JPH11503829A - 抗体検出用化学発光イムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ハプテン等のエンハンサー化合物を含むプローブと化学発光信号発生化合物を含む結合体からなるプレ複合体試薬を利用する化学発光アッセイ。このような化学発光アッセイを実施するためのキットも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 抗体検出用化学発光イムノアッセイ 発明の背景 本発明は一般には化学発光化合物を利用する抗体検出用イムノアッセイに関し 、より詳細にはプレ複合体混合物を形成して２段階アッセイを実施し、信号を増 幅する抗体検出用化学発光イムノアッセイに関する。 化学発光ラベルを信号発生化合物として利用するイムノアッセイは公知である 。イムノアッセイに化学発光発生及び検出を適用することはＷ．Ｒ．Ｓｅｉｔｚ ，“Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｌａｂｅｌｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｃｈｅｍｉｌ ｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，”Ｃｌｉ ｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：１２０−１２６（１９８４）に 記載されている。 不均一イムノアッセイで分離手段として使用される固体多孔質エレメントに固 定化した免疫複合体から発生される化学信号を直接励起及び測定することにより 化学発光アッセイを実施する方法と、この測定を実施するための装置は、参考資 料として本明細書の一部とする本願と同一名義の係属中の米国特許出願 第０７／４２５，６４３号及び０７／２０６，６４５号に記載されている。 化学反応の結果としての発光は文献から公知であり、ＳｃｈｕｓｔｅｒとＳｃ ｈｍｉｄｔにより“Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉ ｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，”Ｖ．ＧｏｌｄとＤ．Ｂｅｔｈｅｌ編，Ａｄｖａｎｃ ｅｓ ｉｎ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８： １８７−２３８ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２ ）に記載されている。イムノアッセイ用ラベルとしてアクリジニウム化合物を使 用することと、その結果としてこれらのラベルから短寿命化学発光信号が発生す ることはＩ．Ｗｅｅｋｓら，“Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ Ｅｓｔｅｒｓ ａｓ Ｈ ｉｇｈｌｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｌａｂｅｌｓ ｉｎ Ｉｍ ｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，”Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９：１４７４−１ ４７８（１９８４）に記載されている。安定なアクリジニウムスルホンアミドエ ステルの使用は、参考資料として本明細書の一部とする本願と同一名義の同時特 許係属出願である米国特許出願第９２１，９７１号（発明者Ｐ．Ｇ．Ｍａｔｔｉ ｎｇｌｙら、公 開ヨーロッパ特許出願第０２７３１１５号）に記載されている。酵素又は求核剤 がアダマンタン構造を含むジオキセタンに作用する結果として長寿命発光信号が 発生することは文献に記載されている。例えばＡ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐの公開ヨー ロッパ出願第０２５４０５１号、公開ＰＣＴ特許出願第ＷＯ８９０６６５０号、 Ｉ．Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎら，“１，２−Ｄｉｏｘｅｔａｎｅｓ，Ｎｏｖｅｌ Ｃ ｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉ ｏｎｓ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，”Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎ ｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ４：９９（１９８８）及 び５ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｂｉｏ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ｆ ｌｏｒｅｎｃｅ−Ｂｏｌｏｇｎａ，Ｉｔａｌｙ，Ｓｅｐｔ．２５−２９（１９８ ８）参照。 アビジン−ビオチンの使用等の信号エンハンサーの使用も知られている。例え ば、Ｈｅｖｅｙらの米国特許第４，２２８，２３７号は、アビジンで標識した酵 素を併用する方法で使用されるリガンドのビオチン標識特異的結合基質の使用に ついて記 載している。ビオチン−抗ビオチン系の使用は、参考資料として本明細書の一部 とする本願と同一名義の１９８４年５月１０日付け米国特許出願第６０８，８４ ９号（１９８５年１１月１３日付け公開ヨーロッパ特許出願第１６０，９００号 ）に記載されている。 イムノアッセイで発生される化学発光信号を強化及び増幅する方法は文献から 公知である。例えば、米国特許第４，９２７，７６９号はアクリジニウム−エス テル標識結合体から発生される化学発光信号を界面活性剤の添加により強化する 方法を記載している。