JP2002136294A - ヒトケモカインポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトケモカインポリペプチド、およびそのよ
うなケモカインポリペプチドをコードするＤＮＡ(ＲＮ
Ａ)、およびそのようなポリペプチドを組換え技術によ
り製造する方法を提供する。 【解決手段】 そのようなケモカインポリペプチドを、
白血病、腫瘍、慢性感染、自己免疫疾患、線維症障害、
創傷治癒および乾癬の処置に利用する方法もまた開示す
る。そのようなケモカインポリペプチドに対するアンタ
ゴニスト、並びに慢性関節リウマチ、自己免疫疾患、お
よび慢性の炎症性疾患、および感染症、アレルギー反
応、プロスタグランジンとは無関係の発熱、骨髄不全を
処置するための治療法としての、それらの使用もまた開
示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、新たに同定されたポリヌクレオ
チド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされる
ポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドの製造に関する。とりわけ、
本発明のポリペプチドは、時として以下で、「Ｃkβ−
４」および「Ｃkβ−１０」と呼ばれ、「ケモカイン(ch
emokine)ポリペプチド」と総称される、ヒトケモカイン
ベータ−４およびヒトケモカインベータ−１０である。
本発明はまた、そのようなポリペプチドの作用を阻害す
ることにも関する。

【０００２】ケモカインは、構造上および機能上関係の
ある小さな分泌サイトカインの、出現する(emerging)ス
ーパーファミリーである。ケモカインは全て、アミノ酸
レベルで２５〜７５％の相同性を示し、また本発明のポ
リペプチドがそうであるように、空間的に保存されたシ
ステイン残基を含む。好中球を活性化するペプチド (Ｎ
ＡＰ)／ＩＬ−８ファミリーとしてもまた知られてい
る、「Ｃ−Ｘ−Ｃ分枝(ブランチ)」(保存されたモチー
フにおける最初の２つのシステインの位置による)のメ
ンバーは、主に好中球(例えば、ＩＬ−８およびＮＡＰ
−２)に対する作用によって、早期炎症性(pro-inflamma
tory)活性を発揮するが、「Ｃ−Ｃ分枝(ブランチ)」フ
ァミリーのメンバーは、ある単核細胞を誘引するらし
い。「Ｃ−Ｃ分枝(ブランチ)」のメンバーには、ＰＦ
４、ＭＩＰ、ＭＣＰ、および本発明のケモカインポリペ
プチドが含まれる。

【０００３】多くの生物学的活性が、このケモカインフ
ァミリーに属するものとされている。マクロファージ炎
症性タンパク質１αおよび１βは、異なったリンパ球集
団(populations)および単球に対して走化性である(Ｓch
all,Ｔ.Ｊ.、Ｃytokine、３：１６５（１９９１）)が、
ＭＣＰ−１は、特異的な単球化学誘引物質として記載さ
れている(Ｍatsushima,Ｋ.ら、Ｊ.Ｅxp.Ｍed.、１６
９：１４８５（１９８９）)。このケモカインファミリ
ーの共通機能は、細胞の異なったセット、例えば、免疫
細胞(白血球)および線維芽細胞の走化性遊走を刺激する
能力である。これらのケモカインはまた、このファミリ
ーにおける、ある細胞を活性化することもできる。

【０００４】ケモカインに応答する免疫細胞は、莫大な
数のインビボにおける機能を有することから、そのよう
なケモカインによる調節が、疾患の処置において重要な
分野である。

【０００５】例えば、好酸球は、寄生虫を破壊して、寄
生虫感染を減少させる。好酸球はまた、呼吸器系の気道
における慢性炎症の原因でもある。マクロファージに
は、脊椎動物における腫瘍形成を抑える役目がある。さ
らに、好塩基球は、アレルギー性炎症において重要な役
割を担い得るヒタミンを放出する。従って、そのような
細胞を助長する、また阻害することは、広い治療利用を
有する。

【０００６】本発明の一態様により、Ｃkβ−４、およ
びＣkβ−１０である新規ポリペプチド、さらにはま
た、そのフラグメント、アナログおよび誘導体を提供す
る。本発明のポリペプチドは、ヒト起源である。

【０００７】本発明の別の態様により、そのようなポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたは
ＲＮＡ)を提供する。

【０００８】本発明のまたさらなる態様により、そのよ
うなポリペプチドを組換え技術により製造する方法を提
供する。

【０００９】本発明のまたさらなる態様により、そのよ
うなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを、治療目的に、例えば、固
体(solid)腫瘍、慢性感染、自己免疫疾患、乾癬、喘
息、アレルギーを処置するために、造血を調節するため
に、また創傷治癒を促進するために利用する方法を提供
する。

【００１０】本発明のまたさらなる態様により、そのよ
うなポリペプチドに対する抗体を提供する。

【００１１】本発明のまた別の態様により、例えば、自
己免疫疾患、慢性炎症および感染症、ヒスタミンにより
媒介されるアレルギー反応、プロスタグランジンとは無
関係の発熱、骨髄不全、珪肺症、サルコイドーシス、過
エオシン好性症候群および肺炎症の処置において、その
ようなポリペプチドの作用を阻害するために使用するこ
とができる、そのようなポリペプチドに対するアンタゴ
ニスト／インヒビターを提供する。

【００１２】本発明のこれらの態様および他の態様は、
本明細書中の教示から当業者に明らかであろう。

【００１３】以下の図面は、本発明の態様を説明するも
のであって、請求の範囲により包含される本発明の範囲
を限定しようとするものではない。第１図は、Ｃkβ−
４のcＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示
す。最初の２４個のアミノ酸はＣkβ−４の推定リーダ
ー配列を示すことから、推定される成熟ポリペプチドは
７２個のアミノ酸を含んでなる。アミノ酸に関する標準
的な１文字略号を使用する。第２図は、Ｃkβ−１０のc
ＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。最
初の２３個のアミノ酸はＣkβ−１０の推定されるリー
ダー配列を示すことから、推定される成熟ポリペプチド
は７５個のアミノ酸を含んでなる。アミノ酸に関する標
準的な１文字略号を使用する。第３図は、Ｃkβ−４と
エオタキシン(eotaxin)の成熟ペプチド(下段)との間の
アミノ酸配列の相同性を示す。第４図は、Ｃkβ−１０
(上段)とヒトＭＣＰ−３(下段)との間のアミノ酸配列の
相同性を示す。

【００１４】本発明の一態様により、第１図の推定アミ
ノ酸配列を有する成熟Ｃkβ−４ポリペプチド、または
１９９４年７月２９日にＡＴＣＣ寄託番号第７５８４８
号として寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードさ
れる成熟ポリペプチド、および第２図の推定アミノ酸配
列を有する成熟Ｃkβ−１０ポリペプチド、または１９
９４年７月２９日にＡＴＣＣ寄託番号第７５８４９号と
して寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる
成熟ポリペプチドをコードする、単離された核酸(ポリ
ヌクレオチド)を提供する。

【００１５】Ｃkβ−４をコードするポリヌクレオチド
は、ヒト胆嚢から得られたcＤＮＡライブラリー中で発
見された。Ｃkβ−４は、構造的上、ケモカインファミ
リーに関係がある。それは、１１６個のアミノ酸残基の
タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム
を含み、このうち、最初の約２４個のアミノ酸残基は推
定されるリーダー配列であることから、成熟タンパク質
は９２個のアミノ酸を含んでなる。そのタンパク質は、
エオタキシンに対し、コード配列全体にわたり、２０％
の同一性および３７％の類似性をもって、最も高い程度
の相同性を示す。ケモカインにおける４つの空間的に保
存されたシステイン残基が、本発明のポリペプチドにお
いて見い出されることもまた重要である。

【００１６】Ｃkβ−１０をコードするポリヌクレオチ
ドは、９週の初期ヒト組織から得られたcＤＮＡライブ
ラリー中で発見された。Ｃkβ−１０は、構造的上、ケ
モカインファミリーに関係がある。それは、９８個のア
ミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディ
ングフレームを含み、このうち、最初の約２３個のアミ
ノ酸残基は推定されるリーダー配列であることから、成
熟タンパク質は７５個のアミノ酸を含んでなる。そのタ
ンパク質は、ＭＣＰ−３に対し、コード配列全体にわた
り、６５％の同一性および７７％の類似性をもって、最
も高い程度の相同性を示す。

【００１７】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該
ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖で
あるなら、コード鎖または非コード(アンチ−センス)鎖
であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列
は、第１図および第２図に示すコード配列または寄託さ
れたクローンのコード配列と同じであってよく、あるい
は遺伝コードの重複または縮重の結果として、第１図お
よび第２図のＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡと同じ成
熟ポリペプチドをコードする異なったコード配列であっ
てもよい。

【００１８】第１図および第２図の成熟ポリペプチドま
たは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドには、以下のもの
が含まれ得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成
熟ポリペプチドのコード配列、およびリーダーもしくは
分泌配列またはプロタンパク質配列といったような付加
的コード配列；成熟ポリペプチドのコード配列(また場
合により、付加的コード配列)、および成熟ポリペプチ
ドのコード配列のイントロンまたは非コード配列５'お
よび／または３'といったような非コード配列。

【００１９】従って、「ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコード配
列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付
加的コードおよび／または非コード配列が含まれるポリ
ヌクレオチドを包含する。

