビジン−ビオチン技術の応用法において、本発明の修飾アビジンとともに使用できる「ビオチン化リガンド」は、ビオチン化型の所望のリガンド（例えば、抗体、酵素、レクチンのようなタンパク質、または糖タンパク質、ガングリオシド、ヘパリン、多糖のような炭水化物および糖結合体、ＤＮＡおよびＲＮＡのような核酸、ファージ、ウイルス、細菌および他の細胞）であり、ここでリガンドは、ビオチンまたはその同族体、類似体または誘導体に共有結合している。多くのビオチン化リガンドは市販されているか、または標準的方法により調製される（例えば、ベイヤーとウィルチェック(Bayer and Wilchek)，１９９２ａを参照）。本発明の修飾アビジン型分子［主に、結合部位チロシン残基（図１を参照）の１つまたは両方のオルト位で修飾されているアビジンおよびストレプトアビジン］は、ビオチン残基との可逆性反応に適しており、従ってアビジン−ビオチン技術の重要な新しい手段である。これらの修飾アビジン型分子は、固定化したオルト−フェノール−修飾アビジン型分子から、または溶液中のビオチン化リガンドとともに修飾アビジンを含む可溶性複合体から、穏和な条件下で、遊離ビオチンおよび／またはビオチン化リガンド（例えば、ビオチン化酵素および他のビオチン化した生物活性物質）を除去することを可能にする。このような穏和な条件は、過剰濃度のビオチン、高ｐＨ（例えば、ｐＨ１０）、比較的低い非変性濃度の尿素、グアニジンまたはチオサン酸塩、加熱および／またはこれらの組合せからなる。好適な実施態様において、固定化修飾アビジンからのビオチンまたはビオチン化残基の除去は、ｐＨを変化（例えばｐＨ１０まで上げる）させて行われる。別の好適な実施態様において、除去は、過剰のビオチン（例えば、０．６mMのビオチン溶液）を修飾アビジンカラムに通して、ビオチン化成分を置換させることにより行われる。本発明の修飾アビジン型分子は、アビジン−ビオチン技術を用いる任意の方法、特にアビジン−ビオチン結合の可逆性が有利である方法、例えば親和性リガンドの除去のための親和性クロマトグラフィーに使用する可逆性固定化カラムとして；固定化酵素を除去して可逆性酵素反応槽を作成するために；アビジンブリッジを介して架橋したビオチン化物質からなる溶液中の可溶性生物学的物質を破壊するために；高親和性ファージライブラリーを産生するために；および、細胞分離に使用して、こうして認識成分またはリガンド（例えば、抗体）とともに生存または完全な細胞の樹脂からの分離を促進するか、またはアビジンブリッジを解離させてそのような細胞の凝集に対抗するための、使用に適している。本発明はまた、固体支持体またはマトリックスに結合した本発明の修飾アビジン型分子に関する。当該分野で使用される任意の固体支持体、例えば樹脂、マイクロタイタープレート、ガラスビーズ、磁性ビーズなど（但し、これらに限定されない）が適している。固体支持体へのアビジンの結合は、共有結合または非共有結合でもよく、標準的方法により行われる。１つの好適な実施態様において、修飾アビジン型分子は、樹脂（好ましくはセファロース）に固定化され、こうして得られたセファロース−ニトロ−アビジン樹脂は、単離操作のためのカラムに注がれる（ベイヤーとウィルチェック(Bayer and Wilchek)，１９９２ｂ）。本明細書の説明において「アビジン−セファロースカラム」という用語は、セファロース樹脂に固定化された本発明の修飾アビジン型分子を含有するカラムに使用されるであろう。これらのカラムは、特に分離操作に適している。本発明の別の実施態様において、修飾アビジン型分子はマイクロタイタープレートのウェルに結合される。公知の親和性クロマトグラフィー法（これは、すべての親和性方法の原型である）では、結合リガンド（例えば、抗体または受容体）は固体支持体（例えばセファロース）に結合される。これは、リガンドをビオチン化し、次にアビジンまたはストレプトアビジンブリッジを介してセファロースに固定化することにより行われる。得られるアビジン−セファロースカラムは、次にビオチン化リガンドと反応する物質を単離および精製するためのハンドルとして使用される。多くの場合、リガンド自身（これは、本質的に貴重であるかまたはこわれやすい）を回収するためにまたは別の用途のためにカラムを復元するために、アビジン−セファロースカラムからビオチン化リガンドを分離することが好ましい。