米国特許第４，９５９，１８２号も、界面活性剤とこれに 結合した蛍光化合物の添加により、アルカリホスファターゼ触媒１，２−ジオキ セタンから発生される化学発光信号を増幅する方法を記載している。 抗体検出用化学発光アッセイを実施する方法として公知の慣用方法は、本明細 書に記載するようなエンハンサー化合物を使用する場合であっても、サンプルと 捕獲試薬を反応させ、エンハンサー化合物に結合した結合体とサンプル／捕獲試 薬混合物を反応させ、サンプル／捕獲試薬／結合体混合物をエンハンサ−特異的 結合メンバーと反応させるために別々のインキュベー ション段階を経てから信号を発生するのが通例である。本発明者らは、結合体と プローブのプレ複合体（これらの用語については追って定義する）を形成し、本 明細書に記載するような２段階アッセイを実施することにより、より高強度の読 出信号が発生されることを期せずして発見した。この高強度の信号はアッセイ性 能を高め、アッセイ感度を改善する。発明の要約 本発明は不均一イムノアッセイから発生される化学発光信号の特異的増幅によ り、試料中の分析物の存在を定量する方法を提供するものであり、該方法は、（ ａ）分析物を含む試料を分析物特異的結合対メンバーと接触させ、分析物／分析 物特異的結合対メンバー複合体を形成するために十分な時間及び条件下で第１の 混合物をインキュベートする段階と、（ｂ）分析物／分析物特異的結合対メンバ ー複合体を、分析物特異的結合メンバーに結合したエンハンサー化合物を含むプ ローブとエンハンサー特異的結合メンバーに結合した化学発光信号発生化合物を 含む結合体との予備形成複合体からなるプレ複合体に接触させ、第２の混合物を 形成するために十分な時間及び条件下で前記第２の混合物をインキュベートする 段階と、（ｃ）検出可能な信 号を測定することにより試料中の分析物の存在を定量する段階を含む。エンハン サー化合物はハプテン、蛍光化合物及びジニトロフェノールから構成される群か ら選択することができる。好ましいエンハンサー化合物はビオチンであり、好ま しいエンハンサー特異的結合対メンバーは抗ビオチンである。化学発光信号発生 化合物は、アクリジニウムエステル、アクリジニウムスルホンアミド、フェナン トリジニウム、１，２−ジオキセタン及びルミノールから構成される群から選択 することができる。好ましい化学発光信号発生化合物はアクリジニウムスルホン アミドである。また、分析物特異的結合対メンバーを固相に結合してもよい。 本発明は、プレ複合体試薬を入れた容器を含む、増幅化学発光アッセイを実施 するためのキットも提供する。図面の簡単な説明 図１Ａ〜Ｈは試験した各サンプルのＳ／Ｎ及び絶対信号のグラフであり、 図１Ａは絶対数とプローブと結合体をプロットした陰性数応答関数の三次元グ ラフを示し、 図１Ｂは結合体とプローブと絶対数を線グラフにプロットし た陰性数応答曲線を示し、 図１Ｃは絶対数とプローブと結合体をプロットした陽性数応答関数の三次元グ ラフを示し、 図１Ｄは結合体とプローブと絶対数を線グラフにプロットした陽性数応答曲線 を示し、 図１ＥはＳ／Ｎとプローブと結合体をプロットした陽性サンプルの陽性応答関 数の三次元グラフを示し、 図１Ｆは結合体とプローブとＳ／Ｎを線グラフにプロットした陽性サンプルの 応答曲線を示し、 図１ＧはＳ／Ｎとプローブと結合体をプロットしたサンプルＣ３３Ｅの応答関 数の陽性応答関数の三次元グラフを示し、 図１Ｈは結合体とプローブとＳ／Ｎを線グラフにプロットしたサンプルＣ３３ Ｅの陽性数応答曲線を示し、 図２はＨＣＶのゲノムの地図であり、 図３は２℃〜８℃で６カ月間にわたるプレ複合体（プローブと結合体）の安定 性のグラフであり、Ｓ／Ｎを日数に対してプロットし、黒三角を結ぶ実線は陽性 対照のグラフであり、黒四角を結ぶ実線はＨＣＶ−Ｃ３３抗体に陽性のサンプル のグラフであり、実線（単独）はＨＣＶ−Ｃ１００抗体に陽性のサンプ ルのグラフであり、白星形を結ぶ実線はＨＣＶ−コア抗体に陽性のサンプルのグ ラフであり、スラッシュを結ぶ実線はＮＳ５抗体に陽性のサンプルのグラフであ る。発明の詳細な説明 アクリジニウム化合物の化学発光性とイムノアッセイにおけるその使用につい ては従来記載されている。アクリジニウムエステル又はアクリジニウムスルホン アミドラベルをもつ免疫化学トレーサーをアルカリ過酸化物溶液で誘発すると化 学発光信号を発生し、約２秒後に最大になる。発光は約１０秒後に完全に消滅す る。本発明によると、アクリジニウムスルホンアミド標識化学を利用して高量子 収率の安定なトレーサーを製造することができる。この方法は、参考資料として 本明細書の一部とする本願と同一名義の係属中の米国特許出願第３７１，７６３ 号に記載されている通りである。 あるいは、化学触媒長寿命１，２−ジオキセタン化学発光を種々の方法で発生 させることもできる。例えばヨーロッパ特許出願第０２５４０５１号（前出）は 、テトラブチルアンモニウムクロリド溶液で誘発すると２０分間持続する化学発 光信号を発生する４−（６−第３ブチルジメチルシロキシ−２−ナフチ ル）−４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−アダマンタン］ としてのシロキシ置換ジオキセタンを記載している。また、アリールエステラー ゼやアルカリホスファターゼ等の酵素もアダマンタンケージで安定化されたアリ ールジオキセタン誘導体と反応して同様に長寿命化学発光信号を発生する。 また、ＷＯ８８１００６９４号（前出のＷＯ８９０６６５０号）は３−（２’ −スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェ ニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）及び類似のβ−ガラクトシダーゼ基 質のアルカリホスファターゼ触媒反応から長寿命発光が生じることを記載してい る。イムノアッセイにおけるこれらの化合物の使用も記載されている。このよう に、アルカリホスファターゼ標識技術は公知であり、触媒ジオキセタン化学発光 を使用して長寿命信号を発生することができる。 