【００２０】本発明はさらに、第１図および第２図の推
定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託された
クローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドの
フラグメント、アナログおよび誘導体をコードする、上
記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオ
チドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するア
レル変異体またはポリヌクレオチドの天然には存在しな
い変異体であり得る。

【００２１】従って、本発明には、第１図および第２図
に示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクロ
ーンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド、さらにはまた、その
ようなポリヌクレオチドの変異体が含まれ、これらの変
異体は、第１図および第２図のポリペプチドまたは寄託
されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプ
チドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードす
る。そのようなヌクレオチド変異体には、欠失変異体、
置換変異体並びに付加および挿入変異体が含まれる。

【００２２】先に示したように、該ポリヌクレオチド
は、第１図および第２図に示すコード配列の天然に存在
するアレル変異体または寄託されたクローンのコード配
列の天然に存在するアレル変異体であるコード配列を有
し得る。当業界で知られているように、アレル変異体
は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失ま
たは付加を有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であ
り、これは、コードされるポリペプチドの機能を実質的
には変えない。

【００２３】本発明にはまた、成熟ポリペプチドのコー
ド配列が、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分
泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞からの
ポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機
能するリーダー配列に、同じ読み枠内で融合し得るポリ
ヌクレオチドも含まれる。リーダー配列を有するポリペ
プチドがプレタンパク質であり、また宿主細胞により切
断されて、成熟型のポリペプチドを形成したリーダー配
列を有することがある。該ポリヌクレオチドはまた、付
加的５'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質であるプ
ロタンパク質もコードし得る。プロ配列を有する成熟タ
ンパク質がプロタンパク質であり、また不活性型のタン
パク質である。プロ配列が一度切断されると、活性成熟
タンパク質が残る。

【００２４】従って、例えば、本発明のポリヌクレオチ
ドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパ
ク質、またはプロ配列およびプレ配列(リーダー配列)の
両方を有するタンパク質をコードし得る。

【００２５】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内
で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合に
は、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリ
ペプチドの精製を提供するための、pＱＥ−９ベクター
により与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)であっ
てよく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯ
Ｓ−７細胞を使用する場合には、そのマーカー配列は、
赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは、イ
ンフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピ
トープに対応する(Ｗilson,Ｉ.ら、Ｃell、３７：７６
７（１９８４）)。

【００２６】本発明はさらに、配列間に少なくとも５０
％、また好ましくは７０％の同一性がある場合に、上記
の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポ
リヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド
に関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェ
ント条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、
また好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合に
のみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを
意味する。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチド
にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、第１図およ
び第２図のcＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡによりコー
ドされる成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能または活
性を実質的には保有するポリペプチドをコードする。

【００２７】本明細書中で言う寄託は、特許手続上の微
生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の
下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者
への便宜として与えられるものであって、寄託が３５
Ｕ.Ｓ.Ｃ. §１１２下に要求されることを承認するもの
ではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチ
ドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリ
ペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成し
て、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際は
いつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用
し、または販売するには、実施許諾が要求され得、また
そのような実施許諾は、ここでは付与されない。

【００２８】本発明はさらに、第１図および第２図の推
定アミノ酸配列を有する、または寄託されたcＤＮＡに
よりコードされるアミノ酸配列を有するケモカインポリ
ペプチド、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフ
ラグメント、アナログおよび誘導体に関する。

【００２９】第１図および第２図のポリペプチドまたは
寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドを
示す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナ
ログ」という用語は、そのようなポリペプチドと実質的
に同じ生物学的機能または活性を保有するポリペプチド
を意味する。従って、アナログには、プロプロテイン部
分を切断することにより活性化して、活性な成熟ポリペ
プチドを製造することができるプロプロテインが含まれ
る。

【００３０】本発明のケモカインポリペプチドは、組換
えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプ
チド、好ましくは組換ポリペプチドであってよい。

【００３１】第１図および第２図のポリペプチドまたは
寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドの
フラグメント、誘導体またはアナログは、（i）１つま
たはそれ以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ
酸残基(好ましくは、同型アミノ酸残基)で置換されてお
り、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによ
りコードされるものであってもよく、またはコードされ
たものでなくてもよいもの、（ii）１つまたはそれ以上
のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（ii
i）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増
加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のよ
うな、他の化合物と融合しているもの、または（iv）リ
ーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精
製に使用される配列、またはプロプロテイン配列といっ
たような、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合し
ているものであり得る。そのようなフラグメント、誘導
体およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範
囲内であると思われる。

【００３２】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ま
しくは、均一となるまで精製される。

【００３３】「単離された」という用語は、物質がその
元の環境(例えば、それが天然に存在するなら、天然の
環境)から除去されていることを意味する。例えば、生
きている動物にある天然に存在するポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは単離されていないが、天然の系にお
ける共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じ
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されてい
る。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分とな
り得、および／またはそのようなポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは組成物の部分となり得、またそのよう
なベクターまたは組成物はその天然の環境の部分ではな
いという点で、なお単離されている。

【００３４】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
が含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作
された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え
技術による製造にも関する。

【００３５】宿主細胞は、例えば、クローニングベクタ
ーまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺
伝的に操作される(トランスデュースされ、またはトラ
ンスフォームされ、またはトランスフェクトされる)。
該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、フ
ァージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロ
モーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、
またはＣkβ−４およびＣkβ−１０遺伝子を増幅するの
に適するよう改変された従来の栄養培地で培養すること
ができる。温度、pＨ等といったような培養条件は、発
現用に選択された宿主細胞で先に使用した培養条件であ
って、当業者に明らかであろう。本発明のポリヌクレオ
チドは、ペプチドを組換え技術により製造するのに使用
することができる。従って、例えば、該ポリヌクレオチ
ドを、ポリペプチドを発現するための様々な発現ベクタ
ーのいずれか１つに含ませることができる。そのような
ベクターには、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配
列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファ
ージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラ
スミドとファージＤＮＡとの組合せから得られるベクタ
ー；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性
狂犬病といったようなウイルスＤＮＡが含まれる。しか
し、他のいずれのベクターも、それが宿主中で複製可能
であって、生存可能である限り、使用することができ
る。

【００３６】適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベク
ターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を
当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアー
ゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、
当業者の範囲内であると思われる。

【００３７】発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現
制御配列(プロモーター)に作動可能に結合し、mＲＮＡ
合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例とし
て、以下のものが挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ４０プ
ロモーター、Ｅ.coli. lacまたはtrp、ファージラムダ
Ｐ_Ｌプロモーター、および原核もしくは真核細胞または
それらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知
られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻
訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結区も
含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配
列も含み得る。さらに、発現ベクターは、真核細胞培養
の場合にはジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオ
マイシン耐性といったような、またはＥ.coliではテト
ラサイクリンまたはアンピシリン耐性といったような、
トランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型
特性を与えるために、１つまたはそれ以上の選択可能な
マーカー遺伝子を含むのが好ましい。

【００３８】上記のような適当なＤＮＡ配列、さらには
また、適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクタ
ーを、適当な宿主をトランスフォームするために使用し
て、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にするこ
とができる。

【００３９】適当な宿主の代表例として、以下のものが
挙げられる：Ｅ.coli、Ｓtreptomyces、Ｓalmonella ty
phimuriumといったような細菌細胞；酵母のような真菌
細胞；ＤrosophilaおよびＳf９といったような昆虫細
胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowesメラノーマといったよ
うな動物細胞；植物細胞等。適当な宿主の選択は、本明
細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。

【００４０】とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載
した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物
も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆
方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベク
ターといったようなベクターを含んでなる。この実施態
様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、該
配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、制御配
列を含んでなる。適当なベクターおよびプロモーターが
多数、当業者に知られていて、市販されている。以下の
ベクターを例として挙げる。細菌用: pＱＥ７０、pＱＥ
６０、pＱＥ−９(Ｑiagen)、pＢＳ、pＤ１０、ファージ
スクリプト(phagescript)、psiＸ１７４、pbluescript
ＳＫ、pbsks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８Ａ、p
ＮＨ４６Ａ(Ｓtratagene)；ptrc９９a、pＫＫ２２３−
３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５(Ｐharm
acia)。真核生物用: pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯ
Ｇ４４、pＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagene)、pＳＶＫ３、p
ＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(Ｐharmacia)。しかし、他の
いずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中
で複製可能であって、生存可能である限り、使用するこ
とができる。

【００４１】プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望
の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベク
ターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々
に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、
Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰ_Ｒ、Ｐ_Ｌおよびtrpが含まれ
る。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期(immediate
early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期Ｓ
Ｖ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスの
メタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベクターおよ
びプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲
内である。

【００４２】さらなる態様では、本発明は、上記の構築
物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物
細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核
細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような
原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リ
ン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキ
ストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポ
レーションにより行うことができる。(Ｄavis,Ｌ.、Ｄi
bner,Ｍ.、Ｂattey,Ｌ.、Ｂasic Ｍethods inＭolecula
r Ｂiology（１９８６）)。

【００４３】宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用し
て、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造す
ることができる。あるいはまた、本発明のポリペプチド
は、従来のペプチド合成装置により合成的に製造するこ
とができる。

【００４４】成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中
で発現させることができる。そのようなタンパク質を、
本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造
するために、無細胞翻訳系もまた使用することができ
る。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ
ングおよび発現ベクターは、Ｓambrookら、Ｍolecular
Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual, 第２版、Ｃold Ｓ
pring Ｈarbor、ニューヨーク、（１９８９)により記載
されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。