これは、本発明の修飾アビジン型分子を含有するカラムを使用して、ビオチン化リガンドを固定化し、これを、アルカリ性溶液（例えば、緩衝液Ｃ、ｐＨ１０）を添加するか、または過剰のビオチン（例えば、任意のｐＨで０．６mM）を添加してカラムから分離することにより行われる。次に、復元したアビジンカラムに、新しいタイプのビオチン化リガンドまたは新鮮なバッチの同じビオチン化リガンドを添加することができる。アビジン−ビオチン系は、種々の方法により細胞を分離するのに使用されている。１つのアプローチは、細胞表面分子（例えば、表面抗原）を認識するビオチン化リガンド（例えば、抗体）を使用する。ビオチン化リガンドは、カラムまたは他のタイプのマトリックス（例えば、磁性ビーズ）に、アビジンまたはストレプトアビジンブリッジを介して結合させることができる。あるいは混合した細胞集団の懸濁物を、ビオチン化リガンドで処理し、反応性表面分子を有する細胞を、アビジン溶液を使用して凝集させることができる。通常このアプローチは、混合集団から特定の集団の細胞を選択的に「除去」するためにのみ使用されている。アビジンによりマトリックスに結合または凝集されると、細胞の完全性または生存活性を保持する方法では、関与する親和性反応（すなわち、ビオチン化リガンドと表面分子の間、およびアビジンとビオチンの間）は容易に破壊されない。例えば、抗体と抗原の間の反応の破壊には通常、多くの細胞に対して障害性の条件（例えば、低いｐＨ）を必要とする。しかし非反応性の細胞は、回収することができる。結合した細胞集団を回収するために、本発明の修飾アビジン型分子を含有するカラムを使用することができ、ビオチン含有溶液［例えば、等張条件（例えば、ｐＨ７の０．１５ＭのＮａＣｌ）下の０．６mMのビオチン、または適切な組織培養培地中の過剰濃度のビオチン］を使用して、カラムから細胞（ビオチン化リガンドとともに）を分離するか、または凝集した細胞は同じビオチン含有溶液を使用して分散させることができる。固定化酵素は、主に食品、薬品および化学工業の分野で使用される（カチャルスキー−カツジール(Katchalsky-Katzir)，１９９３）。酵素反応槽系で使用する場合の固定化酵素の１つの問題は、酵素またはそのマトリックスは一種のエージング反応を受けることである。例えば、酵素は有名な高感受性タンパク質であり、一定の半減期を有し、使用または保存により時間とともに不活性化されていく。従って工業的使用には、結合酵素が使用できなくなった時固定化マトリックスが再使用することが有利である。従って、本発明の修飾アビジン型分子を含有するカラムに結合したビオチン化酵素からなる酵素反応槽は、アルカリ性溶液（例えば、緩衝液Ｃ、ｐＨ１０）を添加するか、または過剰のビオチン（例えば、任意のｐＨで０．６mM）を添加することにより、不活性化ビオチン化酵素を除去ことにより復元することができる。次に、新鮮なバッチのビオチン化酵素を、復元した修飾アビジンカラムに加えることができる。同様に、細胞を修飾アビジンカラムに固定化し、細胞ベースの反応槽系として使用することができる。ビオチン含有溶液［例えば、等張条件（例えば、ｐＨ７の０．１５ＭのＮａＣｌ）下の０．６mMのビオチン、または適切な組織培養培地中の過剰濃度のビオチン］を使用して細胞を分離させ、こうして修飾アビジンカラムを復元することができる。ファージライブラリー法では、ビオチン化リガンド（例えば、抗体、受容体）は、マイクロタイタープレートのような固体支持体に結合される。これはしばしば、リガンドのビオチン化、および以後のストレプトアビジンブリッジを介するプレートへの固定化により行われる。次に繊維状バクテリオファージ（例えば、Ｍ１３）を加え、固定化リガンドと反応できる表面ペプチドを含有するファージは、プレートに結合する。非特異的に結合したファージは、低濃度の中性界面活性剤（例えばツイーン２０）で洗浄して除去する。次に、結合しているファージは、ｐＨを下げて（これは、固定化リガンドとファージ上の表面ペプチドの反応を破壊する）プレートから分離される。このアプローチの１つの可能性のある問題は、あるファージは非常に高い親和性反応によりプレートに結合することがあることである。これらのファージは、ビオチン化リガンドに対する高親和性ペプチドのために特に興味深い。