本発明は特異的結合メンバーを利用するイムノアッセイを提供する。本明細書 で使用する「特異的結合メンバー」とは特異的結合対、即ち化学的又は物理的手 段を介して一方の分子が他方の分子と特異的に結合する２つの異なる分子の一員 である。 従って、慣用イムノアッセイの抗原及び抗体特異的結合対以外に、他の特異的結 合対としてはビオチンとアビジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配 列、エフェクターとレセプター分子、補因子と酵素、酵素阻害剤と酵素等が挙げ られる。特異的結合対メンバーは結合体（後記定義）とプローブ（後記定義）の 組み合わせでもよい。更に、特異的結合対は元の特異的結合メンバーの類似体で あるメンバー、例えば分析物類似体も含んでいてもよい。免疫反応性特異的結合 メンバーとしては、抗原、抗原フラグメント、モノクローナルでもポリクローナ ルでもよい抗体及び抗体フラグメント、並びにその複合体が挙げられ、組換えＤ ＮＡ分子により形成されるものも含む。本明細書で使用する「ハプテン」なる用 語は、抗体と結合することができるが、担体タンパク質と結合していない限り、 抗体形成を誘発することができない部分抗原又は非タンパク質結合メンバーを意 味する。 本明細書で使用する「分析物」とは、試料中に存在する可能性のある被検出物 質である。分析物は天然の特異的結合メンバー（例えば抗体）が存在するか又は 特異的結合メンバーを製造できる任意の物質であり得る。例えば、分析物はアッ セイで１ 種以上の特異的結合メンバーと結合することができる物質である。「分析物」は 更に任意の抗原物質、ハプテン、抗体及びその組み合わせでもよい。特異的結合 対のメンバーとして、分析物は天然の特異的結合パートナー（対）により検出す ることができ、例えばビタミンＢ１２を定量するには内因子タンパク質を特異的 結合対のメンバーとして使用し、炭水化物を定量するにはレクチンを特異的結合 対のメンバーとして使用する。分析物としては、タンパク質、ペプチド、アミノ 酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、治療目的及び違法目的で投与するものを 含めた薬剤、細菌、ウイルス並びにこれらの物質の任意のものの代謝物又は抗体 を挙げることができる。このような抗体の製造と特異的結合メンバーとしての使 用適性に関する詳細は当業者に周知である。 本明細書で使用する「捕獲試薬」とは、サンドイッチアッセイ等では分析物、 競合アッセイ等では指示試薬もしくは分析物、又は間接アッセイ等ではそれ自体 分析物に特異的である補助特異的結合メンバーに対して夫々特異的な非標識特異 的結合メンバーを意味する。捕獲試薬はアッセイの実施前又はアッセイの実施中 に固相材料に直接又は間接的に結合し、固定化複合体を 試料から分離できるようにしてもよい。 「試料」とは、着目分析物を含有する可能性のある全血又は赤血球、白血球、 血小板、血清及び血漿等の全血成分、腹水、尿、脳脊髄液、並びに他の身体成分 等の生物液体のサンプルであり得る。場合により、水、土壌及び植物から試料を 得てもよい。 本明細書で使用する「プローブ」なる用語は、「エンハンサー化合物」に結合 した特異的結合対のメンバーを意味する。「エンハンサー化合物」は化学発光化 合物により発生される信号を強化することが可能なアッセイで使用される任意の 化合物であり得る。例えば、エンハンサー化合物としてはビオチン等のハプテン が挙げられ、フルオレセイン、ジニトロフェノール等でもよい。 「化学発光化合物」とは化学発光信号を発生することが可能な全化合物を含み 、例えばアクリジニウムエステル、アクリジニウムスルホンアミド、フェナント リジニウム、１，２−ジオキセタン、ルミノール、又は化学発光物質を触媒する 酵素等である。 本明細書で使用する「結合体」とは、エンハンサー化合物に 特異的な化合物（エンハンサーの特異的結合メンバー）が結合した化学発光化合 物を意味する。例えば、使用するエンハンサー化合物がビオチンである場合には 、抗ビオチン又はアビジンをエンハンサー特異的化合物として使用することがで きる。 本発明の方法によると固相を使用してもよい。本明細書で使用する「固相」と は、不溶性であるか又は後期反応により不溶性にすることが可能な任意の材料を 意味する。固相は捕獲試薬を吸引固定化する内在能力により選択することができ る。あるいは、固相は捕獲試薬を吸引固定化する能力をもつ付加レセプターを保 持していてもよい。付加レセプターとしては、捕獲試薬自体又は捕獲試薬に結合 した帯電物質とは逆電荷の帯電物質を挙げることができる。あるいは、レセプタ ー分子は固相に固定化され、特異的結合反応により捕獲試薬を固定化できる任意 の特異的結合メンバーでもよい。レセプター分子はアッセイの実施前又はアッセ イの実施中に捕獲試薬を固相材料に間接的に結合できる。 本発明のアッセイ装置は多数の構造をとることができ、そのうちのいくつかは 固相として選択する材料に依存する。例えば、固相としては任意の利用可能な多 孔質材料が挙げられる。「多 孔質」とは、試料が容易に通過できる材料を意味し、吸湿性及び非吸湿性固相材 料の両者を含む。本発明で使用される固相の例を挙げると、アッセイ試薬の１種 以上を含む１層以上をもつ流動アッセイ装置で使用するにはファイバーグラス、 セルロースもしくはナイロンパッド；浸漬読取りアッセイではディップスティッ ク；滲出（例えば紙）もしくは薄層クロマトグラフィーもしくは毛管作用（例え ばニトロセルロース）技術では試験ストリップ；又は当業者に周知の他の多孔質 もしくは連続気泡材料（例えばポリエチレンシート材料）である。但し、固相は 多孔質材料に限定されない。固相はポリマーもしくはガラスビーズ、微粒子、管 、シート、プレート、スライド、ウェル、テープ、試験管等、又は内在電荷をも つかもしくは帯電物質を保持できる任意の他の材料でもよい。 