【００４５】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベク
ターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、
プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、
約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。
例には、bp １００〜２７０の、複製開始点の後期側に
あるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期
プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にある
ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハ
ンサーが含まれる。

【００４６】通例、組換え発現ベクターには、複製開始
点、および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能
にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ.coliのアンピ
シリン耐性遺伝子およびＳ.cerevisiae ＴＲＰ１遺伝
子、並びに下流の構造配列の転写を行わせるために高度
に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれ
るであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３
−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系
酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショック
タンパク質をコードするオペロンから得ることができ
る。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始および終結配
列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺
腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリ
ーダー配列と共に、適当な相(phase)で構築される。場
合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特性、例え
ば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易
化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパ
ク質をコードすることができる。

【００４７】細菌で使用するのに有用な発現ベクター
は、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、
適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプ
ロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入す
ることにより構築される。そのベクターは、ベクターの
維持を確実なものとするために、また所望により、宿主
内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現
型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含んでなる
であろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿主
には、Ｅ.coli、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella typ
himurium、並びにＰseudomonas属、Ｓtreptomyces属、
およびＳtaphylococcus属の範囲内の様々な種が含まれ
るが、他のものもまた、選択物質として使用することが
できる。

【００４８】代表的であるが、非限定的な例として、細
菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニン
グベクター pＢＲ３２２(ＡＴＣＣ ３７０１７)の遺伝
要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択
可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでなり得
る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２
２３−３(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals、Ｕppsala、ス
ウェーデン)およびpＧＥＭ１(Ｐromega Ｂiotec、Ｍadi
son、ＷＩ、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨
核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構
造配列と組み合わせる。

【００４９】適当な宿主株をトランスフォーメーション
して、その宿主株を適当な細胞密度まで増殖させた後、
選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シ
フトまたは化学誘導)により誘導して、細胞をさらなる
期間培養する。

【００５０】細胞を、一般的には、遠心分離により収集
し、物理的または化学的方法により破壊して、その結果
得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保有する。

【００５１】タンパク質の発現に使用される微生物細胞
は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊、また
は細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても
破壊でき、そのような方法は、当業者に周知である。

【００５２】組換えタンパク質を発現させるために、様
々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。
哺乳動物発現系の例には、Ｇluzman、Ｃell、２３：１
７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線
維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを
発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２
７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨＫ細胞系が含ま
れる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプ
ロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必要な
リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス
ドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および
５'に隣接する非転写配列もまた含んでなるであろう。
ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、お
よびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転
写遺伝要素を与えることができる。

【００５３】ケモカインポリペプチドは、硫酸アンモニ
ウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽
イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロ
マトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパ
タイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグ
ラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から
回収して、精製することができる。必要に応じて、タン
パク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成
するのに使用することができる。最後に、高性能液体ク
ロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終精製工程に使用する
ことができる。

【００５４】本発明のケモカインポリペプチドは、天然
に精製された産物、もしくは化学合成法の産物であり得
るか、または原核もしくは真核宿主から(例えば、培養
物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞
によって)組換え技術により製造することができる。組
換え製造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプ
チドは、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化
され得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメ
チオニンアミノ酸残基が含まれ得る。

【００５５】ケモカインポリペプチドは、癌の化学療法
の間の、また白血病に対する補助的保護処置として、骨
髄幹細胞のコロニー形成を阻害するために使用すること
ができる。

【００５６】該ケモカインポリペプチドはまた、ケラチ
ノサイトの過増殖により特徴付けられる乾癬の処置とし
て、表皮ケラチノサイト増殖を阻害するために使用する
こともできる。

【００５７】該ケモカインポリペプチドはまた、宿主防
御細胞、例えば、細胞障害性Ｔ細胞およびマクロファー
ジの侵入および活性化を刺激することにより、固形腫瘍
を処置するために使用することもできる。それらはま
た、耐性の慢性感染、例えば、ミコバクテリア白血球の
誘引および活性化によるミコバクテリア感染に対する宿
主防御を高めるために使用することもできる。

【００５８】該ケモカインポリペプチドはまた、ＩＬ２
の生合成阻害によってＴ細胞の増殖を阻害することによ
り、自己免疫疾患およびリンパ性白血病を処置するため
に使用することもできる。

【００５９】Ｃkβ−４およびＣkβ−１０はまた、デブ
リ(debris)をクリアリングする、また結合組織を促進す
る炎症性細胞の漸増によって、また過剰のＴＧＦβによ
り媒介される線維症の制御によっても、創傷治癒におい
て使用することもできる。これと同じ方法で、Ｃkβ−
４およびＣkβ−１０をまた、肝硬変、変形性関節症お
よび肺線維症が含まれる、他の線維症障害を処置するた
めに使用することもできる。該ケモカインポリペプチド
はまた、住血吸虫症、旋毛虫症および回虫症でのよう
に、組織に侵入する寄生虫の幼虫を殺すという、特徴の
ある機能を有する好酸球の存在も増加させる。それらは
また、様々な造血始原細胞の活性化および分化を調節す
ることにより、造血を調節するために使用することもで
きる。

【００６０】ケモカインポリペプチドはまた、脈管形成
のインヒビターとして使用することもでき、従って、そ
れらは抗腫瘍効果を有する。

【００６１】本発明のケモカインポリペプチドはまた、
同様の生物学的活性を有する他の分子を同定するのにも
有用である。このことに関するスクリーニングの例は、
既知のＤＮＡ配列を使用してオリゴヌクレオチドプロー
ブを合成することにより、遺伝子のコード領域を単離す
ることである。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を
有する標識化オリゴヌクレオチドを、ヒトのcＤＮＡ、
ゲノムＤＮＡまたはmＲＮＡのライブラリーをスクリー
ニングするために使用して、ライブラリーのどのメンバ
ーにプローブがハイブリダイズするかを決定する。

【００６２】本発明はまた、変化したレベルのポリペプ
チド、またはそのようなポリペプチドに関するメッセー
ジを提供するmＲＮＡを定量的かつ定性的に検出するた
めの診断用アッセイにも関する。そのようなアッセイは
当業界で周知であり、またＥＬＩＳＡアッセイ、ラジオ
イムノアッセイおよびＲＴ−ＰＣＲが含まれる。該アッ
セイにおいて検出されるポリペプチド、またはそれらの
mＲＮＡのレベルは、様々な疾患におけるポリペプチド
の意義の解明に、また変化したレベルのポリペプチドが
重要となり得る疾患の診断に使用することができる。

【００６３】本発明は、ポリペプチドに対する受容体の
同定方法を提供する。該受容体をコードする遺伝子は、
発現クローニングにより同定することができる。ポリア
デニル化ＲＮＡを該ポリペプチドに応答する細胞から調
製して、このＲＮＡから作られるcＤＮＡライブラリー
をプールに分けて、ＣＯＳ細胞または該ポリペプチドに
応答しない他の細胞をトランスフェクトするために使用
する。ガラススライド上で増殖させた、トランスフェク
トされた細胞を、標識化ポリペプチドにさらす。該ポリ
ペプチドは、ヨウ素化または部位特異的プロテインキナ
ーゼに対する認識部位の包含を含め、様々な方法により
標識化することができる。固定およびインキュベーショ
ンに続いて、そのスライドをオートラジオグラフ分析に
かける。陽性のプールを同定して、サブプールを調製
し、反復サブプーリングおよび再スクリーニング方法を
利用して、再びトランスフェクトし、最終的には、推定
される受容体をコードする単一クローンを得る。受容体
を同定するための他の方法として、標識化ポリペプチド
を細胞膜と光親和性により結合させるか、または受容体
分子を発現する調製物を抽出することができる。橋かけ
(cross-linked)物質をＰＡＧＥ分析により分けて、Ｘ線
フィルムにさらす。該ポリペプチドの受容体を含む標識
化複合体を切除し、ペプチドフラグメントに分けて、タ
ンパク質ミクロ配列決定にかけることができる。ミクロ
配列決定から得られるアミノ酸配列を使用して、一組の
オリゴヌクレオチドプローブを設計し、cＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングして、推定される受容体をコー
ドする遺伝子が同定されるであろう。

【００６４】本発明は、ポリペプチドの、それらの同定
された受容体に対する相互作用を高める(アゴニスト)、
またはブロックする(アンタゴニスト)薬物を同定するた
めに、薬物をスクリーニングする方法を提供する。アゴ
ニストは、該ポリペプチドの天然の生物学的機能を増大
させる化合物であるが、アンタゴニストは、そのような
機能を排除する。例として、該ポリペプチドの受容体を
発現する哺乳動物の細胞または膜調製物が、薬物の存在
下、標識化ケモカインポリペプチド、例えば、放射能と
インキュベートされるであろう。次いで、この相互作用
を高める、またはブロックする、その薬物の能力を測定
することができるであろう。

【００６５】可能性のあるアンタゴニストには、抗体、
また幾つかの場合には、ポリペプチドに結合するオリゴ
ヌクレオチドが含まれる。可能性のあるアンタゴニスト
の別の例は、ポリペプチドの負の(negative)優性突然変
異体である。負の優性突然変異体は、野生型のポリペプ
チドの受容体に結合するが、生物学的活性を保有してい
ないポリペプチドである。