すなわち、本発明の修飾アビジンまたはストレプトアビジンを使用して、高親和性ファージは、アルカリ性溶液（例えば、緩衝液Ｃ、ｐＨ１０）を加えるかまたは過剰のビオチン（例えば、任意のｐＨの０．６mM ）を加えて、ビオチン化リガンドとともにマイクロタイタープレートから分離することができる。ファージに結合した回収された高親和性ペプチドは次に、細菌に感染させて、および確立されたファージライブラリー法（例えば、スコット(S cott)，１９９２を参照）により、増やすことができる。遺伝子増加とＤＮＡ単離は、ビオチン化ＤＮＡを本発明の修飾アビジン型分子または修飾アビジンカラムと、公知の方法により複合体を形成させることにより行われる（ウィルチェックとベイヤー(Wilchek and Bayer)，１９８８を参照）。複合体からビオチン化ＤＮＡを分離するために、アビジンを消化するのにこれまでタンパク質分解性酵素（例えば、プロテイナーゼＫ）が使用されてきた。本発明の修飾アビジン型分子を使用することにより、ビオチン化ＤＮＡは、アルカリ性溶液（例えば、緩衝液Ｃ、ｐＨ１０）を用いるかまたは過剰のビオチン（例えば、任意のｐＨの０．６mM）を加えることにより、分離できる。バイオセンサーは、特異性を付与する生物学的感知成分および生物学的イベントを、さらに処理または定量可能な応答に変換する変換機能（すなわち、電気化学的、光学的、熱量的または音響的）からなる。生物学的リガンドは、触媒性（例えば、酵素、細菌細胞、組織）または非触媒性（例えば、抗体、受容体、ＤＮＡ）のいずれかでよい。そのような検出器は、感知表面への反応性成分の１つの固定化に依存し、完成したバイオセンサー装置の得られる成分は非常に高価である。アビジン−ビオチン系はこれまで、そのようなリガンドをバイオセンサーに固定化するための一般的な方法として使用されてきた。未変性のアビジンまたはストレプトアビジンを本発明の修飾アビジンで置換する能力は、コストおよび簡便性で有利な可逆性タイプのバイオセンサーを提供するであろう。従って、ビオチン化リガンドは、修飾アビジンまたはストレプトアビジンを介してバイオセンサーに固定化され、必要な場合は、ビオチン化リガンドはアルカリ性溶液（例えば、緩衝液Ｃ、ｐＨ１０）を用いるかまたは過剰のビオチン（例えば、所望のｐＨ、イオン強度などの条件の０．６mMビオチン）を加えることにより、分離できる。次にバイオセンサーの修飾アビジン型分子は、同じかまたは異なるビオチン化リガンドで充填することができる。本発明はまた、アビジン−ビオチン技術を用いるアビジン−カラムまたはビオチン化リガンドのいずれかの回収方法であって、（ｉ）樹脂に結合した本発明の修飾アビジン型分子を含有するカラムにビオチン化リガンドを固定化し；（ii）こうして固定化されたビオチン化リガンドにより、所望の反応または分離操作を実施し；(iii)条件を変更して、固定化された修飾アビジンカラムからビオチン化リガンドを除去し；そして（iv）さらなる使用のためにビオチン化リガンドおよび／または修飾アビジンカラムを回収する、ことからなる上記方法を提供する。ビオチン化リガンドは、ｐＨの上昇、加熱、過剰濃度のビオチン、または低濃度の尿素、グアニジンまたはチオシアン酸の添加、および／またはこれらの組合せにより、固定化された修飾アビジンカラムから除去される。好適な実施態様において、ビオチン化リガンドは、ｐＨを１０に上げるかまたは０．６mMビオチンを添加することにより、固定化修飾アビジンカラムから除去される。本発明を以下の非限定例により例示する。例材料と方法（ｉ）材料。卵白アビジンは、ＳＴＣラボ（STC labs）（ウィニペグ（Winnipeg ）、カナダ）またはベロヴォケミカルズ（Belovo Chemicals）（バストン（Bast ogne）、ベルギー）から提供された。ストレプトアビジンは、既に記載されているように（ベイアー(Bayer)ら，１９９０）、改良されたイミノビオチン−セファロースカラムを使用して、ストレプトミセス・アビジニイ(Streptomyces avid inii)の培養濾液から精製した。セファロース４ＢＣＬはファルマシア(Pharma cia)（ウプサラ(Uppsala)、スエーデン）から入手した。テトラニトロメタンは、フルカ(Fluka)から得た。プロテインＡおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）（セントルイス、ミズーリ州、米国）から得た。（ii）緩衝液：緩衝液Ａ：５０mMクエン酸−リン酸、ｐＨ３〜６；緩衝液Ｂ、５０mMトリス−塩酸、ｐＨ７〜９；緩衝液Ｃ、５０mM炭酸ナトリウム−ＨＣｌ、ｐＨ１０。（iii）ビオチン化法：例で使用されるタンパク質および酵素は、既に記載されているように（ベイヤーとウィルチェック(Bayer and Wilchek)，１９９０）、ビオチニルＮ−ヒドロキシスクシンイミジル活性ステル（ＢＮＨＳ）を用いる通常のビオチン化法によりビオチン化した。（iv）アビジンおよびストレプトアビジンのセファロースへの固定化は、既に記載されているように（コーンとウィルチェック（Kohn and Wilchek），１９８４）、臭化シアン法により行った。（ｖ）酵素測定法（ａ）西洋ワサビペルオキシダーゼ活性ペルオキシダーゼ活性は、２，２’ −アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を基質として使用して測定した。基質溶液は、緩衝液Ａ（ｐＨ５）１０ml当たり２．５mgの基質を含み、ここに１０μｌの３０％過酸化水素を加えた。色の生成を４２０nmで測定した。（ｂ）アルカリ性ホスファターゼ活性は、ｐ−ニトロフェニルホスフェートを基質として使用して測定した。基質溶液は、０．５mM ＭｇＣｌ₂ を含有する１Ｍのジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）１０ml当たり１０mgの基質を含有した。色の生成を４１０nmで測定した。（vi）タンパク質：タンパク質は、アビジンまたはストレプトアビジン（適宜）またはＢＳＡを標準物質として用いて、ブラッドフォード（Bradford）法により測定した。例１：ニトロ−アビジン、ニトロ−ストレプトアビジンの調製、およびセファロースへのこれらの固定化（ｉ）ニトロ−アビジンの調製：卵白アビジンの試料［１mlの５０mMトリス緩衝液（ｐＨ８またはそれ以上）中５mg］を、異なる濃度のテトラニトロメタン［ＴＮＭ）（約５〜５０mMに対応する０．５〜５μｌ］で、２３℃で３０分間処理した。試料を、１ＭＮａＣｌで１回、そして２回蒸留水で２回、一晩透析した。試料中の修飾チロシンの量は、アミノ酸解析により測定した。図２に示すように、修飾法の条件下で、２０mM濃度以上の試薬を使用して最大レベル（約７０％）の修飾が達成され、すなわち、平均してアビジンテトラマーの４つのサブユニットのうち約３つが修飾されているようであった。以後の実験で、使用したニトロ −アビジンは、２μｌを用いて調製した。（ii）ニトロ−ストレプトアビジンの調製：ストレプトアビジン分子のサブユニット当たりのチロシン残基の数が多いため、ストレプトアビジン（２．５mg／ml 緩衝液）を、より高レベルのテトラニトロメタン（約５０mMに対応する６μｌ）を用いてニトロ化した。（iii）セファロースに固定化されたニトロ−アビジンとニトロ−ストレプトアビジンの調製（ａ）セファロース４ＢＣＬの臭化シアン活性化水を切ったセファロース４ＢＣＬの４０ｇをまず水で洗浄し、次に３０％アセトン(v／v)そして最後に６０％アセトン(v／v)で洗浄した。樹脂を６mlの６０％アセトンに再懸濁し、０〜４℃に冷却した。磁性攪拌棒で攪拌しながら、６mlのＣＮＢｒ溶液（１０ｇ／１００mlアセトン）を加え、次に同量のトリエチルアミン（ＴＥＡ）溶液（１５．２ｇ／１００mlアセトン）を１〜２分間で滴下して加えた。活性化した樹脂を濾過し、０．１Ｍ重炭酸ナトリウムで洗浄した。（ｂ）セファロースへの固定化活性化セファロース４ＢＣＬへのニトロ− アビジンとニトロ−ストレプトアビジンの結合は、０．１Ｍ重炭酸溶液中で４℃ で１６時間行った。（iv）アビジン−セファロースおよびストレプトアビジン−セファロース樹脂のニトロ化上記（iii）（ｂ）で記載したように（しかし非修飾アビジンを使用して）調製した４mlのアビジン−セファロース樹脂（１．４mgアビジン／mlセファロース）を、５０mMトリス緩衝液（ｐＨ８）で洗浄し、６μl のＴＮＭで２３ ℃で５０分間処理した。ニトロ修飾した樹脂をまず１ＭＮａＣｌ、次に２回蒸留水で、そして最後にＰＢＳで洗浄した。