天然、合成、又は化学的に修飾した天然材料を固相として使用することができ 、例えば多糖類（例えば紙等のセルロース材料や酢酸セルロース及びニトロセル ロース等のセルロース誘導体）、シリカ、無機材料（例えば失活アルミナ、珪藻 土、ＭｇＳＯ₄、又は塩化ビニル、塩化ビニル−プロピレンコポリマー及び塩化 ビニル−酢酸ビニルコポリマー等の多孔質ポリマーマ トリックスに均一に分散した他の微粉無機材料）、天然（例えば綿）及び合成（ 例えばナイロン）の両者の布、多孔質ゲル（例えばシリカゲル、アガロース、デ キストラン及びゼラチン）、ポリマーフィルム（例えばポリアクリルアミド）等 が挙げられる。固相は妥当な強度をもつべきであり、又は検出可能な信号の発生 を妨げない支持体により補強してもよい。 流動アッセイ装置に好ましい固相材料としては、多孔質ファイバーグラス材料 又は他の繊維マトリックス材料等の濾紙が挙げられる。このような材料の厚さは 限定的ではなく、主にアッセイするサンプル又は分析物の性質（例えば試料の流 動性等）に基づいて選択される。 固相の内在電荷を変更又は強化するために、帯電物質を材料に直接被覆しても よいし、又は微粒子に被覆してから固相支持体材料に保持させてもよい。あるい は、微粒子をカラムに保持するか又は可溶性試薬と試料の混合物に懸濁すること により固相として使用してもよいし、粒子自体を固相支持体材料に保持固定化し てもよい。「保持固定化」とは、支持体材料上又はその内部の粒子が支持体材料 の内部の別の位置まで実質的に移動できないことを意味する。粒子は任意の適当 な型の粒状材料か ら当業者により選択することができ、ポリスチレン、ポリメチルアクリレート、 ポリプロピレン、ラテックス、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアクリロニト リルル、ポリカーボネート等の材料から構成されるものを挙げることができる。 粒子の寸法は限定的ではないが、粒子の平均直径が使用する支持体材料の平均細 孔寸法よりも小さいことが好ましい。 本発明の好ましい態様によると、検出しようとする分析物を含有している可能 性のある試料を分析物に特異的な結合対メンバー（所謂「捕獲試薬」）と接触さ せて混合物を形成する。分析物／分析物特異的結合対メンバー複合体を形成する ために十分な時間及び条件下でこの混合物をインキュベートする。その後、これ らの複合体を、分析物特異的結合メンバーに結合したエンハンサー化合物とエン ハンサー化合物結合メンバーに結合した化学発光信号発生化合物を含む結合体か らなる予備形成プローブ／結合体混合物のプレ複合体（所謂「プレ複合体」）に 接触させ、第２の混合物を形成する。分析物／分析物特異的結合対メンバー／プ レ複合体の複合体を形成するために十分な時間及び条件下でこの第２の混合物を インキュベートする。化学発光化合物により発生される信号を測定することによ り試料中 の分析物の存在を定量する。捕獲試薬も固相に結合すると好ましい。好ましいエ ンハンサー化合物はビオチンであり、測定可能な信号を発生することが可能な好 ましい化学発光化合物はアクリジニウムスルホンアミドである。プレ複合体はプ ローブと結合体の混合物であり、アッセイで使用する前に相互に反応させる（即 ちプローブ／結合体の予備形成複合体を形成する）。プローブと結合体からなる プレ複合体試薬を入れた容器を含む試験キットも提供される。キットはアッセイ の実施に有用な他の試薬も含んでいてもよく、例えばサンプルを希釈、洗浄及び 混合するための緩衝液や、化学発光反応を誘発することが可能な化合物（例えば アクリジニウム化合物を使用する場合にはアルカリ過酸化物アクチベーター溶液 ）の容器を含んでいてもよい。 以下、実施例により本発明を説明するが、以下の実施例は本発明の範囲及び精 神を具体的に説明することを目的とし、これを限定するものではない。 実施例 実施例１．微粒子の調製 ２つの別個の微粒子群にＨＣＶ−１のコア、ＮＳ３、ＮＳ４ 及びＮＳ５領域からクローニングしたＨＣＶ組換え抗原を被覆することにより、 数種のＨＣＶ組換え抗原で被覆した微粒子を調製した。ＨＣＶ配列（「ＨＣＶ− １」）はＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、受託番号Ｍ６２３２１（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ．２２：３４４１−３４４４（１９９４））から入手できる 。図２は下記組換え抗原のゲノム位置を示すＨＣＶのゲノム地図である。 Ａ．組換えタンパク質の調製 ｉ．ＨＣＶ ＨＣ４３抗原。ＨＣＶ ＨＣ４３組換え抗原はＣｈｉｒｏｎ Ｃ ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡから入手した。この抗原は ＨＣＶ−１のアミノ酸配列１〜１５０及び１１９２〜１４５７を含んでいた（ア ミノ酸配列は上記ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）から入手可能）。 ｉｉ．ＨＣＶ Ｃ−１００抗原。ＨＣＶ Ｃ−１００組換え抗原はＣｈｉｒｏ ｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡから入手した。この 抗原はＨＣＶ−１（上記ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）から入手可能）のアミノ酸 配列１５６９〜１９６１を含んでいた。 ｉｉｉ．ＨＣＶ ＮＳ５抗原。ＨＣＶ ＮＳ５組換え抗原は Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡから入手 した。この抗原はＨＣＶ−１（上記ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）から入手可能） のアミノ酸配列２０５４〜２９９５を含んでいた。 Ｂ．微粒子の被覆 ｉ．ＨＣＶ ＨＣ４３／Ｃ１００微粒子の調製 ＨＣ４３とｃ−１００の両者を被覆した微粒子を次のように調製した。要約す ると、微粒子（１０％ｗ／ｖ、０．７〜０．