【００６６】ポリペプチドの負の優性突然変異体を検出
するためのアッセイには、ポリビニルピロリドンを含ま
ないポリカーボネート膜を備えたマルチウエル走化性チ
ャンバーを使用して、可能性のあるアンタゴニスト／イ
ンヒビターまたはアゴニスト分子の存在下および不存在
下、白血球に対するポリペプチドの化学誘引物質能を測
定するという、インビトロにおける走化性アッセイが含
まれる。

【００６７】アンチセンス技術を利用して製造されたア
ンチセンス構築物もまた、可能性のあるアンタゴニスト
である。アンチセンス技術を利用して、三重らせん形成
またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝
子発現を制御することができ、この方法は両方とも、ポ
リヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づ
く。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、
ポリヌクレオチド配列の５'コード部分を使用して、長
さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌク
レオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転
写に関与する遺伝子領域に対して相補的であるよう設計
し(三重らせん−Ｌeeら、Ｎucl.Ａcids Ｒes.、６：３
０７３（１９７９）；Ｃooneyら、Ｓcience、２４１：
４５６（１９８８）；およびＤervanら、Ｓcience、２
５１：１３６０（１９９１）を参照)、そのことによっ
て、転写およびポリペプチドの産生を妨げる。アンチセ
ンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてm
ＲＮＡにハイブリダイズして、mＲＮＡ分子のポリペプ
チドへの翻訳をブロックする(アンチセンス−Ｏkano、
Ｊ.Ｎeurochem.、５６：５６０（１９９１）；Ｏligode
oxynucleotides as Ａntisense Ｉnhibitors of Ｇene
Ｅxpression、ＣＲＣ Ｐress、Ｂoca Ｒaton、ＦＬ（１
９８８）)。上記のオリゴヌクレオチドをまた、細胞に
送り込むことから、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを
インビボにおいて発現させて、ポリペプチドの産生を阻
害することができる。

【００６８】別の可能性のあるアンタゴニストは、生物
学的機能を失ってしまってはいるが、それにもかかわら
ず、ポリペプチドの受容体を認識して結合し、それによ
って、その受容体を有効にブロックするポリペプチド
の、自然に、または合成的に修飾されたアナログであ
る、ポリペプチドのペプチド誘導体である。ペプチド誘
導体の例には、これらに限定されるものではないが、小
さなペプチドまたはペプチド様分子が含まれる。

【００６９】該アンタゴニストは、自己免疫疾患および
慢性の炎症性疾患および感染症において、マクロファー
ジおよびそれらの前駆体の、並びに好中球、好塩基球、
Ｂリンパ球および幾つかのＴ細胞サブセット、例えば、
活性化およびＣＤ８細胞障害性Ｔ細胞、並びに天然のキ
ラー細胞の走化性および活性化を阻害するために使用す
ることができる。自己免疫疾患の例には、慢性関節リウ
マチ、多発性硬化症、およびインスリン依存性糖尿病が
含まれる。幾つかの感染症には、単核食細胞の漸増およ
び活性化を妨げることによる珪肺症、サルコイドーシ
ス、特発性肺線維症、好酸球産生および遊走を妨げるこ
とによる特発性過エオシン好性症候群、マクロファージ
の遊走および本発明のケモカインポリペプチドの産生を
妨げることによる内毒素性ショックが含まれる。該アン
タゴニストはまた、動脈壁における単球浸潤を妨げるこ
とにより、アテローム性動脈硬化症を処置するために使
用することもできる。

【００７０】該アンタゴニストはまた、ケモカインによ
り誘発されるマスト細胞および好塩基球の脱顆粒、並び
にヒスタミンの放出を阻害することにより、ヒスタミン
により媒介されるアレルギー反応を処置するために使用
することもできる。

【００７１】該アンタゴニストはまた、単球の創傷領域
への誘引を妨げることにより、炎症を処置するために使
用することもできる。それらはまた、急性および慢性の
炎症性肺疾患が、肺における単核食細胞の腐骨形成と関
連があることから、正常な肺のマクロファージ数を調節
するために使用することもできる。

【００７２】アンタゴニストはまた、患者の関節におい
て単球の滑液中への誘引を妨げることにより、慢性関節
リウマチを処置するために使用することもできる。単球
の流入および活性化は、変性および炎症性関節炎の両方
の病因において重要な役割を担う。

【００７３】該アンタゴニストはまた、他の炎症性サイ
トカインの生合成を妨げる、主としてＩＬ−１およびＴ
ＮＦが原因となる有害なカスケードを妨げるために使用
することもできる。この方法では、該アンタゴニストは
また、炎症を妨げるために使用することもできる。該ア
ンタゴニストはまた、ケモカインにより誘発される、プ
ロスタグランジンとは無関係の発熱を阻止するために使
用することもできる。

【００７４】該アンタゴニストはまた、骨髄不全の病
症、例えば、再生不良性貧血および脊髄形成異常症候群
を処置するために使用することもできる。

【００７５】該アンタゴニストはまた、肺における好酸
球蓄積を妨げることにより、喘息およびアレルギーを処
置するために使用することもできる。該アンタゴニスト
はまた、薬学上許容され得る担体、例えば、以下に記載
するような担体と共に、組成物中で使用することもでき
る。

【００７６】本発明のケモカインポリペプチドおよびア
ゴニストまたはアンタゴニストは、適当な薬学的担体と
組み合わせて使用することができる。そのような組成物
は、治療上有効な量のポリペプチド、および薬学上許容
され得る担体または賦形剤を含んでなる。そのような担
体には、これに限定されるものではないが、生理食塩
水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロ
ール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれ
る。その製剤は、投与方法に適合すべきである。

【００７７】本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分
を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の
容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供す
る。そのような容器に関連して、薬学的または生物学的
製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により
規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒト
への投与のための製造、使用または販売の、該当局によ
る承認を表わす。さらに、本発明のポリペプチドは、他
の治療化合物と共に使用することができる。

【００７８】該医薬組成物は、局所、静脈内、腹腔内、
筋肉内、腫瘍内、皮下、鼻腔内または皮内経路といった
ような、便利な方法で投与することができる。該ポリペ
プチドは、具体的な徴候を治療および／または予防する
のに有効な量で投与される。一般に、該ポリペプチド
は、少なくとも約１０μg／kg(体重)の量で投与され、
最も多くの場合、それらは、１日当り約８mg／kg(体重)
を超えない量で投与されるであろう。最も多くの場合、
投与経路および症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日
約１０μg／kg〜約１mg／kg(体重)である。

【００７９】該ケモカインポリペプチドおよびアゴニス
トまたはアンタゴニストは、「遺伝子治療」と呼ばれる
ことが多い、そのようなポリペプチドのインビボにおけ
る発現により、本発明に従って使用することができる。

【００８０】従って、例えば、患者由来の細胞を、エク
スビボにおいてポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞
を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方
法は、当業界で周知である。例えば、本発明のポリペプ
チドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使
用によって、細胞を当業界で既知の方法により操作する
ことができる。

【００８１】同様に、例えば、当業界で既知の方法によ
り、ポリペプチドのインビボにおける発現のために、細
胞をインビボにおいて操作することができる。当業界で
知られているように、細胞をインビボにおいて処理し
て、ポリペプチドをインビボにおいて発現させるため
に、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレ
トロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投
与することができる。そのような方法により本発明のポ
リペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方
法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例え
ば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイ
ルス以外のもの、例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合
わせた後、細胞をインビボにおいて操作するために使用
することができるアデノウイルスであってもよい。

【００８２】本発明の配列はまた、染色体同定にも有益
である。その配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に
対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせること
ができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同
定する必要がある。実際の配列データ(反復多型性)に基
づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色***置をマ
ークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤ
ＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を病気と
関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階である。

【００８３】簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプラ
イマー(好ましくは、１５−２５bp)を調製することによ
り、配列を染色体にマップすることができる。cＤＮＡ
のコンピューター分析を使用して、ゲノムＤＮＡ中の１
つ以上のエクソンをスパン(span)しないプライマーを迅
速に選択することから、増幅過程を複雑なものとする。
次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含
む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用す
る。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む、それらの
ハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与える
であろう。体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、
特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅速な
方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用い
ての本発明を利用して、サブローカリゼーションは、具
体的な染色体または大きいゲノムクローンのプール由来
のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達成する
ことができる。その染色体へマップするのに同様に利用
することができる他のマッピング方法には、in situ ハ
イブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティッド(f
low−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニング、お
よび染色体特異的cＤＮＡライブラリーを構築するため
のハイブリダイゼーションによるプレセレクションが含
まれる。

【００８４】cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッ
ドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(ＦＩＳ
Ｈ)を利用して、正確な染色***置を一工程で与えるこ
とができる。この技術は、５００または６００塩基とい
う短いcＤＮＡで利用することができる；しかし、２,０
００bpより大きいクローンは、簡単な検出に十分なシグ
ナル強度を有する独自の染色***置へ結合する可能性が
高い。ＦＩＳＨは、ＥＳＴが得られるクローンの使用を
必要とし、また長ければ長いほどよい。例えば、２,０
００bpが良好であり、４,０００はより良好であって、
４,０００以上は、恐らく、良好な結果を妥当な時間割
合で得るのに必要ない。この技術の復習には、Ｖerma
ら、Ｈuman Ｃhromosomes：a Ｍanual of Ｂasic Ｔech
niques、Ｐergamon Ｐress、ニューヨーク（１９８８）
を参照。