例２．ニトロ−アビジンへのビオチン化タンパク質の結合（ｉ）ニトロ−アビジンへのビオチン化タンパク質の結合をいくつかの方法で試験した。１つの実験では、例１(iii)の臭化シアン法により、セファロース１ml 当たり約０．５mgのアビジンを使用して、ニトロ−アビジンをセファロースに固定化し、緩衝液Ａ、Ｂ、またはＣ（１００μｌ）中のビオチン化ＢＳＡの試料を、１００μl のニトロ−アビジンセファロース樹脂に適用した。溶出画分をタンパク質について測定した。異なるｐＨ値での結合パーセントを、樹脂に適用したタンパク質の量から、溶出画分中のタンパク質の量を引いて求めた。図３に示すように、最適の結合はｐＨ４で起きた。より高いｐＨ（５〜８の間）では、結合のプラトーレベルが観察された。ｐＨ８より上では、結合は顕著に低下し、ｐＨ１０では結合は無視できるほどであった。（ii）マイクロタイタープレート測定法でビオチン化アルカリ性ホスファターゼ酵素を使用して、同様の結果が得られた（図４）。この実験では、例１（ｉ）に従って調製したニトロ−アビジンは、マイクロタイタープレートに吸着（１μg ニトロ−アビジン／１００μl リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）／ウェル）され、プレートを１％ＢＳＡ溶液でブロッキングし、ビオチン化アルカリ性ホスファターゼの試料を、異なるｐＨの緩衝液Ａ、Ｂ、およびＣ中で適用した（３７μ g ／０．１ml緩衝液／ウェル）。プレートを洗浄し、結合した酵素画分を、ｐ− ニトロフェニルホスフェートを基質として使用して前記方法ｖ（ｂ）に記載したように酵素測定法により比色法で測定した。（iii）同様のマイクロタイタープレート酵素測定法を使用して、ニトロ−アビジンの結合活性を、未変性の（非修飾）アビジンのそれと比較した。アビジンまたはニトロ−アビジン（１μｇ／１００μl ＰＢＳ／ウェル）でコーティングしたマイクロタイタープレートに、実験的に決定した最適の結合ｐＨ（すなわち、ｐＨ４）で異なる濃度（１５０μl の緩衝液Ａ中１０ng〜１μg）のビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼを入れた。プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ酵素活性を、ＡＢＴＳを基質として使用して前記方法ｖ（ａ）に記載したように測定した。図５に示すように、これらの条件下では、非修飾アビジンおよびニトロ −アビジンのビオチン結合性能は区別できなかった。例３．ニトロ−アビジンからのビオチン化タンパク質の分離（ｉ）ニトロ−アビジンカラムからのビオチンの分離についての好適な条件を決定するために、ビオチン化ＢＳＡ（１．５mg／１５０μl 緩衝液Ａ、ｐＨ４）を、例１（iv）のニトロ−アビジン−セファロース樹脂を含有するカラムに適用した。結合した物質を、上昇するｐＨの緩衝液Ａ、ＢおよびＣで洗浄し、溶出画分のタンパク質濃度を追跡した。図６に示すように、樹脂からビオチン化タンパク質を分離させるのにアルカリ性溶液（緩衝液Ｃ、ｐＨ１０）が必要であった。（ii）ニトロ−ストレプトアビジンを例１(iii)のセファロースに結合させて調製したニトロ−ストレプトアビジンカラムを使用して、同じ方法を使用して（但し、緩衝液Ｃ（ｐＨ１０）のみで洗浄）、同様の結果（図７）が得られた。（iii）同様の実験で、例１（iv）に従って調製したニトロ−アビジン−セファロース樹脂を含有するカラムから、ビオチン化ＢＳＡを分離するための手段として、遊離ビオチンとの競合を探索した。ビオチン化ＢＳＡ（１．５mg／１５０μ l 緩衝液Ａ、ｐＨ４）を、２mlのニトロ−アビジン−セファロースカラムに適用した。緩衝液Ａ（ｐＨ４）中の０．６mMビオチンを含有する溶液をカラムに通し、タンパク質濃度を追跡した。図８に示すように、ビオチニル−ＢＳＡの大部分は、緩衝液Ａ（ｐＨ４）中の０．６mMビオチンを使用して分離された。ビオチニル−ＢＳＡのビオチン誘導性溶出を、ｐＨ４〜１０の緩衝液Ａ、Ｂ、またはＣを使用して、ｐＨの関数として試験した。（iv）遊離ビオチンをｐＨ４から１０の範囲の異なるｐＨの緩衝液に溶解した以外は、例１（iv）に従って調製したニトロ−アビジン−セファロース樹脂で同じ条件下で、同様の実験を行った。