９μｍ）（Ｓｅｒａｄｙｎｅ，Ｉｎ ｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮの市販品）の５００μｌアリコートを被覆用緩衝液 （０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）を含有する２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ ５．０）９６２μｌと室温で約１分間混合した。次に実施例１（Ａ）（ｉｉ）に 記載したように調製したＨＣＶ Ｃ１００−３抗原溶液（０．６５ｍｇ／ｍｌ） １５４μｌと実施例１（Ａ）（ｉ）に記載したように調製したＨＣ４３抗原溶液 （６５０μｇ／ｍｌ）３０８μｌを微粒子溶液に加え、混合し、室温で１６時間 タンブリングした。 こうして調製した微粒子を次にＴＤｘ（登録商標）マイクロ遠心機（Ａｂｂｏ ｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏ ｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）で１２，０００ｒｐｍで１０分間ペレット化した。次に 上清を取り出し、微粒子を微粒子保存用緩衝液（ＭＳＢ）（１０ｍＭリン酸塩、 ｐＨ７．７、１６ｍＭＥＤＴＡ、３ｍＭジチオトレイトール、１５０ｍＭ Ｎａ Ｃｌ及び０．０５ｍｇ／ｍｌドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ］）２ｍｌに再懸 濁し、遠心分離し、上清をデカントして微粒子を再びＭＳＢに再懸濁し、遠心分 離し、上清をデカントした。次に微粒子をＭＳＢ２．５ｍｌに最終濃度２．０％ に再懸濁した。 ｉｉ．ＨＣＶ ＮＳ−５微粒子の調製 ＨＣＶ ＮＳ−５被覆／保存用緩衝液（５０ｍＭ炭酸塩、ｐＨ１０、０．２ｍ ｇ／ｍＬ ＳＤＳ）５３０μｌと１０％ｗ／ｖ０．７〜０．９μｍ微粒子（Ｓｅ ｒａｄｙｎｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮの市販品）２００μｌを混合し 、実施例１（Ａ）（ｉｉｉ）に記載したように調製したＨＣＶ ＮＳ−５抗原溶 液（濃度６５０μｇ／ｍＬ）２７０μｌを微粒子に加えた。微粒子を混合し、室 温で１６時間タンブリングした。 こうして調製した微粒子を次にＴＤｘ（登録商標）マイクロ遠心機（Ａｂｂｏ ｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ， ＩＬ）で１２， ０００ｒｐｍで１０分間ペレ ット化した。次に上清をデカントし、微粒子をＭＳＢ５ｍｌに最終濃度０．４％ に再懸濁した。 ｉｉｉ．ＨＣＶ ＨＣ４３／Ｃ１００とＨＣＶ ＮＳ５微粒子のブレンディン グ 実施例１Ｂ（ｉ）に記載したように調製した微粒子２２０μｌと実施例１Ｂ（ ｉｉ）に記載したように調製した微粒子３３０ｐｌを混合し、１５分間インキュ ベートし、ＭＳＢで５０ｍｌまで希釈した。実施例２．アクリジニウム標識抗ビオチン抗体の調製 Ａ．３段階アッセイ用 （ｉ）メチルアクリジニウムの活性化 アクリジニウムメチルエステル（（参考資料として本明細書の一部とする１９ ８８年７月６日付け公開ヨーロッパ特許出願第０２７３１１５号に記載されてい るように調製した）１０−メチル−ｎ−トシル−ｎ−（２−カルボキシエチル） −９−アクリジニウムカルボキサミドトリフルオロメチルスルホネート（１．８ ｍｇ））のアリコートをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅ ｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）１８０μｌに溶かした。溶解し たアクリジニウム にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、ＤＭＦ中５．７５ｍｇ／ｍＬ）８８ μｌと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤ ＡＣ、ＤＭＦ中９．７５ｍｇ／ｍｌ）８８μｌを加えることによりアクリジニウ ムエステルを活性化した。ＥＤＡＣとＮＨＳのモル比は１：１とした。反応物を 遮光バイアルで室温で一晩撹拌した。クロロホルム、ＤＭＦ及び酢酸を９：９： ２ｖ／ｖ比で展開溶媒として使用して薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ Ｓｉｌ ｉｃａ Ｇｅｌ６０Ｆ−２５４，Ｍｅｒｃｋ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）に より活性化を確認した。活性化エステルはＤＭＦに溶かしたアクリジニウム塩よ りも高いＲｆ（〜０．２２）をもつ新種として溶出した。 （ｉｉ）活性化メチルアクリジニウムへの抗ビオチンの結合 結合用緩衝液（ＣＢ、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０ ．５％（３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパ ンスルホネート）（ＣＨＡＰＳ（登録商標）、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ｐＨ８．０含有）３６μｌ と活性化メチルアクリジニウムエステル溶液（１０ｍ ｇ／ｍＬ）（実施例２Ａに記載したように調製）８μｌをアンバーガラスバイア ルで撹拌しながら室温で濃度１０ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗ビオチン抗体（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０［１１］：２１１２［１９９４］ ）２００μｌに加え、１０分間混合した。次に反応混合物をＴＤｘ（登録商標） マイクロ遠心機（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐ ａｒｋ，ＩＬ）で１２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、凝集物を除去した。 