【００８５】ある配列が正確な染色***置に一度マップ
されると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデ
ータと関連付けることができる。そのようなデータは、
例えば、Ｖ.ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in
Ｍan(Ｊohns Ｈopkins Ｕniversity Ｗelch Ｍedical
Ｌibraryを介してオンラインで利用できる)に見い出さ
れる。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝
子と疾患との間の関係を結合分析(物理的に隣接した遺
伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する。

【００８６】次に、病気に冒された個体と冒されていな
い個体との間のcＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定
する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまた
は全てにおいて認められるが、いずれの正常な個体にお
いても認められないなら、その変異は疾患の原因となる
ものであるらしい。

【００８７】現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッ
ピングの分析から、疾患と関連する染色体領域に正確に
局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因とな
る遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガ
ベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子
を仮定する)。

【００８８】ポリペプチド、それらのフラグメントもし
くは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそ
れらを発現する細胞を免疫源として使用して、それらに
対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、
例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であ
り得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化
抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発
現ライブラリーの生成物も含まれる。当業界で既知の様
々な方法を、そのような抗体およびフラグメントの製造
に使用することができる。

【００８９】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入
することにより、またはポリペプチドを動物、好ましく
はヒトでない動物に投与することにより得ることができ
る。次いで、そのようにして得られた抗体は、そのポリ
ペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリ
ペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、
完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するの
に使用することができる。次いで、そのような抗体を使
用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプ
チドを単離することができる。

【００９０】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全
て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術
(ＫohlerおよびＭilstein、１９７５、Ｎature、２５
６:４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ
細胞ハイブリドーマ技術(Ｋozborら、１９８３、Ｉmmun
ology Ｔoday ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗
体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Ｃole
ら、１９８５、Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer
Ｔherapy、Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.、７７−９６頁におい
て)が含まれる。

【００９１】単鎖抗体の産生に関して記載されている技
術(米国特許第４,９４６,７７８号)は、本発明の免疫原
性ポリペプチド産生物に対する単鎖抗体を製造するのに
適合し得る。

【００９２】本発明をさらに、以下の実施例に関して記
載する；しかし、本発明は、そのような実施例に限定さ
れないことを理解すべきである。部または量は全て、特
にことわらない限り、重量単位である。

【００９３】以下の実施例の理解を容易にするために、
幾つかの頻繁に出てくる方法および／または用語を記載
する。

【００９４】「プラスミド」は、前置きする小文字のp
および／または続けて大文字および／または数字により
示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されてい
て、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、ま
たは公開された方法により入手可能なプラスミドから構
築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラス
ミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろ
う。

【００９５】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列に
のみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒切断することを示
す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されて
おり、それらの反応条件、補因子および他の必要条件
は、当業者に知られているように使用した。分析目的に
は、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使
用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを
単離する目的には、一般的に、より多量の体積中、ＤＮ
Ａ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。
特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者
により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベ
ーション時間が通常利用されるが、供給者の指示に従っ
て変えることができる。消化後、その反応物をポリアク
リルアミドゲルで直接電気泳動して、所望のフラグメン
トを単離する。

【００９６】切断したフラグメントのサイズ分離は、Ｇ
oeddel,Ｄら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、８：４０５７
（１９８０）により記載されている８％ ポリアクリル
アミドゲルを用いて行う。

【００９７】「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成
することができる、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、
または２つの相補的ポリヌクレオチド鎖を示す。そのよ
うな合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有さ
ないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰでホスフェー
トを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドにラ
イゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、
脱リン酸化されていないフラグメントにライゲートする
であろう。

【００９８】「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸
フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過
程をいう(Ｍaniatis,Ｔ.ら、同上、１４６頁)。特にこ
とわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせる
べきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０.５μg当り
１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、
既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができ
る。

【００９９】特にことわらない限り、トランスフォーメ
ーションは、Ｇraham,Ｆ.およびＶan der Ｅb,Ａ.、Ｖi
rology、５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記
載されているようにして行った。

【０１００】

【実施例】実施例 １ Ｃkβ−４の細菌発現および精製 最初に、Ｃkβ−４をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ
第７５８４８号を、プロセシングされたＣkβ−４タン
パク質の５'および３'配列(推定されるシグナルペプチ
ド配列なし)に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプラ
イマーを利用して増幅する。Ｃkβ−４に対応する付加
的ヌクレオチドを各々、５'および３'配列に付加した。
５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列： を有し、ＳphＩ制限酵素部位(肉太の活字)、続いて、成
熟タンパク質をコードする配列の第２ヌクレオチドから
始まる１７ヌクレオチドのＣkβ−４コード配列(下線を
引いた活字)を含む。ＡＴＧコドンは、ＳphＩ部位に含
まれる。ＡＴＧに続く次のコドンでは、１つ目の塩基が
ＳphＩ部位に由来し、また残りの２つの塩基は、推定さ
れる成熟タンパク質の最初のコドンの２つ目および３つ
目の塩基に対応する。結果として、このコドンにおける
１つ目の塩基は、もとの配列と比較して、ＧからＣに変
わり、結果的には、組換えタンパク質においてＥがＱに
置き換わる。３'配列： は、ＢamＨ１部位に対する相補的配列(肉太の活字)、続
いて、終止コドンより前に、２１ヌクレオチドの遺伝子
特異的配列を含む。その制限酵素部位は、細菌発現ベク
ター pＱＥ−７０(Ｑiagen,Ｉnc. ９２５９ Ｅton Ａv
e.、Ｃhatsworth、ＣＡ ９１３１１)上の制限酵素部位
に対応する。pＱＥ−７０は、抗生物質耐性(Ａmp^ｒ)、
細菌の複製開始点(ori)、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモ
ーターオペレーター(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位(Ｒ
ＢＳ)、６−Ｈisタグおよび制限酵素部位をコードす
る。次いで、pＱＥ−７０をＳphＩおよびＢamＨ１で消
化した。増幅された配列をpＱＥ−７０にライゲートし
て、ヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードする配列と共
に枠内に挿入した。第８図は、この配列(arrangement)
の模式的な表示を示す。次いで、そのライゲーション混
合物を使用して、Ｓambrook,Ｊ.ら、Ｍolecular Ｃloni
ng：Ａ Ｌaboratory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaborat
ory Ｐress（１９８９）に記載されている手順により、
Ｑiagenから商標 Ｍ１５／rep４で入手可能なＥ.coli.
株をトランスフォームした。Ｍ１５／rep４はプラスミ
ドpＲＥＰ４の多重コピーを含み、これは、lacＩリプレ
ッサーを発現して、またカナマイシン耐性(Ｋan^ｒ)も与
える。トランスフォーマントを、それらがＬＢプレート
で増殖する能力により同定して、アンピシリン／カナマ
イシン耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを単
離して、制限分析により確認した。所望の構築物を含む
コロニーを、Ａmp(１００ug／ml)とＫan(２５ug／ml)の
両方を補ったＬＢ培地中での液体培養で一晩増殖させた
(Ｏ／Ｎ)。そのＯ／Ｎ培養物を使用して、大きな培養物
を１：１００〜１：２５０の割合で播種した。細胞が、
０.４〜０.６の光学密度６００(Ｏ.Ｄ.^６００)まで増殖
した。次いで、ＩＰＴＧ(「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド」)を、最終濃度が１mＭとなるま
で加えた。ＩＰＴＧは、lacＩリプレッサーを不活性化
することにより、Ｐ／Ｏのクリアリングを誘導し、遺伝
子発現を増加させる。細胞をさらに３〜４時間増殖させ
た。次いで、細胞を遠心分離により収集した。細胞ペレ
ットをカオトロピック剤である６モルのグアニジンＨＣ
l中で可溶化した。清澄後、この溶液から、６−ヒスチ
ジンタグを含むタンパク質による強固な結合を可能にす
る条件下、ニッケル−キレートカラムでのクロマトグラ
フィーにより、可溶化したＣkβ−４を精製した。(Ｈoc
huli,Ｅ.ら、Ｊ.Ｃhromatography ４１１：１７７−１
８４（１９８４）)。６モルのグアニジンＨＣl(pＨ ５.
０)中、Ｃkβ−４(純度 ＞９８％)をカラムから溶出し
た。ＧnＨＣlからのタンパク質の再生は、幾つかのプロ
トコルにより成し遂げることができる。(Ｊaenicke,Ｒ.
およびＲudolph,Ｒ.、Ｐrotein Ｓtructure−Ａ Ｐract
ical Ａpproach、ＩＲＬ Ｐress、ニューヨーク（１９
９０）)。まず最初に、段階透析を利用して、ＧnＨＣＬ
を除去する。あるいはまた、Ｎi−キレートカラムから
単離される精製タンパク質を、減少型リニアＧnＨＣＬ
グラジエントを通す第２カラムに結合させることができ
る。そのタンパク質をカラムに結合させる間に再生した
後、２５０mＭのイミダゾール、１５０mＭのＮaＣl、２
５mＭのトリス−ＨＣl(pＨ ７.５)および１０％のグリ
セロールを含む緩衝液で溶出する。最後に、可溶性タン
パク質を、５mＭの重炭酸アンモニウムを含む貯蔵緩衝
液に対して透析する。