図９に示すように、遊離ビオチンは試験した全ｐＨ範囲にわたって有効な溶出物であった。比較のために、ビオチンの非存在下のｐＨ１０での溶出を示す。例４．非修飾ビオチン結合部位のブロッキング記載した条件下では結合部位チロシンの部分的修飾しか達成できないため、非修飾部位は、ニトロ−アビジンの以後の適用において問題となる可能性がある。従って異なるレベルのニトロ−チロシンを含有する例１（ｉ）に従って調製したニトロ−アビジン試料（図２を参照）を、マイクロタイタープレートのウェルにコーティングした（１μg ／１００μl ＰＢＳ／ウェル）。同様の濃度の未変性の卵白アビジンを対照として使用した。ウェルを１％ＢＳＡでブロッキングし、吸着したタンパク質試料は、緩衝液Ａ（ｐＨ４）中の０．６mMビオチンを使用して過剰レベルの遊離ビオチンでブロッキングした。修飾された結合部位を占有したビオチンは、前記例３で記載したアルカリ性溶液（緩衝液Ｃ、ｐＨ１０）を使用して分離された。ブロッキングとアルカリ処理の後に、部分的にニトロ化されたアビジン試料のビオチン結合能を、ビオチン化ペルオキシダーゼ系を使用してマイクロタイタープレート中の酵素測定法により測定した（前記方法ｖ（ａ））。図１０に示すように、結合は修飾の程度に比例し、最大の結合は約６０％の修飾で起きた。例５．ニトロ−アビジンカラムの繰り返し使用例１ (iii)のセファロース−ニトロ−アビジン樹脂を含有するカラムの安定性を、ビオチン化タンパク質の繰り返し適用と溶出により試験した。ビオチン化ＢＳＡの同一試料（３００μg ／ml緩衝液Ａ、ｐＨ４）を、セファロース−ニトロ −アビジン樹脂の０．７５mlのカラムに適用した。カラムを緩衝液Ａ（ｐＨ４）で洗浄し、緩衝液Ｃ（ｐＨ１０）を使用して溶出した。この操作をさらに３回繰り返し、ブラッドフォード（Bradford）測定法によりタンパク質について画分を追跡した（図１１Ａ）。図１１Ｂに示すように、溶出した画分の蓄積は、サイクル毎にニトロ−アビジンカラムに結合し分離されるビオチン化タンパク質の基本的に同じレベルを与えた。例６．ビオチニル−プロテインＡ／ニトロ−アビジンカラム上のＩｇＧの精製普遍的な親和性樹脂としてのニトロ−アビジンカラムの性能を調べた。このアプローチでは、ビオチン化プロテインＡを、セファロースに結合させ、カラムに注ぎ、カラムを、ウサギの全血清から直接免疫グロブリンを精製するための免疫親和性カラムとして使用し、次にビオチン化プロテインＡをカラムから分離させた。例１（iv）に従って調製した０．５mgニトロ−アビジン／mlセファロースを含有する２mlのカラムに、４mlの緩衝液Ａ（ｐＨ４）中の１．８mgのプロテインＡを加えた。ウサギ全血清［０．１Ｍ緩衝液Ｂ（ｐＨ８）で４倍希釈したものを０．５ml］をカラムに適用した。カラムを同じ緩衝液で洗浄し、次に同じ緩衝液で１０mM濃度で洗浄した。結合した免疫グロブリンは、緩衝液Ａ（ｐＨ４）によりカラムから分離された。次に５０mM緩衝液Ｃ（ｐＨ１０）により、ビオチン化プロテインＡを除去した。結果を図１２に示す。次に種々のピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べ、これにより基本的に純粋な画分の予測されたタンパク質を示した（図１３）。精製した免疫グロブリンは、同等の画分の市販試料と同様に純粋であり、アルカリ処理によりカラムから溶出したビオチニルプロテインＡは同様に純粋であった。例７．ヨード化アビジンの調製とマイクロタイタープレートに吸着したヨード化アビジンへのビオチン化タンパク質の結合（Ｉ）ヨード化アビジンの調製０．５mlのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中の２mgのアビジンの試料を、１０μl のＫＩ溶液（３２mg／ml）と２００μl のクロラミンＴ（2mg／ml）で処理した。２３℃で３０分間インキュベート後、３００μl のメタ重亜硫酸ナトリウム（２mg／ml）を１分間加えた。１mlの１％ＫＩ溶液を添加して反応を停止させた。試料を２回蒸留水に対して透析した。