次に、０．１ｍｇ／ｍｌ ＣＨＡＰＳ、１２０ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭリン 酸ナトリウム、ｐＨ６．３を含有する緩衝液で平衡化しておいた３００×７．８ ｍｍ Ｂｉｏ−Ｓｉｌ（商標） ＳＥＣ−２５０ゲル濾過カラム（Ｂｉｏ−Ｒａ ｄ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）に上清を加えた。モデル１１４Ｍポンプを装着し たＢｅｃｋｍａｎ ４２１Ａコントローラーを使用してカラムを同一緩衝液で１ ．０ｍｌ／分で溶離した。１ｍｌフラクションを集め、Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ− ７スペクトロフォトメーターで２８０ｎｍと３７０ｎｍの吸光度を測定した。２ ８０ｎｍの吸光度を使用し、この波長でアクリジニウムによる寄与分を補正した タンパク質濃度（補正タンパク質吸光度＝Ａ₂₈₀− （Ａ₃₇₀×０．２４７））を測定することによりアクリジニウム取込度を計算し た。夫々１４，６５０及び２２０，０００Ｍ^-1ｃｍ^-1のモル吸光係数を使用して アクリジニウムとＩｇＧのモル数を計算した。得られたアクリジニウムとＩｇＧ の比（モル／モル）は約２であった。結合体を４℃で保存した。 Ｂ．２段階アッセイ用 （ｉ）ビオチン化抗ヒトＦ（ａｂ’）₂とアクリジニウム標識抗ビオチン結合 体のプレ複合体の調製 （ａ）上記実施例２（Ａ）（ｉ）に記載したようにメチルアクリジニウムを抗 ビオチンに標識した。抗ヒトＩｇＧのビオチン化Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントは Ｋｉｒｋｅｒｇａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ ）から購入した。Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０（１１）：２１ １２（１９９４）に記載されている方法に従って蛍光偏光によりこのビオチン化 プローブへの機能性ビオチンの取込度を測定した処、ビオチン８モル／モルＩｇ Ｇであった。 プレ複合体を形成するために、ビオチン化プローブ（Ｉｍｇ／ｍｌ）１０μｌ に抗ビオチンメチルアクリジニウム（２２５μｇ／ｍｌ）２００μｌを加え、反 応混合物を結合体希釈剤 （１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ６．３中に０．０４ｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（Ｂ ＳＡ）、０．０１ｇ／ｍＬ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（登録商標）、６００ｍ Ｍ ＮａＣｌ、０．００１ｇ／ｍｌナトリウムアジドを含有）２９０μｌで希釈 することによりメチルアクリジニウム標識抗ビオチン抗体をビオチン化Ｆ（ａｂ ’）₂プローブと反応させた。この混合物を時々震盪しながら暗所に室温で３０ 分間放置した。次に、混合物１００μｌをＣＢ１５９．９ｍｌで希釈し、混合し 、室温で一晩保存した。こうして形成されたこのプレ複合体を０．２μｍ Ｎａ ｌｇｅｎｅ（登録商標）膜で濾過した。濾過したプレ複合体を暗所に２〜８℃で 保存した。 （ｂ）上記のように調製した等容量のビオチン化プローブ（結合体希釈剤中１ ０μｇ／４００ｍｌ）をアクリジニウム標識結合体（結合体希釈剤中４５μｇ／ ４００ｍＬ）と混合し、反応混合物を形成した。この反応混合物を暗所で室温で ２時間撹拌した。次に反応混合物を０．２μｍ膜で濾過し、着色ポリプロピレン びんに２〜８℃で保存した。実施例３．抗ＨＣＶ抗体を検出するための３段階アッセイ 本明細書に記載するような典型装置（Ａｂｂｏｔｔ Ｐｒｉ ｓｍ（商標）装置、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）を使用することにより３段階アッセイを実施した。この装置と 関連試薬、方法及び使い捨て器具は、参考資料として本明細書の一部とする本願 と同一名義の米国特許第５，０８９，４２４号、５，１２０，１９９号、５，０ ０６，３０９号、５，１９８，３６８号、５，２３２，６６９号、５，２４４， ６３０号、５，２４６，３５４号、５，２９９，４４６号、５，０１５，１５７ 号及び意匠第３３２，８３４号に詳細に記載されている。 要約すると、対照又は血清又は血漿サンプル１００μｌと実施例１（Ｂ）（ｉ ｉｉ）に記載したように調製したＨＣＶ抗原を被覆した微粒子５０μｌをＰｒｉ ｓｍ（商標）装置のステーション１で反応トレーのインキュベーションウェルに 分配し、アッセイタイミングを開始した。外部撹拌又は震盪を用いずに溶液の相 互拡散によりサンプルと微粒子を混合した。次にステーション４で繊維マトリッ クスを含む検出ウェルに反応混合物を移し、室温で１８分間インキュベーション 後に洗浄した。検出ウェルを次のステーション（ステーション５）に移し、ヤギ 抗ヒトＩｇＧ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤの市販品）のビオチン化Ｆ（ａｂ’）₂フラグ メント５０μｌ（２．５ｎｇ）を繊維マトリックスに分配した。検出ウェルを５ ．４分間インキュベートし、ステーション６で微粒子と過剰のプローブをプロー ブ洗浄溶液（ＷＳ、０．３％ＬＤＳ、０．９％ＮａＣｌ、０．１％ＰｒｏＣｌｉ ｎ ３００（登録商標）（Ｒｏｈｎ ＨａａｓＣｏｒｐ．，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａ ｎｉａの市販品）を含有する０．１Ｍクエン酸塩、ｐＨ４．５）１００μｌで４ 回洗浄した。ステーション７でアクリジニウム標識抗ビオチン結合体５０μｌ（ ３．