【０１０１】実施例 ２ Ｃkβ−１０の細菌発現および精製 最初に、Ｃkβ−１０をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣ
Ｃ第７５８４９号を、プロセシングされたＣkβ−１０
タンパク質(シグナルペプチド配列なし)の５'および３'
配列、およびＣkβ−１０遺伝子の３'側のベクター配列
に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを利用
して増幅する。Ｃkβ−１０に対応する付加的ヌクレオ
チドを各々、５'および３'配列に付加した。５'オリゴ
ヌクレオチドプライマーは、配列： を有し、ＳphＩ制限酵素部位(肉太の活字)、続いて、成
熟タンパク質をコードする配列から始まる１９ヌクレオ
チドのＣkβ−１０コード配列(下線を引いた活字)を含
む。ＡＴＧコドンは、ＳphＩ部位に含まれる。３'配
列： は、ＢamＨ１部位に対する相補的配列(肉太の活字)、続
いて、終止コドンより前に、１９ヌクレオチドの遺伝子
特異的配列を含む。その制限酵素部位は、細菌発現ベク
ター pＱＥ−７０(Ｑiagen,Ｉnc. ９２５９ Ｅton Ａv
e.、Ｃhatsworth、ＣＡ ９１３１１)上の制限酵素部位
に対応する。pＱＥ−７０は、抗生物質耐性(Ａmp^ｒ)、
細菌の複製開始点(ori)、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモ
ーターオペレーター(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位(Ｒ
ＢＳ)、６−Ｈisタグおよび制限酵素部位をコードす
る。次いで、pＱＥ−７０をＳphＩおよびＢamＨ１で消
化した。増幅された配列をpＱＥ−７０にライゲートし
て、ヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードする配列と共
に枠内に挿入した。第１０図は、この配列の模式的な表
示を示す。次いで、そのライゲーション混合物を使用し
て、Ｓambrook,Ｊ.ら、Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌabo
ratory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress
（１９８９）に記載されている手順により、Ｑiagenか
ら商標 Ｍ１５／rep４で入手可能なＥ.coli.株をトラン
スフォームした。Ｍ１５／rep４はプラスミドpＲＥＰ４
の多重コピーを含み、これは、lacＩリプレッサーを発
現して、またカナマイシン耐性(Ｋan^ｒ)も与える。トラ
ンスフォーマントを、それらがＬＢプレートで増殖する
能力により同定して、アンピシリン／カナマイシン耐性
コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを単離して、制
限分析により確認した。所望の構築物を含むコロニー
を、Ａmp(１００ug／ml)とＫan(２５ug／ml)の両方を補
ったＬＢ培地中での液体培養で一晩増殖させた(Ｏ／
Ｎ)。そのＯ／Ｎ培養物を使用して、大きな培養物を
１：１００〜１：２５０の割合で播種した。細胞が、
０.４〜０.６の光学密度６００(Ｏ.Ｄ.^６００)まで増殖
した。次いで、ＩＰＴＧ(「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド」)を、最終濃度が１mＭとなるま
で加えた。ＩＰＴＧは、lacＩリプレッサーを不活性化
することにより、Ｐ／Ｏのクリアリングを誘導し、遺伝
子発現を増加させる。細胞をさらに３〜４時間増殖させ
た。次いで、細胞を遠心分離により収集した。細胞ペレ
ットをカオトロピック剤である６モルのグアニジンＨＣ
l中で可溶化した。清澄後、この溶液から、６−ヒスチ
ジンタグを含むタンパク質による強固な結合を可能にす
る条件下、ニッケル−キレートカラムでのクロマトグラ
フィーにより、可溶化したＣkβ−１０を精製した。(Ｈ
ochuli,Ｅ.ら、Ｊ.Ｃhromatography ４１１：１７７−
１８４（１９８４）)。６モルのグアニジンＨＣl(pＨ
５.０)中、Ｃkβ−１０(純度 ＞９８％)をカラムから溶
出した。ＧnＨＣlからのタンパク質の再生は、幾つかの
プロトコルにより成し遂げることができる。(Ｊaenick
e,Ｒ.およびＲudolph,Ｒ.、Ｐrotein Ｓtructure−Ａ
Ｐractical Ａpproach、ＩＲＬ Ｐress、ニューヨーク
（１９９０）)。まず最初に、段階透析を利用して、Ｇn
ＨＣＬを除去する。あるいはまた、Ｎi−キレートカラ
ムから単離される精製タンパク質を、減少型リニアＧn
ＨＣＬグラジエントを通す第２カラムに結合させること
ができる。そのタンパク質をカラムに結合させる間に再
生した後、２５０mＭのイミダゾール、１５０mＭのＮa
Ｃl、２５mＭのトリス−ＨＣl(pＨ ７.５)および１０％
のグリセロールを含む緩衝液で溶出する。最後に、可溶
性タンパク質を、５mＭの重炭酸アンモニウムを含む貯
蔵緩衝液に対して透析する。次いで、そのタンパク質を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。

【０１０２】実施例 ３ ＣＯＳ細胞における組換えＣkβ−４の発現 プラスミド、Ｃkβ−４ ＨＡの発現は、１）ＳＶ４０
複製開始点、２）アンピリシン耐性遺伝子、３）Ｅ.col
i 複製開始点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０ イン
トロンおよびポリアデニル化部位が続くＣＭＶプロモー
ターを含む、ベクター pcＤＮＡＩ／Ａmp(Ｉnvitrogen)
から得られる。完全なＣkβ−４前駆体およびその３'末
端に枠内で融合したＨＡタグ(tag)をコードするＤＮＡ
フラグメントを、そのベクターのポリリンカー領域にク
ローン化したことから、組換えタンパク質発現は、ＣＭ
Ｖプロモーターの下に指示される。ＨＡタグは、前記の
ようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得ら
れるエピトープに対応する(Ｉ.Ｗilson、Ｈ.Ｎiman、
Ｒ.Ｈeighten、Ａ.Ｃherenson、Ｍ.Ｃonnolly、および
Ｒ.Ｌerner、１９８４、Ｃell ３７、７６７)。ＨＡタ
グを標的タンパク質へ融合させることにより、組換えタ
ンパク質を、ＨＡエピトープを認識する抗体で容易に検
出することが可能となる。プラスミド構築方法を以下に
記載する：Ｃkβ−４をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣ
Ｃ第 号を、２つのプライマーを用いてクロー
ン化された、もとのＥＳＴでのＰＣＲにより構築した： ５'プライマー は、ＨindIII部位、続いて、開始コドンから始まる２０
ヌクレオチドのＣkβ−４コード配列を含む； ３'配列 は、ＸbaＩ部位に対する相補的配列、翻訳終止コドン、
ＨＡタグ、およびＣkβ−４コード配列の最後の２０ヌ
クレオチド(終止コドンは含まれていない)を含む。従っ
て、ＰＣＲ産物は、ＨindIII部位、Ｃkβ−４コード配
列、続いて、枠内で融合したＨＡタグ、そのＨＡタグの
隣の翻訳終了終止コドン、およびＸbaＩ部位を含む。Ｐ
ＣＲにより増幅されたＤＮＡフラグメントおよびベクタ
ー、pcＤＮＡＩ／Ａmpを、ＨindIIIおよびＸbaＩ制限酵
素で消化して、ライゲートさせた。そのライゲーション
混合物をＥ.coli株 ＳＵＲＥ(Ｓtratagene Ｃloning Ｓ
ystems、１１０９９ Ｎorth Ｔorrey Ｐines Ｒoad、Ｌ
a Ｊolla、ＣＡ ９２０３７から入手可能である)にトラ
ンスフォームし、そのトランスフォームされた培養物を
アンピシリン培地プレート上に置いて、耐性コロニーを
選択した。プラスミド ＤＮＡをトランスフォーマント
から単離して、正しいフラグメントの存在に関して制限
分析により試験した。組換えＣkβ−４の発現には、Ｄ
ＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ方法により、ＣＯＳ細胞を発現
ベクターでトランスフェクトした(Ｊ.Ｓambrook、Ｅ.Ｆ
ritsch、Ｔ.Ｍaniatis、Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌab
oratory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐres
s、（１９８９）)。Ｃkβ−４ ＨＡタンパク質の発現
を、放射能標識および免疫沈降法により検出した。(Ｅ.
Ｈarlow、Ｄ.Ｌane、Ａntibodies：Ａ Ｌaboratory Ｍa
nual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress、（１９８
８）)。トランスフェクションから２日後、細胞を^３５
Ｓ−システインで８時間標識化した。次いで、細胞培地
を集めて、細胞を界面活性剤(ＲＩＰＡ緩衝液(１５０m
Ｍ ＮaＣl、１％ ＮＰ−４０、０.１％ ＳＤＳ、１％
ＮＰ−４０、０.５％ ＤＯＣ、５０mＭ トリス、pＨ
７.５))で溶菌した。(Ｗilson,Ｉ.ら、同上 ３７：７６
７（１９８４）)。細胞溶菌液および培養培地は両方と
も、ＨＡに特異的なモノクローナル抗体で沈降した。沈
降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。