（ii）ヨード化アビジンへのビオチン化ペルオキシダーゼの結合ヨード化アビジンをマイクロタイタープレートに吸着させ、プレートを１％ＢＳＡ溶液でブロッキングし、そしてビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼの試料を、異なるｐＨの緩衝液Ａ、Ｂ、およびＣ（３７μｇ／０．１ml緩衝液／ウェル）中で適用した。プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼの酵素活性を、ＡＢＴＳを基質として前記方法ｖ（ａ）中に記載したように測定した。図１４に示すように、最適の結合はｐＨ５で起きた。例８．アゾチロシン−アビジンおよびストレプトアビジンの調製０．３ＭのＨＣＬ（１０ml）に溶解したｐ−アルサニル酸（ｐ−アミノベンゼンアルソン酸）（１００mg）を、氷浴中でＮＡＮＯ₂（５mlの水中３５mg）で処理した。６分後、溶液をＮａＯＨでｐＨ５に調整し、直ちに使用した。得られたアゾアルサニル酸［０．１Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．４）中２mg］０．５mlを、アビジンの溶液［４．５mlの０．１Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．４）中５mg］に加え、室温で２時間反応を行った。反応の進行は分光光度計（λ_max ３４２nm）で追跡し、アゾアルサニル酸誘導体化アビジンを、ＰＢＳまたは５０mMのトリス緩衝液（ｐＨ８）に対して透析した。アゾ−チロシンストレプトアビジンを同様にして調製した。ｐ−アルサニル酸の代わりに他のｐ−アミノベンゼン誘導体［例えば、アントラニル酸（ｏ−アミノ安息香酸）、ｐ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノベンゼンリン酸およびスルファニル酸（ｐ−アミノベンゼンスルホン酸）］を使用して、対応するアゾ誘導体を得る。例９．アミノチロシン−アビジンおよびストレプトアビジンの調製ニトロ−アビジンまたはアゾチロシン−アビジン（１mlの５０mMトリス緩衝液（ｐＨ８）中２mg）を、２４倍モル過剰のＮＡ₂Ｓ₂Ｏ₄（４mlの同じ緩衝液中１．４mg）で処理した。反応は室温で１６時間行い、還元の程度は分光光度計で証明した（ニトロ−アビジンについてはλ_max４２８nm、アゾチロシン−アビジンについては３４２nmでの吸光度の低下）。タンパク質をＰＢＳに対して透析した。アミノチロシン−ストレプトアビジンを、１mgのニトロ−ストレプトアビジンと対応するモル過剰のＮＡ₂Ｓ₂Ｏ₄を使用して、同様の方法により産生した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者モラグ，エリィイスラエル国 64954 テル−アビブ，デビッドハメレチブールバード 25

Claims

【特許請求の範囲】１．（ｉ）未変性の卵白アビジン；(ii)組換えアビジン；(iii)脱グリコシル化型のアビジン；（iv）細菌性ストレプトアビジン；（ｖ）組換えストレプトアビジン；（vi）端を切り取ったストレプトアビジン；および(vii)必須のチロシン残基以外の部位で修飾された（ｉ）〜（vi）の誘導体、よりなる群から選択されるビオチン結合性修飾アビジン型分子であって、該ビオチン結合性修飾アビジン型分子において、ビオチン結合部位の必須のチロシン残基は、そのｐＫａが、対応する非修飾アビジン型分子中の非修飾チロシン残基のｐＫａに比較して低下しているように修飾されることを特徴とする、上記分子。２．ビオチン結合部位でのチロシンのｐＫａは、チロシン残基への１つまたはそれ以上の求電子基および／または求核基の付加により低下している、請求の範囲第１項に記載の修飾アビジン型分子。３．請求の範囲第２項に記載の修飾アビジン型分子であって、修飾された必須のチロシン残基は、式：［式中、Ｘ₁とＸ₂は、それぞれニトロ、ハロゲン、ＮＲ₁Ｒ₂および--Ｎ＝ＮＲ₃ （ここで、Ｒ₁とＲ₂は、それぞれ水素、Ｃ₁〜Ｃ₈アルキルおよびＣ₁〜Ｃ₆カルボキシアシルから選択され、Ｒ₃は、酸性の基により置換されたアリールである）から選択される基である］を有する、上記分子。４．Ｘ₁および／またはＸ₂は、ニトロ基である、請求の範囲第３項に記載の修飾アビジン型分子。５．ニトロ−チロシン未変性卵白アビジン。６．ニトロ−チロシン細菌性ストレプトアビジン。７．