５ｎｇ）を反応トレー内の検出ウェルの繊維マトリックスに分配した。アル カリ過酸化物アクチベーター溶液５０μｌを加えて化学発光（ＣＬ）信号を誘発 した。ステーション９で信号を光子計数により測定した。信号集積時間は６秒間 とした。結果はまず信号対雑音（Ｓ／Ｎ）比として表し、その後、信号対カット オフ（Ｓ／ＣＯ）比として表した。実施例４．２段階ＨＣＶアッセイ ２段階アッセイを計画し、実施例３に記載した方法を次のように変形して実施 した。要約すると、ステーション１で対照又はサンプル５０μｌと、試料希釈剤 緩衝液（ＳＤＢ、０．１％ Ｃｅｌｑｕａｔ（登録商標）［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｒｃｈ，Ｗｏｏｄｒｕ ｆｆ，ＳＣの市販品］、４％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）、１０％新生 ウシ血清、１Ｍ ＮａＣｌ、４．５％Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）（Ａｔｌａ ｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡの市販品）、７５μｇ／ｍｌ スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、０．１５％大腸菌溶解物及び０． １％アジドを含有する２０ｍＭ硼酸塩、ｐＨ７．５）５０μｌと、（実施例１（ Ｂ）（ｉｉｉ）に記載したように調製した）ＨＣＶ抗原を被覆した微粒子５０μ ｌを各インキュベーションウェルに分配し、アッセイタイミングを開始した。外 部撹拌又は震盪を用いずにこれらの成分を相互拡散により混合して反応混合物を 形成した。ステーション４で、繊維マトリックスを含む検出ウェルに反応混合物 を移し、室温で１８分間インキュベーション後に転移用洗浄液（ＴＷ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）、１０％グリセロール及 び０．１％ＰｒｏＣｌｉｎ ３００（登録商標）を含有する０．１Ｍ硼酸塩緩衝 液、ｐＨ７．０）３００μｌで２回洗浄した。ステーション５で予備複合体化し たビオチン化Ｆ（ａｂ’）₂／アクリジニウム標 識抗ビオチン（ヤギ抗ヒトＩｇＧのビオチン化Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントとア クリジニウム標識抗ビオチン抗体）５０μｌを検出ウェルの繊維マトリックスに 分配した。ウェルを２２．３分間インキュベートし、ステーション８で反応混合 物を含む繊維マトリックスを最終洗浄液（ＦＷ、０．９％ＮａＣｌ及び０．１％ ＰｒｏＣｌｉｎ ３００（登録商標）を含有する０．０２５Ｍ ＭＥＳ（２−［ Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）、ｐＨ５．７）５０μｌで６回洗浄した。 ステーション９でＣＬ信号を誘発し、測定した。信号集積時間は６秒間とした。実施例５．種々の濃度のプローブと結合体を使用することによるプレ複合体の最 適化 使用するプローブと結合体の比を変えて実施例２（Ｂ）（ｉ）（ｂ）に記載し た手順に従ってプレ複合体混合物の数種の調製物を調製した。各混合物の最終容 量は１６６ｍｌとした。既知反応性のＨＣＶ血漿サンプルのパネルに絶対化学発 光（ＣＬ）信号とＳ／Ｎ比を比較することにより、ＨＣＶアッセイで種々の濃度 のプローブと結合体を使用した場合のプレ複合体調製物の相対性能を評価した。 この血漿パネルはＨＣＶ抗体に陽性の 再石灰化ヒト血漿（「ＰＣ」と呼ぶ）、抗ＨＣＶ ３３Ｃのみに陽性のヒト血漿 ボーダーライン（「Ｃ３３Ｅ」と呼ぶ」）、陰性ヒト血漿で１：５０に希釈した ＨＣＶの多重抗体に陽性の血漿サンプル（「２２５７」と呼ぶ）、及びＨＣＶ抗 体に陰性のヒト血漿（「陰性」と呼ぶ）から構成した。Ａｂｂｏｔｔ Ｍａｔｒ ｉｘ（商標）ＨＣＶアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂ ｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）でアッセイを実施することにより、上記の各ＨＣＶ 抗体に対する反応性を測定した。全パネルサンプルはＦＤＡ認可スクリーニング アッセイによると抗ＨＩＶ １及び抗ＨＩＶ ２、抗ＨＴＬＶ−Ｉ及び抗ＨＴＬ Ｖ−ＩＩ、抗ＨＢｃ及びＨＢｓＡｇに陰性であった。この比較試験の結果を下表 １に示す。結果は絶対数で示す陰性対照を除き、下記計算により示すようにバッ クグラウンドを補正したＳ／Ｎ比として表す。Ｓ／Ｎは式：Ｓ／Ｎ＝（サンプル の平均）／（陰性の平均）により決定した。４個の試料の平均化学発光数を使用 して各平均（ｎ＝４）を決定した。Ｓ／Ｎ≧３〜５を反応性とみなした。 ２ファクター３レベル全因子スクリーニング分析を使用してＳｔａｔｇｒａｐ ｈｉｃｓ（登録商標）ソフトウェアパッケージ（Ｍａｎｕｃｒｉｓｔｉｃｓ，Ｉ ｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤの市販品）により表１に示すデータを分析し た。この分析では、夫々７、１０もしくは１３μｇ又は４０、４５もしくは５０ μｇの３種の量（３レベル）の各々でプローブの量と結合体の量（２ファクター ）に観察される変化をモデル化し、各ファクターについてこれらの変化を二次（ 放物線）方程式に数式化した。５及び２０μｇプローブと４５μｇ結合体の組み 合わせはモデル数式化データセットに含まれず、比較の目的で表１に示す。ソフ トウェアパッケージにより、実際のサンプル点間の値を補間した。得られたモデ ルの３−Ｄグラフにより、試験した各サンプルのＳ／Ｎ及び絶対信号の性質を解 明した。これらの結果を図１Ａ〜１Ｈに示す。 図１Ａ及び１Ｂから明らかなように、結合体の濃度を増加することによりバッ クグラウンドも増加する。図１Ｃ及び１Ｄに 示すように、ＰＣサンプルの絶対化学発光数率は結合体及びプローブ量の増加に 伴って増加し続けた。