【０１０３】実施例 ４ ＣＯＳ細胞における組換えＣkβ−１０の発現 プラスミド、Ｃkβ−１０ ＨＡの発現は、１）ＳＶ４０
複製開始点、２）アンピリシン耐性遺伝子、３）Ｅ.co
li 複製開始点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０ イン
トロンおよびポリアデニル化部位が続くＣＭＶプロモー
ターを含む、ベクター pcＤＮＡＩ／Ａmp(Ｉnvitrogen)
から得られる。完全なＣkβ−１０前駆体およびその３'
末端に枠内で融合したＨＡタグ(tag)をコードするＤＮ
Ａフラグメントを、そのベクターのポリリンカー領域に
クローン化したことから、組換えタンパク質発現は、Ｃ
ＭＶプロモーターの下に指示される。ＨＡタグは、前記
のようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得
られるエピトープに対応する(Ｉ.Ｗilson、Ｈ.Ｎiman、
Ｒ.Ｈeighten、Ａ.Ｃherenson、Ｍ.Ｃonnolly、および
Ｒ.Ｌerner、１９８４、Ｃell ３７、７６７)。ＨＡタ
グを標的タンパク質へ融合させることにより、組換えタ
ンパク質を、ＨＡエピトープを認識する抗体で容易に検
出することが可能となる。プラスミド構築方法を以下に
記載する：Ｃkβ−１０をコードするＤＮＡ配列、ＡＴ
ＣＣ第７５８４９号を、２つのプライマーを用いてクロ
ーン化された、もとのＥＳＴでのＰＣＲにより構築し
た： ５'プライマー は、ＨindIII部位、続いて、開始コドンから始まる１９
ヌクレオチドのＣkβ−１０コード配列を含む； ３'配列 は、ＸbaＩ部位に対する相補的配列、翻訳終止コドン、
ＨＡタグ、およびＣkβ−１０コード配列の最後の１９
ヌクレオチド(終止コドンは含まれていない)を含む。従
って、ＰＣＲ産物は、ＨindIII部位、Ｃkβ−１０コー
ド配列、続いて、枠内で融合したＨＡタグ、そのＨＡタ
グの隣の翻訳終了終止コドン、およびＸbaＩ部位を含
む。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡフラグメントおよび
ベクター、pcＤＮＡＩ／Ａmpを、ＨindIIIおよびＢamＨ
１制限酵素で消化して、ライゲートさせた。そのライゲ
ーション混合物をＥ.coli株 ＳＵＲＥ(Ｓtratagene Ｃl
oningＳystems、１１０９９ Ｎorth Ｔorrey Ｐines Ｒ
oad、Ｌa Ｊolla、ＣＡ ９２０３７から入手可能であ
る)にトランスフォームし、そのトランスフォームされ
た培養物をアンピシリン培地プレート上に置いて、耐性
コロニーを選択した。プラスミド ＤＮＡをトランスフ
ォーマントから単離して、正しいフラグメントの存在に
関して制限分析により試験した。組換えＣkβ−１０の
発現には、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ方法により、ＣＯ
Ｓ細胞を発現ベクターでトランスフェクトした(Ｊ.Ｓam
brook、Ｅ.Ｆritsch、Ｔ.Ｍaniatis、Ｍolecular Ｃlon
ing：Ａ Ｌaboratory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌabora
tory Ｐress、（１９８９）)。Ｃkβ−１０ ＨＡタンパ
ク質の発現を、放射能標識および免疫沈降法により検出
した。(Ｅ.Ｈarlow、Ｄ.Ｌane、Ａntibodies：Ａ Ｌabo
ratory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress、
（１９８８）)。トランスフェクションから２日後、細
胞を^３５Ｓ−システインで８時間標識化した。次いで、
細胞培地を集めて、細胞を界面活性剤(ＲＩＰＡ緩衝液
(１５０mＭ ＮaＣl、１％ ＮＰ−４０、０.１％ ＳＤ
Ｓ、１％ ＮＰ−４０、０.５％ ＤＯＣ、５０mＭ トリ
ス、pＨ ７.５))で溶菌した。(Ｗilson,Ｉ.ら、同上 ３
７：７６７（１９８４）)。細胞溶菌液および培養培地
は両方とも、ＨＡに特異的なモノクローナル抗体で沈降
した。沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分
析した。

【０１０４】実施例 ５ バキュロウイルス発現システムを用いての Ｃkβ−１０のクローニングおよび発現 完全な長さのＣkβ−１０タンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列、ＡＴＣＣ第７５８４９号を、遺伝子の５'およ
び３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライ
マーを利用して増幅した。 その５'プライマーは、配列： を有し、またＢamＨＩ制限酵素部位(肉太の活字)、続い
て、真核細胞における翻訳の開始に有効なシグナルに似
ている１２ヌクレオチドを含み(Ｊ.Ｍol.Ｂiol.１９８
７、１９６、９４７−９５０、Ｋozak,Ｍ.)、またすぐ
後ろは、Ｃkβ−１０コード配列の最初の６ヌクレオチ
ドである(翻訳開始コドン「ＡＴＧ」に下線を引く)。 その３'プライマーは、配列： を有し、また制限エンドヌクレアーゼ Ａsp７８１の切
断部位、およびＣkβ−１０遺伝子の３'非翻訳配列に対
して相補的な１９ヌクレオチドを含む。増幅された配列
を、市販のキット(「Ｇeneclean」、ＢＩＯ １０１ Ｉn
c.、Ｌa Ｊolla、Ｃa.)を使用して、１％ アガロースゲ
ルから単離した。次いで、そのフラグメントをエンドヌ
クレアーゼ ＢamＨＩおよびＡsp７８１で消化した後、
１％ アガロースゲル上で次に精製した。このフラグメ
ントをＦ２と名付ける。ベクター pＲＧ１(pＶＬ９４１
ベクターの修飾、以下に論ずる)を、バキュロウイルス
発現システムを用いてのＣkβ−１０タンパク質の発現
に使用した(レビューには、Ｓummers,Ｍ.Ｄ.およびＳmi
th,Ｇ.Ｅ. １９８７、Ａ manual of methods for bacul
ovirus vectors and insect cell culture procedure
s、ＴexasＡgricultural Ｅxperimental Ｓtation Ｂul
letin Ｎo.１５５５を参照)。この発現ベクターは、オ
ートグラファ(Ａutographa)カリフォルニア核多角体病
ウイルス群(ＡcＭＮＰＶ)の強多角体(strong polyhedri
n)プロモーター、続いて、制限エンドヌクレアーゼ Ｂa
mＨＩおよびＡsp７８１の認識部位を含む。シミアンウ
イルス(ＳＶ) ４０のポリアデニル化部位を、有効なポ
リアデニル化に使用する。組換えウイルスを容易に選択
するには、Ｅ.coli由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
を、多角体(polyhedrin)遺伝子のポリアデニル化シグナ
ルが続く多角体プロモーターと同じ向きに挿入する。同
時トランスフェクトした(cotransfected)野生型ウイル
スＤＮＡの、細胞により媒介される相同組換えのための
ウイルス配列を多角体配列の両側に隣接させる。多くの
他のバキュロウイルスベクターを、pＡc３７３、pＶＬ
９４１、およびpＡcＩＭ１といったようなpＲＧ１の代
わりに使用することができるであろう(Ｌuckow,Ｖ.Ａ.
およびＳummers,Ｍ.Ｄ.、Ｖirology、１７０：３１−３
９)。プラスミドを制限酵素ＢamＨＩおよびＡsp７８１
で消化した後、当業界で既知の方法により、仔ウシ腸ホ
スファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、ＤＮＡ
を１％ アガロースゲルから単離した。このベクター Ｄ
ＮＡをＶ２と名付ける。フラグメント Ｆ２および脱リ
ン酸化プラスミド Ｖ２をＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲ
ートさせた。次いで、Ｅ.coli ＨＢ１０１細胞をトラン
スフォームして、Ｃkβ−１０遺伝子を有するプラスミ
ド(pＢacＣkβ−１０)を含む細菌を、酵素 ＢamＨＩお
よびＡsp７８１を用いて同定した。クローン化されたフ
ラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。
リポフェクション法を利用して、プラスミド pＢacＣk
β−１０ ５μgを市販の線形化バキュロウイルス(「Ｂa
culoＧold^ＴＭ バキュロウイルス ＤＮＡ」、Ｐharming
en、Ｓan Ｄiego、ＣＡ)１.０μgと共に同時トランスフ
ェクトした(Ｆelgnerら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. Ｕ
ＳＡ、８４：７４１３−７４１７（１９８７）)。Ｂacu
loＧold^ＴＭ ウイルス ＤＮＡ １μgおよびプラスミド
pＢacＣkβ−１０ ５μgを、無血清グレイス(Ｇrace's)
培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersburg、Ｍ
Ｄ)５０μlを含むマイクロタイタープレートの無菌ウェ
ル中で混合した。その後、リポフェクチン(Ｌipofecti
n)１０μlとグレイス培地９０μlを加え、混合して、室
温で１５分間インキュベートした。次いで、トランスフ
ェクション混合物を、無血清グレイス培地１mlを含む、
３５mmの組織培養プレートに播種したＳf９昆虫細胞(Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ １７１１)に滴加した。そのプレートを
前後に揺り動かして、新たに加えた溶液を混合した。次
いで、そのプレートを２７℃で５時間インキュベートし
た。５時間後、そのトランスフェクション溶液をプレー
トから除去して、１０％ ウシ胎児血清を補ったグレイ
ス昆虫培地１mlを加えた。そのプレートをインキュベー
ターに戻して、２７℃で４日間培養し続けた。