非修飾アビジン型分子を、非変性条件下でテトラニトロメタンと反応させることからなる、請求の範囲第４〜６項までのいずれか１項に記載のビオチン結合性ニトロ−チロシン修飾アビジン型分子の製造方法。８．Ｘ₁および／またはＸ₂は、ハロゲンである、請求の範囲第３項に記載の修飾アビジン型分子。９．ハロゲンはヨードである、請求の範囲第３項に記載の修飾アビジン型分子。 10．Ｘ₁および／またはＸ₂は、アゾ基である、請求の範囲第３項に記載の修飾アビジン型分子。 11．Ｘ₁および／またはＸ₂は、アミノ基である、請求の範囲第３項に記載の修飾アビジン型分子。 12．Ｘ₁および／またはＸ₂は、--Ｎ＝ＮＲ₃基（ここで、Ｒ₃は、カルボキシルまたは酸性の基からのアシル基により置換されたフェニルである）である、請求の範囲第３項に記載の修飾アビジン型分子。 13．固体支持体に結合した、請求の範囲第１〜６項、および第８項〜１２項までのいずれか１項に記載の修飾アビジン型分子。 14．固体支持体は、樹脂、マイクロタイタープレート、ガラスビーズまたは磁性ビーズである、請求の範囲第１３項に記載の修飾アビジン型分子。 15．固体支持体は樹脂である。請求の範囲第１３項に記載の修飾アビジン型分子。 16．樹脂はセファロースである、請求の範囲第１３項に記載の修飾アビジン型分子。 17．樹脂に結合した請求の範囲第１項に記載の修飾アビジン型分子を含有するビオチン化リガンドの固定化のためのカラム。 18．修飾アビジン型分子は、ニトロ−チロシン未変性卵白アビジンであり、樹脂はセファロースである、請求の範囲第１７項に記載のカラム。 19．修飾アビジン型分子は、ニトロ−チロシン細菌性ストレプトアビジンであり、樹脂はセファロースである、請求の範囲第１７項に記載のカラム。 20．アビジン−ビオチン技術を用いる方法における、請求の範囲第１項〜６項、第８項〜１２項および第１４項〜１６項のいずれか１項に記載のビオチン結合性修飾アビジン型分子、または請求の範囲第１７項〜１９項のいずれか１項に記載のカラム、の使用。 21．細胞の固定化と分離ための、ＤＮＡの捕捉と分離のための、ビオチン化酵素の固定化と分離ための、ファージライブラリーの製造ための、およびバイオセンサーの可逆性マトリックスとしての、細胞分離における親和性クロマトグラフィー中の修飾アビジン型分子またはカラムの、請求の範囲第２０項に記載の使用。 22．アビジン−ビオチン技術を用いる方法におけるアビジン−カラムまたはビオチン化リガンドの回収方法であって、（ｉ）樹脂に結合した請求の範囲第１項記載の修飾アビジン型分子を含有するカラムにビオチン化リガンドを固定化し；（ii）こうして固定化されたビオチン化リガンドにより所望の反応または分離操作を実施し；（iii）条件を変更して、固定化された修飾アビジンカラムからビオチン化リガンドを除去し；そして（iv）さらなる使用のためにビオチン化リガンドおよび／または修飾アビジンカラムを回収する、ことからなる上記方法。 23．ｐＨの上昇、加熱、過剰濃度のビオチン、または低濃度の尿素、グアニジンまたはチオシアン酸の添加、および／またはこれらの組合せにより、固定化された修飾アビジンカラムから、ビオチン化リガンドは除去される、請求の範囲第２２項に記載の方法。 24．ｐＨを１０に上げることにより、ビオチン化リガンドは固定化修飾アビジンカラムから除去される、請求の範囲第２３項に記載の方法。 25．０．６mMのビオチンを添加することにより、ビオチン化リガンドは固定化修飾アビジンカラムから除去される、請求の範囲第２３項に記載の方法。 26．請求の範囲第２２項〜２５項のいずれか１項に記載の方法であって、修飾アビジン型分子は、式［式中、Ｘ₁および／またはＸ₂は、それぞれニトロ、ハロゲン、ＮＲ₁Ｒ₂および --Ｎ＝ＮＲ₃（ここで、Ｒ₁とＲ₂は、それぞれ水素、Ｃ₁〜Ｃ₈アルキルおよびＣ₁ 〜Ｃ₆カルキシルアシルから選択され、Ｒ₃は、酸性の基により置換されたアリールである）から選択される基である］の修飾された必須チロシン残基を有する、上記方法。 27．修飾アビジン型分子はニトロ−チロシン未変性卵白アビジンである、請求の範囲第２２項〜２５項のいずれか１項に記載の方法。 28．修飾アビジン型分子はニトロ−チロシン細菌性ストレプトアビジンである、請求の範囲第２２項〜２５項のいずれか１項に記載の方法。