図１Ｅ〜１Ｈに示すように、ＰＣ及びＣ３３Ｅ血漿サンプ ルの最高のＳ／Ｎは中濃度（４５μｇ）の結合体と低濃度（７又は１０μｇ）の プローブで観察された。実施例６．ＨＣＶ血清変換体のパネルによる２段階アッセイと３段階アッセイの 比較 ＨＣＶ血清変換を経た３種の個体からの血漿サンプルのＨＣＶ血清変換パネル に信号対カットオフ（Ｓ／ＣＯ）を比較することにより、上記実施例３及び４に 記載した２段階及び３段階ＨＣＶアッセイの相対性能を評価した。種々の時間間 隔で血漿サンプルを抽出した。この試験の結果を表２に示し、バックグラウンド を補正したＳ／ＣＯとして結果を表す。比較の目的で、Ａｂｂｏｔｔ ３．０ ＨＣＶ ＥＩＡ及びＡｂｂｏｔｔ Ｍａｔｒｉｘ（商標）ＨＣＶアッセイでこれ らのサンプルをアッセイした結果も示す。データから明らかなように、２段階ア ッセイは３段階アッセイよりも高いＳ／ＣＯを生じ、ＨＣＶ試験には２段階アッ セイのほうが優れていることが判明した。 実施例７．異常ＨＣＶサンプルのパネルによる２段階アッセイと３段階アッセイ の比較 各フォーマットから得られたＳ／ＣＯの結果を異常ＨＣＶ血清学サンプルのパ ネルに比較することにより、２段階及び３段階ＨＣＶアッセイの相対性能を評価 した。アッセイは実施例 及び に記載した手順に従って実施した。血漿パ ネルは、表３に示す指定ＨＣＶマーカーに対してＡｂｂｏｔｔ Ｍａｔｒｉｘ（ 商標）により非反応性の個体からのサンプルから構成した。試験したサンプルは サンプル番号２２５７（「２２５７」と呼ぶ）、陽性対照、陰性対照、熱ストレ スを加えた陰性対照サンプル（「ＮＣ」と呼び、５６℃で試験）、ＨＣＶ−コア 抗原のみに陽性のサンプル（「ＨＣＶ−コア」と呼ぶ）、ＨＣＶ−Ｃ１００のみ に陽性のサンプル（「ＨＣＶ−Ｃ１００」と呼ぶ）、ＨＣＶ−Ｃ３３のみに陽性 のサンプル（「ＨＣＶ−Ｃ３３」と呼ぶ）及び特異性サンプル（「Ｓｐｅｃサン プル」と呼ぶ）であった。サンプルＨＣＶ−コア、ＨＣＶ−Ｃ１００及びＨＣＶ −Ｃ３３は表３に示すように種々の希釈液として試験した。この試験の結果を表 ３に示す。結果はバックグラウンドを補正したＳ／ＣＯとして表す。表３のデー タが示すように、 陰性対照及び特異性サンプルを除くサンプルの試験で２段階アッセイのほうが高 いＳ／ＣＯを生じた。熱ストレスを加えた陰性対照は、６日目に３段階アッセイ よりも２段階アッセイのほうが低いＳ／ＣＯを示した。 実施例８．プレ複合体（プローブと結合体）の安定性 実施例２に従って形成したプレ複合体を２℃〜８℃で６カ月間保存し、実施例 ４に記載した２段階アッセイに従って種々の陽性サンプルに対して周期的に試験 した。試験したサンプルは陽性対照（複数のＨＣＶ抗体に陽性のサンプル）、Ｈ ＣＶ−Ｃ３３抗体に弱陽性のサンプル、ＨＣＶ−Ｃ１００抗体に弱陽性のサンプ ル、ＨＣＶ−コア抗体に陽性のサンプル及びＨＣＶ−ＮＳ５抗体に陽性のサンプ ルであった。データは、Ｓ／Ｎを日数に対してプロットした図３に示す通りであ る。データが示す通り、プレ複合体は２〜８℃で保存した場合に１８２日間（６ カ月間）にわたって安定であり、これは、試験した各サンプルのＳ／Ｎがこの期 間に僅かしか低下していないことから明らかである。 このようにプレ複合体を使用すると、別個の抗原抗体添加段階とプローブ複合 体混合物の洗浄段階が不要になり、時間と費用を節約できる。また、プレ複合体 を使用すると、上記データに詳細に示すようにアッセイ感度が増加する。同様に データが示唆するように、プローブと結合体の濃度が低くてよいため、アッセイ 試薬を効率的に使用できる。最後に、プレ複合体は安 定であり、２〜８℃で保存した場合には６カ月間にわたって許容可能な安定性デ ータを示す。 当業者には本発明の上記特定態様の他の変更及び変形も自明であろう。従って 、本発明は請求の範囲に制限される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．不均一イムノアッセイから発生される化学発光信号の特異的増幅により、試 料中の分析物の存在を定量するための方法であって、 ａ．分析物／分析物特異的結合対メンバー複合体を形成するために十分な時間 及び条件下で分析物を含む試料を分析物特異的結合対メンバーと共にインキュベ ートする段階と、 ｂ．分析物／分析物特異的結合対メンバー複合体を、分析物特異的結合メンバ ーに結合したエンハンサー化合物を含むプローブとエンハンサー特異的結合メン バーに結合した化学発光信号発生化合物を含む結合体からなるプレ複合体に接触 させ、第２の混合物を形成するために十分な時間及び条件下で前記第２の混合物 をインキュベートする段階と、 ｃ．検出可能な信号を測定することにより試料中の分析物の存在を定量する段 階を含む前記方法。 ２．前記分析物が抗体又は抗原である請求項１に記載の方法。 ３．前記エンハンサー化合物がハプテン、蛍光化合物及びジニトロフェノールか ら構成される群から選択される請求項１に記 載の方法。 ４．前記エンハンサー化合物がビオチンである請求項１に記載の方法。 ５．前記化学発光信号発生化合物がアクリジニウムエステル、アクリジニウムス ルホンアミド、フェナントリジニウム化合物、１，２−ジオキセタン及びルミノ ールから構成される群から選択される請求項１に記載の方法。 ６．前記化学発光信号発生化合物がアクリジニウムスルホンアミドである請求項 １に記載の方法。 ７．前記分析物特異的結合メンバーを段階（ａ）の前に固相に結合する請求項１ に記載の方法。 ８．エンハンサー化合物を含むプローブと化学発光信号発生化合物を含む結合体 からなるプレ複合体試薬を入れた容器を含む、増幅化学発光アッセイを実施する ためのキット。 ９．前記エンハンサー化合物がハプテン、蛍光化合物及びジニトロフェノールか ら構成される群から選択される請求項８に記載のキット。 １０．前記化学発光信号発生化合物がアクリジニウムエステル、アクリジニウム スルホンアミド、フェナントリジニウム化合物、 １，２−ジオキセタン及びルミノールから構成される群から選択される請求項８ に記載のキット。