【０１０５】４日後、上清を集めて、ＳummersおよびＳ
mith(上記)により記載されたようにして、プラークアッ
セイを行った。変更として、「Ｂlue Ｇal」(Ｌife Ｔe
chnologies Ｉnc.、Ｇaithersburg)を含むアガロースゲ
ルを使用したが、このことにより、青色に染色されたプ
ラークを容易に単離することが可能となる。(「プラー
クアッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関す
る利用者のガイド、およびＬife Ｔechnologies Ｉn
c.、Ｇaithersburgにより配布されたバキュロウイルス
学、９−１０頁にも見い出すことができる)。

【０１０６】ウイルスの連続希釈物を細胞に加えてから
４日後に、青色に染色されたプラークをエッペンドルフ
ピペットの先端で採取した。次いで、組換えウイルスを
含む寒天を、グレイス培地２００μlを含むエッペンド
ルフ管内で再び懸濁させた。その寒天を短時間の遠心分
離により除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清
を、３５mmの皿に播種した昆虫Ｓf９細胞を感染させる
のに使用した。４日後、これらの培養皿の上清を収集し
た後、４℃で保存した。

【０１０７】Ｓf９細胞を、１０％ 熱不活性化ＦＢＳを
補ったグレイス培地で増殖させた。その細胞を、感染多
重度(ＭＯＩ) ２で組換えバキュロウイルス Ｖ−Ｃkβ
−１０に感染させた。６時間後、その培地を除去して、
メチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ II
培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersburg)に替
えた。４２時間後、５μＣiの^３５Ｓ−メチオニンおよ
び５μＣiの^３５Ｓ システイン５μＣi(Ａmersham)を加
えた。その細胞をさらに１６時間インキュベートした
後、それらを遠心分離により収集して、標識化タンパク
質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィー
により視覚化した。

【０１０８】先の教示から見て、本発明の多数の変更お
よび変化が可能であることから、後記する請求の範囲内
で、特に記載した以外の方法で、本発明を行うことがで
きる。

【０１０９】配 列 表 （１） 一般的情報 ： （i） 特許出願人 ： リー等 （ii） 発明の名称 ： ヒトケモカインポリペプチド （iii） 配列の数 ： ４ （iv） 連絡先 ： （Ａ） 住所 ： カレラ，バーン，ベーン，ギルフィラ
ン，セッチ，ステュアート・アンド・オルステイン （Ｂ） 通り ： ベッカー・ファーム・ロード６番 （Ｃ） 市 ： ローズランド （Ｄ） 州 ： ニュージャージー （Ｅ） 国 ： アメリカ合衆国 （Ｆ） ＺＩＰ ： ０７０６８ （v） コンピューター解読書式 ： （Ａ） 媒体型 ： ３.５インチ ディスケット （Ｂ） コンピューター ： ＩＢＭ ＰＳ／２ （Ｃ） オペレーティング・システム ： ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ） ソフトウエア ： ワードパーフェクト ５.１ （vi） 本出願のデータ ： （Ａ） 出願番号 ： （Ｂ） 出願日 ： 同日 （Ｃ） 分類 ： （vii） 先行技術データ ： （Ａ） 出願番号 ： （Ｂ） 出願日 ： （viii） 弁理士／代理人情報 ： （Ａ） 氏名 ： フェルラロ，グレゴリー・ディ （Ｂ） 登録番号 ： ３６,１３４ （Ｃ） 参照／整理番号 ： ３２５８００−１８３ （ix） 電話連絡先情報 ： （Ａ） 電話番号 ： ２０１−９９４−１７００ （Ｂ） ファックス番号 ： ２０１−９９４−１７４４ （２） 配列番号１の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ２９１塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （xi） 配列の記述 ： 配列番号１ ： （３） 配列番号２の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： ９６アミノ酸 （Ｂ） 型 ： アミノ酸 （Ｃ） 鎖の数 ： （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 配列の種類 ： タンパク質 （xi） 配列の記述 ： 配列番号２ ： （４） 配列番号３の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ２９７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （xi） 配列の記述 ： 配列番号３ ： （５） 配列番号４の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： ９８アミノ酸 （Ｂ） 型 ： アミノ酸 （Ｃ） 鎖の数 ： （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 配列の種類 ： タンパク質 （xi） 配列の記述 ： 配列番号４ ：

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｃkβ−４のcＤＮＡ配列および対応する推定
アミノ酸配列を示す。最初の２４個のアミノ酸はＣkβ
−４の推定リーダー配列を示すことから、推定される成
熟ポリペプチドは７２個のアミノ酸を含んでなる。アミ
ノ酸に関する標準的な１文字略号を使用する。

【図２】 Ｃkβ−１０のcＤＮＡ配列および対応する推
定アミノ酸配列を示す。最初の２３個のアミノ酸はＣk
β−１０の推定されるリーダー配列を示すことから、推
定される成熟ポリペプチドは７５個のアミノ酸を含んで
なる。アミノ酸に関する標準的な１文字略号を使用す
る。

【図３】 Ｃkβ−４とエオタキシン(eotaxin)の成熟ペ
プチド(下段)との間のアミノ酸配列の相同性を示す。

【図４】 Ｃkβ−１０(上段)とヒトＭＣＰ−３(下段)
との間のアミノ酸配列の相同性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 1/16 48/00 11/00 Ａ６１Ｐ 1/16 11/06 11/00 17/02 11/06 17/06 17/02 19/02 17/06 31/00 19/02 35/00 31/00 35/02 35/00 37/02 35/02 37/08 37/02 43/00 １０５ 37/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 43/00 １０５ Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ハオドン・リー アメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイ ザーズバーグ、ラトリッジ・ドライブ 11033番 (72)発明者 マーク・ディ・アダムス アメリカ合衆国20878メリーランド州ノー ス・ポトマック、ダフィーフ・ドライブ 15205番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 DA02 DA05 DA11 EA02 EA03 EA04 GA11 HA01 4C084 AA02 AA13 AA17 BA01 BA08 BA20 BA21 MA01 NA14 ZA592 ZA752 ZA892 ZA962 ZB072 ZB112 ZB132 ZB212 ZB262 ZB272 ZB322 ZB372 4C085 AA13 AA14 CC32 EE01 GG01 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA59 ZA75 ZA89 ZA96 ZB07 ZB11 ZB13 ZB21 ZB26 ZB27 ZB32 ZB37

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）図１又は図２に示す全アミノ酸配
   列を含むポリペプチドをコードする核酸； （ｂ））図１又は図２に示す推定アミノ酸配列を有する
   ポリペプチドの少なくとも成熟形を含むポリペプチドを
   をコードする核酸； （ｃ）ポリペプチドの少なくとも成熟形をコードする図
   １又は図２に示すコード配列を有する核酸； （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの核酸によりコードさ
   れるポリペプチドの断片、アナログ、又は誘導体をコー
   ドする核酸； （ｅ）その相補鎖が（ａ）〜（ｄ）のいずれかの核酸に
   ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、Ｃｋβ−
   ４活性を有するポリペプチドをコードする核酸； （ｆ）その相補鎖が（ａ）〜（ｄ）のいずれかの核酸に
   ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、Ｃｋβ−
   １０活性を有するポリペプチドをコードする核酸； （ｇ）該核酸がＮ−末端メチオニンをコードしない
   （ａ）〜（ｆ）のいずれかの核酸； （ｈ）該核酸がＮ−末端メチオニンをコードする（ａ）
   〜（ｆ）のいずれかの核酸； （ｉ）（ａ）〜（ｈ）のいずれかの核酸に相補性のポリ
   ヌクレオチド； （ｊ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５８４８号又は第７５８４
   ９号に含まれるｃＤＮＡによりコードされる全アミノ酸
   配列を含むポリペプチドをコードする核酸； （ｋ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５８４８号又は第７５８４
   ９号に含まれるｃＤＮＡによりコードされるポリペプチ
   ドの少なくとも成熟形を含むポリペプチドをコードする
   核酸； （ｌ）ポリペプチドの少なくとも成熟形をコードするＡ
   ＴＣＣ寄託番号第７５８４８号又は第７５８４９号に含
   まれるｃＤＮＡのコード配列を有する核酸； （ｍ）（ｊ）〜（ｌ）のいずれかの核酸によりコードさ
   れるポリペプチドの断片、アナログ、又は誘導体をコー
   ドする核酸； （ｎ）その相補鎖が（ｊ）〜（ｌ）のいずれかの核酸に
   ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、Ｃｋβ−
   ４活性を有するポリペプチドをコードする核酸； （ｏ）その相補鎖が（ｊ）〜（ｍ）のいずれかの核酸に
   ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、Ｃｋβ−
   １０活性を有するポリペプチドをコードする核酸； （ｐ）該核酸がＮ−末端メチオニンをコードしない
   （ｊ）〜（ｏ）のいずれかの核酸； （ｑ）該核酸がＮ−末端メチオニンをコードする（ｊ）
   〜（ｏ）のいずれかの核酸；及び （ｒ）（ｊ）〜（ｑ）のいずれかの核酸に相補性のポリ
   ヌクレオチド；よりなる群から選択される核酸を含むポ
   リヌクレオチド；又は該ポリヌクレオチドによりコード
   されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの癌化学治療の
   間の保護処置のための、白血病、個体腫瘍、慢性感染
   症、自己免疫病、乾癬、喘息、アレルギーを処置するた
   めの、又は創傷治癒を促進するための使用。